Systèmes AAV et modèles murins pour l’étude de l’expression ectopique de Neurod1 dans des cellules transduites à des moments subaigus et chroniques post-AVC ischémique

Résumé

Ce protocole décrit l’expression ectopique de Neurod1 à médiation virale après un AVC ischémique cortical. Neurod1 est administré (1) à l’aide du système AAV Cre-Flex chez des souris de type sauvage pendant la phase subaiguë post-AVC (7 jours) et (2) à l’aide d’un seul vecteur AAV chez des souris rapporteures conditionnelles pendant la phase chronique post-AVC (21 jours).

Résumé

L’expression ectopique de facteurs neurogènes in vivo est apparue comme une approche prometteuse pour remplacer les neurones perdus dans des modèles de maladies. L’utilisation de facteurs de transcription neuraux basic helix-loop-helix (bHLH) via des systèmes de particules pseudo-virales non propagateurs, y compris les rétrovirus, les lentivirus et les virus adéno-associés (AAV), a été largement rapportée. Pour les expériences in vivo , les AAV sont de plus en plus utilisés en raison de leur faible pathogénicité et de leur potentiel de traductibilité. Ce protocole décrit deux systèmes AAV pour étudier l’expression ectopique des facteurs de transcription dans les cellules transduites après un AVC ischémique. Dans les deux systèmes, l’expression de Neurod1 est contrôlée par le promoteur court GFAP (gfaABC(1)D), qui est régulé à la hausse dans les astrocytes réactifs après un AVC ainsi que dans les neurones endogènes lorsqu’il est combiné à l’expression du facteur neurogène. Dans le modèle d’AVC ischémique décrit, l’ischémie focale est induite par l’injection d’endothéline-1 (ET-1) dans le cortex moteur de souris, créant une lésion entourée d’astrocytes réactifs exprimant GFAP et de neurones survivants. Des injections intracérébrales d’AAV sont effectuées pour induire ectopiquement l’expression de Neurod1 dans les phases subaiguës (7 jours) et chroniques (21 jours) post-AVC. Dans les semaines qui suivent l’injection d’AAV, un nombre significativement plus élevé de neurones parmi les cellules transduites est identifié chez les souris exprimant extopiquement Neurod1 par rapport aux souris recevant des virus de contrôle AAV. Les stratégies basées sur l’AAV utilisées ont reproduit les résultats observés d’un nombre accru de neurones exprimant le gène rapporteur dans un modèle d’AVC cortical léger à modéré. Ce protocole établit une plate-forme standard pour explorer les effets de l’expression ectopique des facteurs de transcription délivrés avec des systèmes basés sur l’AAV, contribuant ainsi à la compréhension de l’expression des facteurs neurogènes dans le contexte de l’AVC.

Introduction

L’AVC est l’une des principales causes d’invalidité dans le monde¹. Un accident vasculaire cérébral se produit lorsque le flux sanguin vers le cerveau est perturbé. Cela peut se produire soit par un accident vasculaire cérébral hémorragique (~15 % des cas), où un vaisseau sanguin dans le cerveau éclate, soit par un accident vasculaire cérébral ischémique, où le flux sanguin vers le cerveau est bloqué¹. Les accidents vasculaires cérébraux ischémiques sont les plus fréquents et représentent ~85 % des cas d’accident vasculaire cérébral¹. Un accident vasculaire cérébral réduit l’apport de glucose et d’oxygène au cerveau, entraînant une mort rapide des cellules neuronales et une altération de la fonction neuronale.

L’AVC ischémique entraîne la perte de cellules en quelques minutes au cœur de la lésion par des mécanismes d’excitotoxicité, de stress oxydatif et nitrosatif, de dérégulation calcique, de dépolarisation de l’étalement cortical, d’œdème, de perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et d’inflammation ^2,3. Les cellules des régions péri-infarctus subissent une mort cellulaire apoptotique dans les heures et les jours qui suivent l’AVC⁴. L’environnement péri-infarctus est exposé à des signaux pro- et anti-inflammatoires qui conduisent à l’activation de la microglie et des astrocytes (astrocytes « réactifs »), qui jouent divers rôles après une blessure 5,6,7,8. Les astrocytes réactifs subissent un certain nombre de changements phénotypiques qui comprennent la régulation positive de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et la formation d’une bordure autour de la lésion dans les jours suivant l’AVC qui aide à limiter l’étendue de la lésion et affecte la neuroplasticité dans le tissu blessé ^8,9,10.

La reprogrammation cellulaire directe permet de convertir un type de cellule mature en un autre type de cellule mature sans passer par un état pluripotent¹¹. Transformer les cellules cérébrales résidentes en nouveaux neurones pour remplacer ceux perdus à cause des blessures présente une voie attrayante pour la restauration du cerveau. L’AVC est une cible idéale pour les traitements cellulaires, étant donné la nécessité de disposer de méthodes thérapeutiques pour remplacer les neurones perdus, élargir le délai thérapeutique et, en fin de compte, faciliter la récupération fonctionnelle. À cette fin, de nombreux articles ont démontré la reprogrammation de l’astrocyte au neurone (AtN) in vitro et in vivo, en utilisant une variété de facteurs de transcription neurogènes basic-helix-loop-helix (bHLH), y compris Ascl1, Neurog2, Neurod1 et plus récemment, des versions mutées d’Ascl1 (Ascl1-SA6) qui ont démontré une efficacité de reprogrammation améliorée 11,12,13,14 . Il est important de tenir compte des nombreux facteurs de conception expérimentale qui peuvent avoir une incidence sur les résultats, l’interprétation et les comparaisons entre les études. Ghazale et al. ont démontré que l’efficacité de reprogrammation de l’AtN variait entre différentes souches de souris, sérotypes AAV et promoteurs lors de l’utilisation du même facteur^{de transcription bHLH 14}. D’autres considérations, telles que le modèle de lésion, la région du cerveau, le dosage viral, le moment de l’administration des gènes, le facteur de reprogrammation et le mode d’administration, auront une incidence sur les résultats. Des rapports récents ont démontré que les neurones transduits préexistants ont été interprétés à tort comme des neurones reprogrammés^15,16. Bien que les rapports ne nient pas nécessairement que la conversion AtN se produit, ces études ont souligné l’importance d’expériences bien contrôlées, et plusieurs articles ont formulé des recommandations pour les prochaines étapes dans le domaine 15,17,18,19. Ce qui ressort de la littérature, c’est que l’expression ectopique des facteurs de transcription bHLH peut améliorer les résultats fonctionnels dans une variété de modèles animaux de maladies/lésions neurodégénératives 13,20,21,22,23,24.

Ici, ce protocole Neurod1, un facteur de transcription d’intérêt, est exprimé de manière ectopique dans les cellules transduites^13,22. Le modèle endothéline-1 (ET-1) bien établi de l’AVC ischémique au cortex sensorimoteur chez les souris adultes est utilisé. L’injection d’ET-1 entraîne une vasoconstriction locale imitant la physiopathologie de l’AVC ischémique, y compris une déficience fonctionnelle 22,23,25. Le promoteur de la GFAP courte (gfaABC(1)D) couramment utilisé est utilisé pour piloter l’expression ectopique de Neurod1 au site de la lésion et dans la région périlésionnelle à l’aide de deux stratégies virales : (1) l’administration d’AAV5-CAG-Flex ::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre chez les souris de type sauvage et (2) l’administration d’AAV5-GFAP-Neurod1-Cre chez les souris rapporteures tdTom-Cre. Pour mieux comprendre le potentiel d’expression ectopique de Neurod1 dans le cerveau blessé par un AVC, les AAV ont été administrés dans la phase subaiguë (7 jours) ou dans la phase chronique (21 jours) après l’AVC. Dans les deux paradigmes, un nombre significativement plus élevé de neurones marqués a été trouvé dans les semaines suivant l’expression ectopique de Neurod1.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l’Université de Toronto et est conforme au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation (2^e édition, Conseil canadien de protection des animaux, 2017). Pour cette étude, le rapporteur tdTom-Cre de type sauvage (C57BL/6J) et transgénique (B6. Des souches de souris Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J)²² ont été utilisées. Les souris étaient âgées de 7 à 9 semaines et comprenaient des mâles et des femelles. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Chirurgie de l’AVC de l’endothéline-1

REMARQUE : Tous les instruments et matériaux chirurgicaux sont stérilisés par autoclave avant l’opération. Le cadre stéréotaxique est stérilisé avec PREempt. Les seringues sont stérilisées avec PREempt, 70 % d’alcool, et amorcées avec du PBS stérile avant l’opération. L’endothéline-1 (ET-1) est stockée sur de la glace tout au long de la chirurgie.

1. Avant de commencer l’opération, aménagez la zone de récupération en plaçant une cage propre sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Alternativement, si une lampe chauffante est utilisée, placez seulement la moitié de la cage sous la chaleur.
   1. Pour anesthésier des souris à l’aide d’isoflurane, suivez le protocole approuvé par le Comité de protection des animaux. Placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésique et allumez l’oxygène à 1-1,5 L/min, puis ajustez le vaporisateur d’isoflurane à 3 %-5 % pour initier l’anesthésie.
2. Retirez l’animal de la chambre une fois qu’il est couché sur le côté et qu’il ne peut plus se tenir debout, et placez-le sur une surface propre. Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié en confirmant l’absence de réflexe de pincement de l’orteil avant et pendant la chirurgie.
   1. Fixez le cône nasal prolongé de l’appareil d’anesthésie sur l’animal et ajustez l’isoflurane à 1 % à 2 % pour l’entretien. Minimisez l’exposition à l’isoflurane (5 min à 3 % à 5 % pour l’induction et le reste à 1 % à 2 %), car la procédure peut prendre jusqu’à 40 min.
3. Utilisez des tondeuses à poils d’animaux pour enlever la fourrure du cou/derrière les oreilles jusqu’au nez de l’animal afin d’exposer la peau du crâne pour la chirurgie.
4. Peser l’animal et administrer la dose appropriée d’analgésique préopératoire par voie sous-cutanée (méloxicam (2,0 mg/kg)) en fonction du poids.
5. Appliquez une pommade lubrifiante pour les yeux sur chaque œil de la souris pour prévenir la dessiccation de la cornée pendant l’anesthésie.
6. Stérilisez la zone de la peau coupée (étape 1.3) avec de l’éthanol à 70 %, suivi de deux fois de l’alcool de chlorhexidine pour former un champ chirurgical.
7. Transférez la souris sur un cadre stéréotaxique de souris en plaçant d’abord son nez dans le cône de nez stéréotaxique, puis stabilisez le crâne avec des barres d’oreille. Gardez la souris sur un coussin chauffant réglé à 37 °C pour un soutien thermique tout au long de la procédure chirurgicale. Maintenez l’isoflurane à 1 % à 2 % afin que la souris affiche une fréquence respiratoire de 1 respiration/s.
8. Répétez l’application de lubrification oculaire pour prévenir la dessiccation de la cornée pendant la procédure si nécessaire. Appliquez un champ chirurgical stérile sur le corps de la souris, sous les oreilles, pour augmenter la taille du champ stérile.
9. Faites une incision verticale parallèle au plan sagittal de l’animal de l’arrière du milieu des yeux vers l’arrière de la tête (os pariétal) avec une lame de scalpel #10. Explicez le crâne en rétractant doucement la peau vers les côtés.
10. Utilisez un coton-tige pour perturber le fascia sur le crâne et laissez le crâne sécher pour exposer le bregma.
11. Installez des bras manipulateurs avec porte-perceuse transportant une perceuse stéréotaxique à grande vitesse avec un foret de 0,018 po.
12. Percez 3 trous de bavure (0,018" de diamètre) avec une perceuse stéréotaxique à grande vitesse aux coordonnées du cortex sensorimoteur droit à 2,25 mm latéralement au bregma et +0,0 mm rostral, +1,0 mm rostral et -1,0 mm caudal au bregma.
13. Remplacez la perceuse par une seringue de 26 G avec une aiguille de 0,375" de long.
14. Chargez dans la seringue 1,5 μL d’ET-1 400 μM dissous dans du PBS stérile. Pour assurer un bon écoulement, libérez un petit volume d’ET-1 jusqu’à ce qu’une goutte puisse être observée à la pointe de l’aiguille. Utilisez un coton-tige stérile pour essuyer l’excédent avant d’effectuer une injection.
15. Abaissez la pointe de l’aiguille au-delà du crâne dans le trou de la meule centrale (dans le cortex sensorimoteur droit à + 0,0 en avant et à 2,25 mm latéralement du bregma) sans percer la dure-mère. Une fois alignée, abaissez l’aiguille de 1 mm dans le cerveau.
16. Injectez 1 μL d’ET-1 en distribuant 0,1 μL à la fois. Poussez le piston de la seringue Hamilton vers l’avant pour distribuer 0,1 μL et attendez une minute avant d’injecter les 0,1 μL suivants, injectez jusqu’à ce que 1 μL ait été distribué.
    1. Une fois que le dernier 0,1 μL a été distribué (0,1 μL x 10 injections = 1 μL au total), maintenez l’aiguille en place pendant 10 minutes pour éviter le reflux, puis retirez-la lentement vers le haut pour retirer la seringue.
17. Pour vous assurer que l’aiguille ne se bloque pas pendant l’injection, relâchez un petit volume de l’ET-1 jusqu’à ce qu’une goutte puisse être observée à la pointe de l’aiguille. Utilisez un coton-tige stérile pour essuyer l’excédent avant d’effectuer une injection. Stérilisez les seringues avant d’injecter à l’animal suivant avec PREempt, suivi d’alcool à 70 %, puis de PBS stérile.
18. Pour fermer la plaie, suturez la peau sus-jacente du crâne à l’aide d’une suture stérile en polyester polysorb 4-0.
19. Administrez une pommade antibiotique à l’aide d’un coton-tige sur la zone suturée pour prévenir l’infection postopératoire.
20. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et transférez-la dans une cage d’hébergement propre et préchauffée dans la zone de récupération. Éteignez le vaporisateur d’isoflurane et l’oxygène.
21. Gardez la cage sur un coussin chauffant pendant toute la durée de la récupération de l’anesthésie. Alternativement, si vous utilisez une lampe chauffante, placez la souris sur le côté de la cage sous la lampe afin que la souris puisse se déplacer vers le côté froid de la cage lorsqu’elle se réveille de l’anesthésie pour éviter la surchauffe. Surveillez la souris à la sortie de l’anesthésie dans les 5 à 10 prochaines minutes.
22. Surveiller la souris pendant les 3 prochains jours (surveillance du poids), fournir des soins postopératoires (purée humide pour assurer l’hydratation) et des analgésiques (2 mg/kg de méloxicam, 2 fois par jour par voie sous-cutanée, pendant 2-3 jours) conformément aux réglementations établies par le comité local de protection des animaux.

2. Administration du virus adéno-associé (AAV) (7 jours - modèle subaigu ou 21 jours - modèle chronique) après l’AVC

ATTENTION : Reportez-vous aux lignes directrices de l’établissement en matière de biosécurité pour travailler avec les AAV. Selon les lignes directrices de l’Université de Toronto, cette chirurgie est pratiquée dans une enceinte de biosécurité de niveau de confinement 2.

REMARQUE : Tous les instruments et matériaux chirurgicaux sont stérilisés par autoclave avant l’opération. Le cadre stéréotaxique est stérilisé avec PREempt. Les seringues sont stérilisées avec PREempt, 70 % d’alcool, et amorcées avec du PBS stérile. Les AAV sont stockés sur de la glace tout au long de l’opération.

1. Avant de commencer l’opération, aménagez la zone de récupération en plaçant une cage propre sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Alternativement, si une lampe chauffante est utilisée, placez seulement la moitié de la cage sous la chaleur.
   1. Pour anesthésier des souris à l’aide d’isoflurane, placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésique et allumez l’oxygène à 1-1,5 L/min, puis ajustez le vaporisateur d’isoflurane à 3 %-5 % pour initier l’anesthésie (en suivant les protocoles approuvés par l’institut).
2. Retirez l’animal de la chambre une fois qu’il est couché sur le côté et qu’il ne peut plus se tenir sur une surface propre. Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié en confirmant l’absence de réflexe de pincement de l’orteil avant et pendant la chirurgie.
   1. Fixez le cône nasal prolongé de l’appareil d’anesthésie sur l’animal et ajustez l’isoflurane à 1 % à 2 % pour l’entretien. Minimisez l’exposition à l’isoflurane (5 min à 3 % à 5 % pour l’induction et le reste à 1 % à 2 %), car la procédure peut prendre jusqu’à 40 min.
3. Peser l’animal et administrer la dose appropriée d’analgésique préopératoire par voie sous-cutanée (méloxicam (2,0 mg/kg)) en fonction du poids.
4. Appliquez une pommade lubrifiante pour les yeux sur chaque œil de la souris pour éviter que la dessiccation de la cornée ne soit sous anesthésie.
5. Stérilisez la zone de la peau coupée avec de l’éthanol à 70 %, suivi de deux fois de l’alcool de chlorhexidine pour former un champ chirurgical.
6. Transférez la souris sur un cadre stéréotaxique de souris en plaçant d’abord son nez dans le cône de nez stéréotaxique, puis stabilisez le crâne avec des barres d’oreille. Gardez la souris sur un coussin chauffant réglé à 37 °C pour un soutien thermique tout au long de la procédure chirurgicale. Maintenez l’isoflurane à 1 %-2 % afin que la souris affiche une fréquence respiratoire de 1 respiration/s.
7. Répétez l’application de lubrification oculaire pour prévenir la dessiccation de la cornée pendant la procédure si nécessaire. Appliquez un champ chirurgical stérile sur le corps de la souris, sous les oreilles, pour augmenter la taille du champ stérile.
8. S’il est toujours présent, coupez les sutures avec une paire de ciseaux chirurgicaux et retirez la croûte avec une paire de pinces. Rétractez la peau pour exposer le crâne.
   REMARQUE : Pour le modèle chronique, il peut être nécessaire d’exciser la peau avec la lame de scalpel #10.
9. Utilisez un coton-tige stérile pour sécher le crâne et localiser les trous de bavure.
10. Installez les bras manipulateurs de l’appareil stéréotaxique avec un porte-aiguille portant une seringue de 26 G avec une aiguille de 0,375" de long.
11. Chargez 3,4 μL d’AAV (1 x 10⁹ copies du génome (GC)/μL pour l’étude aiguë ; 1 x 10¹⁰ GC/μL pour l’étude chronique) dans la seringue. Pour s’assurer que l’écoulement est bon, libérez un petit volume d’AAV jusqu’à ce qu’une goutte puisse être observée à la pointe de l’aiguille. Utilisez un coton-tige stérile pour essuyer l’excédent avant d’effectuer une injection.
12. Abaissez la pointe de l’aiguille au-delà du crâne dans le premier trou de fraise utilisé pour ET-1 (dans le cortex sensorimoteur droit à + 0,0 antérieur et 2,25 mm latéral au bregma) sans perforer la dure-mère. Une fois alignée, abaissez l’aiguille de 1 mm dans le cerveau. (0 PA, +2,25 ML, -1,0 DV de bregma).
13. Injecter 1 μL d’AAV (1 x 10⁹ GC/μL pour l’étude aiguë ; 1 x^{10 10} GC/μL pour l’étude chronique) en distribuant 0,1 μL à la fois. Poussez le piston de la seringue Hamilton vers l’avant pour distribuer 0,1 μL et attendez une minute avant d’injecter les 0,1 μL suivants ; injecter jusqu’à ce que 1 μL ait été distribué. Une fois que le dernier 0,1 μL a été distribué (0,1 μL x 10 injections = 1 μL au total), maintenez l’aiguille en place pendant 10 minutes pour éviter le reflux, puis retirez-la lentement vers le haut pour retirer la seringue.
14. Pour vous assurer que l’aiguille ne se bloque pas pendant l’injection, libérez un petit volume d’AAV jusqu’à ce qu’une goutte puisse être observée à la pointe de l’aiguille. Utilisez un coton-tige stérile pour essuyer l’excédent avant d’effectuer une injection.
15. Répétez les étapes 2.11 à 2.14 pour les injections d’AAV dans les deux trous de bavure restants (dans le cortex sensorimoteur droit à +1 PA, +2,25 ML, -1,0 DV ; et -1 PA, +2,25 ML, -1,0 DV mm à partir de bregma. Stérilisez les seringues avant d’injecter à l’animal suivant avec PREempt, suivi d’alcool à 70 %, et enfin de PBS stérile.
16. Pour fermer la plaie, suturez la peau sus-jacente du crâne à l’aide d’une suture stérile en polyester polysorb 4-0.
17. Administrez une pommade antibiotique à l’aide d’un coton-tige sur la zone suturée pour prévenir l’infection postopératoire.
18. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et transférez-la dans une cage d’hébergement propre et préchauffée dans la zone de récupération. Éteignez le vaporisateur d’isoflurane et l’oxygène.
19. Gardez la souris à l’intérieur de la cage et stérilisez l’extérieur de la cage avec PREempt et de l’alcool à 70 % avant de la placer sur un coussin chauffant pour récupérer de l’anesthésie.
    1. Alternativement, si vous utilisez une lampe chauffante, placez la souris sur le côté de la cage sous la lampe afin que la souris puisse se déplacer vers le côté froid de la cage lorsqu’elle se réveille de l’anesthésie pour éviter la surchauffe. Surveillez la souris à la sortie de l’anesthésie dans les 5 à 10 prochaines minutes.
20. Surveillez la souris pendant les 3 prochains jours (surveillance du poids), fournissez des soins postopératoires (purée humide pour assurer l’hydratation) et des analgésiques (2 mg/kg de méloxicam, 2 fois par jour par voie sous-cutanée, pendant 2 à 3 jours) conformément aux réglementations établies par le comité local de protection des animaux.

3. Préparation et dissection des tissus

1. Pour euthanasier la souris, injectez par voie intrapéritonéale du tribromoéthanol (Avertin) (conc. 12,5 mg/mL, 250 mg/p.c. (kg)) et attendez 2 à 3 minutes pour une induction complète. Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié en retirant la souris de la cage et en confirmant l’absence de réflexe de pincement des orteils.
2. Dans une hotte, effectuer une perfusion transcardique²⁶ avec une solution saline suivie de 4 % de paraformaldéhyde. Vaporisez la tête de l’animal euthanasié avec de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elle soit trempée.
3. Coupez la tête à la base du crâne à l’aide d’une paire de gros ciseaux. Ouvrez la peau le long de la ligne médiane de tout le crâne à l’aide de ciseaux à iris droits de 4-1/2 po. Rétractez la peau pour exposer le crâne.
4. À partir de l’ouverture de la cavité vertébrale au niveau du cou, insérez les ciseaux de l’iris et coupez à travers le crâne le long de la suture sagittale et interfrontale.
5. Insérez ensuite des ciseaux dans les deux orbites et coupez la suture fronto-nasale.
6. Faites particulièrement attention à ne pas endommager le cerveau. Ouvrez les plaques crâniennes à gauche et à droite jusqu’à ce que le cerveau soit exposé.
7. Transférez le cerveau dans un flacon à scintillation avec 4 % de paraformaldéhyde. Maintenir le cerveau dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 4 h.
8. Le cerveau est ensuite cryoprotégé en remplaçant 4 % de paraformaldéhyde par 30 % de saccharose. Conserver le cerveau dans 30 % de saccharose à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du flacon (~12 h).

4. Sectionner des cerveaux congelés

1. Réglez la température de la chambre du cryostat entre -20 °C et -26 °C.
2. Faites une coupe coronale à travers le cervelet et fixez la partie plate et caudale du cerveau sur un mandrin de cryostat avec un composé de température de coupe optimale (OCT).
3. Placez le mandrin avec le cerveau dans le support de disque et alignez le bulbe olfactif avec la lame du couteau.
4. Sectionnez le cerveau en tranches coronales d’une épaisseur de 20 μm. Pour éviter les traînées ou les rayures sur les tranches de cerveau sectionnées, placez un morceau de ruban adhésif sur la plate-forme de sectionnement pour créer un petit espace entre la plaque anti-roulis et la plate-forme. Un pinceau peut être utilisé pour ajuster l’orientation de la section avant de la capturer sur une lame de verre chargée positivement.
5. Conservez les lames contenant des sections cérébrales à -20 °C.

5. Immunohistochimie et quantification

1. Traiter les coupes pour l’immunohistochimie à l’aide d’un anticorps primaire contre NeuN, un marqueur pan-neuronal, selon les protocoles standard^22,26.
2. Décongeler des sections de cerveau cryoconservées pendant 5 minutes à température ambiante. Lavez les sections trois fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 minutes chacune.
3. Incuber les sections dans 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 20 min à température ambiante pour perméabiliser.
4. Préparez la solution bloquante (5 % de sérum de chèvre normal et 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS) et incubez les sections dans la solution bloquante pendant 1 h à température ambiante.
5. Diluer l’anticorps primaire, anti-NeuN de lapin, dans un rapport de 1:500 dans la solution de blocage. Incuber les sections avec la solution d’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C.
6. Lavez les sections trois fois avec 0,3 % de Triton X-100 dans PBS, pendant 5 minutes à chaque lavage.
7. Diluer l’anticorps secondaire, chèvre anti-lapin 568 ou 488, à un rapport de 1:1000 dans le PBS. Incuber les sections avec la solution d’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante, à l’abri de la lumière.
8. Effectuez trois lavages avec 0,3 % de Triton X-100 dans PBS, pendant 5 min chacun. Incuber les sections avec du DAPI (1:10 000 en PBS) pendant 5 min à température ambiante.
9. Lavez les sections trois fois de plus avec du PBS, pendant 5 minutes chacune. Montez les sections tachées sur une lame de verre à l’aide d’un support de montage à fluorescence et d’une lamelle en verre. Laissez sécher les lames montées pendant la nuit.
10. Imagez des lames colorées à l’aide d’un objectif 20x avec un microscope confocal pour obtenir des vues des cellules Reporter+ autour de la lésion de l’AVC dans 3 coupes coronales différentes (entre les régions anatomiques du croisement du corps calleux antérieurement et le croisement de la commissure antérieure postérieurement) pour chaque animal.
    REMARQUE : La distance de propagation de l’AAV variera à l’intérieur de l’hémisphère. Cependant, sur la base de notre expérience et de l’analyse post-traitement tissulaire des cellules Reporter+, la propagation de l’AAV s’étend généralement sur environ +3 mm à -3 mm du bregma. Les cellules rapporteures + autour de la lésion de l’AVC (identifiées par l’absence/la coloration clairsemée de NeuN) dans la zone située entre l’endroit où le corps calleux croise la ligne médiane et la commissure antérieure se connecte, doivent être quantifiées.
11. Pour la quantification des neurones transduits, effectuez une analyse de colocalisation. Comptez manuellement le nombre de cellules doublement positives (Reporter+NeuN+) et le nombre total de cellules transduites (Reporter+) dans les coupes de cerveau. Pour les résultats ici, >3 champs de vision ont été comptés autour de la lésion (médiale, latérale et inférieure) à partir de 3 coupes coronales par souris.

Résultats

Examiner les résultats cellulaires de l’expression ectopique de Neurod1 induite par le promoteur GFAP court (gfaABC(1)D) dans les souches rapporteures de type sauvage (C57BL/6J) et transgéniques (en particulier, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J)²² deux systèmes basés sur AAV5 ont été utilisés chez des souris blessées par un AVC ET-1 (Figure 1A-C). Dans un modèle subaigu d’AVC, Neurod1 a été intégré dans le système AAV Cre-Flex et administré à des souris de type sauvage au jour 7 après l’AVC (Figure 1B). Le deuxième vecteur Flex contient la séquence inversée de la GFP pilotée par le promoteur CAG qui est flanquée de sites de recombinaison hétérotypiques et antiparallèles de type loxP (Figure 1B). Les deux constructions virales sont injectées ensemble en même temps après l’AVC. Une fois que Cre est exprimé dans les cellules transduites, la GFP est inversée et excisée aux sites de recombinaison, orientant la séquence dans la direction sensorielle, ce qui permet l’expression de la GFP. Par conséquent, les cellules qui expriment Cre seront GFP positives, ce qui indique qu’elles ont été transduites par les vecteurs Cre-Flex. Dans le modèle subaigu, les souris ont été sacrifiées 21 jours après la transduction (c’est-à-dire 28 jours après l’AVC), et le nombre de cellules transduites (GFP+), ainsi que le nombre de cellules NeuN+GFP+ (cellules transduites exprimant NeuN), ont été comptés dans le parenchyme des cerveaux blessés par AVC. Comme le montre la figure 2A, les neurones sont perdus sur le site de la lésion ischémique. La quantification des cellules transduites dans le paradigme subaigu à l’aide du système AAV Cre-Flex révèle significativement plus de neurones marqués (cellules NeuN+GFP+/GFP+) chez les souris traitées par Neurod1 par rapport aux souris témoins Stroke-Cre (43,05 +/- 5,50 % vs 18,43 +/- 3,03 % de cellules NeuN+GFP+/GFP+, dans Stroke-Neurod1 vs. souris traitées par Stroke-Cre (témoin), respectivement) (p = 0,0172) (figures 2B et C).

Dans une série d’expériences distinctes, la conversion de l’AtN a été réalisée dans un modèle chronique d’AVC (Figure 1B,C). Le facteur de transcription Neurod1 a été administré à des souris rapporteures tdTom-Cre blessées par ET-1 lors d’un AVC le 21e jour après l’AVC (Figure 1C). Identique au système Cre-Flex utilisé chez les souris de type sauvage, l’expression de Neurod1 a été pilotée par le promoteur GFAP court. Cependant, dans ce système, une seule construction AAV a été utilisée avec la recombinase Cre après Neurod1 (Figure 1B). Par conséquent, les cellules exprimant GFAP produiront une recombinase Cre, induisant le rapporteur tdTom, indiquant que les cellules ont été transduites par AAV. Les souris ont été sacrifiées 77 jours après l’AVC (8 semaines après l’AAV) (figure 1C). Comme le montre la figure 3A, une lésion corticale est observée au jour 77 après l’AVC chez les souris tdTom-Cre. Le nombre de cellules transduites exprimant le marqueur neuronal, NeuN+, a été quantifié (pourcentage relatif de cellules (NeuN+tdTom+/tdTom+) au stade chronique post-AVC et a révélé que les souris ayant reçu Stroke-Neurod1 avaient significativement plus de neurones marqués que les souris témoins Stroke-Cre (74,81 +/- 4,835 % vs 53,05 +/- 5,028 % NeuN+/tdTom+ cellules dans Stroke-Neurod1vs. souris traitées par Stroke-Cre (témoin), respectivement) (p = 0,0355) (figures 3B et C).

Dans l’ensemble, les résultats démontrent une transduction de base des neurones et un nombre plus élevé de cellules transduites exprimant NeuN+ avec l’administration de Neurod1 dans les phases subaiguës et chroniques post-AVC chez des souris rapporteures de type sauvage et tdTom-Cre, avec deux systèmes différents basés sur l’AAV.

Figure 1 : Expression ectopique de Neurod1, vecteurs et chronologies. (A) Représentation graphique de l’induction d’un AVC par injection d’Endothéline-1 (ET-1) dans le cortex moteur de la souris. Virus adéno-associé (AAV) administré sur 3 sites, au site d’injection d’ET-1 ainsi qu’aux sites entourant la lésion, 1 mm antérieur et postérieur. Panneau zoomé montrant des cellules transduites avec AAV-Neurod1 dans le cortex moteur. (B) Schéma des deux vecteurs AAV du système Cre-Flex administrés à des souris de type sauvage (panneau supérieur). Le vecteur AAV5 1 contient le promoteur GFAP court, le facteur de transcription Neurod1 et la séquence de recombinase Cre flanquée d’un site loxP (triangle noir) et d’un site lox2272 (triangle blanc). Le vecteur AAV5 2 porte la séquence rapporteuse inversée du gène GFP flanquée d’une paire de sites loxP et lox2272. La transduction des deux vecteurs dans les cellules entraîne une excision et une inversion médiées par Cre, ce qui permet à l’expression de la GFP de marquer les cellules transduites. Neurod1 a également été administré à des souris tdTom-Cre à l’aide d’un vecteur AAV5 (panneau inférieur). Dans le vecteur AAV5 1, le promoteur GFAP court, le facteur de transcription Neurod1 et la séquence de recombinase Cre sont emballés. L’expression de Cre dans les cellules transduites entraîne l’excision du codon Stop aux sites loxP (triangle noir), permettant l’expression de tdTomato. (C) Le système Cre-Flex a été testé chez des souris de type sauvage avec des AAV injectés dans la période subaiguë post-AVC (post-AVC Jour 7). Des souris de type sauvage ont été sacrifiées 21 jours après la transduction de l’AAV (28 jours après l’AVC). L’AAV a été administré à des souris tdTom-Cre dans la période chronique post-AVC (post-AVC 21), et les souris ont été sacrifiées 56 jours après la transduction de l’AAV (77 jours après l’AVC). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’administration ectopique de Neurod1 à l’aide d’AAV Cre-Flex dans la phase subaiguë post-AVC conduit à une augmentation du nombre de cellules transduites exprimant NeuN. (A) Immunocoloration des sections cérébrales coronales à travers le cortex moteur au jour 28 après l’AVC chez les souris témoins Stroke-Cre (à gauche) et Stroke-Neurod1 (à droite). Une perte neuronale est observée au site de la lésion (lignes pointillées blanches). Des cellules transduites (GFP+, vertes), des neurones (NeuN+, rouges) et des cellules NeuN+GFP+ colocalisées (orange) sont observées dans le cortex. Barres d’échelle : 250 μm. (B) Images représentatives du tissu cérébral témoin Stroke-Cre (en haut) et Stroke-Neurod1 (en bas) montrant les neurones (NeuN+, rouge) et la GFP+ transduite par AAV (vert). Les encarts entourés de blanc montrent un gros plan des cellules pour chaque canal individuel. Les pointes de flèche blanches indiquent les cellules transduites par AAV (GFP+). Les flèches blanches indiquent des cellules NeuN+GFP+ colocalisées. Barres d’échelle : 125 μm. (C) Quantification des cellules NeuN+GFP+/GFP+ chez les souris Stroke-Cre et Stroke-Neurod1. N = 3 souris par groupe. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± MEB. Test de Shapiro-Wilk (p = 0,3223). Test t non apparié, *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : L’administration ectopique de Neurod1 chez les souris rapporteures tdTom-Cre dans la phase chronique post-AVC conduit à une augmentation du nombre de cellules transduites exprimant NeuN. (A) Immunomarquage de sections cérébrales coronales à travers le cortex moteur au jour 77 après l’AVC à partir de souris témoins Stroke-Cre et Stroke-Neurod1. La perte neuronale est observée au site de la lésion ischémique (lignes pointillées blanches). Les cellules transduites sont marquées avec tdTom (rouge) dans le péri-infarctus. NeuN+tdTom+ (orange) sont des cellules transduites qui expriment des marqueurs neuronaux. Barres d’échelle : 250 μm. (B) Images représentatives du tissu cérébral témoin Stroke-Cre (en haut) et Stroke-Neurod1 (en bas) montrant les neurones (NeuN+, vert) et les cellules transduites par AAV (tdTom+, rouge). Les encarts entourés de blanc montrent un gros plan des cellules pour chaque canal individuel. Les pointes de flèche blanches indiquent les cellules transduites par AAV (tdTom+). Les flèches blanches indiquent des cellules NeuN+tdTom+ colocalisées. Barres d’échelle : 125 μm. (C) La quantification des cellules NeuN+tdTom+/tdTom+ dans le paradigme chronique montre un nombre significativement plus élevé de cellules transduites exprimant NeuN+ (cellules NeuN+tdTom+/tdTom+) chez les souris traitées par Neurod1. N = 3 souris par groupe. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± MEB. Test de Shapiro-Wilk (p = 0,2044). Test t non apparié, *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole détaille deux systèmes AAV et des modèles murins pour étudier l’expression ectopique de Neurod1 dans le contexte d’un modèle d’AVC cortical ET-1 léger-modéré. Il est important de prendre en compte un certain nombre d’étapes critiques relatives à l’AVC ET-1 pour assurer la reproductibilité et l’uniformité de la lésion. Les trous de bavure doivent être soigneusement percés sans perforer la dure-mère pour éviter les blessures chirurgicales involontaires. Il est important d’utiliser des repères cohérents, dans ce cas bregma, pour assurer une région d’intérêt similaire (cortex sensorimoteur dans cette étude). Ceci est particulièrement important pour les études utilisant des évaluations comportementales, car l’emplacement et la taille de la lésion auront un impact sur les résultats fonctionnels 13,22,25,27. Plus important encore, le taux d’injection d’ET-1 et la pression appliquée par le chirurgien sur la seringue doivent être cohérents pour des résultats reproductibles. Il convient de noter que l’aiguille de la seringue peut se boucher et doit être nettoyée entre les animaux pour assurer une administration précise de l’ET-1. Lors de l’analyse cellulaire des tissus, si aucune lésion d’AVC n’est observée, l’aiguille a probablement été obstruée pendant l’opération. Si le problème persiste, procurez-vous un nouveau lot d’endothéline-1 auprès du fabricant, car des problèmes de puissance dépendants du lot ont été observés dans le passé.

Les étapes de l’intervention chirurgicale pour administrer l’AAV sont similaires à celles du protocole d’induction de l’AVC ET-1. Par conséquent, les considérations susmentionnées sont essentielles. De plus, le titre et le volume viraux de l’AAV doivent être cohérents pour que l’efficacité de la transduction puisse être comparée entre les groupes. Dans ce protocole, 1 x 10⁹ GC/μL d’AAV pour l’étude aiguë et 1 x^{10 10} GC/μL d’AAV pour l’étude chronique ont été administrés. Il est crucial de sélectionner une dose virale suffisamment faible pour minimiser les erreurs d’expression artéfactuelle, tout en restant suffisamment élevée pour assurer une transduction cellulaire suffisante, permettant de détecter les différences entre les groupes expérimentaux. La gamme de doses virales optimales pour de telles études a été déterminée à 10 7-10¹⁰ GC/μL^13,24. Des titres plus élevés d’AAV entraînent non seulement un marquage étendu des neurones dans le groupe témoin, mais il a également été démontré qu’ils induisent l’astrocytose, perturbent la barrière hémato-encéphalique et régulent à la hausse les réponses inflammatoires^28,29. Des études portant sur l’administration de facteurs de transcription à médiation virale après un AVC ont utilisé différents sites d’administration pour les injections d’AAV. Une étude a décrit le marquage réussi des cellules transduites à l’aide d’une seule injection d’AAV dans le site¹³ de la lésion de l’AVC. D’autres études ciblent une à trois zones autour de la zone d’infarctus³⁰. Ici, l’AAV a été administré à trois endroits, avec une injection aux coordonnées du site d’injection de l’ET-1 et 2 autour du site de la lésion (une injection à 1,0 mm antérieur et une injection à 1,0 mm postérieur) dans le but de transduire les astrocytes réactifs dans le bord glial périlésionnel⁹. Lors de l’analyse cellulaire des tissus, si aucune ou très peu de cellules fluorescentes (1 à 10 cellules/section) sont observées, l’aiguille peut avoir été obstruée lors de l’injection, ou l’AAV a été gelé-décongelé trop de fois, ce qui a conduit à l’inactivation du virus.

L’efficacité de la transduction a été examinée à différents moments dans le modèle d’AVC léger-modéré, et les résultats démontrent que significativement plus de neurones sont marqués dans les cerveaux traités par Neurod1 à la fois subaiguë et chronique après l’AVC. Les travaux présentés ici sont les premiers à démontrer la transduction de Neurod1 dans la phase chronique post-AVC et révèlent que les neurones expriment Neurod1 de manière ectopique jusqu’à 8 semaines après l’AVC. Bien que les résultats selon lesquels un nombre accru de neurones transduits sont observés dans les cerveaux blessés par un AVC qui ont reçu Neurod1 par rapport aux vecteurs de contrôle sont cohérents avec le fait que Neurod1 joue un rôle dans la conversion de l’AtN, l’interprétation des résultats cellulaires nécessite une bonne connaissance des limites du paradigme expérimental. La grande majorité des études publiées portant sur la conversion de l’AtN utilisent le GFAP comme promoteur, car le GFAP est régulé à la hausse dans les astrocytes réactifs dans les maladies neurodégénératives, y compris les accidents vasculaires cérébraux ^4,31. Cependant, il a été démontré qu’une faible expression de GFAP se produit également dans les neurones³². Cela est cohérent avec les résultats rapportés ici dans lesquels un pourcentage de cellules transduites dans le groupe témoin (Stroke-Cre) sont des neurones préexistants³². Plus précisément, les groupes témoins Stroke-Cre de ce protocole ont montré un marquage de 18,43 +/- 3,03 % et 53,05 +/- 5,028 % des cellules NeuN+Reporter+, ce qui représente l’étiquetage des neurones préexistants, indiquant l’expression du promoteur GFAP dans les neurones. En effet, l’expression ciblée de Neurod1 dépend d’un certain nombre de facteurs, dont le tropisme viral. Il a été démontré que l’AAV5 transduit les neurones avec une efficacité différente dans différentes régions du cerveau, y compris le cortex sensorimoteur, ce qui indique que les sérotypes AAV ont un tropisme cellulaire régional, qui doit être pris en compte dans les études induisant l’expression ectopique des facteurs de transcription^31,33. Les souches de souris peuvent également affecter la transduction de l’AAV^14,34. Une étude comparant la transduction de l’AAV dans le striatum de souris de type sauvage (C57BL/6J) et FVB/N a révélé un tropisme cellulaire et une efficacité de transduction variables dans les deux souches³⁴.

L’un des avantages du système Cre-Flex est qu’il peut être utilisé pour le marquage à long terme chez les souris de type sauvage, ce qui peut réduire le problème de l’expression non spécifique de Cre présente dans les lignées de souris Cre-reporter^15,35. Un inconvénient du système Cre-Flex est que l’expression du transgène indépendant de Cre peut se produire en raison de 0,1 à 0,8 % des particules virales ayant des sites LoxP recombinés pendant la production virale³⁶. Ces résultats soulignent l’importance des expériences de traçage de lignée, par exemple, le pré-marquage des astrocytes avant l’administration d’AAV à l’aide de la lignée de souris Aldh1l1-CreERT2, afin de s’assurer que la conversion de l’AtN n’est pas surestimée lors de la présentation des conclusions¹⁵. Des études ont suggéré que l’activation du promoteur de GFAP humain (tel qu’utilisé dans ces études) par la régulation cis par des gènes en aval (tels que Neurod1) peut entraîner l’expression de GFAP dans les neurones endogènes, conduisant à un nombre plus élevé de neurones marqués dans le groupe de traitement^15,32. L’ensemble de ces études et des résultats présentés ici souligne l’importance des expériences de traçage de lignées, par exemple, le pré-marquage des astrocytes ou des neurones avant l’administration d’AAV, pour différencier les neurones préexistants et endogènes lors de l’analyse¹⁵.

En envisageant les prochaines étapes qui pourraient réduire la transduction neuronale, différents sérotypes AAV et/ou l’utilisation d’un promoteur moins spécifique aux astrocytes de promiscuité seraient utiles¹⁹. Le nombre croissant de rapports décrivant l’hétérogénéité des astrocytes peut avoir un impact supplémentaire sur la spécificité de l’expression génique si différentes sous-populations d’astrocytes sont plus sensibles à la conversion AtN en général 37,38,39,40.

L’âge des animaux utilisés dans les modèles précliniques de blessure ou de maladie est également une considération importante qui peut entraîner des résultats variables. Par exemple, dans le cas d’un neurotraumatisme, l’âge peut affecter la réactivité des astrocytes, ce qui aurait un impact sur les résultats de l’étude pour la conversion de l’AtN⁴¹. De plus, les lignées rapporteures inductibles par Cre peuvent perdre de la spécificité d’expression au fil du temps, ce qui peut avoir un impact sur les mesures de résultats⁴². À ce jour, la reprogrammation chez les animaux plus âgés n’a pas fait l’objet d’études exhaustives⁴³.

Le protocole décrit l’administration de l’AAV en 2 phases post-AVC : (1) la phase subaiguë (à 7 jours) et (2) la phase chronique (à 21 jours) après l’AVC ischémique. L’expression ectopique de Neurod1 dans un modèle d’AVC chronique n’a pas été examinée ; Par conséquent, l’observation selon laquelle beaucoup plus de neurones sont marqués à ce stade tardif a des implications importantes pour les études futures visant à promouvoir la récupération de l’AVC dans l’AVC chronique. Les études examinant le potentiel de l’expression ectopique de Neurod1 pour améliorer les résultats de l’AVC devront intégrer des évaluations comportementales, car les résultats fonctionnels après un AVC sont les mesures de succès les plus pertinentes sur le plan clinique pour une intervention thérapeutique 13,22,25,27.

À l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour les patients souffrant d’incapacités induites par un AVC dans les phases subaiguës et chroniques suivant l’AVC, à l’exception de la réadaptation, qui présente des avantages limités. Il a été démontré que l’expression forcée des gènes bHLH neurogènes dans la glie améliore les résultats fonctionnels après un AVC^22,30. Les résultats sont cohérents avec les études de reprogrammation de l’AtN démontrant que l’expression ectopique de Neurod1 augmente la transduction neuronale 3 et 7 semaines après l’administration de l’AAV par rapport aux souris recevant le vecteur de contrôle. Plus important encore, plusieurs articles ont présenté des recommandations pour les contrôles, la conception et les interprétations de l’étude dans le domaine de la reprogrammation de l’ATN 17,18,19,22. À cette fin, ce protocole a décrit des systèmes AAV et des modèles murins pour l’expression ectopique des facteurs de transcription après un AVC, qui peuvent être utilisés pour informer et faire progresser des investigations ultérieures sur les mécanismes cellulaires sous-jacents aux observations.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#77 Mèche (.018	David Kopf Instruments	8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre	Vecteur  ; Biolabs
Suture résorbable avec aiguille Polysorb&trade ; Polyester CV-15 3/8 Cercle Pointe Conique Aiguille Taille 4 - 0 Tressé	Covidien	GL-881
Anti-NeuN Anticorps (lapin)  ;	Millipore Sigma	ABN78  ;
C57BL/6 Souris	Charles River	027
Chlorhexidine Solution	Partnar	PCH-020
Contec&trade ;   ; PRÉEMPT&trade ; Solution désinfectante RTU	Fisher Scientific	29-636-6212
Cryostat	Thermo Scientific  ;	HM525 NX  ;
Endothéline 1	Millipore Sigma	05-23-3800-0.5MG
Rasoir de sécurité plume Microtome lames	Feather	12-631P
Fisherbrand  ; Lunettes de protection : Rectangles	Fisher Scientific	12-545M  ;
Support de montage de fluorescence	Agilent Technologies	S3023  ;
Hamilton Seringue	Hamilton Company	7634-01
Perceuse stéréotaxique à grande vitesse	David Kopf Instruments	1474
Solution Metacam (Meloxicam)	Boehringer Ingelheim
O.C.T Compound	Fisher Scientific	23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCre	Vector Builder	P190924-1001suq
Pommade Polyderm USP	TARO	2181908
SOMNI Scientific&trade ;   ; Coussin chauffant pour la température animale	Fisher Scientific	04-777-177
Stereotaxic Instruments	David Kopf Instruments	Modèle 902
Superfrost Plus Lames de microscope, blanc	Fisherbrand	12-550-15
tdTomato Reporter Mice  ;	Le Jackson Laboratory	007914
V-1 Système d’anesthésie animale de laboratoire de table	VetEquip	901806