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Optimisation de la collecte de larmes chez la souris pour l’analyse de l’ARNm et des protéines

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DOI :

10.3791/66955

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19 juillet 2024

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1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

Dans cet article

Résumé

L’identification de biomarqueurs d’ARN et de protéines à partir de déchirures dans des modèles murins est très prometteuse pour le diagnostic précoce de diverses maladies. Ce manuscrit fournit un protocole complet pour optimiser l’efficacité et l’efficience de l’isolement de l’ARNm et des protéines à partir de larmes de souris.

Résumé

Le film lacrymal est un biofluide hautement dynamique capable de refléter les changements moléculaires associés à la pathologie, non seulement dans la surface oculaire, mais aussi dans d’autres tissus et organes. L’analyse moléculaire de ce biofluide offre un moyen non invasif de diagnostiquer ou de surveiller des maladies, d’évaluer l’efficacité d’un traitement médical et d’identifier d’éventuels biomarqueurs. En raison du volume d’échantillon limité, la collecte d’échantillons lacrymaux nécessite des compétences spécifiques et des outils appropriés pour garantir une qualité élevée et une efficacité maximale. Diverses méthodologies d’échantillonnage des larmes ont été décrites dans des études humaines. Dans cet article, une description complète d’un protocole optimisé est présentée, spécialement conçu pour extraire des informations sur les protéines liées aux larmes à partir de modèles animaux expérimentaux, en particulier de souris. Cette méthode comprend la stimulation pharmacologique de la production de larmes chez des souris âgées de 2 mois, suivie d’un prélèvement d’échantillons à l’aide de bandelettes Schirmer et de l’évaluation de l’efficacité et de l’efficience du protocole par des procédures standard, SDS-PAGE, qPCR et PCR numérique (dPCR). Ce protocole peut être facilement adapté pour l’étude de la signature de la protéine lacrymale dans une variété de paradigmes expérimentaux. En établissant un protocole d’échantillonnage des larmes abordable, standardisé et optimisé pour les modèles animaux, l’objectif était de combler le fossé entre la recherche humaine et animale, en facilitant les études translationnelles et en accélérant les progrès dans le domaine de la recherche sur les maladies oculaires et systémiques.

Introduction

Les larmes sont considérées comme un ultrafiltrat plasmatique et ont également été décrites comme un liquide intermédiaire entre le sérum plasmatique et le liquide céphalo-rachidien en raison d’un chevauchement important des biomolécules qu’elles partagent1. Il a été rapporté que les larmes humaines contiennent des protéines, des lipides lacrymaux, des métabolites et des électrolytes2. Récemment, d’autres biomolécules telles que les ARNm, les miARN et les vésicules extracellulaires ont également été identifiées 3,4,5,6,7.

Chez l’homme, les déchirures basales sont situées dans le film lacrymal, qui se compose de trois couches : la couche lipidique externe, qui maintient la surface des larmes lisse pour nous permettre de voir à travers et d’empêcher l’évaporation des larmes ; la couche aqueuse moyenne, qui maintient l’œil hydraté, repousse les bactéries, protège la cornée et constitue 90 % du film lacrymal ; et enfin, la couche de mucine, une famille de protéines de haut poids moléculaire qui sont en contact avec la cornée et permettent à la larme d’adhérer à l’œil8. La distribution des larmes sur la surface oculaire commence par la sécrétion de la glande lacrymale. Ce liquide est ensuite guidé à travers les canaux lacrymaux pour passer sur la surface de l’œil et s’écouler dans des canaux de drainage. Chaque clignement permet aux larmes de se disperser uniformément sur l’ensemble de l’œil, le gardant humide9.

Le film lacrymal est un biofluide hautement dynamique capable de refléter les changements moléculaires qui se produisent non seulement sur la surface oculaire, mais aussi dans d’autres tissus et organes. L’analyse de l’expression différentielle dans ce biofluide représente une approche prometteuse pour la découverte de biomarqueurs dans les maladies humaines10,11. L’utilisation du film lacrymal comme source de biomarqueurs pour le diagnostic précoce de diverses pathologies a été grandement facilitée par la présence de méthodes de collecte non invasives. La méthode la plus courante pour recueillir les larmes dans les cliniques humaines et vétérinaires implique un support à base de membrane (bande de Schirmer), qui fonctionne sur le principe de l’action capillaire, permettant à l’eau contenue dans les larmes de se déplacer sur la longueur d’une bandelette de test en papier ou de tubes capillaires placés dans le sac conjonctival inférieur du sujet 12,13,14. Malgré la limitation inhérente à l’obtention d’un petit volume d’échantillon par cette méthode, l’analyse biochimique de la composition des larmes à l’aide de diverses techniques sensibles a facilité l’identification de molécules biomarqueurs potentielles11,15. Les protocoles d’optimisation et d’évaluation de l’élution des protéines lacrymales à partir des bandelettes et des capillaires de Schirmer chez les patients humains sont bien documentés16,17. Cependant, il existe des descriptions complètes de protocoles optimisés spécialement conçus pour extraire des informations moléculaires liées aux déchirures à partir de modèles animaux expérimentaux, mais elles sont rares. Les méthodes existantes, telles que l’induction de larmes par stimulation directe de la glande lacrymale18, tout en permettant la collecte de plus grands volumes, sont invasives et peuvent causer de l’inconfort aux animaux. Des méthodes non invasives, telles que la collecte de larmes sur la surface oculaire, ont été décrites comme un moyen d’isoler l’ADN et les miARN19,21.

Ce protocole vise à établir une méthode rentable et optimisée pour la collecte et le traitement des larmes chez la souris. La méthode privilégie la non-invasivité tout en obtenant des volumes de larmes suffisants adaptés à l’analyse moléculaire grâce à des techniques telles que SDS-PAGE, qPCR et dPCR. Les informations extraites sur le contenu des protéines et de l’ARNm peuvent ensuite être utilisées pour identifier des biomarqueurs potentiels dans les modèles expérimentaux existants de la maladie.

Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par le Comité d’Éthique Animale de Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Les animaux de laboratoire ont été traités et manipulés en stricte conformité avec les directives d’utilisation des animaux de la revue et conformément à la déclaration de l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. La santé oculaire avant et après les procédures a été évaluée en évaluant les écoulements oculaires, les paupières enflées, les anomalies oculaires et les changements de comportement.

1. Animaux et préparation des réactifs

  1. Utiliser trois souris mâles C57BL/6 de 2 mois par répétition pour la procédure, avec un poids de départ de ~25 g (Figure 1). Traitez chaque souris individuellement et placez-la sur un coussin chauffant pour maintenir la chaleur.
  2. Pour induire la sécrétion lacrymale, préparer une solution mère de pilocarpine à 20 mg/mL en utilisant de l’eau stérile.
  3. Coupez les bandelettes de test de Schirmer à une longueur de 5 mm et pliez chaque bande à l’encoche à un angle de 90°.
  4. Préparez 250 μL d’eau stérile avec un inhibiteur de protéase (1 comprimé pour 50 mL, selon les instructions du fabricant).

2. Stimulation et collecte de la production de larmes

  1. Pesez chaque souris individuellement pour calculer la posologie appropriée des traitements.
  2. Pour stimuler la production de larmes, administrer 30 mg/kg de pilocarpine par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue à insuline de 6 mm (figure 1B). Attendez 2 minutes après l’injection du médicament pour que ses effets se manifestent.
    REMARQUE : Il n’a pas été possible d’obtenir des données sur des animaux non stimulés en raison de la disponibilité limitée de liquide lacrymal.
  3. Prélevez les larmes en plaçant l’extrémité de chaque fragment de bande Schirmer au centre de la paupière inférieure à l’aide d’une pince à épiler et maintenez-la en place jusqu’à ce que la larme atteigne la limite de la bande (Figure 1C). Ensuite, remplacez la bande. Placez séquentiellement 2 bandes Schirmer dans chaque œil, avec un intervalle de 2 minutes entre les bandes pour le prélèvement. Le processus de collecte des larmes nécessite environ quatre fragments de bande sur 10 minutes par souris.
  4. Placez les fragments de la bande Schirmer dans des tubes stériles sur de la glace pour éviter la dégradation des composants. Dès que la collection est terminée, commencez le traitement des déchirures.

3. Isolement des protéines

  1. Placez les fragments de bandelettes dans un tube de microcentrifugation de 600 μL contenant 20 μL d’eau stérile avec un inhibiteur de protéase et centrifugez-les pendant 1 h à 600 x g à 4 °C, comme indiqué précédemment17 (figure 1D).
  2. Effectuer une ponction à l’aide d’une aiguille d’injection en acier inoxydable de 7,5 cm à l’extrémité du tube de 600 μL contenant l’échantillon (figure 1E). Ensuite, transférez ce tube perforé dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 mL et centrifugez les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C, comme indiquéprécédemment 17, pour récupérer le volume des larmes diluées. Le volume du film lacrymal (surnageant) se trouvera au fond du tube.
  3. Créez un pool de protéines en combinant le surnageant récupéré dans tous les échantillons. Dans cette expérience, un volume total d’environ 200 μL a été obtenu.
    REMARQUE : La production de larmes peut durer plus de 1 heure. Pendant ce temps, les larmes peuvent encore être recueillies.
  4. Quantifier la teneur totale en protéines du bain lacrymal à l’aide de la méthode standard de Bradford22.

4. Analyse de la FDS-PAGE

  1. Chauffer les échantillons de protéines à 99 °C pendant 4 min pour dénaturer les protéines. Vortex brièvement les échantillons pour mélanger les composants.
  2. Charger 30 μg de teneur en protéines quantifiée de chaque échantillon sur un gel SDS-PAGE à 10 % (tableau 1) et analyser les échantillons à 90 V pendant 2 h en utilisant la méthode standard23.
  3. Après l’électrophorèse, recouvrez le gel d’une solution de coloration (tableau 1) et incubez pendant 30 minutes pour colorer les protéines.
  4. Rincez le gel avec la solution décolorante plusieurs fois jusqu’à ce que l’arrière-plan devienne clair et que des bandes de protéines soient visibles.
  5. Acquérez des images avec un système de documentation sur gel.

5. Isolement de l’ARNm pour la qPCR et la PCR numérique

  1. Placez les bandelettes dans un tube de microcentrifugation de 600 μL contenant 20 μL d’eau stérile. Faites une ponction à l’extrémité du tube contenant l’échantillon, placez-le dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 mL et centrifugez, comme indiqué précédemment dans Human Tears3, pendant 20 min à 2 000 x g à 4 °C (figure 1E-H).
  2. Créez un pool à partir de tous les échantillons. Le volume récupéré de cette expérience était d’environ 22 μL de surnageant pour chaque souris, c’est-à-dire 66 μL de volume total. Placez les tubes sur de la glace carbonique pour éviter la dégradation des biomolécules.
  3. Ajouter 200 μL de solution monophasique de phénol et d’isothiocyanate de guanidinium (obtenue dans le commerce) et homogénéiser par pipetage. Laisser reposer 5 min à température ambiante. À cette étape, les échantillons peuvent être conservés à -20 °C pendant plusieurs semaines ou à -70 °C pendant plusieurs mois.
  4. Ajouter 40 μL de chloroforme et mélanger au tourbillon pendant 15 s. Laisser reposer 2 min à température ambiante. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 15 min à 4°C.
  5. Transférez soigneusement la phase aqueuse (sans prendre l’interphase) dans un nouveau tube de 1,5 ml.
  6. Ajouter 0,5 μL de glycogène (0,05 μg/μL) à 100 μL d’isopropanol et mélanger par pipetage. Le glycogène est co-précipité avec l’ARN et n’interfère pas avec les étapes suivantes.
  7. Laisser reposer 10 min à -20 °C. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Décantez rapidement le surnageant.
  8. Ajouter 200 μL d’éthanol froid à 75 % et remettre en suspension la pastille d’ARN par vortex. Centrifugeuse à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
  9. Décantez l’éthanol. Sans retourner le tube, laissez-le sécher à l’air libre pendant 20-30 min. Ajouter 20 μL d’eau sans RNase et remettre en suspension.
  10. Procédez à la lecture de la densité optique dans le spectrophotomètre de microvolume à 260 nm et 280 nm pour évaluer la pureté de l’ARN. Les échantillons doivent être sur de la glace.
    REMARQUE : Les bandes ribosomales 28S et 18S ne peuvent pas être observées à l’aide d’un gel d’agarose en raison de la nature de l’échantillon. La présence d’autres ARN, tels que les miARN ou les ARNm, peut être analysée à l’aide d’un bioanalyseur, comme montré précédemment18.
  11. Synthétisez l’ADNc à partir de l’ARN lacrymal à l’aide d’un kit commercial conformément au protocole du fabricant.
    1. Commencer avec un ARN d’entrée dans une plage de 10 ng à 5000 ng ; selon le kit utilisé, mélangez-le avec 1 μL d’Oligo (dT) et jusqu’à 12 μL d’eau sans RNase. Faites-le tourner à 500 x g pendant 30 s et incubez à 65 °C pendant 5 min.
    2. Ajouter au tube de mélange 4 μL de tampon de réaction 5x, 1 μL d’inhibiteur de RNase, 2 μL de mélange dNTP et 1 μL de transcriptase inverse.
    3. Faites tourner le tube à 500 x g pendant 30 s pour tirer le mélange vers le bas. Ensuite, incubez le tube à 42 °C pendant 60 min. Terminez la réaction en incubant le tube à 70 °C pendant 10 min.
  12. En raison de la faible concentration d’ARNm dans les larmes, il est recommandé d’utiliser de l’ADNc non dilué pour la qPCR24. Pour cette expérience, 150 ng d’ADNc ont été utilisés. Effectuez une qPCR à l’aide d’amorces DNMT3a :
    Avant : GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Inverse : CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA et amorces GAPDH :
    Avant : ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, Marche arrière : TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC en suivant les instructions des fabricants et les procédures relatives à l’équipement.
    1. Pour le cycle qPCR, utilisez le programme suivant : Dénaturation initiale : 95 °C pendant 10 min suivie de 45 cycles de C 95 °C - 15 s, 60 °C - 30 s et 72 °C - 30 s, se terminant par une extension finale à 72 °C pendant 5 min.
    2. Effectuez une analyse de la courbe de fusion pour évaluer la présence de dimères d’amorce ou d’amplicons non spécifiques dans la réaction. La rampe de température a commencé de 50 °C à 99 °C finale, avec une tenue initiale de 90 s pour la première étape et une tenue de 5 s entre chaque étape.
    3. Pour la dPCR25, effectuez des dilutions en série afin d’optimiser la quantité d’ADNc nécessaire pour détecter l’ARNm d’intérêt. Dans cette expérience, utilisez les dilutions suivantes d’ADNc dans de l’eau exempte de nucléases : 150 ng, 75 ng, 37,5 ng et 18,75 ng d’ADNc. Des amorces pour DNMT3a mentionnées précédemment ont été utilisées. Pour le cycle dPCR, utilisez le programme suivant : dénaturation initiale : 95 °C pendant 2 min suivie de 40 cycles de 95 °C - 15 s et 60 °C - 30 s.

Résultats

Le protocole décrit dans cet article fournit une méthode simple et abordable pour obtenir des informations moléculaires à partir de liquide lacrymal en utilisant des techniques couramment disponibles dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. De plus, le protocole peut être mis à l’échelle en utilisant des techniques très sensibles telles que ELISA pour la détection de l’activité enzymatique.

Après ces procédures, le rendement total en protéines était d’environ 3 à 4 μg/μL. L’analyse de la page SDS des extraits de protéines totales colorée à Coomassie révèle des modèles d’expression des protéines dans la rétine totale et les déchirures (Figure 2A).

L’ARN isolé avait un rapport d’absorption UV de 260/280 entre 1,9 et 2,0. Le rendement moyen était de 134,8 ng/μL. La qPCR a été réalisée à l’aide d’ensembles d’amorces pour un gène d’entretien (glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, GAPDH)3 et un gène de biomarqueur putatif (DNA-méthyl transférase 3a, DNMT3a)26. Un échantillon d’ADNc non dilué 1:1 (150 ng) a été utilisé.

Une analyse de la courbe de fusion a été effectuée et les taux de Ct ont été calculés dans le logiciel de qPCR. Toutes les expériences ont été réalisées en double. L’analyse a révélé des valeurs Ct comprises entre 20 et 24, ce qui correspond à une plage appropriée de la quantité de départ d’ARNm cible dans l’échantillon (Figure 2B). Cependant, l’analyse de la courbe de fusion de la figure 2C suggère la faible présence d’ARNm cible. Néanmoins, le gel d’agarose à 2 % a confirmé la présence d’amplicons à la taille attendue (figure 2D).

La dPCR a été réalisée à l’aide de la même paire d’ensembles d’amorces pour DNMT3a. La dilution des échantillons d’ADNc utilisés était de 1:1 (150 ng), 1:2 (75 ng), 1:4 (37,5 ng), 1:8 (18,75 ng). Toutes les expériences ont été réalisées en double. La dPCR a pu détecter de 1,33 copie/μL dans l’échantillon non dilué à 0,45 copie/μL dans l’échantillon dilué 8 fois (Figure 3A,3B). Ainsi, la dPCR a montré une sensibilité accrue à l’ARNm cible présent dans les larmes par rapport à la qPCR.

figure-results-1
Figure 1 : Schéma du protocole d’extraction des larmes chez la souris. (a) Collecte de larmes. Trois souris C57BL/6J âgées de 2 mois ont été utilisées. (B) La production de larmes a été induite pharmacologiquement par l’administration intrapéritonéale de pilocarpine. Photographie illustrant l’emplacement de la bande Schirmer. (c) Traitement des larmes. Les larmes ont ensuite été recueillies à l’aide de bandes Schirmer pendant 10 minutes et transférées dans des tubes de microcentrifugation. (D) Les larmes recueillies dans les bandelettes de Schirmer ont été centrifugées avec de l’eau stérile et des inhibiteurs de protéase ou simplement de l’eau stérile. (E, F) Ces tubes ont été perforés au fond et transférés par la suite dans un nouveau tube stérilisé de 1,5 mL pour faciliter l’évasion du liquide. (G, H) Les larmes sont recueillies dans le tube de 1,5 mL. (I) Photographie représentative de la procédure de collecte des larmes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Analyse en aval d’un film lacrymal pour des applications moléculaires. (A) SDS-PAGE de larmes de souris et d’un extrait de protéine rétinienne. MW : Marqueur de poids moléculaire. voie 1 : Profils protéiques de la rétine (30 μg) ; Voie 2 : profils protéiques des larmes (30 μg). (B) qPCR pour GAPDH et DNMT3a dans les larmes de souris. Les moyennes CT et ΔCT sont indiquées dans le tableau 2. (C) Analyse de la courbe de fusion pour les produits PCR DNMT3a et GAPDH. L’axe des y représente le taux de variation de la fluorescence dans la réaction d’amplification (dF/dT), et l’axe des x représente la température en °C (D) Analyse de l’amplicon de la PCR dans une électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % contenant 0,5 μg/mL de bromure d’éthidium. Voie M : 1 kb Plus Échelle DNA. Voies 1 et 2 : amplicon PCR GAPDH et DNMT3a, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : PCR numérique (dPCR) pour l’expression de DNMT3a dans les larmes de souris. (A) Les résultats de la dPCR sont affichés sous forme de nuage de points 1D montrant en points bleus les copies de transcription de DNMT3a. Les points noirs sont des partitions sans les copies de transcription DNMT3a présentes. (B) Une série de dilution d’ADNc a été générée pour déterminer la concentration optimale pour quantifier les copies de transcrits DNMT3a. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom du matériauDescription
10% SDS GelPour un gel de séparation : 3,8 mL de H2O distillé ; 2,6 mL de Tris ; pH 8,8 ; 1,5 M 3,4 mL d’acrylamide ; 100 μL 10% SDS ; 100 μL 10 % APS ; 4 μL TEMED.
Pour un gel collecteur : 2,72 mL de H2O distillé, 0,52 mL de Tris ; pH 6,8 ; 1,5 M 0,68 mL d’acrylamide, 40 μL 10 % SDS, 40 μL 10 % APS 4 μL TEMED.
Tampon d’électrophorèse250 mM de base Tris, 2 M de glycine, 1% SDS
Solution de colorationDissoudre les réactifs suivants dans 43 mL d’eau (à conserver à température ambiante dans une bouteille ambrée) : Coomassie 0,25 g ; acide acétique 7 mL ; méthanol 50 mL
Solution de décolorationDissoudre les réactifs suivants dans 63 mL d’eau (à conserver à température ambiante) : acide acétique 7 mL ; éthanol 30 mL

Tableau 1. Configurer pour SDS-Page.

Nom du gèneCT1CT2Moyenne avec SDΔCT
GAPDH20.1420.7320.44±0.17
DNMT3a24.5924.9724.78±0.074.35

Tableau 2. Valeurs Ct de DNMT3a et GAPDH dans les larmes de souris.

Discussion

Le liquide lacrymal est facilement accessible, et la détermination de biomarqueurs dans les larmes peut être utilisée comme une technique complémentaire réussie pour le diagnostic précoce de diverses maladies humaines27. Bien que l’analyse biochimique de la composition des larmes dans des modèles animaux expérimentaux complète cette approche et promette des progrès significatifs dans la compréhension de la base moléculaire des maladies, les données et les protocoles disponibles sont rares, ce qui nous a amenés à en développer un. La méthode décrite dans ce rapport est techniquement simple à réaliser et permet d’identifier de manière préliminaire l’expression différentielle de différentes molécules candidates associées à la maladie.

Le prélèvement des larmes peut être réalisé par diverses méthodes telles que les tubes capillaires et les bandelettes Schirmer16,17, les écouvillons28et les éponges29. La méthode de la bande de Schirmer a été préférée en raison de sa facilité d’accès, de ses capacités quantitatives, de son adaptabilité lors de la collecte des échantillons, de son coût et de sa simplicité d’extraction des composants de larmes pour le traitement en laboratoire. De plus, cette méthode est rentable, peu invasive et ne présente aucun risque de blessure ou d’endommagement de la cornée, grâce à la composition de la bande filtrante en papier16,17. Les étapes critiques de ce protocole comprennent la nécessité d’une stimulation pharmacologique de la production de larmes à l’aide de la pilocarpine et la sélection d’un tampon d’élution approprié.

La pilocarpine est un agoniste cholinergique qui se lie aux récepteurs muscariniques M3 et peut provoquer une stimulation pharmacologique des glandes exocrines, augmentant la production de larmes, la sécrétion salivaire et la miction. Bien que des études chez l’homme aient démontré que la stimulation lacrymale ne modifie pas l’osmolarité du liquide collecté30, elle influence clairement les profils protéiques31. L’utilisation de la pilocarpine comme stimulateur pharmacologique cholinergique des glandes exocrines et activateur de sécrétion lacrymale a été rapportée avec succès chez le lapin et la souris 19,32,33, mais l’effet de la stimulation sur la teneur en protéines n’a pas été évalué. Pour éviter cette limitation et permettre une comparaison précise des profils de déchirure entre les conditions expérimentales, il est crucial de prendre en compte les paramètres de collecte spécifiques. De même, l’introduction d’une étape de rinçage avant le prélèvement des larmes pourrait être bénéfique pour éviter une contamination préalable de la surface de l’œil. Dans ce protocole, une concentration de 30 mg/kg de pilocarpine a été utilisée13. Comme les souris sont restées immobiles et calmes après l’injection de ce médicament, les larmes ont été recueillies sans aucune anesthésie, ce qui a facilité le prélèvement d’échantillons.

Le choix d’un tampon d’élution approprié est étroitement lié à la méthode choisie pour analyser la composition biochimique d’un échantillon lacrymal et le taux de récupération de la matière biologique de la bandelette. Par exemple, dans une étude comparative portant sur la rétention des protéines des bandelettes de Schirmer chez les patients, il a été établi qu’un tampon comprenant 100 mM de bicarbonate d’ammonium et 0,25 % de Nonidet P40 (NP40) donnait des résultats supérieurs pour les applications de protéomique ou d’analyse ELISA multiplex17. Entre nos mains, l’utilisation d’eau stérile s’est avérée suffisante pour visualiser les extraits de protéines totales dans SDS-PAGE et pour détecter l’ARNm des gènes d’intérêt par PCR.

Pour évaluer la présence de DNMT3a et d’ARNm GAPDH dans les larmes de souris, nous avons comparé les performances de la qPCR et de la dPCR. La présence de dimères d’amorce observée dans la courbe de fusion de la qPCR est attribuée à la faible abondance du transcrit DNMT3a . Comme démontré, la dPCR a une sensibilité et une efficacité nettement supérieures pour détecter l’ARNm cible dans ces échantillons non dilués et dilués. Cette capacité de détection précise fait de la dPCR la méthode privilégiée pour l’analyse des larmes chez la souris, offrant aux chercheurs et aux cliniciens un outil fiable pour les études futures et les applications cliniques potentielles.

La mise au point d’un protocole normalisé pour la collecte d’échantillons lacrymaux dans des modèles animaux représente une avancée significative dans la recherche. Ce protocole facilite non seulement la collecte systématique et précise d’échantillons lacrymaux, mais ouvre également un large éventail de possibilités pour leur application dans divers domaines d’étude. La possibilité d’obtenir des échantillons de larmes à partir de modèles animaux permet d’étudier un large éventail de maladies et d’affections, ainsi que d’explorer de nouveaux biomarqueurs et des thérapies potentielles. De plus, l’établissement d’un protocole standardisé favorise la reproductibilité des résultats entre différentes études et laboratoires, contribuant ainsi à la validité et à la fiabilité de la recherche. En fin de compte, cette avancée dans la méthodologie de collecte d’échantillons de larmes dans des modèles animaux a le potentiel de conduire à d’importantes découvertes et d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de diverses maladies, ouvrant ainsi de nouvelles voies pour le diagnostic, le traitement et la prévention.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par VELUX STIFTUNG [projet 1852] à M.L. et des bourses de troisième cycle de CONAHCYT à M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) et A.M.F (CVU 1317418). Sincère gratitude à tous les membres du laboratoire, du Centro de Investigación sobre el Envejecimiento et du Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) pour leurs contributions à ces discussions stimulantes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-mercaptoéthanolGibco1985023
2x tampon LaemmliBio-Rad16-0737
Acide acétiqueQuimica Meyer64-19-7
AcrylamideSigma-AldrichA4058
Réactif BradfordSigma-AldrichRéf. B6916
ChloroformeSigma-Aldrich1003045143
Coomassie Bleu R 250Biologique des États-Unis6104-59-2
ÉthanolQuimica Rique64-17-5
GeneRuler 1kb plus Échelle d’ADNThermofisher scientifiqueRéférence SM1331
GlycérolBiologique des États-UnisG8145
GlycineSANTA CRUZSC- 29096
GlycogèneRoche10901393001
HclQuimica Rique7647-01-0
Alcool isopropyliqueQuimica Rique67-63-0
MéthanolQuimica Meyer67-56-1
Micro tubes 1,5 mlAxygenMCT-150-C
Micro tubes 600 & micro ; lAxygenRéférence : MCT-060-C
NaClSigma-AldrichS3014
Tubes PCR & couperNovasbioRéférence PCR 0104
PilocarpineSigma-AldrichP6503-10g
Inhibiteur de la protéaseRoche11873580001
Kit PCR QIAcuity EvaGreen (5mL)Qiagen250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24 puits (10)Qiagen250001
Real qPlus 2x Master Mix VertAmpliqonA323402
Kit de synthèse d’ADNc RevertAid First StradThermofisher scientifiqueK1622
Bandelettes de test de SchirmerLaboratorio SantgarSANT1553
SDSSigma-AldrichL3771
TEMEDSigma aldrich102560430
Réactif TRISigma-AldrichT9424-200MLsolution monophasique d’isothiocyanate de phénol et de guanidinium
TrisBiologique des États-UnisRéf. T8650
Base TrisChem CruzSC-3715A

Références

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101(2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679(2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301(2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363(2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254(2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon. , Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023).
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15(2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), Maywood. 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886(2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

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