Circuits immunométaboliques dans l’infection pour faire progresser les thérapies dirigées vers l’hôte

Résumé

Ici, un protocole pour la conception, la construction et l’administration d’un circuit synthétique inductible à base de tétracycline contrôlé par la tétracycline est présenté. L’effet des circuits synthétiques sur l’élimination des parasites et l’expression des cytokines peut être étudié en canalisant le pipeline présenté. Ce protocole est pertinent pour les chercheurs qui étudient les thérapies basées sur des circuits synthétiques dans les maladies infectieuses.

Résumé

L’immunométabolisme est un déterminant essentiel de la progression de la leishmaniose. L’approche basée sur la biologie synthétique a suscité beaucoup d’attention en tant qu’étape vers une intervention thérapeutique ciblant les facteurs associés à l’hôte qui sont à l’origine de la leishmaniose. La biologie synthétique implique l’ingénierie de composants génétiques de manière orthogonale et modulaire pour moduler avec précision les systèmes biologiques, conférant de nouvelles fonctions aux cellules. Dans l’étude présentée, l’élucidation d’un pipeline systématique pour le développement d’un circuit synthétique inductible contrôlé par la tétracycline (TetON) visait à délivrer de la succinate déshydrogénase en tant qu’agent thérapeutique pour faciliter l’élimination des parasites Leishmania intracellulaires. Le protocole décrit décrit la conception d’un circuit synthétique et sa validation ultérieure. La stratégie proposée se concentre également sur l’incorporation de circuits synthétiques dans le squelette plasmidique en tant que véhicule d’administration. De plus, des machines d’administration utilisant des nanoparticules à base de polyplexes pour l’administration de circuits synthétiques ont été utilisées dans des lignées cellulaires de macrophages murins sans compromettre la morphologie cellulaire. La standardisation de la méthode a été effectuée pour sélectionner les cellules transfectées et déterminer la concentration d’induction optimale pour l’expression en circuit synthétique. Les observations révèlent une nette réduction de la charge parasitaire intracellulaire dans les cellules transfectées par rapport aux cellules infectées. Les cytokines pro-inflammatoires ont été exprimées après l’infection dans des cellules transfectées et induites par un circuit synthétique comme mécanisme pour favoriser l’élimination du parasite. Cela souligne que la méthode basée sur la biologie synthétique est une approche puissante dans la leishmaniose en ciblant les facteurs de l’hôte associés à la progression de la maladie.

Introduction

L’avancement de la médecine holistique et intégrative est un lien important qui a été identifié entre les altérations métaboliques dans les cellules immunitaires et leur capacité à moduler le phénotype des cellules immunitaires dans les maladies infectieuses. L’immunométabolisme offre de nouvelles perspectives pour élucider la pathogenèse des maladies infectieuses prévalentes chez l’homme. De plus, il fournit des techniques prometteuses pour le développement de vaccins et de médicaments en identifiant de nouvelles cibles d’intervention¹. La reprogrammation métabolique des cellules immunitaires est identifiée dans diverses maladies infectieuses, y compris la leishmaniose. Leishmania spp. est responsable de la leishmaniose, dont Leishmania major (L. major) provoque la leishmaniose cutanée (CL). Les parasites L. major ont un impact significatif sur le métabolisme des cellules hôtes, en particulier dans les macrophages, pour la prolifération et la survie en tant que parasites intracellulaires². Les macrophages peuvent généralement se polariser en sous-ensembles activés de manière classique (M1) ou activés (M2) où les cellules M1 possèdent une sécrétion élevée de cytokines pro-inflammatoires et une production d’oxyde nitrique (NO) par le métabolisme des espèces azotées. Les cellules M2 présentent des niveaux élevés de cytokines anti-inflammatoires et présentent une activité élevée de l’arginase par le métabolisme de l’azote³. Ainsi, les deux phénotypes diffèrent non seulement par leur réponse immunitaire, mais aussi par leurs voies métaboliques.

La biologie des systèmes de la leishmaniose vise à identifier des cibles moléculaires pour la conception de nouveaux traitements par la conception et le développement de médicaments. La reconstruction des réseaux de signalisation et des voies métaboliques aide à comprendre la leishmaniose en tant que modèle holistique et permet d’identifier le principal composant à l’origine de l’état pathologique. La modélisation mathématique est l’une des approches analytiques appliquées les plus privilégiées pour comprendre les complexités de la leishmaniose⁴. Des réseaux immunométaboliques et des modèles mathématiques ont permis d’identifier la succinate déshydrogénase (SDHA) comme un composant clé du phénotype M1, qui est exprimé pour éliminer le parasite⁵. La biologie synthétique a des applications dans le diagnostic, le développement de vaccins et les traitements contre la leishmaniose. Le métabolisme ciblant la modulation de la réponse immunitaire peut être réalisé à l’aide d’outils de biologie synthétique. Pour la modulation de l’inositol phosphoryl céramide synthase qui régule le métabolisme des sphingolipides et modifie la signalisation immunitaire de l’hôte, un circuit génétique possédant un comportement bisstable a été utilisé pour ajuster synthétiquement la robustesse intrinsèque du modèle d’infection à L. major ^6,7. Par conséquent, la biologie des systèmes et la biologie synthétique peuvent fournir une plate-forme de génie génétique basée sur un modèle pour le développement de la médecine de précision dans le système modèle de Leishmania.

Le phénotype M1 est marqué par l’expression de réseaux de signalisation immunométaboliques où la production de cytokines inflammatoires et de voies métaboliques améliore de manière synergique l’élimination du parasite. La polarisation M1 signifie la production de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine-12 (IL-12), l’interféron-gamma (IFN-γ) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Les voies métaboliques fortement enrichies dans le phénotype M1 comprennent la glycolyse, la voie du pentose phosphate et le cycle tronqué de l’acide tricarboxylique (cycle TCA)⁵. Le cycle tronqué du TCA dirige la machinerie d’élimination des parasites grâce à l’augmentation des niveaux de succinate et de citrate, qui guident la production de NO³. L’accumulation de succinate par la SDHA conduit à l’activation du facteur de transcription 1-alpha inductible par l’hypoxie (HIF-1α), qui induit la production d’IL-1β⁸. Dans le phénotype M2, l’oxydation des acides gras, l’augmentation de l’utilisation de la glutamine et l’augmentation de la phosphorylation oxydative du glucose sont observées ainsi que la production de cytokines anti-inflammatoires telles que l’interleukine-10 (IL-10), le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), l’interleukine-4 (IL-4) et l’interleukine-13 (IL-13)³. M2 présente des mitochondries allongées comme une caractéristique distinctive, conduisant à une efficacité accrue dans la production d’énergie. Ils utilisent des acides gras, du glucose et de la glutamine comme substrats pour alimenter le cycle du TCA, générant ainsi de l’ATP par phosphorylation oxydative à un taux plus élevé pour favoriser la croissance et la prolifération du parasite⁹. L’enzyme SDHA responsable de l’accumulation de succinate par le biais du TCA tronqué peut non seulement favoriser la production de NO, mais également initier une consommation d’oxygène dépendante du succinate par le transport d’électrons¹⁰. Dans les macrophages infectés par Leishmania, la SDHA est régulée à la baisse de 2,17 fois, ce qui indique que la respiration aérobie pourrait également être régulée à^{la baisse par 11}. Afin d’augmenter la consommation de succinate pour induire la production de NO médiée par les cytokines pro-inflammatoires et favoriser l’élimination du parasite, l’expression de la SDHA est essentielle.

Le circuit synthétique offre des thérapies ciblées avec précision qui peuvent modifier le système malade pour obtenir une oscillation bistable qui peut restaurer un phénotype sain au niveau spatio-temporel. La distribution et l’expression du circuit synthétique rendent le système dynamique et robuste. L’un des facteurs essentiels contribuant à l’avancement de la biologie synthétique réside dans la capacité d’assembler des parties et des éléments génétiques de manière modulaire pour permettre la génération d’architectures complexes et de fonctionnalités sur mesure¹². Les contraintes associées aux techniques d’expression traditionnelles ont stimulé l’émergence de circuits synthétiques de plasmides inductibles à base d’opérons de tétracycline, permettant ainsi une évaluation rapide du plasmide et une distribution facile dans divers types de cellules¹³. La protéine répressrice sensible à la tétracycline (TetR), lorsqu’elle existe en tant que dimère, présente une forte affinité de liaison avec l’opéron tet (TetO), supprimant efficacement la transcription. Cependant, lors de l’interaction de son ligand, la doxycycline (dox), TetR subit une altération structurelle, entraînant sa dissociation de TetO, permettant ainsi à la transcription de se dérouler sans entrave. Ce circuit peut présenter un contrôle de traduction protéique¹⁴. Par conséquent, grâce à la méthodologie définie, le circuit synthétique plasmidique inductible à base d’opéron tétracycline conçu a été permis d’exprimer SDHA dans le vecteur pEGFP-N1. L’évaluation de l’efficacité de transformation du circuit et de son rendement a permis de mieux cerner la compétence de livraison. Grâce à la digestion par restriction du vecteur, la détermination de l’efficacité du clonage a été confirmée. De plus, une lignée cellulaire de macrophages de souris RAW264.7 transfectée dérivée de macrophages péritonéaux de souris Balb/c a été observée pour l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dose-dépendante de la doxycycline dans les cellules transfectées. De plus, l’effet d’élimination du parasite dans les cellules transfectées a été corroboré par une expression du circuit synthétique. De plus, l’induction et l’expression de cytokines pro-inflammatoires ont été observées, ce qui a été dirigé par une augmentation du point temporel de l’infection dans le circuit synthétique transfecté et induit des cellules, ce qui était directement associé au fonctionnement du circuit synthétique.

Protocole

1. Culture cellulaire de cellules RAW264.7

REMARQUE : Utilisez un faible nombre de passages pour l’expérimentation. La lignée cellulaire RAW264.7 a été obtenue à partir du dépôt national de cellules du Conseil d’innovation en biotechnologie du Centre national des sciences cellulaires (BRIC-NCCS), à Pune. Comme la lignée cellulaire RAW264.7 est une lignée cellulaire de macrophage, elle peut commencer à se différencier avec l’augmentation des passages. Après avoir ranimé les cellules, utilisez la lignée cellulaire pour la transfection après 2 passages.

1. Semez 5 x 10⁵ cellules de la lignée cellulaire RAW264.7 dans une fiole de²⁵ cm complétée par 5 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 100 UI/mL de pénicilline comme milieu complet.
2. Conservez les cellules pour la croissance et la prolifération dans un incubateur avec 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à ce que 90 % de confluence soit atteint.
3. Jetez le support et lavez-le 3 fois avec 1 tampon salin de phosphate (PBS). Ajoutez 1 mL de PBS dans la fiole, grattez les cellules à l’aide d’un grattoir et recueillez les cellules dans un tube de 1,5 mL.
4. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à 24 °C et remettre la pastille en suspension à l’aide d’une pipette de 1 mL dans 1 mL de milieu complet DMEM.
5. Comptez les cellules dans la chambre de comptage cellulaire à l’aide de bleu trypan à 0,5 % pour identifier le pourcentage de cellules vivantes.

2. Culture cellulaire du parasite L. major

NOTE : L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) était un cadeau du BRIC-NCCS. Les promastigotes doivent avoir un nombre de passage inférieur à 10. Le nombre de passages plus faible garantit que le parasite est en bonne santé et que sa capacité à infecter les macrophages est plus élevée.

1. Cultivez des promastigotes de L. major (MHOM/Su73/5ASKH) dans le milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 20 % de FBS comme milieu complet.
2. Grainez 1 x 10⁶ promastigotes dans^{une fiole} non ventilée de 25 cm contenant 5 mL de milieu complet. Incuber le ballon à 27 °C pendant 5 jours et observer le promastigote stationnaire L. major parasite à 20x au microscope à fond clair.
   REMARQUE : Les promastigotes en phase stationnaire peuvent être obtenus en 4 à 7 jours après la culture. Ils se caractérisent par leur état flagellé allongé et leur motilité réduite.

3. Conception d’un circuit synthétique dans un plasmide comme vecteur de livraison

1. Conception de parties du circuit synthétique
   1. Ouvrez le logiciel Tinker cell et passez à l’onglet Pièces. Sélectionnez le composant Promoteur dans la bibliothèque et placez-le sur le canevas pour symboliser le promoteur du cytomégalovirus (CMV) dans le circuit synthétique. Récupérez le site de liaison du répresseur, analogue à TetO, à partir de l’onglet Pièces et positionnez-le à côté du promoteur sur le canevas, en l’intégrant de manière transparente au promoteur CMV.
   2. Incorporez l’opérateur tétracycline (TetO), les sites d’entrée internes des ribosomes (IRES) et la région codante en glissant et déposant le site de liaison du répresseur, le site de liaison du ribosome (rbs) et la région codante sur le canevas, en les intégrant aux composants génétiques existants.
   3. Renommez la région codante en TetR, désignant le répresseur sensible à la tétracycline, qui fonctionne comme un régulateur négatif putatif dans le circuit synthétique. Fusionner ces éléments génétiques pour faciliter la construction des parties synthétiques.
   4. Incorporez une région d’espacement (sd1) sur la toile, conçue pour être clivable par des protéases cellulaires comme le teschovirus-1 2A porcin (P2A). Introduisez une région codante supplémentaire représentant le gène d’intérêt, étiquetez-la comme SDHA dans la construction synthétique et intégrez-la aux autres éléments.
   5. Adjacente à la région codante SDHA, intégrez une autre région d’espacement clivable de la protéase (sd2), qui sera clivable par la protéase cellulaire P2A. Introduisez une région codante représentant le gène rapporteur et étiquetez-la comme GFP dans le construit.
      REMARQUE : L’expression GFP peut fournir une estimation de la production de SDHA et garantir que le circuit synthétique a un fonctionnement logique¹³.
   6. À côté de GFP, ajoutez une terminaison (ter1) et vérifiez les pièces assemblées en vérifiant si toutes les pièces sont connectées. Le circuit doit apparaître en rouge lorsque vous cliquez sur une pièce. Cela confirme la formation d’un circuit génétique fonctionnel.
   7. Dans l’onglet Réaction, attribuez des taux régulateurs, qui incluent des paramètres et des valeurs initiales pour la production de protéines, à TetR, SDHA et GFP pour délimiter la réaction de traduction dans le circuit synthétique.
   8. Ajoutez une petite molécule à partir de l’onglet Pièces, nommez-la Doxycycline (dox) et attribuez-lui une fonction d’onde en sélectionnant Entrée dans l’onglet Parties et connexion, puis en cliquant sur Entrée d’onde.
   9. Depuis l’onglet Régulation , cliquez sur Réaction de la répression. Faites glisser et déposez la vitesse de réaction sur le canevas entre dox et TetR. Réglez la cinétique de réaction entre dox et TetR en double-cliquant sur l’icône de la fonction d’onde sur dox et en ajustant Doxyxycline.sin.amplitude à 10.
   10. Mettez en œuvre la réaction régulatrice transcriptionnelle entre la protéine TetR et le site de liaison du répresseur en sélectionnant la réaction dans l’onglet Régulation et en la plaçant sur la toile entre TetR et TetO.
   11. En double-cliquant sur chaque composant et réaction, définissez une concentration initiale et un paramètre pour la simulation. Cliquez sur Simulation, choisissez Déterministe et simulez le circuit pour 100 unités de temps. Ajustez le graphique de simulation à partir du panneau de configuration, qui s’affiche avec le graphique, et observez le modèle graphique pour les protéines SDHA et TetR.
2. Identification des composants génétiques à partir du registre des pièces iGEM
   1. Ouvrez le Registre des pièces biologiques normalisées (Table des matériaux) et cliquez sur Rechercher. Entrez le nom du composant génétique, par exemple, promoteur du CMV.
      REMARQUE : Le processus de recherche de l’ID iGEM doit être effectué pour tous les composants génétiques du circuit synthétique. Les étapes d’identification de l’ID iGEM du promoteur CMV sont énumérées ; Par la suite, les étapes doivent être répétées pour les autres composants.
   2. Pour obtenir la séquence nucléotidique du promoteur CMV, cliquez sur l’option Obtenir la séquence de pièces et enregistrez le fichier en tant que fichier texte.
      REMARQUE : Il est crucial de noter que des stocks de toutes les parties génétiques sont disponibles.
   3. Répéter les étapes 3.2.1 et 3.2.2 pour toutes les parties génétiques (opérateur tétracycline, séquence de Kozak, TetR, P2A et GFP) à l’exception de la SDHA.
   4. Pour obtenir la séquence codante pour la protéine SDHA, ouvrez NCBI et choisissez Nucléotide dans la liste déroulante à côté de la fenêtre de recherche. Tapez Succinate déshydrogénase et Mus musculus et recherchez la séquence nucléotidique.
   5. Cliquez sur l’option CDS pour obtenir la séquence de codage de SDHA et enregistrer la séquence dans un fichier texte.
   6. Fusionnez la séquence nucléotidique de toutes les parties régulatrices génétiques dans un seul fichier séquentiellement. Ajoutez le codon de départ (ATG) juste après la séquence de Kozak et supprimez les codons d’arrêt internes pour éviter la formation de polypeptides naissants.
   7. Ouvrez le site ExPASy¹⁵ et collez la séquence de nucléotides. Cliquez sur l’option Traduire la séquence . Sélectionnez 5'3' Frame 1 et supprimez les codons d’arrêt, qui seront surlignés en rouge dans la section des résultats.
      REMARQUE : Pour déterminer si la séquence nucléotidique se traduit efficacement en la séquence polypeptidique souhaitée, vous pouvez utiliser un outil de traduction tel qu’ExPASy. Cela garantit la prévention des polypeptides naissants indésirables. La sélection du vecteur pEGFP-N1 pour l’expression du circuit synthétique est optimale, étant donné que le promoteur du CMV et le gène GFP étaient préexistants dans le vecteur. Toutes les parties génétiques ont été assemblées à l’aide d’un protocole de clonage (qui a été externalisé). Les enzymes de restriction utilisées pour le clonage des inserts sont NotI et XhoI. Ces sites d’enzymes de restriction sont situés dans le site de clonage multiple du vecteur pEGFP-N1.

4. Transformation du circuit synthétique dans les cellules DH5α d’Escherichia coli (E.coli)

1. Préparation des cellules compétentes E.coli DH5α
   REMARQUE : L’autoclave des réactifs est recommandé. Les réactifs peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
   1. Cultiver 1 mL d’inoculum frais dans 50 mL de bouillon Luria (LB) à 37 °C, 180 tr/min. Faites croître les cellules pendant environ 2 h jusqu’à ce qu’une densité optique (DO) de 0,4 à 0,6 soit atteinte à 600 nm.
   2. Centrifuger les cellules à 4 696 x g à 4 °C pendant 15 min. Jeter manuellement le surnageant dans la fiole en renversant le tube à centrifuger de 50 mL et en récoltant la pastille de cellule.
   3. Remettez doucement la pastille en suspension dans 2 ml de chlorure de magnésium 0,1 M (MgCl2) glacé à l’aide d’une pipette de 1 mL. Compléter le volume jusqu’à 20 mL avec du MgCl 2 glacé_.
   4. Centrifuger le tube à 4 696 x g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant. Remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette de 1 ml dans 1 ml de chlorure de calcium 0,1 M (CaCl₂) glacé et incubez sur de la glace pendant 2 h. Utilisez les cellules compétentes fraîchement préparées pour la transformation.
2. Transformation de cellules compétentes avec construction de circuit synthétique
   1. Mesurez 50 μL de cellules compétentes et ajoutez-les dans un tube de 1,5 ml. Placez le tube sur de la glace. Ajouter 10 ng de construction de circuit synthétique à l’aliquote et garder sur la glace pendant 3 min.
   2. Cellules de choc thermique à 42 °C pendant 3 min sur un bloc chauffant sec. Une fois l’incubation sur le bloc chauffant sec terminée, remettez les cellules sur de la glace pendant 3 min, ajoutez 1 mL de LB dans les cellules et incubez à 37 °C pendant 1 h à 250 tr/min.
   3. Une fois l’incubation terminée, centrifuger les cellules à 4 696 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de LB et les déposer sur une gélose LB contenant 50 μg/mL de kanamycine. Retournez la plaque et incubez à 37 °C pendant 24 h.

5. Isolation de la construction du circuit synthétique

1. Dans un tube à centrifuger de 50 ml, prélever 10 ml de milieu LB et ajouter 50 μg/mL de kanamycine comme bouillon de sélection pour cultiver des cellules transformées pour l’isolement plasmidique. Prélevez une colonie transformée à l’aide d’une pointe de 200 μL et ajoutez-la au bouillon de sélection.
2. À l’aide d’une boucle d’inoculation, sélectionner une autre colonie unique, tracer une plaque à l’aide de la technique pentagonale et incuber à 37 °C pendant 24 h afin de maintenir les isolats d’une seule colonie.
3. Faites pousser les cellules pendant la nuit à 180 tr/min à 37 °C. Le lendemain, centrifuger la culture à 4 696 x g pendant 20 min à 24 °C. Après la centrifugation, jeter le surnageant en inversant le tube et ajouter 1 mL de tampon de remise en suspension (50 mM de chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris-HCl), 10 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA), 100 μg/mL de RNase A (pH-8,0)) à la pastille et remettre les cellules en suspension en pipetant doucement.
   REMARQUE : Pour remettre le tampon en suspension, ajoutez la RNase A 5 min avant d’ajouter le mélange à la pastille de cellule.
4. Incuber le mélange pendant 5 min à RT. Ajouter 1 mL de tampon de lyse (hydroxyde de sodium 0,2 N (NaOH), 1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS)) dans les cellules et mélanger en inversant le tube pendant 2 min. Incuber le tube pendant 5 min à RT.
5. Ajouter 1 mL de tampon de neutralisation dans les cellules (3 M d’acétate de potassium (CH₃CO₂K)) et mélanger en inversant le tube plusieurs fois. Centrifuger les cellules à 4 696 x g pendant 20 min à RT et recueillir le surnageant dans un tube de 1,5 mL.
6. Ajouter 500 μL d’isopropanol au surnageant et bien mélanger en inversant. Incuber le surnageant sur de la glace pendant 15 min, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
   REMARQUE : L’incubation peut durer de 5 min à 1h. Pendant ce temps, il est conseillé de mélanger doucement le contenu en inversant toutes les 5 min.
7. Jetez le surnageant, ajoutez 1 mL d’éthanol à 70 % (réfrigéré) à la pastille et centrifugez-la à 12000 x g pendant 5 min à 4 °C. Répétez cette étape une fois de plus.
8. Faites sécher la pastille à l’air libre et mettez en suspension le plasmide obtenu dans 20 μL d’eau stérile sans nucléases (NFW). Mesurer la concentration du plasmide sur un spectrophotomètre à la longueur d’onde de 260/280 nm.
   REMARQUE : Ajouter plus de NFW si la concentration de plasmide est très élevée pour être estimée par nanogoutte. Le processus de dilution du plasmide doit être effectué dans un capuchon laminaire.

6. Électrophorèse sur gel d’agarose (AGE) du circuit synthétique

1. Préparation d’un échantillon de plasmide pour AGE
   1. Dans un tube de 1,5 ml, mesurer 20 μL de 1x Tris-acétate-EDTA (TAE). Ajouter 4 μL de tampon de chargement 6x et bien mélanger par pipetage.
   2. Faites tourner rapidement le tube, ajoutez 1 μg du vecteur plasmidique du circuit synthétique et mélangez bien en pipetant le mélange. Ce mélange réactionnel peut être chargé sur du gel d’agarose.
      REMARQUE : Évitez le pipetage rigoureux car il pourrait endommager la structure plasmidique. Au lieu de cela, faites tourner rapidement les réactifs pour mélanger.
2. Digestion par restriction du circuit synthétique
   1. Dans un tube de 1,5 ml, ajoutez 2 μL de tampon de restriction 10x, 1 μL de NotI et 1 μL d’enzyme de restriction XhoI, et mélangez bien en faisant tourner rapidement le contenu. Ajoutez 1 μg de vecteur plasmidique de circuit synthétique et faites tourner rapidement le contenu.
   2. Augmentez le volume du tube à 20 μL en ajoutant du NFW au contenu et en donnant au tube un essorage rapide. Incuber le tube à 37 °C pendant 1 h.
   3. Après l’incubation, maintenez le tube à 70 °C pendant 15 min dans un bloc chauffant sec pour désactiver les enzymes de restriction. Refroidissez le contenu du tube et ajoutez 6 μL de tampon de chargement au mélange réactionnel. Mélangez le contenu en faisant tourner rapidement le tube. Ce mélange réactionnel peut être chargé sur du gel d’agarose.
   4. Installez le gel d’agarose et faites-le fonctionner en utilisant le protocole¹⁶ décrit précédemment. Brièvement, chargez des échantillons de 20 μL dans chaque puits, chargez 5 μL d’une échelle d’ADN de 1 Kb et faites fonctionner le gel à 100 V. Débranchez l’alimentation électrique une fois l’électrophorèse terminée, acquérez le gel sur un imageur à gel et activez l’option de fluorescence pour afficher les bandes.

7. Transfection de la construction du circuit synthétique dans la lignée cellulaire RAW264.7

1. Préparation des échantillons
   1. Préparez des échantillons pour déterminer l’effet d’élimination du parasite par circuit synthétique induit. Le premier échantillon est constitué de cellules RAW264.7 non transfectées (contrôle), le deuxième est constitué de cellules RAW264.7 infectées par des promastigotes de L. major pendant 6 h (6 h infectés), le troisième échantillon était constitué de cellules RAW264.7 transfectées avec un circuit synthétique et induites par dox (IMT), les échantillons de point temporel d’infection sont des cellules RAW264.7 transfectées par un circuit synthétique et induites par du dox qui est infecté par L. major promastigotes (IMTI) pour différents points de temps 6 h (6 h IMTI), 12 h (12 h IMTI), 18 h (18 h IMTI) et 24 h (24 h IMTI).
   2. Pour préparer tous les échantillons, grattez les cellules RAW264.7 de la fiole de 25 cm² et centrifugez-la à 300 x g pendant 5 min à RT.
   3. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet DMEM. Prenez 10 μL des cellules remises en suspension dans un tube de 100 μL, ajoutez 10 μL de bleu de trypan à 0,5 % dans les cellules et mélangez bien.
   4. Chargez 10 μL de mélange de cellules et de bleu trypan sur la lame de la chambre de comptage de cellules et prélevez le comptage des cellules dans 4 chambres.
   5. Plaquez les cellules dans le fond de lamelle de 96 puits, les plaques à 2 x 10,⁴ cellules par puits et incubez les cellules pendant 24 h. Cet échantillon est l’échantillon de contrôle. Cette étape reste constante pour la préparation d’autres échantillons.
      REMARQUE : Préchauffez le média à 37 °C dans un bain-marie avant de l’utiliser.
   6. Pour préparer un échantillon infecté de 6 h, centrifuger 1 mL de promastigotes majeurs en phase stationnaire à 7 273 x g pendant 10 min. Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de milieu complet DMEM et effectuer le comptage cellulaire dans une chambre de comptage cellulaire en suivant les étapes 7.1.3 à 7.1.4.
   7. Ajouter 2 x 10 promastigotes majeurs de⁵L dans le puits et les incuber avec 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 6 h. Après l’incubation, laver les cellules 3 fois avec du PBS.
   8. Pour préparer l’échantillon IMT, ensemencez les cellules en suivant les étapes (7.1.2-7.1.5) et effectuez les étapes de transfection 7.2.1-7.2.6.
   9. Pour préparer des échantillons de points temporels d’IMTI, suivez les étapes 7.1.2 à 7.1.5 et effectuez les étapes de transfection 7.2.1 à 7.2.6. Jetez le milieu complet DMEM contenant 500 μg/mL de généticine (G418) et 1 μg/μL de dox et lavez les cellules 3x avec 1x PBS.
   10. Ajouter 2 x 10 promastigotes majeurs de⁵L. dans les puits et les incuber pendant 6 h, 12 h, 18 h et 24 h. Après l’infection, jeter les promastigotes contenant du milieu complet DMEM et laver les puits 3x avec 1x PBS. Ajouter 200 μL de milieu complet DMEM contenant 500 μg/mL de généticine (G418) et 1 μg/μL de dox dans les cellules et incuber pendant 24 h.
2. Transfection de circuit synthétique
   1. Dans un tube de 1,5 ml, ajoutez 24 μL de milieu à sérum réduit, qui est un milieu essentiel minimal amélioré. Dans le milieu, ajoutez 1 μg de vecteur pEGFP-N1 cloné avec un plasmide de circuit synthétique.
   2. Dans un tube frais de 1,5 ml, ajouter 24 μL de Minimal Essential Medium et ajouter 1 μL de polyéthylénimine (PEI ; 1 μg /μL). Mélangez bien en pipetant le mélange au moins 10 fois et incubez à RT pendant 5 min.
   3. Transférez le mélange PEI dans le tube de 1,5 mL contenant le mélange d’ADN. Bien mélanger en pipetant goutte à goutte au moins 10x. Incuber le mélange ADN/PEI à RT pendant 10 min.
   4. Jetez le milieu des puits sur les plaques inférieures à 96 puits et lavez les cellules 3 fois avec du PBS. À l’aide d’une pipette, ajoutez délicatement l’ADN :PEI goutte à goutte dans les cellules et secouez doucement la plaque. Incuber les cellules avec 5% de CO₂ à 37 °C pendant 3 h.
   5. Après l’incubation, ajoutez 200 μL de Minimal Essential Medium frais aux cellules, secouez doucement la plaque et incubez pendant 24 h avec 5 % de CO₂ à 37 °C.
      REMARQUE : L’Île-du-Prince-Édouard est cytotoxique ; Par conséquent, il est recommandé de ne pas incuber de cellules après la transfection pendant plus de 24 heures.
   6. Le lendemain, jetez le milieu et lavez les cellules 2 fois avec du PBS. Ajouter dans les cellules un milieu complet DMEM contenant 500 μg/mL de généticine (G418) et 1 μg/μL de dox et incuber pendant 24 h.
3. Fixation des échantillons pour la microscopie confocale
   1. Pour fixer tous les échantillons, laver les cellules avec 1x PBS 3x, ajouter 100 μL de paraformaldéhyde à 4% aux cellules et incuber à RT pendant 10 min.
   2. Lavez les cellules avec du PBS 3x. Une fois le lavage terminé, ajoutez 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) aux cellules et incubez à RT pendant 15 minutes dans l’obscurité.
   3. Après l’incubation, laver les cellules 3 fois avec du PBS. Observez les cellules au microscope confocal pour l’expression de la GFP et la coloration DAPI.

8. Acquisition de cellules transfectées par microscopie confocale et quantification

1. Nettoyez le fond des lamelles des puits à l’aide d’un mouchoir absorbant. Allumez les commandes du microscope confocal à balayage laser. Ensuite, allumez le compresseur et la lampe au mercure.
2. Pour faire fonctionner la machine, les commandes du microscope, la commande de la tête de balayage, la clé laser, le module laser, la lampe, le contrôleur de microscope et le processeur doivent être activés séquentiellement.
3. Sur l’ordinateur, ouvrez le logiciel (Table des matériaux) et cliquez sur Activer le contrôle de la platine XY. Une fenêtre contextuelle s’ouvrira qui vous demandera d’exécuter le nettoyage pour 7S3. Cliquez sur Non. Fermez le graphique en direct et ajustez les écrans de réglage.
4. À l’objectif 60x, ajoutez une goutte d’huile d’immersion, placez la plaque inférieure de la lamelle de 96 puits sur la platine et déplacez la platine dans le plan X-Y pour ajuster la position de l’objectif sur le puits. Cliquez sur l’oculaire et sélectionnez Alexa-488 Channel. Cliquez sur Shutter Off pour faire la mise au point des cellules sur l’oculaire. Ajustez l’oculaire par noyau et mise au point fine.
5. Cliquez sur Shutter On présent sur le boîtier de contrôle du microscope et déplacez l’objectif pour ajuster sa position et faire la mise au point sur la zone d’intérêt pour observer les cellules en Contraste Interférentiel Différentiel (DIC). Passez en mode EPI sur le boîtier de commande du microscope pour observer les cellules du filtre de longueur d’onde Alexa-488 pour l’expression de la GFP. Les cellules doivent apparaître en vert.
6. Cliquez sur Obturateur désactivé, accédez à l’imagerie LSM et choisissez la résolution de l’image comme 1 024 x 1 024. Cliquez sur Ajouter une phase et faites-la glisser pour ajouter une chaîne verte en tant que phase.
7. Sur le programme Olympus, cliquez sur LSM et cliquez ensuite sur Live Button pour observer les cellules en contraste de phase et le canal Alexa 488nm. Appuyez sur Ctrl et faites défiler pour faire la mise au point sur les cellules à partir du logiciel de capture d’images.
8. Ajustez le gain et le décalage pour ajuster l’intensité de fluorescence capturée par le détecteur. Cliquez sur Capturer, nommez les images, puis cliquez sur Enregistrer.
9. Dans un logiciel d’imagerie, cliquez sur Fichier, sélectionnez toutes les images avec l’extension .oir, puis cliquez sur Ouvrir.
10. Cliquez sur la vue en mosaïque pour visualiser les images dans tous les canaux. Pour ajouter une barre d’échelle aux images, cliquez sur Afficher , puis choisissez l’option Barre d’échelle .
11. Pour enregistrer des images à partir de canaux uniques en niveaux de gris 16 bits, cliquez sur Fichier et sélectionnez Exporter l’image. Sélectionnez l’image et cochez les coches sur toutes les chaînes. Dans l’onglet Sélectionner un cadre de l’option de vue fractionnée, choisissez Oui. Dans l’onglet Sortie, choisissez la couleur RVB 24 bits avec l’option d’informations de gravure et choisissez tiff comme type de fichier pour l’image. Dans le dossier d’exportation vers, choisissez l’emplacement de fichier approprié pour enregistrer les images, puis cliquez sur OK.
12. Pour enregistrer des images fusionnées, suivez les mêmes étapes, sauf que, dans l’option de vue fractionnée, choisissez Non, et dans l’onglet Sortie, choisissez Canaux fusionnés avec informations de gravure.
13. Pour analyser l’expression de GFP dans les cellules, ouvrez Fiji sous Windows et exportez le fichier tiff. Sélectionnez la couleur verte pour analyser l’expression GFP.
14. Sélectionnez la zone de la cellule à l’aide de l’outil à main levée et cliquez sur Analyser pour mesurer l’intensité de fluorescence. Répétez le processus pour 3 images.
15. Exportez les données vers un logiciel d’analyse et effectuez des tests statistiques sur les données quantifiées.

9. Dosage de la charge parasitaire

1. Tout en visualisant les cellules sur un microscope confocal, comptez le nombre total de parasites présents dans les macrophages individuels.
2. Examinez au hasard 100 macrophages et notez le nombre de parasites intracellulaires. Effectuer un test statistique entre les échantillons infectés et les points temporels de l’IMTI pour examiner l’effet de l’expression de la SDHA sur le nombre de parasites.

10. Quantification de l’IL-10 et de l’IL-12 par immuno-sorbant enzymatique (ELISA)

1. Préparez les échantillons conformément aux étapes 7.1 et 7.2 et recueillez le milieu dans un tube de 1,5 ml. Conservez le support sur de la glace ou rangez-le à -20 °C jusqu’à nouvel ordre. Suivez les instructions du manuel d’utilisation du kit et effectuez l’ELISA pour l’IL-10 et l’IL-12.

11. Profilage des cytokines à l’aide de la PCR quantitative à transcription inverse en temps réel (qRT-PCR)

1. Préparez les échantillons selon les étapes 7.1 et 7.2. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 500 μL de réactif TRIzol et incuber les cellules pendant 2 min à RT.
   REMARQUE : Les étapes d’isolement de l’ARN doivent être effectuées dans une armoire à flux laminaire par mesure de sécurité contre la contamination par la RNase.
2. Prélever les échantillons dans un tube de 1,5 mL, y ajouter 100 μL de chloroforme et mélanger en inversant les tubes 5x-8x. Incuber les échantillons pendant 15 min à RT. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
3. Trois couches seront observées, recueillir la couche supérieure aqueuse claire dans un tube frais de 1,5 ml. Ajouter 500 μL d’isopropanol à la couche aqueuse, bien mélanger en inversant 10x et incuber les échantillons pendant 15 min à RT. Toutes les 5 minutes, mélangez à nouveau les échantillons en inversant les tubes.
4. Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant et lavez la pastille 2 fois avec de l’éthanol à 75 % fabriqué dans de l’eau contenant du pyrocarbonate de diéthyle à 0,1 % (DEPC) pendant 5 min et centrifugez-la à 8 000 x g à 4 °C.
   REMARQUE : Le DEPC contenant de l’eau dégrade les RNases, et il est donc recommandé de l’utiliser pour l’isolement des ARN.
5. Enfin, faites sécher la pastille à l’air libre pendant 5 min à RT, dissolvez-la dans 20 μL d’eau contenant du DEPC et mesurez la concentration d’ARN isolé, rapport 260/280 et 260/230, à l’aide d’un spectrophotomètre.
   REMARQUE : Le rapport 260/280 doit être d’environ 2,0, ce qui est généralement indicatif d’une forme pure d’ARN, et le rapport 260/230 doit être compris entre 2,0 et 2,2 afin de considérer que l’ARN isolé est exempt de composés chimiques indésirables tels que le TRIzole.
6. Pour la préparation de 20 μL de chaque échantillon d’ADNc, décongelez les réactifs sur de la glace et donnez-leur un bref essorage pendant 15 s à RT. Donnez un court essorage à tous les réactifs et même aux échantillons d’ARN avant utilisation.
7. Dans un tube autoclavé de 100 μL, prélever 0,8 μL de 25x dNTP, 2 μL de 10x Primer, 2 μL de 10x tampon. Ajouter une concentration de 1 μg/μL d’ARN et ajouter 0,5 μL d’enzyme transcriptase inverse. Augmenter le volume à 20 μL en utilisant du DEPC contenant de l’eau.
8. Faites tourner brièvement les échantillons d’ADNc pendant 1 minute à RT. Gardez les échantillons sur de la glace.
9. Allumez le thermocycleur, dévissez le panneau supérieur pour desserrer le support et placez les échantillons sur le bloc. Après avoir placé les échantillons, vissez bien le couvercle.
10. Une fois le système allumé, cliquez sur Exécuter. Sélectionnez l’option Principal , puis entrez dans le menu Programmes et sélectionnez l’option CDNA . Définissez le volume de l’échantillon à 20 μL et cliquez sur RUN. Le thermocycleur exécute le programme en quatre étapes. La première étape est de 25 °C pendant 10 min, la deuxième est de 37 °C pendant 2 h, la troisième est de 85 °C pendant 5 min et la dernière étape est de 4 °C pour toujours.
11. Une fois que le cycle entre dans la quatrième étape, cliquez sur Entrer et terminez le cycle. Prélevez les échantillons et procédez à la qRT-PCR. Conservez les échantillons d’ARN à -80 °C et les échantillons d’ADNc à -20 °C.
12. Pour la détection des cytokines, décongelez les réactifs requis 2x PCR Master mix, l’ADNc et les sondes pour TNF-α, IFN-γ, TGF-β et NFW sur glace.
    REMARQUE : Tous les réactifs, mélanges réactionnels et échantillons doivent être conservés sur de la glace.
13. Dans un tube de 100 μL, préparez un échantillon d’ADNc en ajoutant 1 μL d’ADNc et 3,5 μL d’AFNF. Pour préparer le mélange maître, prélevez 5 μL de mélange maître et ajoutez 0,5 μL de sonde dans un tube de 100 μL. Mélangez le contenu en faisant un petit tour. Calculez le nombre d’échantillons et de gènes cibles et préparez le mélange réactionnel en conséquence.
    REMARQUE : Ajouter NFW et master mix au fond du tube de 100 μL. Ajoutez de l’ADNc et une sonde à la paroi du tube de centrifugation par mesure de précaution pour s’assurer que le volume est ajouté et pour éviter le mélange croisé de tout réactif.
14. Placez les bandelettes à 8 puits dans le refroidisseur PCR. Transférez 5,5 μL de mélange maître et de flacon contenant une sonde au fond de chaque puits dans les bandes de 8 puits. En conséquence, répétez l’étape pour tous les gènes cibles.
15. Transférez 4,5 μL du mélange d’ADNc et d’NFW sur la paroi du puits en bandes de 8 puits. En conséquence, répétez l’étape pour tous les échantillons.
16. Scellez les bandelettes avec les couvercles et faites un court tour de 10 secondes pour mélanger les gènes et les échantillons dans le puits. Placez la bandelette dans la fente d’échantillon qRT-PCR et fermez la fente.
17. Sur le bureau, lancez le logiciel et connectez-vous en tant qu’invité. Une fenêtre contextuelle apparaîtra à l’écran. Cliquez sur Continuer sans connexion.
18. Dans le menu Configuration, cliquez sur Configuration avancée. Dans Propriétés de l’expérience, écrivez le nom de l’expérience dans l’onglet Nom de l’expérience. Dans quel type d’expérience souhaitez-vous configurer l’option, sélectionnez Quantification-Comparative CT (ΔΔ CT).
19. Dans quelle vitesse de rampe souhaitez-vous utiliser dans l’instrument ? , cliquez sur Rapide (~ 40 minutes pour terminer une course). Dans le menu de configuration de la plaque, définissez les noms des gènes dans l’option Définir les cibles et tapez les noms des échantillons dans Définir les échantillons.
20. Dans l’onglet Méthode d’exécution, tapez 10 μL dans Volume de réaction par puits. Juste avant de tenir l’étape, cliquez sur Ajouter une étape et sélectionnez Étape d’attente. Réglez la température à 50 °C et le temps à 2 min. Dans la deuxième étape de maintien, n’effectuez aucun changement, qui sera de 95 °C pendant 1 s.
21. Dans l’étape de cyclisme Étape 1, réglez la température à 95 °C et le temps à 3 s. À l’étape 2, réglez la température à 60 °C et le temps à 30 s. Cliquez sur Exécuter pour démarrer le cycle qRT-PCR.

12. Analyse statistique

REMARQUE : Pour toutes les données, la moyenne est représentée par une barre, et l’écart-type représente la barre d’erreur dans un graphique à barres (la valeur p < 0,05 est considérée comme significative).

1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données et insérez les données obtenues de l’expérience confocale.
2. Pour l’analyse en microscopie confocale, appliquez l’ANOVA unidirectionnelle ordinaire avec le test de correction de Tukey pour la comparaison de plusieurs groupes pour l’expression de la GFP. Considérez les données avec p < 0,05 comme statistiquement significatives. Préparez une représentation graphique des données avec la moyenne représentée par une barre et l’écart-type représentant la barre d’erreur.
3. Pour le test de charge parasitaire, créez une nouvelle feuille et entrez les données de comptage des parasites pour 100 macrophages. Appliquer l’ANOVA unidirectionnelle ordinaire avec correction de Tukey entre tous les échantillons. Considérez les données avec une valeur p < 0,05 comme statistiquement significatives.
4. Pour l’ELISA, effectuez une ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples de Tukey. Pour la qRT-PCR, effectuez une ANOVA à un facteur avec le test de correction de Tukey.

Résultats

La disposition des parties génétiques formant le circuit synthétique pour exprimer le circuit synthétique est illustrée (Figure 1A). Les parties correspondantes ont été clonées dans le vecteur pEGFP-N1 de manière orthogonale et modulaire, ce qui est représenté sur la figure 1B. La simulation du circuit synthétique a révélé une dynamique oscillatoire à la fois dans le SDHA et le répresseur de tétracycline. Cette observation suggère un modèle d’expression réciproque caractérisé par des fonctions d’onde périodiques. L’augmentation de la concentration de SDHA peut être attribuée à l’induction de la doxycycline, tandis que l’expression de TetR peut résulter d’une baisse des niveaux de doxycycline (figure 1C). Compte tenu de l’expression oscillatoire inductible de SDHA et TetR observée in silico, une stratégie de livraison de circuit synthétique à travers le vecteur plasmidique pEGFP-N1 a été conçue et mise en œuvre.

Les pièces iGEM identifiées pour l’étude comprennent BBa_K1493803 pour TetO, BBa_K4344028 pour la séquence de Kozak, BBa_C0040 pour TetR et BBa_K1537016 pour P2A, respectivement. L’identifiant d’accession NCBI pour SDHA est NM_025848. Ces composants ont été assemblés pour construire un circuit synthétique TetON inductible par la doxycycline, couvrant un total de 1317 paires de bases (Fichier supplémentaire 1). Comme TetO fonctionne comme un élément régulateur de l’ADN, sa séquence n’a pas été traduite. La séquence en aval de la séquence de Kozak, s’étendant de 5' TetR à l’extrémité 3' de P2A, positionnée en aval de SDHA, a été choisie pour la validation in silico de la traduction. L’observation a révélé l’absence de codons stop internes, assurant une translation ininterrompue sur toute la longueur de la séquence (Fichier supplémentaire 2). Les parties régulatrices d’un circuit synthétique de 1317 pb ont été insérées entre les sites de restriction NotI et XhoI, qui se trouvent à 5' en amont de l’EGFP (Figure 1B). Les résultats du séquençage mettent en évidence que la séquence d’insertion a été clonée dans le plasmide (Fichier supplémentaire 3).

L’introduction d’un circuit immunométabolique dans la souche DH5α d’E. coli a conduit à la croissance de colonies transformées présentant une résistance à la kanamycine, l’antibiotique utilisé comme marqueur sélectif lors de la transformation bactérienne. La présence abondante de colonies transformées sur la plaque de sélection était plus élevée, ce qui suggère que les cellules compétentes présentaient un fort potentiel de transformation, révélateur de l’efficacité du protocole de transformation utilisé (Figure 1D).

Une seule colonie a été isolée et ensemencée dans 10 mL de LB supplémenté en kanamycine pour l’isolement du plasmide. Le rendement plasmidique dérivé d’une culture de 10 mL est détaillé dans le tableau 1. Une méthode standard d’isolement des plasmides a été utilisée pour cette procédure. Les solutions tampons ont été fraîchement préparées la veille de l’isolement des plasmides, et les conditions d’incubation ont été optimisées pour maximiser le rendement plasmidique. La concentration plasmidique obtenue a dépassé 1 μg/μL, avec des rapports 260/280 et 260/230 dépassant respectivement 1,8 et 2,0. Ces résultats indiquent que les plasmides isolés étaient de grande pureté et dépourvus de contaminants tels que les protéines, l’EDTA, les glucides et le phénol.

Le décalage de mobilité électrophorétique pour le circuit synthétique isolé a été évalué. La digestion par restriction a été effectuée à l’aide des enzymes de restriction NotI et XhoI, car c’étaient les sites de restriction où le circuit synthétique était inséré. Deux bandes ont été observées sur un gel d’agarose à 1 %, une bande près de 1500 pb et une entre 4 kb et 5 kb. Étant donné que la taille de l’insert est de 1317 pb, la bande à 1500 pb correspond probablement à l’insert. Le vecteur pEGFP-N1 a une taille de 4,7 kb. Par conséquent, la bande proche de 5 kb est présumée être le vecteur pEGFP-N1. Par conséquent, on a déduit qu’un circuit synthétique complet et intact était présent dans le vecteur de livraison. De plus, une bande d’environ 6 kb a été détectée pour le circuit synthétique intact non digéré, indiquant que le vecteur pEGFP-N1 héberge un insert de près de 1,3 kb dans le vecteur plasmidique (Figure 1E).

Figure 1 : Conception et validation de circuits synthétiques. (A) Représentation de circuits synthétiques par l’assemblage de parties génétiques et de composants régulateurs. (B) Graphique de simulation déterministe montrant l’expression périodique de SDHA et TetR à 100 unités de temps. (C) Colonies transformées en circuit synthétique d’E. coli DH5α résistantes à la kanamycine. L’unité est une unité de 100 fois car il s’agit d’une simulation déterministe. (D) Électrophorèse sur gel d’agarose d’un circuit synthétique intact et digéré par restriction à l’aide d’enzymes de restriction NotI et XhoI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Concentration du plasmide (μg/mL)	260/280	260/230
1248.5	1.95	2.45
1123.1	1.89	2.43
1155.8	1.87	2.41
1056.8	1.94	2.47

Tableau 1 : Rendement de la construction du circuit synthétique obtenu après isolement du plasmide. Le tableau montre la concentration du plasmide en μg/mL, leur rapport 260/280 et 260/230.

Dans les cellules témoins et infectées, l’intensité de fluorescence observée était faible pour la GFP. Cependant, on a observé que la transfection du circuit synthétique avec un rapport de 1:1 de plasmide et de PEI avec 500 μg/mL de G418 et l’induction avec 1 μg/μL de dox induisait une expression élevée de la GFP dans les cellules IMT. Dans les cellules IMTI de 6 h, l’expression de la GFP était également significativement plus élevée, bien que l’expression de la GFP soit plus faible que dans l’échantillon IMT (Figure 2A,B). De plus, une augmentation de l’expression de la GFP a été observée dans les échantillons IMTI 12 h, IMTI 18 h et IMTI 24 h. Cette augmentation peut être due à une augmentation du temps d’infection, qui pourrait avoir induit des altérations métaboliques plus importantes dans les macrophages par le parasite résidentiel¹⁷. Les taux intracellulaires de SDHA peuvent être affectés en raison d’une augmentation du temps d’infection¹⁸. Comme le dox a été complété à ces échantillons IMTI, les niveaux de SDHA par les circuits synthétiques ont pu augmenter, conduisant ainsi à une augmentation de l’expression de la SDHA.

Une coloration au DAPI a été effectuée pour identifier le nombre de parasites résidentiels dans les macrophages. Dans les macrophages infectés par 6 h de L. major , le nombre observé de parasites intracellulaires était de 6 cellules par macrophage, ce qui est plus élevé par rapport à l’échantillon IMTI de 6 h, qui avait 1 à 2 parasites intracellulaires par macrophage. Après la transfection et l’induction dox, une réduction significative de la charge parasitaire intracellulaire a été observée à différents moments de l’infection (Figure 2C). Les observations suggèrent que les circuits synthétiques pourraient avoir induit des effets d’élimination des parasites en stimulant l’expression de la SDHA.

Figure 2 : Microscopie confocale à balayage laser. Images d’échantillons de contrôle, infectés, IMT et IMTI. (A) Analyse de l’expression de la GFP dans tous les échantillons expérimentaux avec une barre d’échelle de 50 μm pour le contrôle, 6 h infectés et IMT, 20 μm pendant 6 h IMTI, 10 μm pour 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI respectivement. Les canaux utilisés étaient DIC, DAPI, GFP et les images fusionnées de tous les canaux. (B) ANOVA à un facteur avec test de correction de Tukey de tous les échantillons expérimentaux (n = 3) pour l’expression de la GFP (p < 0,05 est considéré comme significatif) Les barres d’erreur représentent l’écart-type. (C) Une analyse de l’ANOVA à un facteur avec le test de correction de Tukey de la charge parasitaire dans 100 cellules de macrophages pour des échantillons de (A) (n = 3) a été réalisée (p < 0,05 est considérée comme significative). Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La détection des taux d’IL-10 et d’IL-12 dans les milieux de tous les échantillons a révélé que les concentrations d’IL-10 et d’IL-12 étaient les plus élevées 6 heures après l’infection, avec une régulation à la baisse des niveaux de cytokines après l’infection de 24 heures. Il n’y avait pas de différence significative dans les niveaux d’IL-10 et d’IL-12 lors de la transfection et de l’induction de circuits synthétiques. De plus, il y avait une différence non significative dans les niveaux d’IL-10 et d’IL-12 dans les échantillons de points temporels de l’IMTI (figure 3). L’échantillon infecté de 6 h a déjà montré l’expression de l’IL-10 et de l’IL-12^19,20, l’observation d’une différence non significative entre l’IL-10 et l’IL-12 nous a fait étudier l’effet du circuit synthétique sur d’autres cytokines.

Figure 3 : ELISA de l’IL-10 et de l’IL-12 pour identifier leurs niveaux sécrétoires dans les milieux de différents échantillons. Les échantillons (n = 2) comprennent le contrôle, 6 h infecté, 24 h infecté, IMT 6 h, IMTI 12 h, IMTI 18 h, IMTI 24 h. Une analyse de l’ANOVA à deux facteurs avec l’analyse du test de correction de Tukey a été réalisée (p <,05 est considéré comme significatif). Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La détection des niveaux de transcrits du TNF-α, de l’IFN-γ et du TGF-β dans les échantillons infectés dans les 6 h, les échantillons IMT et les échantillons IMTI dans les 24 h a révélé qu’une augmentation significative du TNF-α à 2,5 fois a été observée dans les échantillons IMTI sur 24 h par rapport aux échantillons infectés et IMTI (figure 4). Dans l’échantillon de 24 h de l’IMTI, une augmentation de 35 fois des taux d’IFN-γ a été observée par rapport aux échantillons d’infection et de TMI. Les taux de TGF-β, bien qu’ils aient montré une régulation positive significative à 1,5 fois dans l’échantillon IMTI de 24 h, la variation relative du pli était plus faible par rapport au TNF-α et à l’IFN-γ, ce qui suggère que les cytokines pro-inflammatoires sont significativement régulées à la hausse dans l’échantillon IMTI de 24 h.

Figure 4 : Analyse qRT-PCR des cytokines (A) TNF-α, (B) IFN-γ et (C) TGF-β pour les échantillons infectés 6 h, IMT et IMTI 24 h (n = 2). Une ANOVA à un facteur avec le test de correction de Tukey a été réalisée (p < 0,05 est considéré comme significatif). Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Séquence nucléotidique de parties génétiques assemblées pour former le circuit synthétique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Séquence traduite d’un circuit synthétique exprimant TetR, P2A et SDHA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Résultat du séquençage du circuit synthétique cloné dans le plasmide pEGFP-N1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les résultats obtenus soulignent l’efficacité du pipeline, qui a été canalisé pour la conception et la mise en œuvre d’un circuit synthétique. La construction de ce circuit synthétique a été une étape vers le développement d’une médecine de précision pour les maladies infectieuses comme la leishmaniose. Grâce à l’assemblage in silico de parties génétiques et à la simulation déterministe, l’effet modulatoire distingué du système TetON a été surveillé. L’effet du circuit, notamment, aurait pu conduire à l’expression bistable réciproque de TetR et SDHA/GFP. L’expression de la SDHA était périodique, ce qui pourrait indiquer que son expression n’était augmentée qu’en présence de doxycycline. Pour observer les changements potentiels dans les modèles d’expression au cours d’une période, une unité de temps de 100 a été sélectionnée. Les résultats identifient que le circuit synthétique a montré un comportement périodique pour TetR et SDHA/GFP, probablement attribuable à sa nature orthogonale²¹. L’assemblage de parties génétiques à partir du registre des pièces iGEM a joué un rôle central, car il a fourni des composants génétiques nécessaires à la construction de circuits synthétiques²². L’arrangement modulaire des parties génétiques est essentiel car la traduction et le fonctionnement du circuit peuvent être affectés, ce qui peut conduire à une expression inefficace et à un effet modulateur dans les cellules²³.

La taille de l’insert du circuit synthétique était d’environ 1,3 kb pour s’assurer que la taille du vecteur n’est pas trop grande, ce qui peut potentiellement réduire l’efficacité de la transformation²⁴. La sélection d’un vecteur approprié est une étape critique car il doit posséder des parties génétiques, qui sont essentielles pour augmenter le nombre de copies dans le système bactérien et produire une copie plasmidique élevée, et sa machinerie d’expression doit bien s’adapter dans le système mammifère²⁵. Le vecteur pEGFP-N1 est bien caractérisé dans la lignée cellulaire RAW264.7 et possède une structure plasmidique compacte avec un site de clonage multiple²⁶. Des solutions tampons normalisées en laboratoire ont été utilisées pour l’isolement des plasmides afin d’assurer la production de plasmides hautement concentrés et purs, qui ont été validés par l’estimation spectrophotométrique et l’AGE. L’insertion du circuit synthétique dans le vecteur pEGFP-N1 a été validée par digestion de restriction, et les échantillons ont été analysés sur AGE et séquençage. Les résultats de l’AGE représentaient une bande de 1,3 kb d’insertion, une bande de 4,7 kb de vecteur pEGFP-N1 et une bande de 6 kb de l’ensemble du circuit synthétique.

Une transfection à l’aide d’un rapport ADN :1, 1:2 et 2:1 a été effectuée, où le rapport observé de 1:1 a fonctionné le mieux sans perturber la morphologie cellulaire (données non présentées). Il est recommandé d’utiliser une concentration de 400 μg/mL à 1000 μg/mL de G418 pour la sélection des cellules transfectées²⁷. Une dose de 500 μg/mL de G418 a été utilisée pour la sélection des cellules transfectées, car elle a efficacement inhibé la croissance des cellules non transfectées sans compromettre la croissance cellulaire ou la morphologie des cellules transfectées (données non présentées). Compte tenu de l’importance du phénotype cellulaire dans l’efficacité de la transfection, en particulier dans les lignées cellulaires de macrophages, qui peuvent subir une différenciation et devenir difficiles à transfecter, un faible nombre de passage de la lignée cellulaire RAW264.7 a été utilisé pour la transformation²⁸. Le nombre de passages cellulaires peut également être un facteur critique dans l’efficacité de la transfection. Un nombre de passage élevé peut conduire à une transfection^{inefficace 29}. Dox est l’inducteur préféré pour le système d’induction Tet-ON en raison de son efficacité de liaison élevée à TetR, de sa distribution tissulaire favorable, de sa faible toxicité et d’une demi-vie de 24 h³⁰. Après la transfection, les cellules ont été induites avec dox pendant 24 h, et elles ont été observées pour l’expression de la GFP. Pour les cellules RAW264.7, la concentration de dox utilisée pour l’induction de circuits synthétiques était de 1 μg/mL, ce qui se situe dans la plage recommandée de 1-2 μg/mL³¹ (données non présentées). Cependant, la régulation de la concentration de SDHA après l’induction était indéterminée. Dans l’ensemble, la détermination et la normalisation du nombre de passages cellulaires, de la concentration d’ADN : PEI, de la concentration du marqueur de sélection de la transfection chez les mammifères et de la concentration d’induction de la doxycycline sont des facteurs cruciaux dans le processus de transfection.

Suite à l’induction du circuit synthétique post-infection à différents points temporels, une réduction significative de la charge parasitaire intracellulaire a été observée. Une comparaison des charges parasitaires entre les échantillons infectés et IMTI a révélé une charge plus faible dans les cellules induites par le circuit synthétique, probablement attribuable à l’expression de la SDHA. Comme l’expression de SDHA est associée à la production de NO, on a observé que les cellules IMTI ont une forme morphologique irrégulière et rugueuse, ce qui se produit dans la lignée cellulaire RAW264.7 lorsque le NO est produit³². Les niveaux d’IL-10 et d’IL-12 après l’infection de 6 h étaient les plus élevés, car les deux cytokines ont été signalées comme étant régulées à la hausse à ce moment-là, ce qui subit une modification phénotypique pour produire plus d’IL-10 que d’IL-12¹⁹. Comme les taux d’IL-10 et d’IL-12 n’ont pas modifié de manière significative la post-transfection et dans les échantillons IMTI, un profilage des cytokines a été effectué pour détecter les réponses cytokiniques pro-inflammatoires et anti-inflammatoires.

Des niveaux d’expression du TNF-α, de l’IFN-γ et du TGF-β ont été identifiés dans des échantillons d’infection après 6 h, d’IMTI et d’IMTI après 24 h. Pour éliminer les parasites intracellulaires, le TNF-α et l’IFN-γ sont principalement essentiels car ils induisent des explosions oxydatives par la production de NO. Les macrophages polarisés M2 expriment le TGF-β, qui régule à la baisse les cytokines^{pro-inflammatoires 33}. L’échantillon IMTI de 24 heures a montré une augmentation de l’expression du TNF-α et de l’IFN-γ que celle du TGF-β, ce qui suggère que les macrophages, lors de la transfection et de l’infection par L. major, pourraient s’être polarisés en phénotype exprimant des cytokines pro-inflammatoires. L’étude donne donc un aperçu des altérations phénotypiques induites lors de la transfection avec un circuit synthétique et met en évidence la dynamique de l’infection. L’effet des circuits synthétiques en tant que thérapeutique peut être étudié car leur induction a augmenté l’expression des cytokines pro-inflammatoires de manière significative par rapport aux cytokines anti-inflammatoires. Ainsi, l’étude a non seulement établi la construction et l’administration du circuit synthétique, mais a également démontré son potentiel thérapeutique dans un modèle de leishmaniose grâce à la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires dans les cellules hôtes touchées par Leishmania.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 &mu ; Embouts L	Tarson	521050
10X tampon de restriction	BioLabs	R0146S	Digestion de restriction
1mL embouts	Tarson	521016
tube de 1mL	Eppendorf	30121023
200 &mu ; L tips	Tarson	521010
25cm2 flacon	Corning	430639	Pour la culture cellulaire
4',6-diamidino-2-phénylindole	ThermoFischer Scientific	D1306	coloration nucléaire
Tube de 50mL	Corning	352070
Plaques de 60mm	Falcon	353002
6X TrackIt Cyan/Orange Tampon	de chargementThermoFischer Scientific	10488085	Chargement d’échantillons pour
AGE 96 plaque de fond de lamelle de puits	ThermoFischer Scientific	160376	Pour l’imagerie confocale et la transfection
Micro plaque de test à 96 puits à fond plat Tarson		941196
Agarose	Sigma	A9539	Pour AGE
Assemblage d’électrophorèse sur gel d’agarose	GeNei	93	Pour AGE
Flux laminaire bactérien	ESCO Lifesciences	2120765	Pour la transformation
Chlorure de calcium	Merck	C4901	Préparation de tampons/réactifs
Culture cellulaire Flux d’air laminaire	ThermoFischer Scientific	1323TS	Pour la culture cellulaire
Racleur de cellules	Genetix	90020	Pour la culture cellulaire
Épandeur de cellules	Fischer Centrifugeuse	12822775
pour tubes de 1,5 ml	Eppendorf	EP5404000537
Centrifugeuse pour faucon de 50 ml	ThermoFischer Scientific	75004210
Fischer Scientific	67-66-3	l’isolement de	l’ARN
Incubateur CO2	ThermoFischer Scientific	3110	Pour la culture cellulaire
Cuvette	Eppendorf	6138000018	Estimation de la concentration plasmidique
CYTIVA IQ 500 imageur gel	Cytiva	29655893	Pour AGE
DEPC TREATED H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	750023	Pour l’isolement de l’ARN
Doxycycline	Merck	33429	Pour l’induction de cellules transfectées
Bloc chauffant sec	Labnet		Pour la transformation et l’inactivation des enzymes de restriction
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Centre national pour la science		Pour la culture cellulaire
Éthanol	Sigma-Aldrich	1.00983	Tampon / Préparation de réactif
Bromure d’éthidium	Sigma	E7637	Pour AGE
Acide éthylènediamine tétraacétique	Fischer Scientific	12635	Tampon / Préparation du réactif
Evos microscope à fond clair	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		pour la construction de circuit synthétique
Sérum fœtal bovin	Gibco	16000-044	Pour la culture cellulaire
Logiciel FV31S-SW	Olypmus		Acquisition d’images
Geneticin	Gibco	1563411	pour la transfection
Méthode d’assemblage Gibson pour le clonage	BIOMATIK		Construction du circuit synthétique
Prisme Graphpad			Analyse statistique
de transcription inverse de l’ADNc à haute capacité	ThermoFischer Scientific	4368814	pour la synthèse de l’ADNc
Isopropanol	Fischer Scientific	13825	Tampon / Préparation de réactif
Kanamycin	Sigma	60615	Pour la transformation et la sélection de la colonie
Bouillon Luria Bertini	Himedia	M1245	Pour la culture E.coli
Chlorure de magnésium	Fischer Scientific	BP214	Préparation de tampon / réactif
Micro Filt Vertical Laminaire	Air Flow Microfilt
MicroAmp Fast 8 tubes, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific	4358293	pour qRT-PCR
MicroAmp Bandes optiques à 8 capuchons	ThermoFischer Scientific	4323032	pour qRT-PCR
Four à micro-ondes	LG	MC-7649DW	pour AGE
Mm00434228_m1 (IFN-&gamma ;)	Sondes ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman
Mm00443258_m1 (TNF)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman
Mm01321739_m1(TGFB)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman
Kit ELISA souris IL-10	ThermoFischer Scientific	BMS614	Pour ELISA
Kit ELISA souris IL-12	ThermoFischer Scientific	BMS616	Pour ELISA
Multiskan Sky avec écran tactile + &mu ; Plaque de chute	ThermoFischer Scientific	51119600DP	Pour
ELISA MX-M Mélangeurs de microplaques 96 puits Mélangeur à plaques de culture cellulaire Réglable 0-1500 tr/min Agitateur de laboratoire	DIAB
national de biotechnologie https://www.ncbi.nlm.nih.gov			pour la construction de circuit synthétique
Chambre de Neubauer	Marienfeld superior	640010	Pour la numération cellulaire
Non ventilé 25cm2 flask	Corning	353014	Pour l’élevage de parasites
NotI	BioLabs	R3189M	Enzyme de restriction
Eau sans nucléases	Biodesign	1QIA	Préparation de réactifs
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 logiciel	Olypmus		Traitement d’images
Olympus FV 3000	Olympus		Pour l’imagerie confocale
Milieux OPTI-MEM	Gibco	31985070	pour la transfection
Vecteur pEGFP-N1 cloné avec circuit synthétique	Biomatik
Pénicilline	ThermoFischer Scientific	15070063	Pour la culture cellulaire
Polyéthylénimine	MERCK	764965	pour transfection
Acétate de potassium	Fischer Scientific	YBP364500	Tampon / Préparation de réactif
Chlorure de potassium	Fischer Scientific	BP366	Tampon / Préparation de réactif
Phosphate de potassium Monobasique	Sigma	P5655	Tampon / Préparation de réactif
Bloc d’alimentation	BIORAD	1645070	Pour AGE
Registre des pièces biologiques standard	https://parts.igem.org/Main_Page		pour la construction du circuit synthétique
ARNISO Plus	Takara	38220090	Pour l’isolement de l’ARN
RNase A	ThermoFischer Scientific	12091021	Préparation tampon / réactif
Roswell Park Memorial Institute Medium	national pour la		science cellulaire Pour la culture du parasite
Incubateur d’agitateur	REMI	CIS 24 plus	Pour la culture E.coli
Chlorure de sodium	Qualigens	Q27605	Tampon / Préparation de réactif
Dodécyl de sodium	Sigma-Aldrich	L3771	Tampon / Préparation de réactif
Hydroxyde de sodium	Fischer Scientific	15895	Tampon / Préparation de réactif
Phosphate de sodium Dibasic	Sigma	S5136	Tampon / Réactif préparation
Spectrophotomètre	Eppendorf		Estimation de la concentration plasmidique
Spin win	Trason	1020
StepOne plus Système de PCR en temps réel	Technologies de la vie	272006777	Pour qRT-PCR
Version du logiciel StepOne 2.3	Technologies de la vie		Pour qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), sans AmpErase UNG	ThermoFischer Scientific	4366072
Cellule			Construction et simulation de circuits synthétiques
TrackIt 1 Kb Plus Échelle d’ADN	ThermoFischer Scientific	Pour AGE
Tris (hydroxyméthyl) Chlorhydrate d’aminométhane	Himedia	MB029	Préparation de tampon / réactif
Tris-acétate-EDTA	SERVA	42549.1	Tampon / Préparation de réactif
Trypan blue	Sigma	T8154	Pour la numération cellulaire
XhoI	BioLabs	R0146S	Enzyme de restriction