Article de méthode

Électroporation à base de substrat poreux avec surveillance de l’impédance électrique transépithéliale

DOI :

10.3791/66971

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27 septembre 2024

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1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’électroporation de substrat poreux (PSEP) associe une distribution constante et à haut débit à une viabilité élevée des cellules. L’introduction de mesures d’impédance électrique transépithéliale (TEEI) donne un aperçu des processus intermédiaires du PSEP et permet une administration sans étiquette. Cet article traite d’une méthode permettant d’effectuer simultanément des expériences d’administration PSEP et une analyse de mesure TEEI.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’électroporation sur substrat poreux (PSEP) est une méthode émergente d’électroporation qui offre un débit élevé et une livraison constante. Comme de nombreux autres types d’administration intracellulaire, le PSEP s’appuie fortement sur des marqueurs fluorescents et la microscopie fluorescente pour déterminer la réussite de l’administration. Pour mieux comprendre les étapes intermédiaires du processus d’électroporation, une plateforme PSEP avec surveillance intégrée de l’impédance électrique transépithéliale (TEEI) a été développée. Les cellules sont cultivées dans des inserts disponibles dans le commerce avec des membranes poreuses. Après une période d’incubation de 12 h pour permettre la formation d’une monocouche cellulaire entièrement confluente, les inserts sont placés dans un milieu de transfection situé dans les puits du dispositif PSEP. Les monocouches cellulaires sont ensuite soumises à une forme d’onde définie par l’utilisateur, et l’efficacité de distribution est confirmée par la microscopie fluorescente. Ce flux de travail peut être considérablement amélioré grâce à des mesures TEEI entre la microscopie pulsée et la microscopie fluorescente pour collecter des données supplémentaires sur le processus PSEP, et ces données TEEI supplémentaires sont corrélées avec des paramètres de livraison tels que l’efficacité et la viabilité de la livraison. Cet article décrit un protocole permettant d’effectuer des mesures PSEP avec TEEI.

Introduction

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L’électroporation est une technique dans laquelle les cellules sont exposées à un champ électrique, créant des pores temporaires dans la membrane cellulaire à travers lesquels les marchandises, y compris les protéines, l’ARN et l’ADN, peuvent passer 1,2. La version la plus utilisée est l’électroporation en vrac (BEP). La PEB est réalisée en remplissant une cuvette avec un électrolyte contenant des millions de cellules, en exposant l’électrolyte à une haute tension et en permettant à la cargaison de pénétrer dans les cellules par diffusion ou endocytose1. Les BEP présentent de nombreux avantages, notamment un débit élevé et de nombreux systèmes disponibles dans le commerce. Cependant, il existe des limites à la livraison du BEP. Le positionnement incohérent des cellules par rapport aux électrodes et le blindage du champ électrique par rapport aux cellules adjacentes entraînent une variabilité significative de l’exposition au champ électrique pendant les PEB3 et 4. La haute tension requise pour le BEP a également un impact négatif significatif sur la viabilité des cellules5. Depuis sa création en 20116, il y a eu un intérêt croissant pour une méthode d’électroporation appelée électroporation sur substrat poreux (PSEP), bien qu’elle soit parfois désignée par d’autres noms, notamment l’électroporation localisée et la nano- ou micro-électroporation 1,7,8. Contrairement à la suspension cellulaire de BEP, la PSEP est réalisée sur des cellules qui adhèrent à un substrat poreux. Non seulement un état d’adhérence est préféré pour la majorité des lignées cellulaires humaines9, mais les pores du substrat se concentrent également sur le courant électrique, localisant le potentiel électrique transmembranaire (TMP) dans des régions spécifiques de la membrane cellulaire10,11. Cette localisation permet une réduction significative de la tension appliquée, diminuant les dommages et augmentant la viabilité des cellules. Cette combinaison d’effets aide à contrôler le développement des pores de la membrane cellulaire, ce qui se traduit par une administration plus cohérente et plus efficace 1,5,12.

Une étude récente a présenté un dispositif PSEP doté d’un réseau d’électrodes plaquées or à six puits pour maintenir des inserts de membrane poreuse disponibles dans le commerce13 (figures 1A, B), une pratique qui a été introduite pour la première fois par Vindis et al.14. L’appareil peut appliquer des impulsions et mesurer l’impédance électrique à travers la monocouche de cellule, connue sous le nom d’impédance électrique transépithéliale (TEEI), en temps réel13. L’interface utilisateur de l’appareil permet un contrôle total de la forme d’onde et de la polarité de l’électroporation. Il est important de noter que les mesures d’impédance en temps réel peuvent être utilisées pour prédire les résultats de l’administration sans avoir besoin de réactifs coûteux ou de marqueurs fluorescents, un concept connu sous le nom d’administration sans marquage15.

La plate-forme PSEP se compose de deux principaux composants électriques personnalisés : le corps principal de l’appareil, qui abrite le générateur d’impulsions et l’équipement de mesure TEEI, et le réseau d’électrodes, où les substrats poreux sont insérés et où l’électroporation se produit. Des diagrammes pour tous les composants électroniques personnalisés et imprimés en 3D peuvent être trouvés sur GitHub : https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. En plus de l’électronique personnalisée, un ordinateur est également nécessaire au bon fonctionnement de la plate-forme. Le logiciel personnalisé nécessite MATLAB (version 2021a ou ultérieure) pour s’exécuter, et Microsoft Excel pour stocker et accéder aux données à des fins d’analyse. Le programme contrôle l’électronique personnalisée et fournit l’interface utilisateur graphique (GUI) pour ajuster les paramètres. Ces programmes ont également été mis à disposition sur GitHub : https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

Les données préliminaires suggèrent que ce processus est possible pour différents types de cellules adhérentes (Figure 1C), mais cet article ne traitera que de la préparation des cellules A431 à l’aide de paramètres qui se sont avérés optimaux pour cette lignée cellulaire par Brooks et al.13. De plus, comme la cargaison d’iodure de propidium (PI) est cytotoxique, deux expériences sont réalisées, la première avec un milieu de transfection PI à haute concentration pour quantifier l’efficacité de l’administration, et la seconde avec uniquement des milieux de culture cellulaire pour mesurer l’EIEO sur des échelles de temps plus longues. Ces expériences utilisent des formes d’onde d’électroporation identiques, ce qui permet de corréler les résultats (Figure 1D).

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Figure 1 : Schéma d’assemblage du réseau d’électrodes et données de base. (A) Modèle CAO d’un insert à l’intérieur d’un puits du réseau d’électrodes. (B) Modèle CAO du réseau d’électrodes. (C) Augmentation de l’impédance due au PSEP pour certaines lignées cellulaires, n = 3 par lignée cellulaire. Barre d’erreur : erreur type de la moyenne. (D) Efficacité de la livraison vs. TEEI augmenter les données de corrélation. L’efficacité de livraison a été calculée en divisant le nombre de cellules étiquetées dans les images PI et calcein des expériences de livraison par le nombre total de cellules identifiées avec Hoechst. Le nombre de cellules a été déterminé à l’aide d’un pipeline CellProfiler personnalisé, n = 6 par tension. Barre d’erreur : erreur type (axes x et y) de la moyenne. Cette figure est reproduite à partir de Brooks et al.13 avec autorisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des réactifs et culture cellulaire

  1. Préparez le milieu de culture cellulaire en ajoutant 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de pénicilline-streptomycine dans un contenant de 500 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM). Produire onze aliquotes de 50 mL pour réduire le risque de contamination et réfrigérer à 4 °C.
  2. Créer 1 mL de 25 μg/mL de fibronectine plasmatique humaine dans une solution mère de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) selon les instructions du fabricant.
  3. Créer 15 mL d’iodure de propidium à 0,1 mg/mL dans une solution mère de DMEM pour permettre des expériences avec des concentrations de cargaison variables.
  4. Cultiver des cellules A431 dans une fiole T75 contenant 12 mL du milieu de culture cellulaire préparé. Les cellules ont été passées tous les 1 à 2 jours pour maintenir une confluence de 50 %.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Enrobage de fibronectine
    1. Sélectionnez douze inserts et deux plaques à 24 puits. Placez les inserts dans une plaque à puits, en créant deux rangées de six. Mettez la deuxième assiette de côté pour plus tard.
    2. Créez 1 300 μL de solution de fibronectine de 1 μg/mL en mélangeant 52 μL de solution mère de fibronectine et 1 248 μL de PBS dans un tube de 1,5 mL.
    3. Répartissez 100 μL de la solution de fibronectine dans chaque insert. Incuber les inserts dans la plaque du puits à 37 °C pendant 3 h.
  2. Ajuster la concentration cellulaire pour optimiser la densité cellulaire
    1. Environ 1 h avant la fin de l’incubation de la fibronectine, retirez le flacon T75 de cellules A431 de l’incubateur pour l’extraction des cellules.
    2. Retirer le support dans le ballon à l’aide d’un aspirateur et laver avec 5 mL de PBS. Retirez le PBS de la même manière et ajoutez 3 ml de trypsine. Incuber pendant 3-4 min avant de tapoter le côté de la fiole pour détacher complètement les cellules.
    3. Ajouter 6 mL de milieu de culture cellulaire dans le ballon, en mélangeant vigoureusement avec une pipette pour détacher les cellules restantes, et transférer le contenu dans un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifugeuse à 100 x g et 20 °C pendant 5 min.
    4. Retirez le milieu de culture cellulaire et la trypsine du tube de centrifugation à l’aide d’un aspirateur, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire. Ajoutez 1 mL de milieu dans le tube à centrifuger et pipetez d’avant en arrière (sans produire de bulles) pour briser la pastille de la cellule et remettre les cellules en suspension.
    5. Pipeter 10 μL de suspension cellulaire, 40 μL de milieu de culture cellulaire et 50 μL de colorant bleu trypan dans un tube de 200 μL, à l’aide d’une pipette pour bien mélanger.
    6. Prélever 10 μL du mélange de colorant et l’injecter dans un hémocytomètre. Comptez les cellules en utilisant la dilution de 10 % du mélange de colorants pour estimer le nombre total de cellules dans le tube à centrifuger de 15 ml.
      REMARQUE : Pour ce protocole, supposons une concentration de 5 000 000 cellules/mL.
    7. Multipliez la densité de semis souhaitée par la surface de la membrane de l’insert, divisez par le nombre de cellules/mL dans la suspension et multipliez par 1 000 pour calculer les microlitres de suspension de cellules nécessaires par insert.
      1. Pour déterminer la quantité totale de suspension cellulaire requise, multipliez ce chiffre par 10 (pour vous assurer qu’il y a suffisamment de cellules pour 9 échantillons, car 3 des 12 inserts seront des témoins sans cellules) et arrondissez au nombre entier le plus proche. Dans ce cas, un total de 135 μL de suspension cellulaire est nécessaire pour cette expérience.
    8. Créez 2 000 μL de solution cellulaire ajustée en mélangeant les 135 μL précédemment calculés de la suspension cellulaire avec 1 865 μL de milieu de culture cellulaire dans un tube à centrifuger séparé de 15 mL.
  3. Cellules d’ensemencement
    1. Retirez l’excès de fibronectine de chaque insert une fois l’incubation de fibronectine terminée.
    2. Lavez les inserts deux fois en ajoutant 100 μL d’eau distillée stérile dans chaque insert. Retirez l’eau en suivant le même ordre que celui dans lequel elle a été ajoutée pour assurer un temps de lavage constant entre les inserts.
    3. Lavez à nouveau l’insert en ajoutant 100 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque insert. Retirez le support en suivant le même ordre qu’il a été ajouté pour assurer un temps de lavage constant entre les inserts.
    4. Inserts d’échantillons de cellules
      1. Ensemencer les cellules en pipetant 200 μL de solution cellulaire ajustée dans chaque insert. Pour assurer une confluence constante entre les inserts, mélangez la solution cellulaire dans le tube à centrifuger avant la distribution et mélangez à nouveau dans chaque insert après la distribution.
    5. Inserts de contrôle négatif
      1. Pipeter 200 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque insert. Pour rester cohérent avec les inserts d’échantillons cellulaires, utilisez la pipette pour mélanger les milieux de culture cellulaire à l’intérieur de chaque insert.
  4. Étiquetage et incubation
    1. Tracez une ligne divisant la deuxième plaque de puits en deux colonnes de trois puits de large (pour les conditions exécutées en trois exemplaires) à l’aide d’un marqueur permanent. Séparez chaque colonne en rangées. Étiquetez chaque région de la grille avec les paramètres appropriés.
    2. Ajoutez 1 ml de milieu de culture cellulaire dans chaque puits pour recevoir un encart pour l’expérience. Transférez les inserts de la plaque du puits de préparation à leur emplacement approprié dans la plaque du puits d’expérience étiquetée et incubez à 37 °C pendant au moins 12 h.

3. Procédure expérimentale

  1. Expérience d’accouchement
    1. Pipeter 1,5 mL de la solution d’IP à 0,1 mg/mL dans chaque puits du réseau d’électrodes. Placez un insert dans chaque puits du réseau d’électrodes, en insérant les pieds de l’insert dans les rainures d’alignement de sorte que l’insert affleure la surface supérieure du puits (Figure 1A,B).
    2. Vissez la carte de circuit imprimé (PCB) de l’électrode supérieure sur le dessus des puits du réseau d’électrodes et connectez le réseau d’électrodes au dispositif PSEP.
    3. Placez le réseau d’électrodes dans l’incubateur à 37 °C pendant au moins 1 h pour permettre à la température de s’équilibrer.
    4. Cliquez sur le menu déroulant à côté de « Membrane » dans le coin supérieur gauche de l’interface graphique et cliquez sur 400 nm GBO. Répétez cette étape pour « Électrolyte », « Cellules », « Densité d’ensemencement cellulaire » et « Durée de cellule », en sélectionnant DMEM, A431, 200 et 12, respectivement.
      REMARQUE : Ces valeurs sont uniquement à des fins d’enregistrement et n’ont pas d’impact sur le fonctionnement de l’appareil. Assurez-vous d’ajuster ces valeurs si nécessaire pour un suivi correct des données.
    5. Tapez 1 dans le champ d’édition Durée post-impulsion (min) sur le côté droit de l’interface graphique pour changer le temps de mesure post-impulsion par défaut à 1 min. Laissez tous les autres paramètres dans l’état par défaut.
      REMARQUE : Les paramètres d’impulsion par défaut créent une forme d’onde carrée de 30 volts, 20 Hz, d’une durée de 1 ms et de 200 impulsions. Les paramètres de mesure TEEI par défaut sont 0,5 volts et 100 Hz, 1 000 Hz, 10 000 Hz et 100 000 Hz.
    6. Cliquez sur le bouton Exécuter et entrez les noms appropriés pour les puits 1-3 et 4-6 lorsque vous y êtes invité. Cliquez sur OK pour démarrer l’expérience.
    7. Retirez le réseau d’électrodes de l’incubateur et transférez les inserts aux emplacements d’origine dans la plaque du puits d’expérience lorsque le programme a fini de s’exécuter.
    8. Mélangez 2 μL de Hoechst 33342 et 5 μL de calcéine AM avec 123 μL de milieux de culture cellulaire dans un tube de 200 μL.
    9. Pipeter doucement 10 μL de la solution de coloration dans chaque insert post-impulsion et remettre les inserts dans l’incubateur pendant 5 min.
    10. Transférez la plaque de puits sur le support de plaque d’un microscope fluorescent avec un objectif à grossissement 5x. Image en fond clair et en fluorescence de chaque colorant. Centrez l’insert sur l’objectif avant de déclencher l’appareil photo.
      REMARQUE : Les longueurs d’onde d’excitation pour PI, calcein AM et Hoechst 33342 sont respectivement de 558 nm, 495 nm et 353 nm. Les longueurs d’onde d’émission sont respectivement de 575 nm, 519 nm et 465 nm.
  2. Expérience de mesure TEEI
    1. Pipeter 1,5 mL du milieu de culture cellulaire dans chaque puits du réseau d’électrodes. Placez les inserts d’échantillon de cellule dans les puits 1 à 3 et les inserts de contrôle dans les puits 4 à 6, en insérant les pieds de l’insert dans les rainures d’alignement de sorte que l’insert affleure la surface supérieure du puits.
    2. Vissez le circuit imprimé de l’électrode supérieure sur le dessus des puits du réseau d’électrodes et connectez le réseau d’électrodes au dispositif PSEP.
    3. Placez le réseau d’électrodes dans l’incubateur à 37 °C pendant au moins 1 h pour permettre à la température de s’équilibrer.
    4. Cliquez sur le menu déroulant à côté de « Membrane » dans le coin supérieur gauche de l’interface graphique et cliquez sur GBO 400 nm. Répétez cette étape pour « Électrolyte », « Cellules », « Densité d’ensemencement cellulaire » et « Durée de cellule », en sélectionnant DMEM, A431, 200 et 12, respectivement.
      REMARQUE : Ces valeurs sont uniquement à des fins d’enregistrement et n’ont pas d’impact sur le fonctionnement de l’appareil. Assurez-vous d’ajuster ces valeurs si nécessaire pour un suivi correct des données.
    5. Laissez tous les paramètres restants dans l’état par défaut.
      REMARQUE : Les paramètres d’impulsion par défaut créent une forme d’onde carrée de 30 volts, 20 Hz, d’une durée de 1 ms et de 200 impulsions. Les paramètres de mesure TEEI par défaut sont 0,5 volts et 100 Hz, 1 000 Hz, 10 000 Hz et 100 000 Hz.
    6. Cliquez sur le bouton Exécuter et entrez les noms appropriés pour les puits 1-3 et 4-6 lorsque vous y êtes invité. Cliquez sur OK pour démarrer l’expérience.
    7. Retirez le réseau d’électrodes de l’incubateur et transférez les inserts aux emplacements d’origine dans la plaque du puits d’expérience lorsque le programme a fini de s’exécuter.
    8. Mélangez 2 μL de Hoechst 33342, 5 μL de calcéine AM et 10 μL de PI avec 113 μL de milieu de culture cellulaire dans un tube de réaction de 200 μL.
    9. Pipeter 10 μL de la solution de coloration dans chaque insert post-impulsion et remettre les inserts dans l’incubateur pendant 5 min.
    10. Transférez la plaque de puits sur le support de plaque d’un microscope à imagerie fluorescente avec un objectif 5x. Image en fond clair et en fluorescence de chaque colorant. Centrez l’insert sur l’objectif avant de déclencher l’appareil photo.
      REMARQUE : Les longueurs d’onde d’excitation pour PI, calcein AM et Hoechst 33342 sont respectivement de 558 nm, 495 nm et 353 nm. Les longueurs d’onde d’émission sont respectivement de 575 nm, 519 nm et 465 nm.

4. Analyse des données

  1. Analyse des données d’image avec le pipeline CellProfiler
    1. Utilisez le flux de travail CellProfiler personnalisé fourni à l’adresse GitHub :https ://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI pour traiter les images de livraison et d’expérience de mesure TEEI.
  2. Analyse TEEI
    1. Cliquez sur l’onglet Analyse dans l’interface graphique.
    2. Basculez l’indicateur de type d’impédance sur TEEI en bas de l’interface graphique.
    3. Cliquez sur la flèche dans la zone en haut à gauche pour afficher tous les noms des expériences dans le fichier de données. Sélectionnez toutes les données de l’échantillon de cellule de l’expérience de mesure TEEI.
    4. Cliquez sur la flèche dans la case suivante à droite pour afficher tous les noms des expériences dans le fichier de données. Sélectionnez toutes les données d’insert de commande de la mesure TEEI.
    5. Cliquez sur Exécuter. Une figure de base contenant les données de l’échantillon de cellule sélectionnées à la fréquence de mesure la plus basse apparaîtra.
    6. Dans la boîte d’options d’exemple sur le côté droit de l’interface graphique, cliquez sur la flèche pour afficher toutes les données d’insertion sélectionnées. Les valeurs aberrantes peuvent être supprimées en sélectionnant les données appropriées et en cliquant sur Supprimer ci-dessous.
      REMARQUE : Toutes les données qui ont été supprimées de l’analyse par le dernier clic sur le bouton Supprimer peuvent être récupérées à l’aide du bouton Annuler .
    7. Cliquez sur Terminé pour passer à la figure suivante lorsque les données souhaitées sont affichées dans la figure.
    8. Répétez les étapes 4.2.6 et 4.2.7 pour les données d’échantillon de cellule et les données de contrôle restantes. Lorsque l’ensemble de données final a été confirmé en cliquant sur « Terminé », la figure d’analyse complète apparaît.
    9. Enregistrez la figure d’analyse.

Résultats

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Le protocole donné établit une méthode d’utilisation des mesures TEEI pour examiner les processus intermédiaires d’électroporation et faire des prédictions de livraison, en particulier pour la lignée cellulaire A431 et le fret PI. Bien que la modification de ce protocole soit abordée plus loin dans l’article, il est important de noter maintenant que même si les valeurs spécifiques peuvent changer, les tendances générales de la réponse restent constantes. Par exemple, les données TEEI qui descendent en dessous de la base de référence initiale correspondent à la mort cellulaire, tandis que l’augmentation maximale de la valeur TEEI au-dessus du minimum correspond à l’efficacité de livraison13. Ces tendances générales et leurs implications sont examinées ci-dessous.

Comme le montre la figure 2A, l’utilisation de la plateforme PSEP peut entraîner diverses tendances en matière de mesure et d’imagerie cellulaire. Le résultat idéal de ce protocole est de produire une courbe similaire aux données de santé optimisées montrées dans la figure 2Ai. Ceci est caractérisé comme le résultat idéal, car il n’y a pas de chute en dessous de la ligne de base, indiquant très peu, voire aucune, mort cellulaire. De plus, la courbe saine optimisée présente la plus forte augmentation de TEEI par rapport au minimum, indiquant un degré élevé d’efficacité de livraison13. Ces inférences sont étayées par l’imagerie post-PSEP de la monocouche cellulaire, qui révèle une mort cellulaire négligeable et une monocouche cellulaire saine et entièrement confluente (Figure 2Aiii). De plus, une expérience de livraison réussie utilisant des formes d’onde PSEP identiques peut être caractérisée par les images présentées à la figure 2B. L’application correcte de la forme d’onde d’électroporation et la concentration de la cargaison permettent d’obtenir un haut degré de cohérence de livraison et de viabilité de la cellule.

La santé et la confluence de la monocouche cellulaire sont essentielles à l’application réussie des prédictions de livraison basées sur l’TEEI16,17. Même avec une forme d’onde optimisée, une monocouche cellulaire malsaine ou incomplète entraîne une réponse TEEI diminuée, comme l’illustrent les données malsaines optimisées de la figure 2Aii. Cependant, notons que les images de ce résultat (Figure 2Avi) correspondent toujours à l’interprétation de la réponse TEEI donnée par Brooks et al.13. Il n’y a pas de creux en dessous de la ligne de base, indiquant une mort cellulaire proche de zéro (Figure 2C,D). De plus, l’augmentation réduite par rapport au minimum correspond à un impact négatif sur l’efficacité de l’administration, car moins de cellules dans la monocouche réduisent l’administration totale de PI (Figure 2C,D).

Si une forme d’onde non optimisée est appliquée, il est possible de voir des diminutions encore plus significatives de la réponse TEEI. En fonction de l’énergie totale et de la période dans laquelle elle est appliquée, des formes d’onde non optimisées peuvent produire des résultats allant d’une efficacité réduite à l’annihilation quasi totale de la monocouche cellulaire (Figure 2Ai,iii,v). Les courbes non optimisées et très non optimisées montrent une diminution significative par rapport à la ligne de base, indiquant une mort cellulaire importante. Cependant, des formes d’onde de moins en moins optimisées entravent la récupération des cellules, ce qui entraîne une diminution de l’efficacité de livraison.

L’efficacité de livraison a été calculée en divisant le nombre de cellules étiquetées dans les images PI et calcein des expériences de livraison par le nombre total de cellules identifiées avec Hoechst. La mort a été calculée en prenant les cellules marquées par PI dans les expériences de mesure TEEI et en divisant par le nombre total de cellules identifiées par Hoechst. Le nombre de cellules a été déterminé à l’aide d’un pipeline CellProfiler personnalisé pour les deux métriques.

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Figure 2 : Courbes de réponse TEEI et imagerie pour les conditions courantes. (A) (i) Données de réponse TEEI illustrant le pourcentage de variation TEEI pour les conditions optimisées et non optimisées. (ii) Comparaison de la réponse TEEI entre des monocouches saines et malsaines dans des conditions de forme d’onde optimisées. iii à v) Imagerie représentative des résultats potentiels pour des conditions de forme d’onde optimisées et non optimisées montrant la mort cellulaire (rouge) et les cellules vivantes (vert). (vi) Imagerie représentative d’une monocouche malsaine après application de conditions de forme d’onde optimisées montrant la mort cellulaire (rouge) des cellules vivantes (vert). (B) Images montrant l’administration réussie de l’IP (rouge), les cellules vivantes (vert) et l’emplacement des noyaux (bleu). Toutes les images sont éclaircies pour plus de clarté. Barres d’échelle : 1000 μm. (C) Diminution de l’EIEO par rapport à la ligne de base pré-PSEP au minimum après PSEP et augmentation du minimum post-PSEP au pic post-PSEP pour des tensions données. (D) Efficacité de distribution et pourcentages de mort cellulaire pour des tensions données. Les barres d’erreur représentent le SEM (n = 6). (C,D) reproduit de Brooks et al.13 avec autorisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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La figure 2C montre que les augmentations par rapport au minimum et les diminutions par rapport à la ligne de base sont tracées pour chaque tension de forme d’onde PSEP. L’augmentation TEEI crée un arc parabolique, culminant autour de 20 volts avant de diminuer, tandis que la diminution TEEI par rapport à la ligne de base augmente de manière exponentielle à mesure que la tension augmente. L’efficacité de la distribution et les pourcentages de mort dans la figure 2D reflètent ces tendances, avec une efficacité de livraison en arc de cercle parabolique, culminant autour de 30 volts, et la mort augmentant de façon exponentielle à mesure que la tension de la forme d’onde augmente.

Une hypothèse pour le mécanisme sous-jacent à l’origine de l’augmentation de l’TEEI est l’électro-osmose à travers les microcanaux du substrat chargés négativement, un phénomène causé par l’application d’un champ électrique18,19. Que la réponse TEEI soit due à un stimulus mécanique provenant du gonflement de la cellule dû à l’écoulement du fluide électro-osmotique, un facteur connu pour se produire avec l’électroporation20, ou en raison du stimulus électrique de la forme d’onde elle-même, il est clair que la santé et l’exhaustivité de la monocouche sont primordiales pour obtenir la chute de tension appropriée à travers la membrane cellulaire requise pour l’électroporation. Pour cette raison, les étapes les plus critiques de cette méthode sont celles concernant l’ensemencement cellulaire et la garantie d’une bonne formation de monocouches cellulaires. Cela peut être confirmé par l’imagerie de la monocouche cellulaire et par la valeur de référence TEEI. Pour les cellules A431, la TEEI moyenne est d’environ 7 Ω·cm², tandis que HEK293T cellules est en moyenne légèrement inférieure de 5 Ω·cm² (Figure 2Aii), probablement en raison de différences morphologiques provoquant des différences dans la surface de jonction cellule-cellule.

En raison du champ électrique requis pour l’électroporation du substrat poreux, l’électrolyse se produira, provoquant la corrosion des électrodes12,21. Cela était particulièrement évident pour l’électrode inférieure, car elle était chargée positivement dans cette expérience pour délivrer du PI chargé positivement. Grâce à l’expérimentation, il a été déterminé que le PCB inférieur pouvait être utilisé environ 20 fois avant que des effets négatifs significatifs ne nécessitent un remplacement13. Pour nettoyer le réseau d’électrodes en vue de sa réutilisation, retirez les milieux de culture cellulaire ou de transfection restants des chambres à l’aide d’un aspirateur. Remplissez chaque chambre aux trois quarts d’éthanol à 70 % et placez le circuit imprimé de l’électrode supérieure sur le réseau d’électrodes de sorte que les électrodes supérieures soient immergées. Laissez l’éthanol dans le réseau d’électrodes pendant au moins 10 minutes avant de retirer l’éthanol et de mettre le réseau d’électrodes de côté pour sécher.

Il est possible de réutiliser les inserts achetés en retirant les substrats, en stérilisant l’insert et en remplaçant le substrat par un substrat provenant d’une autre source. Des inserts à 6 puits avec la même densité de pores et le même diamètre sont disponibles dans le commerce et peuvent être utilisés pour récolter quatre substrats de remplacement de la taille d’un insert à 24 puits. Une fois les inserts précédemment utilisés stérilisés, ajoutez 10 μL d’époxy polymérisé à la lumière ultraviolette dans une boîte de Pétri fraîche. Trempez le côté substrat de l’insert dans la flaque d’époxy pour recouvrir la surface inférieure, et placez soigneusement un nouveau substrat sur le trou de l’insert. Vérifiez visuellement que l’époxy forme un anneau complet pour vous assurer qu’il n’y a pas d’espace dans la connexion. Durcissez sous une lumière UV pendant 30 secondes et stockez les inserts remis à neuf dans une plaque propre à 24 puits pour éviter d’endommager les nouveaux supports avant de les réutiliser.

Comme indiqué précédemment, bien que l’on suppose que l’augmentation observée de l’EIEE se produira dans plusieurs types de cellules, elle n’a été démontrée qu’avec les lignées cellulaires A431 et HEK293T13 (figure 1C), qui sont toutes deux des cellules adhérentes. La méthode peut être modifiée en sélectionnant différentes lignées cellulaires en sélectionnant des membranes avec des caractéristiques de pores différentes, en remplaçant l’enrobage de fibronectine par une autre protéine de matrice extracellulaire en ajustant la concentration ou en changeant la cargaison. Cependant, si des modifications sont apportées à la configuration de l’expérience, il peut être nécessaire de réoptimiser la forme d’onde. Pour optimiser la forme d’onde, une expérience de mesure TEEI peut être menée dans laquelle un seul paramètre de forme d’onde, tel que la tension, est modifié entre chaque groupe de trois échantillons. Sélectionnez la tension optimale en identifiant la plus forte augmentation de l’EIETO sur au moins neuf échantillons sains. Répétez ce processus pour chaque paramètre de forme d’onde, en utilisant les valeurs nouvellement optimisées lorsque vous passez au suivant. N’oubliez pas qu’il peut y avoir plusieurs optima locaux pour les paramètres de forme d’onde (c’est-à-dire que la tension optimale pour une durée d’impulsion peut ne pas être la tension optimale pour une autre durée d’impulsion, et ainsi de suite).

Les avantages de l’électroporation sur substrat poreux sont nombreux. Bien que d’autres méthodes d’administration intracellulaire existent depuis longtemps, peu d’entre elles ont combiné un débit élevé avec un degré élevé de contrôle que le PSEP possède 1,13. De plus, l’utilisation par la plateforme des mesures TEEI donne un aperçu des étapes intermédiaires du processus d’électroporation. Les lectures TEEI indiquent l’état des cellules, guident la sélection des paramètres d’électroporation et permettent de mieux comprendre les comportements et les mécanismes spécifiques des cellules13,17. Grâce aux mesures TEEI, la plateforme est également capable de fournir sans marquage13, ce qui permet une optimisation rapide avec une diminution du besoin de biomarqueurs et de réactifs coûteux chaque fois qu’une expérience est menée. Ces contributions au domaine de l’administration intracellulaire en font un candidat de choix en tant que plate-forme d’administration pour la recherche biologique fondamentale et les applications biomédicales.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Nous tenons à souligner le soutien financier de la NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), des National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) et de l’P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), de la Nebraska Collaborative Initiative et du Voelte-Keegan Bioengineering Support. Le dispositif a été fabriqué au NanoEngineering Research Core Facility (NERCF), qui est partiellement financé par la Nebraska Research Initiative.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de centrifugation conique 15 mLThermo Scientific339651
Hémocytomètre jetable à 2 pucesBulldog BioDHC-N01
75 cm2 Flacon de culture tissulairefisherbrandFB012937
A431 CellulesATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
Classe II Type A2 Armoire de biosécuritéLabgardNU-543-600
Composants personnalisésYangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Tube à centrifuger jetable (50 mL)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
Sérum de veau fœtalGibcoA5670401
système d’aspiration de fluidevacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
Plasma humain FibronectineSigma-AldrichFIBRP-RO
Microscope à fluorescence inverséeZeiss491916-0001-000
Microscope inverséLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256.02
Tube PCR 200 & micro ; LSarstedt72.737
Pénicilline / StreptomycineGibco15140148
Pipette (0.2-2 µ ; L)fisherbrand EliteFBE00002
Pipette (100-1000 & micro ; L)fisherbrand EliteFBE01000
Pipette (20-200 & micro ; L)fisherbrand EliteFBE00200
Pipette (2-20 & micro ; L)fisherbrand EliteFBE00020
l’iodure de propidium
1,5 mLSarstedt72.690.300
Centrifugeuse Sorvall ST 16RThermo Scientific75004240
Thincert (24 puits)Greiner Bio-One662 6410,4 et micro ; M Diamètre des pores, 2x106 cm-2 densité des pores,
plaque de culture tissulaire en PET transparent (24 puits)FisherbrandFB012929
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsinGibco15090046
Tube de réaction Invitrogen P1304MP à

Références

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Mots-clés

lectroporation sur substrat poreuxSuivi de l lectroporationMicroscopie fluorescenceMonocouche cellulaireEfficacit de d livranceViabilit cellulaireParam tres de la forme d ondeR seau d lectrodesInserts de culture cellulaire

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