Protocole optimisé pour les Swiss Rolls intestinaux et la coloration immunofluorescente des tissus inclus dans la paraffine

Résumé

L’intestin est vital pour la digestion et l’absorption. Chaque région - duodénum, jéjunum, iléon, côlon - remplit des fonctions distinctes en raison de structures cellulaires uniques. L’étude de la physiologie intestinale nécessite une analyse méticuleuse des tissus. Ce protocole décrit la fixation et le traitement des tissus à l’aide de la technique du rouleau suisse, assurant une immunocoloration précise grâce à une préservation et une orientation appropriées des tissus.

Résumé

L’intestin est un organe complexe composé de l’intestin grêle et du gros intestin. L’intestin grêle peut être divisé en duodénum, jéjunum et iléon. Chaque région anatomique de l’intestin a une fonction unique qui se reflète dans les différences de structure cellulaire. L’étude des changements dans l’intestin nécessite une analyse approfondie des différentes régions tissulaires et des altérations cellulaires. Pour étudier l’intestin et visualiser de gros morceaux de tissu, les chercheurs utilisent couramment une technique connue sous le nom de rouleaux suisses intestinaux. Dans cette technique, l’intestin est divisé en chaque région anatomique et fixé dans une orientation plate. Ensuite, le tissu est soigneusement roulé et traité pour l’enrobage de paraffine. La fixation et l’orientation correctes des tissus sont une technique de laboratoire souvent négligée, mais elles sont d’une importance cruciale pour l’analyse en aval. De plus, un mauvais roulement suisse du tissu intestinal peut endommager l’épithélium intestinal fragile, entraînant une mauvaise qualité des tissus pour l’immunocoloration. S’assurer que les tissus sont bien fixés et correctement orientés avec des structures cellulaires intactes est une étape cruciale qui garantit une visualisation optimale des cellules intestinales. Nous présentons une méthode simple et rentable pour fabriquer des rouleaux suisses afin d’inclure toutes les sections de l’intestin dans un seul bloc inclus dans la paraffine. Nous décrivons également la coloration par immunofluorescence optimisée du tissu intestinal pour étudier divers aspects de l’épithélium intestinal. Le protocole suivant fournit aux chercheurs un guide complet pour obtenir des images d’immunofluorescence de haute qualité grâce à la fixation des tissus intestinaux, à la technique du Swiss-roll et à l’immunomarquage. L’utilisation de ces approches raffinées préserve la morphologie complexe de l’épithélium intestinal et favorise une compréhension plus profonde de la physiologie et de la pathobiologie intestinales.

Introduction

L’architecture cellulaire de l’intestin pose un défi unique pour maintenir son intégrité structurelle lorsque le tissu intestinal est préservé pour l’immunomarquage. L’intestin grêle est composé de structures allongées en forme de doigts appelées villosités¹. Ces villosités se déforment souvent au cours des processus d’encastrement. Il est crucial de s’assurer que les chercheurs disposent de techniques pour intégrer correctement les intestins afin d’obtenir des coupes efficaces, permettant de visualiser toutes les régions de l’intestin, ainsi que les couches qui composent l’intestin (c’est-à-dire la musculeuse propria, la muqueuse et la séreuse), est crucial pour une analyse expérimentale robuste². Une fixation inadéquate, une fixation excessive et une manipulation inappropriée des tissus compromettront l’intégrité des tissus, entraînant des dommages accidentels à l’épithélium intestinal ^3,4. Endommager l’épithélium intestinal au cours de ces étapes peut diminuer considérablement la qualité des analyses ultérieures, comme l’immunofluorescence, indépendamment de l’efficacité des protocoles d’immunohistochimie et des anticorps utilisés.

L’immunomarquage, comme la bonne fixation des tissus, est une partie importante de la recherche biomédicale. Lorsqu’elle est bien faite, l’immunocoloration peut mettre en lumière des aspects jusque-là inconnus de la structure et de la fonction cellulaires. La coloration par immunofluorescence des sections de paraffine peut être difficile en raison des modifications physicochimiques résultant du processus de fixation et d’enrobage de la paraffine⁵. La fixation et l’intégration de la paraffine entraînent un masquage de l’antigène qui peut interférer avec la détection par immunofluorescence des épitopes d’intérêt⁶. Une fixation retardée peut induire une dégradation protéolytique, ce qui entraîne une coloration affaiblie ou absente des épitopes critiques⁷. De plus, les anticorps sont souvent imprécis avec des niveaux élevés de bruit de fond. Les protocoles d’immunomarquage qui favorisent une liaison cohérente et spécifique des anticorps et un rapport signal/bruit élevé peuvent fournir des informations précieuses aux chercheurs.

Ici, nous fournissons un protocole complet conçu pour obtenir des images d’immunofluorescence de haute qualité grâce à la fixation des tissus intestinaux, à la préparation du rouleau suisse⁸ et à l’immunomarquage. Mettant l’accent sur les lignes directrices visant à préserver l’intégrité de l’intestin, le protocole vise à fournir aux chercheurs une méthodologie robuste pour améliorer la qualité et la fiabilité des études d’imagerie par immunofluorescence. Nous avons également cherché à utiliser des ressources rentables, notamment du papier filtre et une récupération d’antigène maison, des solutions de blocage et des diluants d’anticorps pour rendre le protocole plus accessible aux laboratoires qui peuvent disposer de fonds limités. Comme pour tous les protocoles expérimentaux, les chercheurs doivent optimiser le protocole actuel en fonction de leur approche expérimentale et de leurs domaines d’intérêt.

Protocole

Le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud a approuvé tous les soins, l’entretien et le traitement des animaux. Du tissu intestinal a été prélevé sur des souris adultes C57BL/6J (mâles et femelles âgés de 3 à 5 mois, pesant environ 30 g) pour être utilisé dans la présente étude.

1. Fixation du tissu intestinal

1. Disséquez soigneusement tout l’intestin d’une souris euthanasiée et placez-le dans un bateau de pesée ou une boîte de Pétri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Retirez les intestins du PBS et utilisez des ciseaux pour éliminer délicatement l’excès de graisse et de tissu conjonctif. La coupe du tissu conjonctif aide le tissu à rester à plat lors des étapes suivantes.
3. Divisez l’intestin en segments individuels à l’aide de ciseaux (c’est-à-dire duodénum, jéjunum, iléon, caecum et côlon). Divisez les segments en fonction des caractéristiques anatomiques et/ou de la longueur, avec environ 13 % de la longueur intestinale étant le duodénum, 58 % étant le jéjunum, 8 % étant l’iléon, 6 % étant le cæcum et le côlon est de 15 %⁹. Le duodénum suit l’estomac et l’iléon est la section terminale de l’intestin grêle immédiatement avant le caïcum.
4. Libérez le côlon en coupant l’endroit où il rejoint le caecum à l’aide de ciseaux. Placez le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon dans le bateau de pesée ou la boîte de Pétri de PBS. Jetez le caecum ou fixez-le selon d’autres méthodes publiées¹⁰.
5. Fixez une pointe de pipette P200 à une seringue de 10 ml en coupant la grande extrémité de la pointe avec une lame de rasoir. Remplissez la seringue de PBS.
6. Insérez l’embout de la seringue dans l’ouverture d’un segment intestinal à l’aide d’une pince. Utilisez la pince pour maintenir le segment intestinal sur la seringue et rincez doucement à un débit de ~50 μL/s pour éliminer le contenu intestinal. Recueillez le contenu intestinal dans un bateau de pesée vide ou une boîte de Pétri.
7. Posez le segment intestinal humide en ligne droite sur une bande de papier filtre cellulosique étiqueté à sec (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que le segment intestinal est suffisamment humide pour bien adhérer au papier filtre sec. Étiquetez le papier filtre avec les informations sur le numéro de souris, le génotype, le groupe expérimental, etc. à l’aide d’un crayon.
   REMARQUE : L’utilisation d’un stylo pour étiqueter le papier filtre peut entraîner la perte d’étiquettes lors de la fixation.
8. À l’aide de ciseaux de dissection, ouvrez l’intestin longitudinalement le long de la ligne mésentérique. Coupez ~5 mm à la fois, à l’aide du bord inférieur des ciseaux ou d’une paire de pinces pour poser le tissu coupé à plat sur le papier filtre. Continuez jusqu’à ce que toute la section de l’intestin soit coupée et posée à plat sur le papier filtre. Prenez soin d’ouvrir l’intestin en une ligne aussi droite que possible, car cela facilitera le roulement du tissu.
   REMARQUE : Des ciseaux à pointe sphérique peuvent être utilisés pendant cette étape pour éviter d’endommager les tissus.
9. Placez un autre morceau de papier filtre sur le segment intestinal. Assurez-vous que le papier filtre prend en sandwich le segment intestinal, empêchant l’intestin de s’enrouler ou de perdre sa forme aplatie pendant la fixation.
10. Agrafez les bords du papier filtre pour fixer le mouchoir en place. N’agrafez pas le tissu. Placez suffisamment d’agrafes autour du mouchoir pour éviter que le mouchoir ne se détache du papier filtre pendant la fixation.
11. Répétez les étapes 1.5 à 1.10 pour chacun des segments intestinaux (duodénum, jéjunum, iléon et côlon).
12. Immergez les tissus dans du formol tamponné normal à 10 % (ou un fixateur de votre choix tel que le paraformaldéhyde à 4 %, le fixateur de Carnoy, etc.) pendant la nuit à 4 °C.
    ATTENTION : Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle approprié, car les fixateurs tels que le formol sont toxiques.

2. Roulement et traitement des tissus intestinaux

ATTENTION : Effectuez les étapes 2.1-2.6 dans une hotte ventilée.

1. Retirez délicatement le morceau supérieur de papier filtre (celui qui touche le côté luminal de l’intestin). À l’aide d’une pince, décollez soigneusement l’intestin de la partie inférieure du papier filtre. Jetez le papier filtre.
2. Remplissez trois bateaux de pesée avec du PBS. Lavez le mouchoir en PBS 3x pour éliminer le formol du tissu.
3. À l’aide d’une pince à action inverse (voir le tableau des matériaux), prélevez un morceau d’intestin le long du bord court avec le côté luminal vers le haut. Tournez la pince pour rouler le tissu. Utilisez une paire de pinces régulières pour aider à guider le tissu lorsqu’il est roulé. Si le mouchoir est plié, déroulez-le et réessayez.
4. Placez le tissu dans un bateau de pesée sec ou une boîte de Pétri. Tenez le tissu en place avec une pince dans une main. Ouvrez soigneusement la pince à action inverse et relâchez le tissu, en utilisant l’autre pince pour déloger le tissu de la pince à action inverse.
5. Insérez une goupille de dissection de taille 00 ou une goupille minutien dans le tissu (voir la table des matériaux). Utilisez des pinces coupantes pour retirer la pointe pointue de la goupille. Placez le mouchoir dans une grande cassette, puis placez la cassette dans un récipient contenant de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elle soit prête à être traitée.
6. Répétez les étapes 2.1 à 2.5 avec tous les segments intestinaux (le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon), en plaçant les quatre rouleaux de tissu dans la même grande cassette (voir la table des matériaux). Assurez-vous que la cassette est étiquetée à l’aide d’un crayon pour éviter que l’étiquette ne se lave dans les solutions d’éthanol et de xylène (voir le tableau des matériaux).
7. Une fois que tous les échantillons ont été roulés, placez-les dans un processeur de tissus. Utilisez les réglages suivants pour le tissu intestinal : éthanol à 70 % pendant 35 min ; 90% d’éthanol pendant 35 min ; 95% d’éthanol pendant 35 min ; 100% éthanol pendant 35 min, 3x ; xylène pendant 35 min, 3x ; paraffine pendant 60 min, 3x. Les cassettes peuvent être laissées dans de la cire de paraffine fondue pendant de longues périodes.
   ATTENTION : Assurez-vous de porter un équipement de protection approprié, car le xylène est un produit chimique toxique.

3. Intégration du tissu intestinal

1. Préchauffez de grands moules d’enrobage pour maintenir la paraffine fondue.
2. Retirez les cassettes du processeur de tissus et placez-les dans un bécher de paraffine fondue.
3. À une station d’enrobage, placez une petite quantité de paraffine dans un moule. Retirez les quatre rouleaux suisses de la cassette et placez-les tous dans un seul moule, en les posant aussi à plat que possible. Ajoutez plus de paraffine pour remplir le moule.
4. Déplacez le moule sur la plaque froide et assurez-vous que tous les rouleaux suisses sont à plat au fond du moule. Placez un petit couvercle de cassette étiqueté (voir tableau des matériaux) sur le moule et ajoutez plus de paraffine si nécessaire.
5. Une fois la cire solidifiée, retirez le bloc du moule. Le tissu est maintenant prêt à être coupé en tranches de 5 μm et flotté sur des lames de verre chargées pour l’immunocoloration¹¹.

4. Adhérence tissulaire et préparation des lames

1. Pour s’assurer que la section de tissu de paraffine préparée de 5 μm adhère à la lame, chauffez les lames de verre sur un chauffe-lames ou un bloc chauffant réglé à 60 °C pendant 15 à 30 min. Les diapositives peuvent également être laissées chauffer plus longtemps ; Cette étape n’est pas urgente.
2. Laisser refroidir les lames à température ambiante (~15 min).

5. Déparaffinisation

1. Au début de la déparaffinisation des lames, assurez-vous que le tissu reste dans une solution et ne se dessèche pas pendant toute la durée de l’immunomarquage.
2. Utilisez un support à lames (voir la Table des matières) pour tenir les lames de verre et placez-les dans un plat résistant aux solvants (voir la Table des matières) rempli d’un réactif de clarification/déparaffinisation (voir la Table des matières). Assurez-vous que le réactif recouvre complètement le tissu sur chaque lame. Avant d’immerger complètement les lames dans le réactif de clarification, trempez ou bousculez le support de lames plusieurs fois dans la solution de clarification. Laissez les lames immergées pendant 10 minutes ou plus.
   REMARQUE : Cette étape peut devoir être effectuée dans une hotte ventilée en raison de fumées dangereuses, selon l’agent de nettoyage choisi. La déparaffinisation du tissu dans cette étape n’est pas sensible au temps, si vous utilisez un agent de clarification non toxique.
3. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès de réactif de clarification. Dans une nouvelle boîte résistante aux solvants, répétez l’étape 5.2.
4. Dans une nouvelle parabole résistante aux solvants, répétez l’étape 5.3. Laissez les lames immergées pendant 15 minutes ou plus. Cette étape n’est pas urgente.

6. Réhydratation

1. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès de réactif de clarification. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli à 100 % d’éthanol, trempez ou bousculez la grille à glissières plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente. Répétez l’opération 2 fois.
2. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès d’éthanol à 100 %. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’éthanol à 95 %, trempez ou bousculez la grille à glissières plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente. Répétez l’opération 1 fois.
3. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès d’éthanol à 95 %. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’éthanol à 70 %, trempez ou bousculez la grille à glissières plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente.
4. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès d’éthanol à 70 %. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’éthanol à 50 %, trempez ou bousculez la grille à glissières plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente.
5. Retirez et agitez la grille coulissante pour éliminer l’excès d’éthanol à 50 %. Dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’eau déminéralisée (DI), trempez ou bousculez la grille à lames plusieurs fois et laissez les lames immergées pendant 5 min. Cette étape est urgente.
   1. Pour faire une pause ici, placez les lames dans un récipient avec du PBS jusqu’à ce que l’immunocoloration puisse être reprise après l’étape de réhydratation de l’eau de 5 minutes.

7. Récupération de l’antigène

1. Remplissez une nouvelle boîte résistante aux solvants avec un tampon de récupération d’antigène approprié. Transférez directement le support de diapositives dans cette solution. Assurez-vous que les lames sont complètement immergées dans la solution de récupération de l’antigène, en recouvrant complètement le tissu.
   REMARQUE : Les solutions optimales de récupération d’antigène peuvent varier en fonction de l’anticorps utilisé. Il peut être nécessaire de déterminer la récupération de l’antigène nécessaire pour les anticorps individuels par le chercheur.
   1. Pour faire 1x tampon de récupération de l’antigène du citrate, ajoutez 2,94 g de citrate de sodium dihydraté (voir le tableau des matériaux) pour 1 L d’eau déminéralisée. Une fois le citrate de sodium dihydraté dissous, ajoutez du chlorure d’hydrogène (voir tableau des matériaux) jusqu’à ce que la solution atteigne un pH de 6. Enfin, ajoutez 500 μL de Tween20 (voir le tableau des matériaux) pour 1 L d’eau déminéralisée.
   2. Pour faire 1x tampon de récupération de l’antigène Tris-EDTA, ajoutez 1,211 g de base Tris et 0,292 g d’EDTA dans 1 L d’eau déminéralisée. Une fois dissous, ajustez à pH 9.
2. Couvrez le plat résistant aux solvants contenant la solution de récupération d’antigène et les lames avec un couvercle et fixez le couvercle avec des élastiques.
3. Placez le plat sécurisé résistant aux solvants dans un autocuiseur (voir le tableau des matériaux) sur la grille métallique ou le dessous de plat. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’eau dans l’autocuiseur pour atteindre la grille métallique ou le dessous de plat afin que la pression puisse s’accumuler.
4. Placez le couvercle sur l’autocuiseur et tournez-le dans le sens des aiguilles d’une montre pour verrouiller le couvercle en place. Tournez la soupape de limite de pression qui se trouve sur le couvercle jusqu’au réglage de pression.
5. Sous le réglage du menu, sélectionnez haute pression sur l’autocuiseur, puis sous le réglage de la durée, réglez l’autocuiseur sur 30 min. Sélectionnez Démarrer.
6. Après 30 minutes, l’autocuiseur émettra un bip et se réglera automatiquement sur le réglage de maintien au chaud. Attendez que la pression se soit relâchée naturellement et que le couvercle se dévisse librement.
7. Utilisez des gants résistants à la chaleur (voir le tableau des matériaux) pour retirer le plat résistant aux solvants de l’autocuiseur et retirez l’élastique et le couvercle. Placez le plat dans un bain de glace pendant ~30 min pour permettre aux lames de refroidir à température ambiante. Cette étape n’est pas urgente.
8. Une fois refroidi à température ambiante, retirez la grille coulissante du plat résistant aux solvants et placez-la dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli d’eau DI pour éliminer la solution résiduelle de récupération d’antigène. Assurez-vous que les lames sont complètement immergées.
9. Retirez la grille coulissante de l’eau DI et placez-la dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli de PBS pendant 5 min. Assurez-vous que les lames sont complètement immergées. Cette étape n’est pas urgente.

8. Blocage des taches de fond non spécifiques

1. Préparez une chambre humidifiée en prenant une grande boîte à diapositives et en retirant le couvercle en carton collé au couvercle. À la base de la boîte à glissières, placez des serviettes en papier humides verticalement vers le bas. Assurez-vous que les serviettes en papier humides sont à plat.
2. Retirez une diapositive une par une du support de diapositives immergé dans du PBS. Essuyez soigneusement l’excès de PBS sur la lame de verre, en évitant le tissu.
3. Avec un stylo hydrophobe (voir Tableau des matériaux), formez une barrière qui entoure le tissu en dessinant une boîte autour du tissu avec le stylo hydrophobe. Veillez à éviter le mouchoir et à ne pas utiliser le stylo hydrophobe trop près du mouchoir.
4. Placez la diapositive délimitée horizontalement sur les serviettes en papier humides. Ajouter un tampon de blocage pour couvrir le tissu (~100 μL).
   1. Pour fabriquer un tampon de blocage, ajoutez 100 μL de gélatine de peau de poisson d’eau froide (gélatine Teleostein ; voir le tableau des matières) à 9,85 mL de PBS. Enfin, ajoutez 50 μL de Triton X-100 à 20 % (voir le tableau des matériaux) et mélangez jusqu’à dissolution.
5. Répétez les étapes 8.2 à 8.4 pour chaque diapositive. Fermez la chambre humidifiée et incubez les lames à température ambiante pendant 90 min.

9. Blocage souris sur souris

1. Lorsque vous utilisez un anticorps primaire de souris pour immunomarquer les tissus de souris, effectuez une étape de blocage supplémentaire. Des réactifs de blocage de la souris sur la souris (bloc de la souris sur la souris ; voir le tableau des matériaux) sont disponibles dans le commerce ; Suivez les instructions commerciales lors de la préparation du bloc souris sur souris.
2. Tapotez doucement la solution de blocage et ajoutez immédiatement le bloc souris sur souris préparé pour couvrir le tissu (~100 μL). Répétez l’opération pour chaque lame contenant du tissu de souris, qui sera coloré à l’aide d’un anticorps primaire élevé chez la souris.
3. Incuber des sections de tissus dans la boîte de la chambre humidifiée à température ambiante pendant 15 min.
4. Retirez les lames de la chambre humidifiée et placez-les directement dans un support à lames immergé dans du PBS. Laissez les diapositives dans PBS pendant 5 minutes pour éliminer le bloc souris sur souris.

10. Anticorps primaires

1. Pour chaque lame, sélectionnez des anticorps primaires d’intérêt qui sont cultivés chez différentes espèces. Diluer les anticorps primaires dans le diluant d’anticorps selon les instructions du fabricant. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-CATÉNINE (1:200) et LAMP1 (1:50).
   REMARQUE : Si le fabricant ne fournit pas les dilutions recommandées, une dilution de 1:100 est un bon point de départ. Si l’anticorps primaire d’intérêt est conjugué à un fluorophore, voir étape 12.2.
   1. Pour fabriquer le diluant de l’anticorps, ajoutez un tampon de blocage 1:20 au PBS, si vous utilisez le tampon de blocage de la gélatine de poisson décrit ci-dessus.
2. Retirez les lames du PBS ou de la chambre humidifiée, tapotez doucement l’excès de solution de blocage ou de PBS et remettez-les horizontalement dans la chambre humidifiée. Assurez-vous que la barrière créée avec le stylo hydrophobe à l’étape 8.3 persiste ; tracez à nouveau le contour du tissu si nécessaire.
3. Ajouter des anticorps primaires d’intérêt suffisamment dilués pour couvrir le tissu (~100 μL).
4. Fermez la chambre humidifiée et incubez les lames sur une surface plane à 4 °C dans l’obscurité pendant la nuit.

11. Lavage des lames

1. Retirez les lames de la chambre humidifiée, tapotez doucement les anticorps primaires et placez les lames dans un support à lames immergé dans du PBS pendant 5 min.
2. Retirez la grille coulissante et placez-la dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli de PBS pendant 5 min. Répétez l’étape 1x.

12. Anticorps secondaires et contre-coloration des noyaux

1. Pour chaque lame, sélectionnez des fluorophores d’anticorps secondaires conçus pour se lier à l’espèce d’anticorps primaire. Diluez des fluorophores d’anticorps secondaires ou des anticorps primaires conjugués dans un diluant d’anticorps secondaire. Les anticorps secondaires utilisés étaient l’anti-chèvre d’âne 488 (1:200), l’anti-lapin d’âne cy3 (1:200), l’anti-souris d’âne 647 (1:200), l’anti-lapin d’âne 647 (1:200) et l’anti-rat d’âne cy3 (1:200). L’anticorps primaire γ-ACTINE conjugué au fluorophore 647 a été utilisé à une dilution de 1:100.
   1. Pour fabriquer un diluant d’anticorps secondaire, ajoutez un tampon de blocage 1:100 au PBS, si vous utilisez un tampon de blocage de la gélatine de poisson comme décrit ci-dessus.
2. Retirez les lames du PBS, tapotez doucement pour enlever l’excès de PBS et remettez-les horizontalement dans la chambre humidifiée. Assurez-vous que la barrière créée avec le stylo hydrophobe à l’étape 8.3 persiste ; tracez à nouveau le contour du tissu si nécessaire.
3. Ajouter des fluorophores d’anticorps secondaires suffisamment dilués ou des anticorps primaires conjugués d’intérêt pour couvrir le tissu (~100 μL).
4. Fermez la chambre humidifiée et incubez les lames à température ambiante dans l’obscurité pendant 1 h.
5. Diluer 10 mg/mL de Hoechst (voir le tableau des matériaux) ou de DAPI à l’aide de PBS pour une concentration finale de 1 μg/mL de Hoechst ou de DAPI à l’aide de PBS et ajouter directement au tissu (~100 μL). Incuber 5 min à température ambiante dans l’obscurité.
6. Retirez les lames de la chambre humidifiée et placez-les dans un support à lames immergé dans du PBS pendant 5 minutes dans l’obscurité.
7. Retirez la grille coulissante et placez-la dans un nouveau plat résistant aux solvants rempli de PBS pendant 5 minutes dans l’obscurité. Répétez l’étape 1x.

13. Montage et préparation pour la microscopie

1. Retirez une diapositive à la fois du support de diapositives immergé dans PBS, en gardant les diapositives restantes immergées dans PBS dans l’obscurité. Tapotez doucement pour enlever l’excès de PBS et, si nécessaire, utilisez une lingette non pelucheuse pour essuyer soigneusement l’excès de PBS sur la lame de verre, en évitant le tissu.
2. Ajoutez une à deux gouttes de produit de montage antifade (voir tableau des matériaux) au centre du tissu.
3. Tenez une lamelle propre (voir tableau des matériaux ) par les bords et abaissez-la lentement sur la glissière à un angle de 45°. Assurez-vous que le produit de montage s’étale uniformément sur le tissu.
4. En commençant par le centre du tissu, appuyez doucement sur la lamelle avec deux doigts pour aider à éliminer les bulles d’air et l’excès de milieu de montage. Si nécessaire, continuez à appuyer vers les bords et maintenez une légère pression tout au long.
5. Coupez la petite extrémité d’une pipette P200 non filtrée et fixez-la à l’extrémité d’une pipette sérologique connectée à un vide.
6. En suivant les bords de la lamelle, utilisez l’aspirateur pour retirer l’excès de support de montage.
7. Dans une nouvelle boîte à diapositives, posez la diapositive horizontalement à plat et laissez-la sécher dans l’obscurité à température ambiante.
8. Répétez ce processus pour chaque diapositive.

Résultats

Une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a été effectuée, comme décrit précédemment¹². En utilisant la méthode optimisée, les Swiss Rolls intestinaux comprenaient les trois segments de l’intestin grêle et du gros intestin sur une seule lame. Le fait d’avoir l’intestin entier logé sur une lame permet aux chercheurs d’analyser les changements dans toutes les parties de l’intestin et de réduire les coûts de sectionnement et de coloration des réactifs (Figure 1). De plus, l’exposition simultanée de tous les segments intestinaux aux mêmes solutions lors de l’immunocoloration permet de garantir des résultats précis. La micrographie H&E démontre l’architecture intestinale préservée de toutes les parties de l’intestin grêle et du gros intestin (Figure 2). La mesure des villosités duodénales n’a montré aucune différence significative dans la hauteur des villosités dans le tissu intestinal non ouvert par rapport à cette méthode suisse en rouleau, ce qui suggère que l’ouverture de l’intestin ne perturbe pas l’architecture tissulaire (Figure 2D). L’immunocoloration des Swiss rolls intestinaux montre les différentes couches de l’intestin ainsi que l’ensemble de l’axe de la crypte villeuse. Les images fluorescentes montrent de faibles niveaux de fond dus à la coloration primaire et secondaire des anticorps et décrivent clairement les cellules individuelles présentes dans l’épithélium. La figure 3 montre la morphologie des différents segments intestinaux et la coloration des cellules caliciformes (cellules positives MUC2)¹³, de la membrane apicale (γ-ACTIN)¹⁴, de la membrane latérale des cellules épithéliales (E-CADHERIN)¹⁵ et des noyaux. Ce protocole est adapté à l’identification de nombreux compartiments cellulaires différents, y compris les cellules prolifératives (PCNA)¹⁶, l’interstitium (LAMININ ; Graphique 4A) ¹⁷, le domaine lysosomal (LAMP1)¹⁴ et l’épithélium (β-TÉNINE ; Graphique 4B) ¹⁸. Aéroport international

Figure 1 : Déroulement de la préparation et du traitement des petits pains intestinaux suisses. (A) Les segments intestinaux sont rincés à l’aide d’une seringue contenant du PBS, puis lavés au PBS. (B) Le tissu intestinal humide est ensuite placé sur du papier filtre sec. (C) L’intestin est ouvert longitudinalement sur du papier filtre et (D) légèrement écarté. (E) Un morceau de papier filtre est posé sur l’intestin ouvert, et l’intestin est doucement pris en sandwich entre le papier filtre et agrafé. Les segments intestinaux sont fixés pendant la nuit, et (F) est roulé à l’aide d’une pince. (G) L’intestin est doucement délogé de la pince à action inverse, et (H) a une apparence de rosette. (I, J) Le tissu intestinal est épinglé et placé dans une grande cassette. (K) Les quatre segments intestinaux sont placés dans la même cassette pour le traitement et l’intégration des tissus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des quatre segments de l’intestin. (A) Le balayage des tuiles démontre la capacité de visualiser l’intestin entier en une seule lame avec des rouleaux suisses individuels du duodénum, du jéjunum, de l’iléon et du côlon. (B) Micrographie d’un rouleau suisse intestinal et (C) Encart à grossissement plus élevé pour montrer l’architecture des villosités et de la crypte. (D) La quantification de la longueur des villosités de l’intestin grêle ne montre aucune différence significative entre le tissu roulé suisse et le tissu non ouvert. Barres d’échelle = 1000 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Coloration par immunofluorescence des quatre segments de l’intestin. Des souris témoins adultes C57BL/6J ont été immunomarquées pour les noyaux (cyan), le marqueur de membrane latérale, E-CADHERIN (vert), les cellules caliciformes identifiées par MUC2 (jaune) et le marqueur de bordure en brosse apicale, γ-ACTIN, (magenta). Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Graphique 4. Coloration par immunofluorescence de l’intestin. (A) Une micrographie représentative de la coloration par immunofluorescence de l’intestin de souris met en évidence les noyaux (cyan), les cellules prolifératives, le PCNA (vert) et la lamina propria, la LAMININE (magenta). (B) Image d’immunofluorescence identifiant les noyaux (cyan), le marqueur de membrane cellulaire β-CATÉNINE (vert) et le marqueur de lysosome LAMP1 (magenta) dans l’intestin. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous présentons une méthode optimisée de fixation tissulaire utilisant la technique du rouleau suisse pour préserver l’architecture intestinale et favoriser une immunocoloration précise. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour étudier une grande variété de questions de recherche impliquant la physiologie intestinale et la biologie cellulaire¹⁹. Plusieurs méthodes de laminage suisses optimisées ont été publiées et sont très utiles^20,21. Un avantage de cette technique est la facilité d’ouvrir avec précision l’intestin sur du papier filtre. Cela permet aux tissus d’être fixés à plat, empêchant les tissus de s’enrouler vers l’intérieur lors du roulement, ce qui est particulièrement utile lors de l’analyse de tissus enflammés avec une musculaire épaissie. De plus, il est essentiel de souligner le rôle essentiel de la coupe tissulaire dans l’obtention de résultats fiables. Une coupe appropriée garantit la préservation de l’architecture tissulaire et facilite une immunocoloration précise, contribuant ainsi au succès des analyses en aval¹¹. L’approche optimisée est moins difficile que celle d’autres protocoles, ce qui permet d’obtenir des résultats cohérents entre différents individus. La technique mise en avant dans cet article fournit également une architecture tissulaire bien préservée, une polyvalence et une immunocoloration hautement reproductible à l’aide de divers anticorps.

Un aspect critique de ce protocole est le temps de fixation et de traitement. Une fixation et un traitement inadéquats des tissus peuvent nuire aux analyses histochimiques. Les tissus trop fixés deviennent cassants, tandis que les tissus sous-fixés restent trop mous. Les tissus surfixés et sous-fixés sont difficiles à sectionner et compromettent l’immunomarquage. Une fois disséqué sur du papier filtre, le tissu doit être immédiatement placé dans du formol pour réduire les altérations post-mortem²². Dans ce protocole, le tissu murin est fixé dans du formol pendant la nuit. Plusieurs études ont utilisé ce temps de fixation 20,23,24. Cependant, Boenisch et al. ont montré que l’immunocoloration est constante dans les tissus fixés dans le formol jusqu’à 4 jours²⁵. L’optimisation du temps de fixation et du fixateur est nécessaire en fonction des analyses souhaitées. Par exemple, le fixateur de Carnoy est souvent préféré pour la coloration du mucus²⁶. Le choix des fixateurs et la durée du temps de fixation doivent être optimisés par chaque chercheur en fonction de son approche expérimentale. L’utilisation d’un processeur de tissus automatisé est recommandée pour garantir des temps de traitement précis et cohérents. Notre laboratoire utilise de petites broches pour maintenir le tissu intestinal en place sous forme de rouleaux. Sans broches, le tissu peut se dérouler pendant le traitement. Comme ces broches sont assez petites et tranchantes, des précautions doivent être prises. Nous vous conseillons d’utiliser des pinces coupantes pour retirer l’extrémité pointue de la goupille avant le traitement des tissus. Certaines carottes d’histologie n’acceptent pas les tissus avec des épingles ; Par conséquent, il est préférable de vérifier avant de l’utiliser. Une autre approche consiste à utiliser de la gélose pour ancrer les tissus avant le traitement²⁷ ou des éponges à cassette pourraient être utilisées dans les cassettes pour aider à maintenir les rouleaux.

L’immunomarquage est un protocole qui nécessite une optimisation pour chaque anticorps. L’utilisation d’anticorps validés par knock-out est recommandée dans la mesure du possible. Cette méthode de fixation et de traitement des tissus permet une coloration claire, ce qui permet d’identifier facilement la liaison des anticorps par rapport au signal de fond lorsque des anticorps non validés sont utilisés. Le choix du fixateur, la récupération de l’antigène et la dilution de l’anticorps peuvent avoir un impact sur la spécificité de l’anticorps. Nous recommandons aux chercheurs d’évaluer et d’optimiser soigneusement le protocole en ajustant la fixation, la récupération de l’antigène et le temps d’incubation de chaque anticorps. Pour obtenir les meilleurs résultats, les anticorps doivent être testés à différentes dilutions pour déterminer la concentration optimale et dans différents tampons de récupération d’antigène. La récupération des épitopes améliore l’immunocoloration en brisant les ponts de méthylène formés lors de la fixation. Dans ce protocole, la récupération d’épitopes induite par la chaleur est utilisée plutôt que la récupération d’épitopes induite par les protéolytiques, car la digestion enzymatique est plus susceptible de perturber la morphologie des tissus²⁸. Les tampons de récupération d’épitopes induits par la chaleur les plus courants sont le tampon de citrate, le tris-HCl et le tris-EDTA, le tampon de citrate étant le plus doux sur la morphologie tissulaire²⁹. Le choix du tampon varie et doit être déterminé pour chaque anticorps. De nombreux tampons de récupération d’antigènes, solutions de blocage et diluants d’anticorps sont disponibles dans le commerce. Cependant, ces solutions peuvent être extrêmement coûteuses et prohibitives. Nous avons fourni des recettes de solutions courantes de récupération d’antigènes et de solutions de blocage et de diluant d’anticorps pour garantir la rentabilité.

L’une des limites de cette méthode est que la fixation et le traitement peuvent modifier les tissus et masquer les épitopes. Une autre approche consiste à immunocolorer des tissus frais congelés. Les tissus frais congelés sont surgelés, ce qui permet d’éviter l’exposition à des fixateurs toxiques, de préserver la structure des protéines et d’améliorer l’accessibilité de certains épitopes. Cependant, l’architecture et la morphologie des tissus sont plus pauvres que celles des tissus fixes et inclus dans la paraffine. Parmi les autres défis posés par les tissus frais congelés, citons les matériaux et la logistique nécessaires à la section et au stockage des blocs et des lames congelés. L’analyse des rouleaux suisses par rapport aux bandelettes de tissu intestinal montre des différences dans la hauteur et la largeur des villosités et des différences dans les cellules immunitaires de la lamina propria, comme décrit dans un rapport antérieur³⁰. Ces résultats suggèrent que les Swiss rolls intestinaux modifient certaines caractéristiques intestinales, ce qui devrait être pris en compte lors de la planification des expériences. De plus, une revalidation des anticorps est nécessaire car de nombreux anticorps qui se lient spécifiquement aux tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine ne se colorent pas bien dans les tissus frais congelés³¹.

L’immunocoloration du tissu intestinal peut être utilisée pour répondre à une grande variété de questions concernant la biologie et la physiologie des cellules gastro-intestinales. Cette technique est largement utilisée pour identifier les altérations épithéliales dans le cadre de l’inflammation intestinale, à la suite d’une infection bactérienne et au cours de la progression du cancer. La méthode présentée ici est idéale pour la préservation des tissus intestinaux car elle est rentable, peu techniquement difficile et hautement reproductible. Afin d’obtenir les meilleurs résultats, nous encourageons l’optimisation des étapes décrites dans ce protocole en fonction du plan d’expérience et de l’hypothèse testée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
&beta ;-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Papier filtre cellulose	Cytiva	10427804	Papier Whatman épais
Lames de verre chargé Thermo	Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Broches de dissection taille 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R& D Systems	AF748
Gants de congélation	Tempshield	UX-09113-02
Bloc chauffant	Premiere	XH-2001	Chauffe-lames
Histo-Clear II	Microscopie électronique Sciences	64111-04	Réactif d’élimination
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Acide chlorhydrique	Sigma Aldrich	320331
Stylo hydrophobe	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Grandes cassettes	Tissue-Tek	4173
Pin’s minutien	Outils de science fine	NC9679721
réactif de blocage souris sur souris	Vector Laboratories	MKB-2213	Bloc souris sur souris
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Autocuiseur	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Support de montage
Pince à action inverse	Dumont	5748
Rack à glissières	Tissue-Tek	62543-06
Kit de coloration de lames	Tissue-Tek	62540-01	Plats résistants aux solvants et cadre métallique
Petites cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Citrate de sodium dihydraté	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Tampon de blocage
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Lingettes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
&gamma ;-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638