Électroporation à base de substrat poreux avec surveillance de l’impédance électrique transépithéliale

Résumé

L’électroporation de substrat poreux (PSEP) associe une distribution constante et à haut débit à une viabilité élevée des cellules. L’introduction de mesures d’impédance électrique transépithéliale (TEEI) donne un aperçu des processus intermédiaires du PSEP et permet une administration sans étiquette. Cet article traite d’une méthode permettant d’effectuer simultanément des expériences d’administration PSEP et une analyse de mesure TEEI.

Résumé

L’électroporation sur substrat poreux (PSEP) est une méthode émergente d’électroporation qui offre un débit élevé et une livraison constante. Comme de nombreux autres types d’administration intracellulaire, le PSEP s’appuie fortement sur des marqueurs fluorescents et la microscopie fluorescente pour déterminer la réussite de l’administration. Pour mieux comprendre les étapes intermédiaires du processus d’électroporation, une plateforme PSEP avec surveillance intégrée de l’impédance électrique transépithéliale (TEEI) a été développée. Les cellules sont cultivées dans des inserts disponibles dans le commerce avec des membranes poreuses. Après une période d’incubation de 12 h pour permettre la formation d’une monocouche cellulaire entièrement confluente, les inserts sont placés dans un milieu de transfection situé dans les puits du dispositif PSEP. Les monocouches cellulaires sont ensuite soumises à une forme d’onde définie par l’utilisateur, et l’efficacité de distribution est confirmée par la microscopie fluorescente. Ce flux de travail peut être considérablement amélioré grâce à des mesures TEEI entre la microscopie pulsée et la microscopie fluorescente pour collecter des données supplémentaires sur le processus PSEP, et ces données TEEI supplémentaires sont corrélées avec des paramètres de livraison tels que l’efficacité et la viabilité de la livraison. Cet article décrit un protocole permettant d’effectuer des mesures PSEP avec TEEI.

Introduction

L’électroporation est une technique dans laquelle les cellules sont exposées à un champ électrique, créant des pores temporaires dans la membrane cellulaire à travers lesquels les marchandises, y compris les protéines, l’ARN et l’ADN, peuvent passer ^1,2. La version la plus utilisée est l’électroporation en vrac (BEP). La PEB est réalisée en remplissant une cuvette avec un électrolyte contenant des millions de cellules, en exposant l’électrolyte à une haute tension et en permettant à la cargaison de pénétrer dans les cellules par diffusion ou endocytose¹. Les BEP présentent de nombreux a....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des réactifs et culture cellulaire

1. Préparez le milieu de culture cellulaire en ajoutant 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de pénicilline-streptomycine dans un contenant de 500 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM). Produire onze aliquotes de 50 mL pour réduire le risque de contamination et réfrigérer à 4 °C.
2. Créer 1 mL de 25 μg/mL de fibronectine plasmatique humaine dans une solution mère de solution saline tamponnée ....

Résultats

Le protocole donné établit une méthode d’utilisation des mesures TEEI pour examiner les processus intermédiaires d’électroporation et faire des prédictions de livraison, en particulier pour la lignée cellulaire A431 et le fret PI. Bien que la modification de ce protocole soit abordée plus loin dans l’article, il est important de noter maintenant que même si les valeurs spécifiques peuvent changer, les tendances générales de la réponse restent constantes. Par exemple, les données TEEI qui descendent en dessous de la base .......

Discussion

La figure 2C montre que les augmentations par rapport au minimum et les diminutions par rapport à la ligne de base sont tracées pour chaque tension de forme d’onde PSEP. L’augmentation TEEI crée un arc parabolique, culminant autour de 20 volts avant de diminuer, tandis que la diminution TEEI par rapport à la ligne de base augmente de manière exponentielle à mesure que la tension augmente. L’efficacité de la distribution et les pourcentages de mort dans la

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube de centrifugation conique 15 mL	Thermo Scientific	339651
Hémocytomètre jetable à 2 puces	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Flacon de culture tissulaire	fisherbrand	FB012937
A431 Cellules	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Classe II Type A2 Armoire de biosécurité	Labgard	NU-543-600
Composants personnalisés	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Tube à centrifuger jetable (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Sérum de veau fœtal	Gibco	A5670401
système d’aspiration de fluide	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Plasma humain Fibronectine	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Microscope à fluorescence inversée	Zeiss	491916-0001-000
Microscope inversé	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
Tube PCR 200 & micro ; L	Sarstedt	72.737
Pénicilline / Streptomycine	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µ ; L)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 & micro ; L)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 & micro ; L)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 & micro ; L)	fisherbrand Elite	FBE00020
			l’iodure de propidium
1,5 mL	Sarstedt	72.690.300
Centrifugeuse Sorvall ST 16R	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24 puits)	Greiner Bio-One	662 641	0,4 et micro ; M Diamètre des pores, 2x106 cm-2 densité des pores,
plaque de culture tissulaire en PET transparent (24 puits)	Fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046

Tube de réaction Invitrogen P1304MP à