Extraction liquide-liquide en continu d’acides gras à chaîne moyenne à partir d’un bouillon de fermentation à l’aide de membranes à fibres creuses

Résumé

Un système d’extraction liquide-liquide (LLE) impliquant des membranes à fibres creuses a été développé pour extraire en continu et sélectivement les acides gras à chaîne moyenne (AGCM) du bouillon de fermentation. Le système LLE permet d’obtenir des spécificités élevées de MCFA à partir de bouillons contenant des acides gras à chaîne courte et des alcools. De plus, les AGCM sont concentrés dans une solution de décapage pour faciliter la récupération du produit.

Résumé

Les acides gras à chaîne moyenne (AGCM ; longueurs de carbone : C6-C12) sont des produits chimiques de plateforme de grande valeur qui servent à une variété d’applications industrielles, notamment les antimicrobiens écologiques, les ingrédients alimentaires, les additifs pour l’alimentation animale, les cosmétiques, les parfums, les produits pharmaceutiques et les lipides structurés. Actuellement, la plupart des AGCM sont produits à partir d’huile de palme et de noix de coco originaires d’Asie du Sud-Est et d’Amérique du Sud. L’approche conventionnelle de la récolte des fruits de palmier et de noix de coco cause des dommages écologiques considérables dans ces régions. Par conséquent, les chercheurs élaborent des approches biologiques (p. ex., fermentations de précision et en culture libre) pour générer des AGCM de manière plus durable en utilisant des substrats de faible valeur (p. ex., méthanol, lactate) ou des déchets organiques comme matière première. L’allongement microbien en chaîne (EC) est une plate-forme de fermentation en culture libre à maturation rapide qui convertit les acides gras à chaîne courte (AGCC ; longueurs de carbone : C1-C5) en un sous-ensemble de ces AGCM à des taux pertinents pour l’industrie. Cependant, l’extraction in situ continue des MCFA est nécessaire non seulement pour éviter l’inhibition du produit, mais aussi pour faciliter la récupération des MCFA sous une forme pure et utilisable. L’extraction liquide-liquide (ELL) à l’aide de membranes à fibres creuses et de mélanges d’extracteurs ciblés s’est avérée être une approche robuste pour extraire sélectivement les produits AGCM à partir de bouillons de fermentation contenant des AGCC. Ici, l’application de LLE pour l’élimination continue des AGCM est démontrée en utilisant le CE comme système de fermentation de référence et l’oxyde de trioctylphosphine à 3 % (p/v) dans l’huile minérale comme système d’extraction. Les acides gras allant de l’acide valérique (C5) à l’acide caprylique (C8) sont éliminés sélectivement des bouillons contenant des AGCC et concentrés à des titres élevés dans une solution de décapage alcalin semi-batch pour le traitement en aval.

Introduction

Les acides gras à chaîne moyenne (AGCM) sont des produits chimiques de grande valeur comprenant des longueurs de chaîne allant de six (C6) à douze (C12) carbones. Les AGCM ont des applications industrielles dans les aliments, les aliments pour animaux, les produits pharmaceutiques, les cosmétiques, les parfums, les agents antimicrobiens et la synthèse chimique ^1,2,3. Actuellement, la plupart des AGCM proviennent d’huile de palme et de noix de coco provenant d’Asie du Sud-Est et d’Amérique du Sud ^4,5. Les graves dommages écologiques associés à la production d’huile de palme et de noix de coco sont bien reconnus par les parties prenantes et le grand public. Les chercheurs explorent des approches biologiques (p. ex., fermentations de précision et en culture libre) pour générer des AGCM de manière plus durable en utilisant des substrats de faible valeur ou des déchets organiques comme matière première ^6,7. Une façon durable de produire des AGCM consiste à recycler les flux de déchets organiques à l’aide d’un processus appelé allongement de la chaîne microbienne (EC). Ce bioprocessus de fermentation secondaire est similaire à la digestion anaérobie en ce sens qu’il exploite la polyvalence des microbiomes anaérobies en culture libre, mais au lieu de favoriser la formation de méthane, les systèmes CE suppriment délibérément la voie méthanogène. Dans un microbiome où le carbone ne peut pas être réduit au maximum en CH₄, ni H₂ maintenu en dessous ^{de 10-4} atm par des archées consommatrices d’hydrogène, la réaction de β-oxydation qui décomposerait normalement les carboxylates à chaîne plus longue en acétate (par exemple, C6 → C4 → C2) peut être inversée (par exemple, C2 → C4 → C6, etc.), tant qu’un composé réduit (c’est-à-dire donneur d’électrons) tels que l’éthanol ou le lactate est fourni⁸. Dans ce métabolisme, la molécule d’acide gras en cours d’élongation sert d’accepteur d’électrons. Ainsi, au lieu de générer un produit avec une longueur de carbone de un (CH₄) comme dans la digestion anaérobie, le procédé CE génère des AGCM avec des longueurs de carbone allant de six à huit. Un marché vaste et en croissance est prêt à recevoir ces produits chimiques de plateforme verte. Cependant, jusqu’à présent, il n’a pas été démontré que le procédé CE produisait des AGCM dont la longueur du carbone dépassait huit carbones à des taux appréciables.

L’extraction efficace de ces AGCM est importante non seulement pour la récupération du produit souhaité, mais aussi pour prévenir l’inhibition du produit et pousser le microbiome à produire plus d’AGCM¹. À mesure que la concentration d’AGCM augmente, le métabolisme des AGCM est inhibé et devient moins favorable sur le plan thermodynamique. En supprimant les MCFA en continu, les cadences de production sont maintenues. De plus, comme les AGCC servent de sous-structures pour le processus d’allongement de la chaîne, ils ne doivent pas être retirés du bouillon de fermentation. Les mélanges d’extracteurs ciblés doivent extraire sélectivement les produits à base d’AGCM des bouillons de fermentation contenant des AGCC.

Ici, une approche robuste et pratique est démontrée pour extraire en continu les AGCM d’un bouillon de fermentation contenant des AGCC à l’aide d’un système d’extraction liquide-liquide (LLE) comprenant un extracteur à membrane à fibres creuses hydrophobe en polypropylène, une solution d’extraction organique sélective (oxyde de trioctylphosphine [TOPO]^9,10,11), et un extracteur à membrane à fibres creuses vers l’arrière. Un filtre de protection cellulaire en amont du système LLE est installé pour retenir la biomasse et atténuer l’encrassement membranaire. Les AGCM sont extraits en aval, sous leur forme protonée, du bouillon de fermentation aqueuse (généralement avec un point de consigne de pH <5,8) dans une solution d’extraction organique (c’est-à-dire 3 % de TOPO (p/v) dans l’huile minérale), puis extraits en arrière dans une solution de stripping alcaline (pH = 9), où ils se déprotonent et se concentrent à des titres élevés pour le traitement en aval. Les points de consigne de pH particuliers sont essentiels car ils dictent le gradient de concentration entre chaque phase du processus LED, assurant un transfert net des AGCM du bouillon de fermentation à la solution de stripping. Les LLE utilisant des membranes d’extraction avant et arrière permettent d’obtenir des taux d’extraction élevés tout en minimisant la co-extraction des alcools et des AGCC. L’adjuvant solvant organique, TOPO, permet la formation de complexes d’AGCM. Ces complexes sont plus solubles dans les phases organiques que dans l’eau, ce qui entraîne une sélectivité élevée des AGCM. Le processus de LLE évite également les nombreux inconvénients associés aux approches existantes, qui seront abordés dans la section Discussion. La mise en œuvre à long terme de cette approche LLE a été démontrée dans de multiples études ^9,10,11. Bien que cette approche soit particulièrement adaptée aux applications impliquant la production d’AGCM par allongement de la chaîne microbienne, elle est également utile dans d’autres applications qui nécessitent une séparation sélective de composés possédant des propriétés chimiques similaires, car le système d’extraction organique peut être personnalisé.

Protocole

Les réactifs, les consommables et l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Construction et intégration du bioréacteur et du système d’extraction liquide-liquide

1. Préparez la solution d’extraction en phase organique et le réservoir.
   1. Préparez 2 L de solution d’extraction en phase organique en dissolvant 60 g d’oxyde de trioctylphosphine (TOPO) dans de l’huile minérale à l’aide d’une plaque d’agitation magnétique et d’un agitateur.
   2. Ajouter la solution d’extraction dans un réservoir en verre de 2 L (c’est-à-dire une bouteille Schott).
   3. Placez le réservoir sur une plaque d’agitation magnétique (Figure 1A). La vitesse de mélange recommandée pendant le fonctionnement continu de la LLE est de 150 à 250 tr/min.
2. Préparez un bouchon à trois orifices pour le réservoir de solution d’extraction.
   1. Fixez un tube plongeur au premier orifice pour servir d’orifice de sortie fournissant la solution d’extraction à la membrane d’extraction directe (FEM) (Figure 1B).
   2. Fixez un deuxième orifice qui servira d’orifice de retour pour la solution d’extraction à partir de la membrane d’extraction arrière (BEM) (Figure 1C).
   3. Ajoutez un troisième orifice, ouvert à l’atmosphère, pour amortir les fluctuations de pression causées par la pompe à membrane.
3. Connectez la pompe à membrane aux membranes d’extraction.
   1. Placez un entraînement de pompe à vitesse variable de 100 tr/min équipé d’une tête de pompe à membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) à côté du réservoir (Figure 1D).
   2. Raccorder l’orifice de sortie du réservoir de solution d’extraction (Figure 1A) à l’entrée de la pompe à membrane, puis la sortie de la pompe à membrane à l’entrée côté coque à la base de la FEM (Figure 1B) à l’aide de la tubulure flexible de la pompe (par exemple, taille 16, 18).
   3. Raccorder la sortie côté coque en haut du MEF à l’entrée côté coque à la base du MEB (figure 1C) à l’aide d’un tube de pompe flexible (p. ex., taille 18).
   4. Raccorder la sortie côté coquille située dans la partie supérieure du BEM à l’orifice de retour du réservoir de solution d’extraction (figure 1A) à l’aide d’un tube de pompe flexible (p. ex., taille 16, 18).
      REMARQUE : Ce composant du système transfère les AGCM extraits du bouillon de fermentation dans le MEF vers la solution de stripping dans le MEB.
4. Préparez la solution de stripping en phase aqueuse et le réservoir.
   1. Préparez 3,25 L de solution de stripping en phase aqueuse en prenant une solution d’acide borique 0,5 M et en l’ajustant à pH 9 à l’aide de NaOH.
   2. Versez la solution dans un réservoir en verre de 3,5 L avec un barreau d’agitation magnétique.
   3. Placez le réservoir sur une plaque d’agitation magnétique (Figure 1E).
5. Préparez un capuchon à quatre orifices pour le réservoir de solution de stripping.
   1. Fixez un tube plongeur au premier orifice pour servir d’orifice de sortie fournissant une solution de décapage au BEM.
   2. Fixer un deuxième orifice comprenant un raccord en Y pour (1) servir d’orifice de retour de la solution d’extraction du BEM et (2) servir de flux d’entraînement pour les ajouts de NaOH à partir du système de contrôle du pH.
   3. Ajouter un troisième orifice, ouvert à l’atmosphère, pour tenir compte de l’augmentation de volume causée par les ajouts de NaOH et l’accumulation de MCFA.
   4. Fournir un quatrième port pour accueillir la sonde de pH du contrôleur de pH.
6. Installez un système de contrôle du pH au niveau du réservoir de solution de stripping.
   1. Intégrer un système de contrôle du pH avec un point de consigne de pH 9 avec le réservoir de solution de stripping (figure 1F). Utilisez du NaOH 5 M comme solution de base avec le contrôleur de pH pour contrer les AGCM collectés.
   2. Insérez la sonde de pH dans l’orifice du réservoir de solution de stripping et suspendez-la dans la solution de stripping.
      REMARQUE : Ce système de contrôle du pH ne nécessite pas de solution acide.
7. Préparez les ports de connexion du bioréacteur.
   1. Désignez deux orifices, un orifice de sortie et un orifice de retour, au bioréacteur pour le raccordement au système d’extraction liquide-liquide (LLE) (Figure 1G,H).
   2. Connectez un tube plongeur à l’orifice de sortie. Le bouillon riche en MCFA sera pompé du bioréacteur par l’orifice de sortie dans le système LEL.
      REMARQUE : Le bouillon pénètre d’abord dans le filtre à membrane à fibres creuses avant les membranes d’extraction pour éliminer les cellules et autres solides afin d’éviter l’encrassement.
   3. Insérez un raccord en T au niveau de l’orifice de retour pour recevoir : (1) le bouillon appauvri en MCFA recyclé à partir du MEF et (2) le rétentat contenant des cellules du filtre à membrane à fibres creuses.
8. Installez le filtre à membrane à fibres creuses.
   1. Placez un entraînement de pompe à vitesse variable de 300 tr/min à côté du bioréacteur (Figure 1I).
   2. Fixez la membrane hydrophile à fibres creuses (Figure 1J) à un support annulaire au-dessus de la pompe péristaltique.
   3. Empilez deux têtes de pompe péristaltiques sur l’entraînement de la pompe, grande (par exemple, taille 17) et petite (par exemple, taille 16).
      REMARQUE : La plus grande tête de pompe est connectée au filtre à membrane à fibres creuses pour garantir que le débit de perméat est supérieur au débit alimentant le FEM. Si ce n’était pas le cas, le perméat serait consommé plus rapidement qu’il n’est produit, ce qui provoquerait la formation d’un vide.
   4. Raccordez l’orifice de sortie du bioréacteur à la grande entrée de la tête de pompe à l’aide d’un tube de pompe flexible (par exemple, taille 17).
   5. Connectez la grande sortie de la tête de pompe au filtre à membrane hydrophile à fibres creuses à l’entrée côté tube à la base du filtre à l’aide d’un tube de pompe flexible (par exemple, taille 17).
   6. Boucher l’orifice supérieur du côté de la coque du filtre pour éviter l’afflux d’air.
      REMARQUE :Le bouillon riche en MCFA (contenant des cellules) s’écoulera à travers les tubes à fibres creuses et retournera dans le bioréacteur. Le bouillon clair (sans cellules) passera à travers la membrane en polyéthersulfone (PES) hydrophile de 0,2 μm et s’accumulera du côté de la coque du filtre.
9. Connectez la FEM.
   1. Fixez le premier module à membrane à fibres creuses (FEM) hydrophobe sur un support annulaire au-dessus de la pompe (Figure 1B).
   2. Raccorder le filtre à membrane hydrophile à fibres creuses (figure 1J) à la sortie côté coque à l’entrée de la petite tête de pompe à l’aide d’un tube de pompe flexible (p. ex., taille 16, 18).
   3. Connectez la petite sortie de la tête de pompe au FEM à l’entrée côté tube à la base du module à l’aide d’un tube de pompe flexible (par exemple, taille 16, 18).
   4. Connectez le manomètre (Figure 1K) et la vanne de restriction de débit (Figure 1L) à la sortie côté tube du FEM à l’aide d’un raccord d’accouplement et d’un raccord en T.
   5. Raccordez la sortie du côté tube du MEF à l’orifice de retour du bioréacteur à l’aide d’un tube de pompe flexible (p. ex., taille 18).
      REMARQUE :Ce composant du système transfère les AGCM du bouillon de fermentation clair à la solution d’extraction, puis renvoie le bouillon clair dans le bioréacteur.
10. Connectez le BEM.
    1. Placez un entraînement de pompe à vitesse variable de 300 tr/min équipé d’une tête de pompe péristaltique (p. ex., taille 16) à côté du bioréacteur (figure 1M).
    2. Fixez le deuxième module de membrane hydrophobe à fibres creuses à un support annulaire au-dessus de la pompe péristaltique (Figure 1C).
    3. Raccorder l’orifice de sortie du réservoir de solution de stripping à l’entrée de la pompe péristaltique et la sortie de la pompe à l’entrée côté tube à la base du BEM à l’aide d’un tube de pompe flexible (par exemple, taille 16, 18).
    4. Connectez le manomètre et la vanne de restriction de débit à la sortie côté tube du BEM à l’aide d’un raccord et d’un raccord en T.
    5. Raccorder la sortie côté tube en haut du BEM à l’orifice de retour du réservoir de solution de stripping à l’aide d’un tube de pompe flexible (par exemple, taille 16, 18).
       REMARQUE : Ce composant du système transfère les AGCM de la solution d’extraction à la solution de décapage dans le BEM, puis renvoie la solution de stripping dans son réservoir.

2. Lancement du fonctionnement du système d’extraction liquide-liquide

1. Amorcez et faites circuler les lignes de phase aqueuse.
   1. Mettre en marche la pompe péristaltique de solution de décapage/BEM (Figure 1M) et régler la vitesse de la pompe pour obtenir un débit constant entre 25 et 250 mL·^min-1. Le BEM peut accueillir une gamme de débits relativement large. Commencez par un débit élevé pour assurer une extraction suffisante du MCFA. Le débit peut être réduit de manière incrémentielle plus tard pendant le fonctionnement pour prolonger la durée de vie de l’équipement de pompe et des tuyaux.
      REMARQUE : La vitesse d’écoulement ne doit pas être si faible qu’elle permette une accumulation d’AGCM dans le bouillon du bioréacteur (voir Résultats représentatifs).
   2. Fermez lentement la soupape à pointeau à la sortie de la coque du BEM (Figure 1C) pour établir une contre-pression de ~5 psig.
   3. Mettez en marche la pompe péristaltique du bioréacteur/FEM (Figure 1I) et réglez la vitesse de la pompe pour obtenir un débit constant entre 25 et 250 mL·^min-1. Le FEM peut s’adapter à une gamme relativement large de débits. Commencez par un débit élevé pour assurer une extraction suffisante du MCFA. Le débit peut être réduit de manière incrémentielle plus tard pendant le fonctionnement pour prolonger la durée de vie de l’équipement de pompe et des tuyaux.
      REMARQUE : La vitesse d’écoulement ne doit pas être si faible qu’elle permette une accumulation d’AGCM dans le bouillon du bioréacteur (voir la section Résultats représentatifs).
   4. Fermez lentement la soupape à pointeau à la sortie du FEM côté coque (Figure 1B) pour établir une contre-pression de ~5 psig.
   5. Vérifiez visuellement les conduites de retour pour vous assurer qu’elles sont constantes et qu’elles ont été amorcées.
   6. Vérifiez que le bouillon clair est recueilli à l’intérieur du côté de la coque du filtre à membrane à fibres creuses (Figure 1J).
      REMARQUE : Il faudra plusieurs heures pour remplir le FEM et établir un flux constant entre le filtre à membrane à fibres creuses et le FEM. La vitesse d’écoulement ne doit pas être si faible qu’elle permette une accumulation d’AGCM dans le bouillon du bioréacteur (voir la section Résultats représentatifs).
2. Amorcez et faites circuler les lignes de phase organique.
   1. Mettre en marche la pompe à membrane de la solution d’extraction en phase organique (Figure 1D) et régler la vitesse de la pompe pour obtenir un débit constant entre 5,0 et 50 mL·^min-1. Commencez par un débit modérément faible pour minimiser la pression dans l’extraction en phase organique et minimiser le risque de croisement. Si nécessaire, le débit peut être augmenté progressivement plus tard pendant le fonctionnement pour améliorer l’efficacité de l’extraction
   2. Attendez que le FEM et le BEM soient remplis.
   3. Vérifiez visuellement l’orifice de retour au niveau du réservoir de solution d’extraction pour garantir un débit constant.
   4. Vérifiez qu’aucune solution de phase organique ne passe dans la solution de stripping ou les conduites de bouillon de fermentation. En cas de croisement, de petites gouttelettes de la phase organique sont visibles. Si cela se produit, diminuez la vitesse de la pompe à membrane et augmentez légèrement la contre-pression au niveau du FEM ou du BEM, selon le cas. Ne dépassez pas 10 psig.
      REMARQUE : Pour éviter le croisement de la membrane, il est important d’établir le débit et la contre-pression dans les lignes de phase aqueuse avant d’amorcer les lignes de phase organique.
3. Extraire en continu les AGCM du bioréacteur.
   1. Le système LLE doit être pleinement opérationnel. Laissez le système fonctionner en continu pendant le fonctionnement du bioréacteur.
   2. Mesurer quotidiennement les concentrations de MCFA dans le bioréacteur pour assurer une extraction suffisante des MCFA. Si des concentrations élevées d’AGCM se produisent dans le bioréacteur, cela indique généralement des débits insuffisants du bouillon de fermentation à travers le FEM. Cela peut également indiquer une diminution du flux membranaire en raison de l’encrassement et de la nécessité d’un entretien (voir étape 2.6).
      REMARQUE : Les concentrations d’AGCC et d’AGCM peuvent être mesurées par chromatographie en phase gazeuse selon la méthode décrite par Ge et ^coll.11.
4. Surveillez l’accumulation de MCFA dans le réservoir de solution de décapage.
   1. Mesurez quotidiennement la concentration d’AGCM dans la solution de décapage pendant le cycle de lot. Le système LLE transfère en continu les MFCA du bioréacteur à la solution de stripping, augmentant ainsi la concentration de MCFA au fil du temps. Le processus peut fonctionner pendant de longues périodes pour produire des titres élevés de MCFA. Le taux de production volumétrique des AGCM (mM C·^L-1·^d-1) peut être estimé à l’aide de l’équation 1¹¹.
      REMARQUE : Taux de production volumétrique = (Éq. 1)
      où:
      C_b,n= concentration d’AGCM dans le bouillon de fermentation le jour n, mM C
      C_s,n= concentration d’AGCM dans la solution d’épandage le jour n, mM C
      C_s,n-1= Concentration d’AGCM dans la solution de décapage le jour n-1, mM C
      V_s,n= Volume de solution de décapage le jour n, L
      V_b,n= Volume du bouillon de fermentation (volume du bioréacteur) le jour n, L
      HRT_n = Temps de rétention hydraulique du bioréacteur aux jours n , j
      T_n= Jour n, j
      T_n-1= Jour n-1, j
   2. Pour assurer un fonctionnement stable, calculer périodiquement le taux d’extraction (mM C·^d-1) du système LLE en mesurant la variation de la concentration en AGCM entre les points de mesure et en appliquant l’équation 2¹¹.
      REMARQUE : (Éq. 2)
      où:
      C_s,n= concentration d’AGCM dans la solution d’épandage le jour n, mM C
      C_s,n-1= Concentration d’AGCM dans la solution de décapage le jour n-1, mM C
      V_s,n= Volume de solution de décapage le jour n, L
      T_n= Jour n, j
      T_n-1= Jour n-1, j
   3. Pour maintenir des taux de transfert adéquats à partir de la solution d’extraction, remplacez la solution de décapage par un lot frais avant que la concentration d’AGCM n’atteigne 80 % de saturation.
      REMARQUE : La solubilité maximale de l’acide n-caproïque est de 10,3 g· ^L-1 à 25 °C, et celle de l’acide n-caprylique est de 0,67 g· ^L-1 à 25 °C.
5. Remplacez la solution de décapage.
   1. Éteignez la pompe à membrane (Figure 1D).
   2. Arrêtez la pompe péristaltique de la solution de stripping (Figure 1M).
   3. À l’aide de colliers de serrage, fixez l’entrée côté tube et la sortie côté tube du BEM.
   4. Éteignez le système de contrôle du pH et retirez le bouchon du réservoir de solution de stripping tout en gardant les raccords de port attachés (si possible).
   5. Retirez le réservoir de solution de stripping (Figure 1E).
   6. Remplacer le réservoir de solution d’extraction par un nouveau lot de solution aqueuse d’acide borique 0,5 M ajustée au pH 9 à l’aide de NaOH (voir étape 1.4). Refixez le capuchon sur le réservoir.
   7. Retirez les colliers de serrage de l’entrée côté tube et de la sortie côté tube du BEM.
   8. Mettre en marche la pompe péristaltique de la solution de stripping (Figure 1M), puis la pompe à membrane (Figure 1D). Le fonctionnement du système est maintenant rétabli.
6. Entretien des membranes.
   1. Retirez le FEM et le BEM du système LLE une fois tous les trois mois pour le nettoyage. Trois mois est une fréquence de nettoyage estimée prudente.
      REMARQUE : Selon l’application, les utilisateurs peuvent nettoyer les membranes plus ou moins fréquemment. Les signes d’une diminution des performances de la membrane sont décrits dans la section Résultats représentatifs. Pendant l’entretien, les pompes et le régulateur de pH doivent être éteints. Les instructions de nettoyage doivent être fournies par le fabricant de la membrane.
   2. Vidangez les liquides du système LLE dans des récipients séparés, en commençant par les lignes de solution d’extraction en phase organique, puis les lignes de bouillon de fermentation et les lignes de solution de stripping.
   3. Une fois les membranes nettoyées et réinstallées, retournez les liquides dans leurs réservoirs respectifs.
   4. Relancez le système LLE en utilisant l’approche décrite ci-dessus (voir les étapes 2.1 et 2.2).

Résultats

Des résultats positifs de l’extraction des AGCM sont indiqués par une accumulation constante de produits d’AGCM dans la solution d’extraction en phase aqueuse alcaline (figure 2) et des concentrations relativement stables d’AGCM dans le bouillon de fermentation (données non présentées). La figure 2 illustre trois cycles de semi-dissémination de la solution de décapage pendant le fonctionnement continu de la LLE. Un cycle comprend deux étapes : l’étape de remplacement du lot (Figure 2 : Jour 24, Jour 46 et Jour 68) et l’étape d’accumulation d’AGCM (Figure 2 : Jours 0 à 24, Jours 25 à 46, Jours 47 à 68). Pour ce système particulier de fermentation et de LED, la durée du cycle était d’environ 20 à 24 jours. Cependant, la durée du cycle varie d’une application à l’autre, car elle dépend de plusieurs facteurs, notamment le volume du bioréacteur, la productivité biologique, le volume de la solution de décapage, la surface de la membrane à fibres creuses et les taux de recirculation des liquides dans le système LED. Au cours d’un cycle discontinu, la solution de stripping peut changer de couleur de clair à brun jaunâtre en raison de la co-extraction de faible niveau de divers petits acides organiques (par exemple, acide humique, acides fulviques) présents dans le bouillon de fermentation (Figure 3). Des résultats négatifs de l’extraction des AGCM sont indiqués par une accumulation lente de produits AGCM dans la solution de stripping et des concentrations élevées d’AGCM dans le bouillon de fermentation par rapport à la ligne de base préétablie.

La productivité biologique du caproate est généralement supérieure à celle du caprylate au cours de ces processus de fermentation ; Par conséquent, il est courant que le caproate s’accumule à un rythme plus rapide dans la solution de décapage par rapport au caprylate. De plus, il est normal que les AGCC, tels que l’acétate et le butyrate, s’accumulent dans la solution de décapage en quantités plus faibles, comme le montre la figure 2. Le TOPO dans l’huile minérale a une affinité plus élevée pour les AGCM que pour les AGCC, ce qui provoque une élimination sélective des AGCM. Des études menées par Saboe et ^al.12, Kaur et ^al.13, Carvajal-Arroyo et ^al.14 et Ge et ^al.11 ont démontré la grande sélectivité de TOPO pour les acides gras dans de multiples applications impliquant des solutions aqueuses. La figure 4 illustre le rapport de répartition entre les AGCM et les AGCC au cours du deuxième cycle de lots. On peut s’attendre à des rapports de partitionnement MCFA :SCFA supérieurs à 40:1 plusieurs jours après le début d’un cycle de lots. Le rapport de partitionnement MCFA :SCFA se stabilise lorsque le processus d’extraction s’approche d’un état pseudo-stable. S’il n’est pas possible d’atteindre des ratios >40 après plusieurs jours, cela suggère que l’agent d’extraction TOPO s’est dégradé ou élué. Si cela se produit, une nouvelle solution d’extraction doit être préparée (voir étape 1.1). Si le rapport diminue après la phase de plateau, cela suggère que les AGCM se sont accumulés au-delà de 80 % de leur point de saturation. Si cela se produit, une nouvelle solution de décapage doit être préparée (voir étape 1.4)

Une faible efficacité d’extraction des AGCM peut être causée par des débits insuffisants dans le système LED. Dans la figure 5, la vitesse de pompage a été réduite dans la conduite de circulation du bouillon de fermentation et de la solution de stripping pour illustrer l’impact de la diminution des taux de recirculation du liquide sur l’efficacité de l’extraction des AGCM. L’efficacité d’extraction est définie comme le pourcentage d’AGCM extraits dans la solution de décapage par rapport à l’ensemble des AGCM produits par le bioréacteur plus les AGCM extraits par le LEL. On peut s’attendre à des efficacités d’extraction supérieures à 85 % en fonctionnement normal (figure 5, jours 1 à 14). Lorsque la vitesse de la pompe est faible (Figure 5, jour 14), l’efficacité de l’extraction diminue en réponse. Lorsqu’une vitesse de pompe adéquate est rétablie, il peut s’écouler plusieurs jours avant que l’efficacité de l’extraction ne se rétablisse. Cela pourrait être causé par une réduction de la concentration à l’état d’équilibre des AGCM dans la solution d’extraction causée par la différence entre les taux d’extraction de la solution d’extraction (plus élevée) et celle du bouillon de fermentation (plus faible).

Plusieurs autres facteurs peuvent contribuer à la diminution de l’efficacité de l’extraction, notamment (1) l’encrassement de la membrane, (2) l’écoulement restreint du fluide à chaque étape du système LLE en raison de blocages, (3) la formation de poches de gaz dans les contacteurs à membrane, et (4) permettre aux concentrations de MCFA dans la solution de stripping d’approcher leurs points de saturation. L’encrassement de la membrane est indiqué par une réduction du flux de la membrane au fil du temps par rapport aux conditions initiales. Bien que la formation d’un biofilm soit peu probable dans la FEM, l’encrassement peut se produire en raison de l’accumulation de débris cellulaires et d’autres solides en suspension. De plus, alors que le BEM est aseptique, l’écoulement peut être obstrué en raison de la précipitation de sels d’acides gras dans le contacteur membranaire ou le tube au fil du temps. Cependant, l’entretien et le nettoyage réguliers des contacteurs à membrane (voir étape 2.6) devraient empêcher l’encrassement et les précipitations de sel de se développer. Des poches de gaz se forment parfois sur la face supérieure de la coque des contacteurs à membrane en raison d’un mauvais positionnement. Les contacteurs à membrane doivent être légèrement inclinés par rapport à la verticale pour s’assurer que l’orifice de sortie côté coque est au point le plus élevé, permettant à tout gaz qui se forme de s’échapper du contacteur. L’écoulement des fluides dans le système LLE est configuré pour s’écouler du bas vers le haut des entrepreneurs afin d’aider à éliminer les poches de gaz. Enfin, le transfert de MCFA de la solution d’extraction à la solution de stripping dans le BEM est diminué à des concentrations très élevées de MCFA dans la solution de stripping. Ce problème peut être résolu en remplaçant la solution de décapage plus fréquemment.

Figure 1 : Vue d’ensemble du système d’extraction liquide-liquide. Un rendu schématique montrant les principaux composants du système, les différents circuits de fluides et les directions d’écoulement. Les principaux composants du système sont étiquetés comme suit : (A) réservoir de solution d’extraction en phase organique, (B) membrane d’échange direct, (C) membrane d’échange arrière, (D) pompe à membrane de solution d’extraction, (E) réservoir de solution d’extraction en phase aqueuse, (F) système de contrôle du pH, (G) orifice de sortie du bioréacteur, (H) orifice de retour du bioréacteur, (I) pompe péristaltique à membrane d’échange direct et filtre à membrane à fibres creuses, (J) filtre à membrane à fibres creuses, (K) manomètre, (L) vanne à pointeau et (M) pompe péristaltique de solution de stripping. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Accumulation d’acides gras dans la solution de stripping. Données montrant les concentrations d’acides gras à chaîne courte et d’acides gras à chaîne moyenne au cours de trois cycles de lots de la solution de stripping pendant l’opération d’extraction liquide-liquide en continu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Changement de couleur de la solution de décapage après l’extraction. Une photographie montrant le changement de couleur de la solution de stripping en phase aqueuse avant (c’est-à-dire avant le lot) et après (c’est-à-dire après le lot) un cycle de lot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Rapports d’acides gras dans la solution de stripping. Données montrant le rapport entre les acides gras à chaîne moyenne et les acides gras à chaîne courte au cours d’un cycle discontinu de la solution de stripping lors d’une opération d’extraction liquide-liquide en continu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Effet des débits membranaires sur l’efficacité de l’extraction. Données montrant l’effet de débits insuffisants à travers la membrane d’échange avant et arrière sur l’efficacité d’extraction des acides gras à chaîne moyenne pendant le fonctionnement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les AGCM produits biologiquement se trouvent couramment dans des mélanges avec divers composés organiques, y compris les AGCC et les alcools². Par conséquent, un processus de séparation sélective est nécessaire pour les récupérer et les utiliser efficacement. Le système LLE développé ici extrait sélectivement les AGCM de ces mélanges en continu tout en conservant les AGCC et les alcools. Cette fonctionnalité rend le système LLE particulièrement adapté aux applications de fermentation, telles que l’allongement de la chaîne microbienne, où les MCFA, les AGCC et les alcools constituent les principaux métabolites⁸. Plus précisément, le système LLE permet au processus d’allongement de la chaîne de se poursuivre en éliminant les AGCM, empêchant ainsi l’inhibition du produit¹, tout en laissant les AGCC et les réactifs alcooliques dans le bouillon de fermentation pour une conversion biologique ultérieure. Le système LLE peut être personnalisé pour d’autres applications en modifiant la solution d’extraction spécifique. Par exemple, l’extraction continue des AGCC produits pendant la fermentation pourrait être réalisée à l’aide du même système LLE en retirant le TOPO du mélange de solution d’extraction.

Par conséquent, l’importance de la méthode LLE réside dans le fait qu’elle fournit une technique d’extraction d’AGCM plus robuste pour ces applications de biotraitement et de biotechnologie par rapport aux autres méthodes. L’extraction biphasique in situ avec des liquides non miscibles est une autre approche d’extraction des AGCM du bouillon^{de fermentation 15}. Cependant, cette approche est relativement inefficace. Des couches d’émulsion se forment entre la phase aqueuse (c’est-à-dire le bouillon de fermentation) et la phase organique, limitant considérablement les taux de transfert de masse. Un mélange minimal de fluides interfaciaux entre les couches de phase limite également le transfert de masse. Un autre inconvénient est que les cellules microbiennes sont en contact direct avec la phase organique, provoquant l’entraînement, l’inhibition et la mort cellulaire¹⁵. Enfin, l’extraction biphasique in situ nécessite un entretien fréquent pour éliminer et remplacer la phase organique.

L’application de taux de dilution élevés dans le bioréacteur est une autre méthode pour éviter l’inhibition du produit¹⁶. Des taux de dilution élevés permettent d’obtenir une productivité élevée en maintenant des concentrations élevées de réactifs dans le bioréacteur. Cependant, cette approche est désavantageuse parce qu’elle contribue à l’érosion de la biomasse, à la production de grands volumes d’effluents et à des pertes élevées de substrat (c.-à-d. AGCC et alcools), ce qui entraîne de faibles rendements. Ces inconvénients peuvent être atténués par le recyclage de la biomasse immobilisée et des effluents, mais ces interventions ajoutent à la complexité du système¹⁷. Enfin, la concentration des AGCM dans le flux de produits est diluée, ce qui rend les AGCM inefficaces et coûteux.

Une nouvelle approche d’extraction pourrait consister à distiller en continu les AGCM à l’aide d’une seule membrane d’extraction directe qui sépare physiquement les phases organique et aqueuse, retenant et protégeant ainsi la biomasse microbienne. Les AGCM seraient extraits de manière sélective dans la phase organique, puis distillés. Le raffinat pourrait être recyclé en continu vers la membrane d’extraction. La distillation continue, cependant, est techniquement difficile, en particulier en laboratoire, et peut entraîner la détérioration ou la perte de l’extractant chimique pendant le fonctionnement à long terme. La distillation peut également provoquer une dégradation thermique de la phase organique et des produits MCFA¹⁸.

Le processus LLE évite de nombreux inconvénients associés à ces approches alternatives en intégrant plusieurs caractéristiques et étapes de traitement critiques. Tout d’abord, le filtre à membrane hydrophile à fibres creuses a le double objectif de protéger les cellules de biomasse (les biocatalyseurs) de l’exposition à la solution d’extraction dans le FEB tout en fournissant un filtrat clair riche en MCFA qui réduit l’encrassement et l’accumulation de solides dans le système LLE. Deuxièmement, pour éviter le croisement de liquide, nous avons incorporé des vannes à pointeau pour créer une contre-pression du côté du tube de chaque contacteur à membrane. Cette précaution permet de maintenir un léger gradient de pression transmembranaire, empêchant les fuites indésirables du solvant organique hydrophobe du côté de la coque vers le côté du tube aqueux dans le FEM et le BEM. De plus, les flux de liquide sont configurés pour s’écouler en parallèle de la base vers le haut du FEM et du BEM afin d’éviter le piégeage des bulles de gaz qui pourraient s’accumuler à l’intérieur des modules à membrane, réduisant ainsi l’efficacité du transfert et provoquant un transfert. De plus, cette méthode utilise une pompe à membrane avec une tête de pompe en PTFE résistant aux produits chimiques pour pomper la solution d’extraction corrosive contenant des AGCM, protégeant ainsi le système de la corrosion et des pannes qui pourraient compromettre le processus d’extraction. Enfin, la solution d’extraction alcaline au pH contrôlé maintient un gradient de pH qui permet le transfert continu des AGCM à travers le système LLE à des taux élevés du bioréacteur au réservoir de la solution d’épandage, où les AGCM se déprotonent et s’accumulent à des titres élevés, facilitant ainsi la récupération du produit en aval.

Cette méthode LLE convient à l’extraction continue des AGCM à partir de bioréacteurs à l’échelle du laboratoire (jusqu’à un volume de travail de 6 L) et a été validée pour un fonctionnement à long terme dans plusieurs études 1,9,11,19. La méthode LLE peut également être appliquée pour des applications à plus grande échelle¹⁴ (c’est-à-dire des bioréacteurs à l’échelle pilote), mais nécessite des membranes à l’échelle proportionnelle et de l’équipement de traitement des fluides. Cependant, la méthode présente certaines limites, principalement dans le domaine de la maintenance et de la complexité du système. Étant donné que le processus est conçu pour fonctionner en continu, les modules à membrane et les pompes doivent être entretenus fréquemment, ce qui entraîne des temps d’arrêt considérables. Un autre inconvénient est que la solution de décapage nécessite des quantités relativement importantes de NaOH et d’acide borique. De plus, les MCFA sont corrosifs et entraînent la détérioration de certains composants du système LLE au fil du temps. Par exemple, les connecteurs en plastique et le boîtier de la membrane peuvent devenir cassants, nécessitant un remplacement pendant le fonctionnement. Enfin, le réseau de traitement des fluides du système LLE est complexe, impliquant de nombreux points de raccordement susceptibles de développer des fuites. La plupart de ces limitations et inconvénients, cependant, sont typiques des processus de séparation membranaire continue et doivent être attendus.

Dans l’ensemble, ce protocole LLE offre une approche robuste et efficace pour l’extraction sélective des MCFA, ce qui a des implications pour l’avancement de la recherche dans divers domaines. La méthode pourrait trouver de nombreuses applications pertinentes dans le domaine de la fermentation de précision pour la récupération in situ des produits métabolites extracellulaires pendant la fermentation. La LLE pourrait être une alternative moins coûteuse aux approches conventionnelles de traitement en aval (DSP), telles que la centrifugation post-traitement, la micro et l’ultrafiltration, ou les extractions par solvant effectuées par lots. En effet, le DSP représente souvent un facteur de coût majeur dans les processus de fermentation industrielle. L’extraction continue du produit à l’aide de LLE peut également permettre des fermentations continues, améliorant considérablement la productivité et l’efficacité des opérations par rapport aux approches conventionnelles par lots ou par lots fédéraux. De plus, des recherches futures pourraient étudier des milieux d’extraction autres que les solvants organiques, tels que les solvants eutectiques profonds ou les liquides ioniques. Enfin, le système LLE décrit dans ce protocole était destiné à des fins expérimentales en laboratoire ; Ainsi, il reste encore beaucoup à faire pour les études d’optimisation afin de réduire les besoins en énergie, la surface de la membrane et les rendements et taux d’extraction globaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouteille de média de 10 L	Duran	218018658
Bouteille de média de 3,5 L	Duran	218016957
Acide borique, 99,5 %,  ;	ThermoScientific (Fisher Scientific)	327132500
pompe à vitesse variable	MasterFlex (
L/S ; 300 tr/min	MasterFlex (VWR)	MFLX07528-20
	Thomas Scientific	C761Z18
Liqui-Cel 2,5x8 X50 Membrane CO2, boîtier PP joints toriques Viton (0,5-3 gpm (0,1-0,7 m3/h)), raccords FNPT 1/4 po	3M	LC-02508X50-G453
Agitateur magnétique, capacité de 20 L, 110 V	Cole-Parmer	EW-04661-29
Tube de pompe de précision Masterflex L/S, Tygon, taille 14	MasterFlex (VWR)	MFLX06402-14	La taille spécifique du tube dépendra de l’application.
Tube de pompe de précision Masterflex L/S, Tygon, taille 16	MasterFlex (VWR)	MFLX06402-16	La taille spécifique du tube dépendra de l’application.
Tube de pompe de précision Masterflex L/S, Tygon, taille 17	MasterFlex (VWR)	MFLX06402-17	La taille spécifique du tube dépend de l’application.
Tube de pompe de précision Masterflex L/S, Tygon, taille 18	MasterFlex (VWR)	MFLX06402-18	taille spécifique du tube dépend de l’application.
Tête de pompe standard MasterFlex L/S pour tubes de précision L/S 14, boîtier en polycarbonate, rotor CRS	MasterFlex (VWR)	MFLX07014-20	taille spécifique de la tête de pompe dépend de l’application.
Tête de pompe standard MasterFlex L/S pour tubes de précision L/S 14, boîtier en polycarbonate, rotor CRS	MasterFlex (VWR)	MFLX07014-20	taille spécifique de la tête de pompe dépend de l’application.
Tête de pompe standard MasterFlex L/S pour tubes de précision L/S 16, boîtier en polycarbonate, rotor CRS	MasterFlex (VWR)	MFLX07016-20	taille spécifique de la tête de pompe dépend de l’application.
Tête de pompe standard MasterFlex L/S pour tubes de précision L/S 17, boîtier en polycarbonate, rotor CRS	MasterFlex (VWR)	MFLX07017-20	taille spécifique de la tête de pompe dépend de l’application.
Tête de pompe standard MasterFlex L/S pour tubes de précision L/S 18, boîtier en polycarbonate, rotor CRS	MasterFlex (VWR)	MFLX07018-20	taille spécifique de la tête de pompe dépend de l’application.
Tête de pompe à membrane en PTFE MasterFlex, 10 à 100 mL/min	MasterFlex (VWR)	MFLX07090-62
Oakton 220 pH/ORP/Régulateur de température, 1/8 DIN	Spectrum Laboratory Products	664-12595-E1
Oakton 220 pH/ORP/Régulateur de température, 1/8 DIN	Spectrum Laboratory	Products 664-12595-E1
Oakton Adaptateur femelle BNC à fil dénudé	Spectrum Laboratory Produits	664-12592-E1
Sonde de pH avec connecteur BNC	ThermoScientific	10010-788	N’importe quelle sonde de pH avec connecteur BNC suffira.  ;
Vanne de réglage de débit de précision, polypropylène blanc, 1/4 NPT mâle x mâle	McMaster-Carr	7792K57
ProConnex  ; Kits de raccords - A	Repligen	ACPX-KT2-01N	Compatible avec le filtre hydrophile MINIKROS
Kits de raccords ProConnex - B	Repligen	ACPX-KT1-01N	Compatible avec le filtre hydrophile MINIKROS
Pastilles d’hydroxyde de sodium pour l’analyse	Sigma Aldrich	1.06498
Manomètre en acier inoxydable 0-60 psi Acier inoxydable 1/4 » NPT 2.5 » Face Dial	NA	XJ-219	N’importe quel manomètre comparable couvrant une plage de 0 à 60 psig suffira.  ;
Oxyde de trioctylphosphine (TOPO)  ;	Sigma-Aldrich	346187-100G