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Ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour l’étude de la différenciation Th17 in vitro

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DOI :

10.3791/66966

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15 novembre 2024

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1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour la transduction rétrovirale de l’ARN guide dans les lymphocytes T primaires de souris transgéniques Cas9, offrant une alternative efficace pour l’édition de gènes dans l’étude de la différenciation Th17.

Résumé

Les lymphocytes T auxiliaires qui produisent l’IL-17A, connues sous le nom de cellules Th17, jouent un rôle essentiel dans la défense immunitaire et sont impliquées dans les maladies auto-immunes. Les lymphocytes T CD4 peuvent être stimulés par des antigènes et des cocktails de cytokines bien définis in vitro pour imiter la différenciation des cellules Th17 in vivo. Des recherches approfondies ont été menées sur les mécanismes de régulation de la différenciation Th17 à l’aide du test de polarisation Th17 in vitro .

Les méthodes conventionnelles de polarisation Th17 impliquent généralement l’obtention de lymphocytes T CD4 naïfs à partir de souris génétiquement modifiées pour étudier les effets de gènes spécifiques sur la différenciation et la fonction Th17. Ces méthodes peuvent prendre du temps et être coûteuses et peuvent être influencées par des facteurs extrinsèques cellulaires provenant des animaux knock-out. Ainsi, un protocole utilisant la transduction rétrovirale de l’ARN guide pour introduire l’inactivation du gène dans les lymphocytes T primaires de souris CRISPR/Cas9 constitue une approche alternative très utile. Cet article présente un protocole permettant de différencier les lymphocytes T primaires naïfs en cellules Th17 après un ciblage génique médié par rétroviral, ainsi que les méthodes d’analyse ultérieures par cytométrie en flux pour mesurer l’efficacité de l’infection et de la différenciation.

Introduction

Les cellules Th17, un sous-ensemble unique de cellules T auxiliaires CD4+, sont essentielles à l’éradication des bactéries et des champignons extracellulaires et jouent un rôle important dans diverses maladies auto-immunes 1,2,3. De nouvelles preuves suggèrent que les cellules Th17 présentent une hétérogénéité, fonctionnant dans des conditions pathogènes et non pathogènes, influencées par des facteurs environnementaux et génétiques. L’élucidation des processus régulateurs qui contrôlent la différenciation des cellules Th17, la plasticité et l’hétérogénéité est cruciale pour l’avancement de stratégies immunothérapeutiques plus efficaces.

Les animaux génétiquement modifiés ont été largement utilisés pour dévoiler les principaux régulateurs de la différenciation et des fonctions des cellules Th17. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés implique une manipulation complète in vivo, fournissant l’authenticité et l’étude systématique de son rôle dans des conditions physiologiques ou des modèles de maladies. Néanmoins, le criblage à haut débit avec cette approche est largement impraticable. Les tests de polarisation in vitro offrent une alternative pour étudier la différenciation des cellules Th17. Il a été démontré que l’interleukine 6 (IL-6) en combinaison avec le facteur de croissance transformant β1 (TGFβ1) favorise le développement de cellules Th17 non pathogènes, tandis que l’IL-6, l’IL-1β et l’IL-23 sont impliquées dans la différenciation des cellules Th17 pathogènes (pTh17)4,5.

L’émergence de la technologie CRISPR/Cas9 a facilité l’édition précise du génome à des bases spécifiques. Lorsqu’elle est combinée à la transduction rétrovirale, cette approche fournit une méthode génétique puissante, efficace et économique pour le dépistage et l’étude fonctionnelle des régulateurs potentiels dans les cellules Th17 6,7. Dans cette étude, nous avons amélioré la procédure de transduction rétrovirale dans le système de polarisation Th17. À l’aide d’un système rétroviral, nous avons infecté des lymphocytes T naïfs activés exprimant Cas9 préétablis de souris. Les cellules ont été transduites à l’aide de constructions d’ARN guide (ARNg) pilotées par le promoteur U6, ainsi que de gènes codant pour des protéines rapporteures fluorescentes sous le contrôle du promoteur EF1a pour faciliter l’inactivation du gène cible. Ensuite, les lymphocytes T transduits ont été cultivés dans des conditions spécifiques de cytokines pour induire la différenciation en cellules Th17. Notamment, l’élimination de RoRγt a considérablement réduit la production d’IL-17A par rapport au groupe témoin. L’efficacité de ce système dépend de conditions optimisées de production et de transduction de rétrovirus pour les lymphocytes T primaires activés, fournissant une approche rapide et pratique pour étudier des gènes spécifiques dans la différenciation et la fonction de Th17.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique du bien-être des animaux expérimentaux de l’hôpital Renji de la faculté de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai et sont conformes aux directives institutionnelles.

1. Production de rétroviraux

  1. Préparation de la construction rétrovirale
    1. Utilisez l’outil CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) pour concevoir l’ARNsg pour RORγt knockout8. Spécifiez le génome de référence comme Souris GRCm38, et choisissez la séquence PAM comme NGG (pour SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) basée sur le système de guidage CRISPRko. Validez le nom du gène cible ou d’autres formats de gènes cibles et soumettez les données valides pour obtenir des candidats ARNsg. En définissant d’autres paramètres sur les valeurs par défaut, définissez la cible sgRNA sur RORγt (Rorc, Gene ID : 19885) pour perturber la différenciation de Th17 et sélectionnez les sgRNA non ciblés (abrégé sgNT, séquence : GCGAGGTATTCGGCTCCGCG) dans les banques GeCKO v2 de la souris.
      REMARQUE : Cet outil offre une gamme d’options cliquables pour la conception d’ARN guides, permettant une personnalisation pratique pour répondre à des exigences spécifiques.
      1. Entrez le nom du gène cible dans la zone de recherche sous la colonne Recherche rapide de gènes. Le système affichera l’ID du gène et le nom complet du gène cible pour assurer une sélection précise.
        REMARQUE : Des options supplémentaires sont disponibles pour valider différents formats de gènes cibles.
    2. Choisissez un sgRNA ciblé sur la séquence Rorc (abrégé sgRorc) en fonction du rang combiné élevé et de l’ordre de sélection pour éviter les correspondances hors cible et augmenter l’efficacité sur la cible (séquence sgRorc : GTCATCTGGGATCCACTACG). Synthétiser deux oligonucléotides pour sgRorc et sgNT : pour l’oligo direct, ajouter la séquence « gttttagagctagaaaaatagcaagttaaaat » à l’extrémité 5' de chaque séquence guide ; Pour l’oligonucléotide inverse, ajoutez la séquence « tttcgtcctttccacaagatatataaac » à l’extrémité 3' de chaque séquence guide.
      REMARQUE : En règle générale, plusieurs options existent pour les séquences d’ARNsg. Il est essentiel de sélectionner 2 ou 3 séquences d’ARNsg ciblant le même génotype pour évaluer leur efficacité à l’élimination. Dans nos expériences préliminaires, deux ARNg cibles de Rorc ont été sélectionnés pour la comparaison (séquence d’ARNsg1 : GTCATCTGGGATCCACTACG ; séquence d’ARNg2 : CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Les résultats expérimentaux ont indiqué que l’ARNg présenté dans la méthode actuelle (séquence d’ARNg 1) présente une efficacité de knock-out plus élevée entre les deux.
    3. Amplifiez les séquences codantes de sgRorc et sgNT à l’aide de l’ADN polymérase en PCR avec les amorces ci-dessus et clonez-les dans le vecteur pMX-U6-MCS (entre les régions du promoteur U6 et de l’échafaudage de l’ARNg) dans le cadre avec la protéine fluorescente mCherry, respectivement9. Configurez le système de réaction (50 μL) comme dans le tableau 1. Ces amorces sont constituées d’une séquence d’ARNsg (3'), qui peut insérer l’ARNsg dans le vecteur, et d’un segment de séquence vectorielle (5'), qui peut amplifier le fragment de vecteur de pleine longueur. De plus, concevez les amorces avant et inverse avec un chevauchement d’environ 18 pb dans la région de l’ARNsg (mais pas complètement), facilitant l’assemblage du vecteur de clonage linéarisé pendant le processus de ligature.
      REMARQUE : Un fragment de vecteur linéarisé au site de la séquence d’ARNsg avec des amorces par PCR d’environ 5 551 kd doit être obtenu.
    4. Purifiez la construction à l’aide d’un kit d’extraction de gel et circularisez-la à l’aide d’un kit de clonage. Utilisez les produits de recombinaison pour les essais de transformation.
    5. Choisissez les clones uniques sur les plaques et vérifiez les séquences codant pour sgRorc ou sgNT via le séquençage de première génération, à l’aide de l’amorce du promoteur U6 (séquence : ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. Sélectionnez le clone unique souhaité pour l’amplification dans le bouillon LB. Extrayez de l’ADN plasmidique de haute qualité à partir de cellules bactériennes à l’aide d’un kit de plasmide sans endotoxines.
      REMARQUE : Assurez-vous que la solution plasmidique est de haute qualité. Nous recommandons que la concentration de la solution plasmidique soit d’au moins 1 μg/μL.
  2. Préparation des cellules d’emballage
    1. Préparez les cellules Platinum-E (Plat-E) en utilisant la procédure suivante : cultivez des cellules Plat-E avec du milieu d’aigle modifié de Dulbecco (milieu DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 unités/mL de pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine dans une boîte de culture de 10 cm. On l’appellera ci-après le milieu de culture cellulaire .
      REMARQUE : Pour obtenir la bonne efficacité de transfection, nous vous recommandons d’utiliser des cellules en phase de croissance logarithmique avec moins de 15 numéros de passage.
    2. Divisez une plaque complète de cellules Plat-E de 10 cm (~2,6 × 107 cellules) dans un nouveau plat de 10 cm 1 jour avant la transfection pour obtenir une confluence cellulaire d’environ 80 % le lendemain, ce qui est la condition optimale pour la transfection. Effectuez le passage cellulaire d’une nouvelle boîte de 10 cm dans un rapport de 1:3 (graine ~8 × 106 cellules dans une nouvelle boîte de 10 cm la veille de la transfection).
      REMARQUE : Le rapport de division dépend de l’état de croissance des cellules, avec une efficacité de transfection plus élevée pouvant être obtenue dans les cellules présentant une croissance robuste. Nous effectuons le passage cellulaire d’une parabole de 10 cm dans un rapport de 1:3. Pour différentes boîtes de culture cellulaire, comme une boîte de 6 cm, nous recommandons d’ensemencer 1,5 × 106 cellules Plat-E la veille de la transfection.
  3. Transfection
    1. Une heure avant la transfection, remplacez le milieu de culture cellulaire par 8 mL de milieu sérique réduit sans rouge de phénol à 5 % de FBS, mais sans pénicilline-streptomycine, car cela pourrait interférer avec le réactif de transfection. Réchauffez le sérum réduit à 37 °C avant utilisation.
    2. Préparez le mélange de transfection contenant le mélange 1 et le mélange 2 : le mélange 1 comprend 18 μg d’ADN plasmidique (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) et 6 μg de vecteur rétroviral écotrope pCL (pCL-Eco) dans 1 000 μL de milieu sérique réduit. Le mélange 2 contient 48 μL de réactif de transfection dans 1 000 μL de milieu sérique réduit. Ajoutez le mélange 2 goutte à goutte dans le mélange 1 et mélangez doucement et soigneusement. Incuber le complexe pendant 15-20 min à 20-25 °C.
    3. Versez soigneusement le mélange dans les cellules Plat-E, en faisant tourner doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme. Incuber les cellules à 37 °C sous 5 % de CO2 pendant 6 à 12 h.
    4. Remplacer le milieu par 10 mL de milieu de culture cellulaire frais et poursuivre l’incubation des cellules à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 48 h.
    5. Évaluer l’efficacité de la transfection dans les cellules Plat-E en détectant l’étiquette du vecteur rétroviral, servant de proxy, par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux.
      REMARQUE : Un fort signal de fluorescence mCherry (la fluorescence positive dépasse 80 %) a été détecté dans une proportion considérable de cellules Plat-E transfectées avec le vecteur pMX-U6-MCS, indiquant une transfection réussie.
    6. Récoltez le surnageant de culture contenant le virus et centrifugez-le à 1 500 × g pendant 10 minutes pour prélever les fragments cellulaires. Aliquote du surnageant viral 1 mL par flacon et conserver à -80 °C.
      REMARQUE : La filtration est une méthode alternative pour éliminer les débris cellulaires. Nous recommandons d’utiliser un filtre à seringue avec une taille de pores de 0,45 μm et une membrane en polyéthersulfone (PES) pour minimiser la rétention de particules virales sur la membrane filtrante.

2. Infection rétrovirale des lymphocytes T CD4 + activés et différenciation Th17

  1. Préparer et activer les lymphocytes T CD4+ primaires naïfs
    1. Enduire chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits avec 2 μg/mL d’anti-CD3e et 4 μg/mL d’anti-CD28 dans du PBS stérile de 500 μL, envelopper la plaque dans un parafilm pour éviter l’évaporation et la contamination, puis incuber la plaque à 4 °C pendant la nuit (ou à 37 °C pendant 1 à 2 heures avant d’ensemencer les lymphocytes T CD4+ naïfs) la veille de l’isolement des lymphocytes T CD4+ naïfs.
      REMARQUE : Cette étape est nécessaire pour effectuer une stimulation liée à la plaque pour les cellules T de souris avant d’effectuer la transduction virale.
    2. Le lendemain, euthanasier par asphyxie au CO2 des souris exprimant Cas9 âgées de 6 à 8 semaines (souris R26-CAG-Cas9) et les stériliser avec de l’éthanol à 70 %.
    3. Récoltez la rate de souris et placez-la dans du PBS avec 2 % de FBS et 100 μM EDTA (tampon FACS).
    4. Broyez la rate avec du verre dépoli stérilisé (côté mat) dans le tampon FACS, homogénéisez le tissu en une suspension unicellulaire et filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un tube de 50 ml.
      REMARQUE : Assurez-vous de broyer le mouchoir doucement et régulièrement pour garder le mouchoir humide. Le broyage violent des tissus peut affecter considérablement la survie cellulaire.
    5. Faites tourner la suspension de cellules spléniques à 800 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges. Laissez reposer à température ambiante pendant 5 min, puis ajoutez le tampon FACS pour atteindre un volume total de 15 ml. Centrifuger les splénocytes à 800 × g pendant 5 min.
    6. Remettre les splénocytes en suspension et les filtrer à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Ajustez le volume final à 1 mL pour l’isolement des lymphocytes T CD4+ .
    7. Isolez les lymphocytes T CD4+ à l’aide de trousses de réactifs commerciales en suivant les instructions du manuel.
    8. Étiquetez les lymphocytes T CD4+ avec un mélange d’anticorps fluorescents (CD4, CD25, CD44 et CD62L) à 4 °C pendant 30 min, lavez les cellules avec un tampon FACS et isolez les lymphocytes T CD4+ naïfs à l’aide d’un trieur de cellules à flux. Cela se traduira par l’obtention de lymphocytes T CD4+CD25-CD62L à CD44 faiblementnaïfs.
    9. Retirer le surnageant de stimulation lié à la plaque de la plaque de culture cellulaire à 24 puits (préparée à l’étape 2.1.1) et rincer chaque puits deux fois avec 500 μL de PBS. Plaque 1 x 106 lymphocytes T CD4+ naïfs dans 1 mL de milieu de culture lymphocytaire dans un puits de la plaque de culture cellulaire à 24 puits. Incuber les cellules dans l’incubateur cellulaire.
      REMARQUE : Le milieu de culture lymphocytaire contient 10 % de FBS, 100 unités/ml de pénicilline et 0,1 mg/ml de streptomycine, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM d’HEPES et 50 μM de β-ME dans le milieu RPMI 1640.
  2. Infection rétrovirale
    1. Après 18 à 24 h, recueillir chaque puits de cellules activées dans le tube de 1,5 ml. Centrifuger à 800 × g pendant 5 min et jeter le surnageant.
    2. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de mélange infectieux (10 μg/mL de bromure d’hexadiméthrine, 10 mM de HEPES dans le surnageant du virus) et ajouter 1 mL du mélange dans un nouveau puits d’une plaque de culture cellulaire de 48 puits. Entre-temps, conservez suffisamment de cellules comme témoin négatif (non transduit).
      REMARQUE : Il est possible d’avoir moins de 1 x 106 lymphocytes T CD4+ naïfs activés par puits, mais il n’est pas recommandé d’utiliser moins de 0,5 x 106 cellules par puits. De plus, aucune cellule ne doit être ensemencée dans les puits périphériques de la plaque de culture à 48 puits.
    3. Enveloppez la plaque avec du parafilm et centrifugez-la à 800 x g pendant 90 min à 32 °C. Réglez l’accélération et la décélération à 3. Après la centrifugation, retirez le parafilm, incubez les cellules dans l’incubateur pendant 4 h et procédez aux étapes de différenciation.
  3. Différenciation des cellules infectées en cellules Th17
    1. Préparer les cellules présentatrices d’antigène (CPA) lors de l’infection rétrovirale. Tout d’abord, obtenez des splénocytes de souris de type sauvage en suivant les instructions des étapes 2.1.2 à 2.1.4. Remettre les splénocytes en suspension avec 1 mL de milieu de culture lymphocytaire avec 50 μg/mL de mitomycine dans un tube de 15 mL. Incuber les splénocytes à 37 °C sous 5 % de CO2 pendant 1 h.
    2. Une heure plus tard, ajouter du PBS jusqu’à 15 mL pour laver les splénocytes, centrifuger à 800 x g pendant 5 min, jeter le surnageant, remettre les splénocytes en suspension avec 1 mL de milieu de culture lymphocytaire et compter le nombre de cellules. Les cellules APC ont été préparées avec succès.
    3. Après les 4 h d’incubation cellulaire (comme à l’étape 2.2.3), prélever les lymphocytes T CD4+ transduits dans des tubes de 1,5 mL et les centrifuger à 800 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant et mettez à nouveau en suspension les cellules infectées dans 600 μL de PBS pour les laver. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
    4. Placer 0,5 × 106 lymphocytes T CD4+ transduits dans 1 mL de milieu de culture lymphocytaire avec 1,5 x 10cellules APC 6 dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Compléter avec 2 μg/mL d’anti-CD3e, 2 μg/mL d’anti-CD28 et un cocktail de différenciation cellulaire Th17, qui contient 10 μg/mL d’anti-IFNγ, 10 μg/mL d’anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/mL d’anti-IL4, 2,5-3 ng/mL de hTGF-β et 20-30 ng/mL d’IL-6. Cellules de culture pendant 2 jours.
    5. Prélever chaque puits de cellules dans les tubes de 1,5 mL, centrifuger à 800 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Rafraîchir 1 mL du milieu de culture lymphocytaire uniquement avec 3 ng/mL de TGF-β et 30 ng/mL d’IL-6. Placez les cellules dans un nouveau puits de plaque de culture cellulaire à 24 puits pour une période de culture prolongée. Analysez les cellules 2 jours après le changement de milieu.

3. Évaluation de l’efficacité de la transduction et des résultats de différenciation

  1. Après deux jours de changement de milieu, prélever les cellules et centrifuger à 800 × g pendant 5 minutes et jeter le surnageant. Traitez des cellules différenciées avec 50 ng/mL de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), 500 ng/mL d’ionomycine et 5 μg/mL de brefeldine A dans 500 μL de milieu de culture lymphocytaire dans un nouveau puits de 24 puits de plaque de culture cellulaire à 37 °C incubateur pendant 4 h. Récoltez la moitié des cellules pour l’analyse par cytométrie en flux et lysez l’autre moitié des cellules avec un tampon d’extraction d’ARN pour l’analyse qPCR.
  2. Pour l’analyse par cytométrie en flux
    1. Rassemblez les cellules dans des tubes de 1,5 ml. Ajouter 1 mL de tampon FACS dans des tubes et centrifuger à 800 × g pendant 5 min pour laver les cellules.
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un mélange d’anticorps fluorescents (CD4 et colorant de viabilité fixable dans 100 μL de PBS) et colorer les cellules à 4 °C pendant 30 min.
    3. Lavez les cellules avec 300 μL de PBS et fixez-les avec 300 μL de formaldéhyde (FA) tamponné au phosphate à 2 % à 4 °C pendant au moins 60 min.
    4. Une heure plus tard, lavez les cellules avec du PBS, mettez-les en suspension avec 600 μL de tampon de perméabilisation 1x et centrifugez à 800 × g pendant 5 min.
    5. Jeter le surnageant et le colorer avec de l’anti-IL-17A dans 100 μL de 1x tampon de perméabilisation pendant 60 min à température ambiante ou 4 °C pendant la nuit.
    6. Le lendemain, lavez les cellules avec 1x tampon de perméabilisation et mettez-les en suspension dans 200 μL de PBS. Analyser les cellules par cytométrie en flux10. Voir la section Résultats représentatifs.
  3. Pour l’analyse qPCR, extrayez l’ARN en suivant les instructions du kit d’extraction d’ARN. Transcrire l’ARN en ADNc pour le stockage ou l’analyse qPCR ultérieure. La conception de ces amorces doit respecter les principes généraux de conception des amorces qPCR tout en ciblant spécifiquement la région couvrant le site indel attendu, où le clivage médié par l’ARNg s’est produit. Toute réduction de l’efficacité de l’amplification ou perte de signal à ce site peut servir d’indicateur de réussite de l’inactivation. Les amorces qPCR sont les suivantes :
    Rorc F : TCCACTACGGGGTTATCACCT ; R : AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F : TCAGCGTGTCCAAACACTGAG ; R : CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Résultats

Dans l’étude, nous avons cloné la cible de l’ARNsg en séquences codantes non ciblées de Rorc et d’ARNsg dans le vecteur pMX-U6-MCS avec la protéine fluorescente mCherry (Figure 1A,B). La production de rétrovirus a été effectuée selon le protocole décrit à la figure 2. La transfection a été amorcée le jour 0 et la récolte rétrovirale a eu lieu le jour 2. L’efficacité de la transfection peut être testée par l’intensité de fluorescence mCherry (Figure 1C). Avant de récolter le virus, des lymphocytes T CD4+ naïfs ont été triés et activés. Ces lymphocytes T CD4+ activés ont ensuite été infectés par infection de spin, suivie de la poursuite des étapes de différenciation décrites ci-dessous. Enfin, l’efficacité de la transduction et les résultats de la différenciation ont été évalués à l’aide de l’analyse par cytométrie en flux et de l’analyse qPCR.

La figure 3 illustre la stratégie de contrôle appliquée pour trier les lymphocytes T CD4+ naïfs. Après avoir sélectionné la population cellulaire principale et les cellules singulet (comme le montrent les deux premières portes de la figure 3), les cellules FVD-CD4+ ont été contrôlées pour distinguer les cellules T CD4 polarisées en cellules Th17 de celles des APC. Enfin, l’IL-17A produite par les lymphocytes T CD4 représente l’efficacité de différenciation Th17, ce qui indique l’efficacité de knock-out. Le pourcentage de cellules mCherry positives reflète l’efficacité de l’infection rétrovirale, tandis que l’efficacité de l’inactivation est indiquée par le pourcentage de cellules IL-17A positives. Afin d’améliorer la viabilité cellulaire et de minimiser la durée du tri, les splénocytes ont été enrichis à l’aide d’un kit d’isolement de lymphocytes T CD4+ de souris, ce qui a permis d’obtenir une efficacité d’enrichissement supérieure à 90 %.

L’efficacité de l’infection par le rétrovirus, indiquée par la présence de cellules mCherry-positives, est généralement d’environ 40 % (Figure 4A). Bien que l’efficacité de l’infection puisse être augmentée par la concentration du virus, cette approche se fait au détriment d’une durée d’expérimentation prolongée et de coûts plus élevés. Dans nos expériences, des cellules infectées cultivées sans le cocktail de différenciation cellulaire Th17 ont servi de contrôle négatif de différenciation Th17, désigné comme Th0. Un ARNsg non ciblé a été utilisé comme témoin positif, appelé sgNT. Pour l’édition de gènes, nous avons utilisé l’ARNg ciblant le gène RORγt (sgRNA-Rorc), ce qui a considérablement réduit l’efficacité de la différenciation Th17 (Figure 4A). Cette intervention a également entraîné une diminution substantielle des niveaux d’expression de Rorc et d’IL-17a (Figure 4B).

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Figure 1 : Exemple de sous-clonage d’ARNsg dans un vecteur rétroviral et efficacité de transfection. Le vecteur pMX-U6-MCS a été utilisé comme construction initiale. L’échafaudage de l’ARNg, ainsi que les séquences de l’ARNsg (la partie orange) ciblant le site brouillé (A) et (B) le Rorc, ont été insérés en aval du promoteur U6 (la partie verte sous forme de section pour le séquençage avec des amorces U6). L’emplacement des amorces contenant de l’ARNsg et les sites des amorces de séquençage sont indiqués sous le vecteur circulaire. Les noms complets des abréviations sur le plasmide sont les suivants. Abréviations : AmpR = résistance à l’ampicilline, à la carbénicilline et aux antibiotiques apparentés ; LTR = répétition terminale longue ; MMLVψ = signal d’emballage du virus de la leucémie murine de Moloney ; gag = gène gag tronqué du virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV) dépourvu du codon de départ. (C) Imagerie microscopique de mCherry dans des cellules Plat-E transfectées d’ADN plasmidique. Barre d’échelle : 500 px. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Illustration schématique du protocole. La veille de la transfection, la densité des cellules Plat-E doit être ajustée à une plage appropriée. Le lendemain (jour 0), effectuez la transfection et le remplacement du fluide 12 h plus tard. Le jour 1, triez et activez les lymphocytes T naïfs de souris exprimant Cas9. Par la suite (jour 2), récoltez le surnageant de culture contenant le virus et combinez-le avec les lymphocytes T activés pour la transduction rétrovirale. Les cellules infectées sont ensuite différenciées en cellules Th17 pendant 3 à 4 jours et analysées à l’aide de FACS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Stratégie de contrôle pour trier les lymphocytes T naïfs de CD4. Une coloration de surface a été effectuée sur les lymphocytes T CD4 enrichis pour marquer CD4, CD25, CD44 et CD62L. La stratégie de déclenchement employée était la suivante : initialement, les lymphocytes étaient bloqués en fonction des paramètres de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale. Par la suite, des cellules uniques ont été identifiées à l’aide du FSC-H et du FSC-W. Les cellules CD4+CD25- ont ensuite été contrôlées pour exclure les cellules T régulatrices (Tregs). Enfin, des lymphocytes TCD44 faiblementCD62Lnaïfs ont été identifiés. Les lymphocytes T isolés naïfs CD4+ ont été prélevés pour des expériences ultérieures. Abréviations : FSC = diffusion vers l’avant ; SSC = diffusion latérale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Exemple de transduction réussie de lymphocytes T activés et de différenciation Th17. (A) L’efficacité de différenciation de Th17 est considérablement réduite, ce qui est modifié par l’ARNg RORγt (gating on mCherry+ IL-17a+population). (B) Expression de l’ARNm relatif à Rorγt et IL-17a dans Th0 (cellules infectées cultivées sans cocktail de différenciation cellulaire Th17), sgNT (sgRNA non ciblant) et sgRNA-Rorc (sgRNA ciblant le gène RORγt ). p < 0,001 (test t de Student bilatéral non apparié ; les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composants de réaction PCRProgramme PCR
ComposantVolume (μL)PasIntérimaire.HeureCycle
2 × Phanta Mix (Dye Plus)25195 ºC3 minutes1
jjH2020295 ºC15 s
Amorce-F (10 μM)2356 ºC15 s
Amorce-R (10 μM)2472 ºC5 min 30 sPassez à l’étape 2
35 ×
Modèle (~30 ng)1572 ºCDurée : 5 minutes1
612 ºC∞

Tableau 1 : Composants de réaction PCR et programme PCR pour la construction de vecteurs d’ARNg.

Discussion

L’édition du génome CRISPR/Cas9 par administration rétrovirale est une méthode robuste pour explorer les rôles des lymphocytes T auxiliaires. Ce protocole offre une approche rapide et efficace pour examiner des gènes spécifiques impliqués dans la différenciation et la fonction de Th17. Plusieurs étapes critiques doivent être soigneusement suivies pour obtenir des résultats optimaux. Tout d’abord, pour une meilleure efficacité de l’inactivation des gènes, les ARNg doivent être soigneusement sélectionnés. Compte tenu du risque d’effets hors cible dans l’édition du gène CRISPR/Cas9, il est prudent de choisir 2-3 ARNg avec des scores élevés, comme identifié dans la section 1.1.1 du protocole, pour des expériences ultérieures11,12. Deuxièmement, un titre viral élevé est essentiel pour une infection réussie. Il est essentiel d’assurer un bon entretien de la lignée cellulaire d’emballage Plat-E. Les cellules devraient atteindre environ 80 % de confluence le jour de la transfection, car un nombre insuffisant ou excessif de cellules compromettra les titres viraux. Si les cellules Plat-E ne sont pas disponibles, la co-transfection des cellules 293T du rein embryonnaire humain avec le vecteur pCL-Eco peut également produire des titres viraux élevés13,14. Le maintien d’une concentration élevée de plasmide d’au moins 1 μg/μL est important pour obtenir un titre de virus élevé. Il est essentiel de récolter la suspension virale avant qu’elle ne devienne jaune citron, car le virus présente une sensibilité à l’altération du pH. Par conséquent, le pH du milieu de culture doit être soigneusement régulé dans une plage appropriée. Le virus doit être stocké à -80 ºC pour conserver son intégrité et à l’abri des cycles répétés de gel-dégel15.

Troisièmement, pour atteindre une efficacité d’infection élevée, les cellules primaires doivent être activées de manière adéquate. Une activation cellulaire inadéquate compromet considérablement l’efficacité de l’infection virale16. Avant l’infection virale, le statut d’activation des lymphocytes T doit être confirmé au microscope, car les cellules activées présentent une taille nettement plus grande que les cellules inactivées. Il convient de noter que notre protocole de différenciation Th17 a été spécifiquement optimisé pour les souris C57BL/6, de sorte que des ajustements peuvent être nécessaires pour d’autres souches de souris. Quatrièmement, pour obtenir les résultats souhaités de différenciation Th17, il est crucial de maintenir des conditions cellulaires optimales. Lors d’une infection par spin, il est important de placer les cellules dans les puits près du centre pour aider à maintenir la viabilité cellulaire. Après une infection par spin, l’incubation des cellules pendant 4 h (étape du protocole 2.2.4) est cruciale pour leur rétablissement. De plus, lors du transfert de cellules, un pipetage doux est important pour maintenir la viabilité cellulaire. Différentes conditions de stimulation peuvent avoir un impact sur la différenciation de Th17. Dans cette expérience, l’incorporation de cellules présentatrices d’antigènes dans le système de différenciation a significativement amélioré l’efficacité de la différenciation par rapport à la stimulation sur plaque anti-CD3e et anti-CD28. Enfin, il est crucial de s’assurer que toutes les cytokines utilisées restent fonctionnelles pendant le transport et le stockage. Les cytokines peuvent rapidement perdre leur stabilité lors de cycles de gel-dégel répétés ou de solutions de reconstitution inappropriées. Un traitement par le froid et des aliquotes égales sont nécessaires pour que les cytokines conservent leurs fonctions tout au long des procédures.

Ce protocole de génération de cellules Th17 spécifiques a plusieurs limites. Tout d’abord, il est difficile d’obtenir une efficacité de transduction complète dans les lymphocytes T primaires de souris. Certaines cellules peuvent ne pas subir l’inactivation génique prévue lors de la différenciation Th17. Deuxièmement, les lymphocytes T primaires ont une durée de vie limitée in vitro. Après environ une semaine, ces cellules ont tendance à mourir, ce qui pose des défis pour les expériences ultérieures. Troisièmement, notre protocole repose sur des souris transgéniques Cas9 et lorsque nous avons tenté d’incorporer la séquence Cas9 dans le plasmide de base, cela a entraîné une réduction significative des titres viraux. Enfin, nous remarquons que ce protocole n’est pas adapté à l’analyse des fonctions des gènes impliqués dans les premiers stades de l’activation des lymphocytes T CD4+ naïfs, car ces cellules doivent être activées avant la transduction rétrovirale.

Malgré ses limites, ce protocole a été appliqué avec succès dans diverses études, facilitant l’exploration des principaux régulateurs génétiques impliqués dans la différenciation des Th17. Il permet d’évaluer les changements dans l’efficacité de la différenciation Th17 après l’inactivation des gènes cibles dans les lymphocytes T activés. De plus, ce protocole convient à l’évaluation d’autres aspects de la fonction des cellules Th17, notamment la prolifération cellulaire, la survie, la stabilité des facteurs de transcription, la sécrétion de cytokines et les réponses immunitaires. De plus, notre laboratoire a démontré son efficacité dans la transduction rétrovirale et la différenciation des lymphocytes T régulateurs induits (iTregs). Bien que tous les types de lymphocytes T n’aient pas été testés, ce protocole peut également être applicable à d’autres sous-ensembles, tels que les lymphocytes T Th1, Th2 et CD8+ . Dans l’ensemble, cette technique constitue un outil précieux pour effectuer des knock-outs de gènes dans les cellules immunitaires, offrant un potentiel important pour découvrir des signaux génétiques critiques qui régulent les fonctions immunitaires.

Déclarations de divulgation

Les auteurs affirment qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Dou Liu, Dongliang Xu et Pinpin Hou de l’établissement central de l’Institut d’immunothérapie de Shanghai pour leur soutien dans l’utilisation des instruments. Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine 31930038, U21A20199, 32100718 et 32350007 (à Linrong Lu) ; 32100718 (à Xuexiao Jin) ; Équipe de recherche innovante d’universités locales de haut niveau à Shanghai SHSMU-ZLCX 20211600 (à Linrong Lu) ; Programme d’incubation interne RJTJ24-QN-076 (à Zejin Cui). La figure 2 a été préparée avec Figdraw.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTA (pH 8,0)SolarbioE1170
Plat de culture cellulaire et tissulaire 100 mmBIOFILTCD010100
1 M Hepes (acide libre, stérile)SolarbioH1090
Plaque de culture cellulaire et tissulaire 24 puitsNEST702002
48 puits Plaque de culture cellulaire et tissulaireNEST748002
Brefeldin Une solution (1 000x)Anticorps
Brilliant Violet 650 (RM4-5)BioLegend100546
CD3e (145-2C11), grade fonctionnel, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
Anticorps monoclonal CD44 (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
Anticorps monoclonal CD62L (L-Selectin) (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82  ;
Compteur de cellulesNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 &mu ; m)Filtre cellulaire biosharpBS-40-CS
(70 &mu ; m)biosharpBS-70-CS
  ;eppendorf5425  ; Centrifugeuse R
  ;eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II Kit de clonage en une étapeVazymeC112
DH5&alpha ; Cellules compétentesSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation KitSTEMCELL19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit IITIANGENDP118-02
ExFect Réacteur de transfectionVazymeT101-01
Sérum de veau fœtal, Premium Plus GibcoA5669701
FITC anti-souris IL-17A Anticorps (TC11-18H10.1)BioLegend506907
Solution de formaldéhydeMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix pour qPCR ?+essuie-glace d’ADNg?VazymeR423-01
IonomycineBeyotimeS1672
Mitomycine CMaokang Biotechnology7/7/1950
Souris GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Sérum réduit MediumGibco31985070sérum réduit
Medium Pacific Blue anticorps anti-souris CD4 (RM4-5)BioLegend
Anticorps anti-souris CD25 PE/Cyanine7 (PC61)BioLegend102015
Anticorps CD4 anti-souris PE/Cyanine7 (GK1.5)BioLegend100422
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15140122
PMA/TPA  ;BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 souris  ;Centre d’organismes modèles de ShanghaiN° de catalogue NM-KI-00120
Protéine TGF-bêta 1 humaine recombinante (exprimée par CHO), CFR& D Systems11409-BH
Analyseur de cellules de recherche Recombinant Murine IL-6PeproTech216-16
BD BiosciencesBD LSRFortessa
Trieur de cellules de rechercheSONYMA900
RPMI 1640 MediumBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Thermal Cycler Système PCRApplied BiosystemsA24811
Solution de pyruvate de sodium (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Purifié anti-souris CD28 Anticorps (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Purifié anti-souris IFN-&gamma ; Anticorps (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Anticorps anti-souris IL-4 purifié (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Purified anti-souris IL-12/IL-23 p40 Anticorps (C17.8)BioLegend505309
&beta ;-Mercaptoethanol (50 mM)SolarbioM8211
CD4 anti-souris BioLegend 420601 Anticorps monoclonal 100531

Références

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  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Transduction r troviralelymphocytes T CD4cytom trie en fluxpolarisation in vitroROR gamma TARN guide uniquer gulation immunitaire
Ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour l’étude de la différenciation Th17 in vitro
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