Intégration de l’évaluation comportementale animale et du réseau de neurones convolutifs pour étudier l’interaction entre le wasabi et l’alcool

Résumé

Cet article décrit un ensemble de méthodes pour mesurer la capacité suppressive de l’inhalation de boissons alcoolisées sur la sensation de picotement induite par le wasabi.

Résumé

Les pâtes de wasabi commerciales couramment utilisées pour la préparation des aliments contiennent un composé homologue d’isothiocyanates chimiosensoriels (ITC) qui provoquent une sensation irritante lors de la consommation. L’impact de l’inhalation de boissons alcoolisées diététiques sur la sensation de piquant du wasabi n’a jamais été étudié. Alors que la plupart des études d’évaluation sensorielle se concentrent sur les aliments et les boissons séparément, il y a un manque de recherche sur l’étude olfactive de l’inhalation d’alcool pendant la consommation de wasabi. Ici, une méthodologie est développée qui combine l’utilisation d’une étude comportementale animale et d’un réseau neuronal convolutif pour analyser les expressions faciales des souris lorsqu’elles reniflent simultanément de l’alcool et consomment du wasabi. Les résultats démontrent que le modèle d’apprentissage profond entraîné et validé reconnaît 29 % des images représentant le co-traitement du wasabi et de l’alcool appartenant à la classe du groupe positif à la liqueur négative au wasabi sans qu’il soit nécessaire de filtrer au préalable les matériaux de formation. L’analyse statistique des scores de l’échelle de grimace de souris obtenus à partir des images vidéo sélectionnées révèle une différence significative (P < 0,01) entre la présence et l’absence d’alcool. Cette découverte suggère que les boissons alcoolisées diététiques pourraient avoir un effet décroissant sur les réactions induites par le wasabi chez la souris. Cette méthodologie combinatoire offre à l’avenir un potentiel pour le criblage individuel des composés ITC et les analyses sensorielles des composants spiritueux. Cependant, des études supplémentaires sont nécessaires pour étudier le mécanisme sous-jacent de la suppression du piquant du wasabi induite par l’alcool.

Introduction

Wasabia japonica, communément appelé wasabi, a été reconnu dans la préparation des aliments ^1,2. L’expérience sensorielle intense qu’il provoque lors de la consommation, caractérisée par des larmes, des éternuements ou de la toux, est bien connue. Ce piquant distinctif du wasabi peut être attribué à un composé homologue d’isothiocyanates chimiosensoriels (ITC). Ce sont des composés phytochimiques organosulfurés volatils qui peuvent être classés en ω-alcényle et ω-méthylthioalkyl isothiocyanates³. Parmi ces composés, l’isothiocyanate d’allyle (AITC) est le produit naturel ITC le plus prédominant que l’on trouve dans les plantes appartenant à la famille des crucifères, telles que le raifort et la moutarde⁴. Les pâtes de wasabi commerciales sont généralement préparées à partir de raifort, ce qui fait de l’AITC un marqueur chimique utilisé pour le contrôle de la qualité de ces produits commerciaux⁵.

L’association de boissons alcoolisées diététiques avec des plats infusés au wasabi peut être considérée comme un exemple de disposition culturelle⁶. Subjectivement, cette combinaison peut compléter le piquant et la chaleur entre le wasabi et le spiritueux, améliorant ainsi l’expérience culinaire globale. L’évaluation qualitative comportementale animale (QBA) est une approche méthodologique globale de l’animal qui examine les changements de comportement chez les sujets en réponse à des stimuli externes à court ou à long terme à l’aide de termes numériques⁷. Cette méthode comprend des tests de douleur, des tests moteurs, des tests d’apprentissage et de mémoire, ainsi que des tests d’émotion spécialement conçus pour les modèles de rongeurs⁸. Cependant, les études portant sur l’évaluation sensorielle synergique de la gustation et de l’olfaction restent rares dans la littérature jusqu’à présent ^9,10. La plupart des études sur la sensation chimiquement se limitent à examiner séparément la consommation individuelle d’aliments et de boissons¹¹. Par conséquent, il y a un manque de recherches sur l’interaction goût-odeur impliquant l’acte de renifler de l’alcool tout en consommant du wasabi.

Comme la sensation de picotement induite par le wasabi est considérée comme une forme de nociception¹², les évaluations comportementales animales sont bien adaptées pour évaluer les réponses sensorielles nociceptives chez les rongeurs ^8,13,14. Une méthode d’évaluation de la nociception chez la souris, connue sous le nom de score MGS, a été mise au point par Langford et ^coll.15,16. Cette méthode d’étude comportementale est une approche d’évaluation liée à la douleur, s’appuyant sur l’analyse des expressions faciales présentées par les souris expérimentales. Le dispositif expérimental est simple, impliquant une cage transparente et 2 caméras pour l’enregistrement vidéo. En intégrant des technologies de pointe 17,18,19 pour la capture automatique des données, des mesures comportementales quantitatives et qualitatives peuvent être obtenues, améliorant ainsi le bien-être animal pendant la surveillance comportementale ²⁰. Par conséquent, le MGS a le potentiel d’être appliqué à l’étude des effets de divers stimuli externes sur les animaux de manière ininterrompue et ad libitum. Cependant, le processus de notation ne consiste qu’à sélectionner quelques images vidéo (moins de 10) pour l’évaluation par les panélistes, et une formation préalable est nécessaire. La notation d’un grand nombre d’images d’échantillons peut demander beaucoup de main-d’œuvre. Pour surmonter ce défi chronophage, plusieurs études ont utilisé des techniques d’apprentissage automatique pour prédire le score MGS^21,22. Cependant, il est important de noter que le MGS est une mesure continue. Par conséquent, un modèle de classification multiclasse serait plus approprié pour évaluer un problème logique et catégorique, comme déterminer si les images de souris ingérant simultanément du wasabi et reniflant de la liqueur ressemblent à celles de souris normales.

Dans cette étude, une méthodologie pour étudier l’interaction goût-odeur chez la souris a été proposée. Cette méthodologie combine des études comportementales animales avec un réseau de neurones convolutif (CNN) pour analyser les expressions faciales des sujets souris. Deux souris ont été observées trois fois dans des conditions comportementales normales, lors de l’expérience de nociception induite par le wasabi et en reniflant de l’alcool dans une cage spécialement conçue. Les expressions faciales des souris ont été enregistrées sur vidéo, et les images de cadre générées ont été utilisées pour optimiser l’architecture d’un modèle d’apprentissage profond (DL). Le modèle a ensuite été validé à l’aide d’un ensemble de données d’images indépendant et déployé pour classer les images acquises auprès du groupe expérimental. Pour déterminer l’étendue de la suppression du piquant du wasabi lorsque les souris reniflaient simultanément de l’alcool pendant la consommation de wasabi, les informations fournies par l’intelligence artificielle ont été corroborées par une validation croisée avec une autre méthode d’analyse des données, le MGS marquant¹⁶.

Protocole

Dans cette étude, deux souris mâles ICR âgées de 7 semaines pesant entre 17 et 25 g ont été utilisées pour l’évaluation comportementale animale. Toutes les procédures d’hébergement et d’expérimentation ont été approuvées par le Comité de l’Université baptiste de Hong Kong sur l’utilisation de sujets humains et animaux dans l’enseignement et la recherche. La salle animalière a été maintenue à une température de 25 °C et à un taux d’humidité de 40 % à 70 % selon un cycle lumière-obscurité de 12 heures.

1. Conception de la cage

1. Préparez des briques d’acrylonitrile butadiène styrène en 3 dimensions différentes pour la construction de cages : 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm et 32 mm x 16 mm x 6 mm.
2. Préparez une plaque d’acrylonitrile butadiène styrène (312 mm x 147 mm x 2 mm) comme base de la cage.
3. Préparez une plaque acrylique non transparente de 239 mm x 107 mm d’une épaisseur de 2 mm à utiliser comme plaque inférieure.
4. Préparez une plaque acrylique transparente de 239 mm x 107 mm d’une épaisseur de 5 mm à utiliser comme plaque supérieure.
5. Préparez une plaque acrylique transparente de 107 mm x 50 mm d’une épaisseur de 7 mm à utiliser comme plaque terminale.
6. Construisez 2 murs latéraux opaques en empilant des briques à une hauteur de 54 mm.
7. Intégrez les plaques acryliques dans la cage à base d’acrylonitrile butadiène styrène, comme illustré à la figure 1A.
8. Préparez une chambre à manger composée de cinq plaques acryliques transparentes de 90 mm x 50 mm d’une épaisseur de 2 mm, comme illustré à la figure 1B. Parmi les 5 plaques acryliques transparentes, utilisez 2 plaques pour les côtés, 1 plaque pour le haut, 1 plaque pour le bas, et 1 plaque pour le terminal.
9. Préparez une plaque acrylique transparente de 60 mm x 50 mm 2 mm comme plaque d’introduction et placez-la dans la chambre de la nourriture.

2. Évaluation du comportement animal

1. Hébergez les compagnons de portée de 2 souris mâles ICR de 7 semaines ensemble dans une cage régulière.
2. Fournir aux compagnons de portée de 2 souris un accès gratuit à de la nourriture, des granulés et de l’eau du robinet pendant une période d’adaptation de 1 semaine.
3. Après 1 semaine, introduisez les compagnons de portée de 2 souris avec une bouteille d’éthanol (~40% v/v).
   REMARQUE : Assurez-vous qu’ils ne sont autorisés à renifler ou à inhaler l’éthanol aqueux fourni que sur une base ad libitum tant que la consommation est restreinte.
4. Effectuez des expériences comportementales à l’aide du modèle de souris âgé de 9 à 10 semaines et de la cage de cabine transparente illustrée à la figure 1A.
5. Démontez toutes les plaques acryliques et les plaques d’acrylonitrile butadiène styrène et nettoyez-les soigneusement. Commencez par les rincer au moins 3 fois à l’eau ultra-pure, puis séchez-les à l’aide d’essuie-tout. Ensuite, vaporisez-les avec de l’éthanol à 75%, puis nettoyez-les avec du papier pour lentilles. Enfin, laissez-les sécher à l’air libre pendant au moins 15 min.
6. Pesez les souris et notez leur poids corporel avant chaque réplication de l’expérience comportementale.
7. Préparez fraîchement un mélange de wasabi et de beurre de cacahuète en pesant 1 g de wasabi du commerce et 4,5 g de beurre de cacahuète. Mélangez-les dans un sac en plastique zippé.
   REMARQUE : En raison de la volatilité des isothiocyanates dans le wasabi, il est important de conserver le wasabi commercial dans un congélateur à -20 °C.
8. Pesez et fournissez deux pâtes de 0,5 g de beurre d’arachide ou un mélange de wasabi et de beurre d’arachide sur l’assiette d’introduction de la nourriture, comme illustré aux figures 1B et C.
9. Placez la plaque d’introduction de la nourriture préparée dans la chambre des chows, comme illustré sur la figure 1B, C, pour permettre aux 2 souris d’avoir un accès ad libitum à la nourriture lors de chaque session d’enregistrement vidéo.
10. Remplissez la rainure inférieure avec 30 mL de liquide, soit de l’eau pure ou de la liqueur (~42 % v/v d’éthanol), pour faciliter l’inhalation simultanée, comme indiqué aux figures 1B et C.
11. Commencez l’enregistrement à l’aide des appareils photo de 2 smartphones placés sur les supports de téléphone de chaque terminal.
    REMARQUE : Les spécifications des vidéos sont les suivantes : largeur de l’image, 1920 ; hauteur du cadre, 1080 ; débit de données, 20745 kbps ; fréquence d’images, 30,00 images par seconde (fps).
12. Placez soigneusement les 2 compagnons de portée dressés de souris dans la plate-forme d’étude comportementale animale conçue par le haut et fixez rapidement la cage avec la plaque supérieure.
    REMARQUE : Assurez-vous que cette étape est terminée dans les 15 s.
13. Enregistrez chaque vidéo pendant 2-3 min.
    REMARQUE : Assurez-vous que toute la durée de l’expérience, de la préparation du mélange beurre d’arachide-wasabi à la réalisation de l’enregistrement vidéo, est limitée à 5 min.
14. Répétez toute l’expérience 3 fois.
    REMARQUE : Assurez-vous que chaque répétition de l’expérience est séparée pendant au moins 6 h.
15. Imitez différents scénarios.
    REMARQUE : Par exemple, dans ce travail, une paire de souris a été utilisée dans 4 groupes avec 4 scénarios différents qui ont été imités en utilisant le cadre expérimental décrit ci-dessus. Ces scénarios comprennent le scénario A pour l’étude de fond, le scénario B pour l’étude de contrôle positif, le scénario C pour l’étude d’interaction goût-odeur de wasabi-alcool et le scénario D pour l’étude de contrôle négatif. Le tableau 1 présente un résumé de ces scénarios.

3. Reconnaissance d’images

À l’instar de nombreuses études sur le traitement d’images 23,24,25, un modèle de classification a été obtenu par l’entraînement d’un CNN. Le script pour les opérations DL a été écrit en Python v.3.10 sur Jupyter Notebook (anaconda3). Il est disponible sur le dépôt GitHub suivant : git@github.com :TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Pour construire et entraîner le CNN, des bibliothèques open source ont été utilisées, notamment numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 et keras v.2.11.0. Ces bibliothèques ont fourni les outils et les fonctionnalités nécessaires au développement et à la formation de CNN pour la reconnaissance d’images.

1. Exportez une série d’images d’images vidéo à partir des clips vidéo collectés afin de générer un ensemble de données pour l’entraînement du modèle à l’aide du bloc-notes Jupyter fourni, nommé Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
2. Sélectionnez uniquement les images avec au moins 1 souris consommant la pâte fournie. Des exemples des images sélectionnées sont fournis dans la figure supplémentaire 1, la figure supplémentaire 2, la figure supplémentaire 3, la figure supplémentaire 4, la figure supplémentaire 5, la figure supplémentaire 6 et la figure supplémentaire 7.
3. Effectuez l’augmentation des données en retournant horizontalement les images générées en implémentant le script fourni dans le bloc-notes Jupyter, nommé Step2_DataAugmentation.ipynb.
4. Réservez les données d’image de chaque seconde répliquée pour la validation du modèle CNN indépendant externe. Utilisez les images de chaque première et troisième réplique pour l’entraînement et les tests internes du modèle.
5. Prétraitez les données d’image utilisées dans la modélisation CNN en exécutant le script dans le Jupyter Notebook, nommé Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, y compris le redimensionnement de l’image, la conversion des couleurs noires et la normalisation du signal d’image.
6. Divisez les supports de formation en ensembles de données de formation et de test internes de manière aléatoire selon un modèle 8:2.
7. Initialisez l’architecture pour CNN. Concevez le nombre de sorties de CNN en fonction du nombre de scénarios à examiner.
   REMARQUE : Par exemple, dans cette étude, le réseau de neurones a été désigné pour classer 3 classes. Assurez-vous que le script de gestion du déséquilibre des données sur le poids de la classe est compilé.
8. Trouvez la combinaison d’hyperparamètres qui donne une perte minimale sur les échantillons de test internes pour la construction CNN.
9. Adoptez la combinaison optimale d’hyperparamètres pour la construction de l’architecture CNN.
10. Ouvrez les blocs-notes Jupyter fournis Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb et Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Validez le modèle atteint à l’aide des images indépendantes (originales et retournées) de la deuxième réplique de l’expérience comportementale sur les animaux.
11. Déployez le modèle atteint et validé pour classer les images de trame vidéo générées à partir du groupe expérimental à l’aide de Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    REMARQUE : Par exemple, il s’agit du scénario C dans cette œuvre.

4. Notation manuelle de l’échelle de grimace de la souris

REMARQUE : Pour valider les informations fournies par la prédiction du modèle CNN, une autre méthode précédemment développée et validée par Langford et al. a été appliquée¹⁶. Cette méthode consiste à noter le MGS en fonction des 5 unités d’action faciale (UA) spécifiques de la souris : resserrement orbitaire, renflement du nez, renflement des joues, resserrement des oreilles vers l’extérieur et changement des moustaches. Chaque UA se voit attribuer un score de 0, 1 ou 2, indiquant respectivement l’absence, la présence modérée ou la présence évidente de l’UA. Ce système de notation permet de quantifier et de mettre à l’échelle chaque UA afin d’évaluer le niveau de nociception ou d’inconfort ressenti par les souris.

1. Capturez 3 images vidéo des compagnons de portée ingérant la pâte pour chaque clip vidéo. Assurez-vous que chaque image est séparée d’au moins 3 secondes.
2. Codez à l’aveugle et réorganisez de manière aléatoire les images de différentes classes de scénarios dans l’ordre à l’aide du fichier modèle fourni nommé « shuffleSlides.pptm » (fichier supplémentaire 1) et en exécutant le code de macro intégré.
3. Invitez au moins 10 panélistes à noter les exemples d’images.
4. Entraînez les panélistes à noter des échantillons d’images à l’aide du MGS. Fournir aux panélistes du matériel de formation qui comprend l’article original concernant MGS et son manuel^15,16.
5. Calculez le score MGS de chaque sujet animal dans une image capturée en faisant la moyenne de tous les points de score des 5 AU faciaux correspondants. Présentez le score MGS comme la moyenne ± l’erreur type de mesure (SEM).
6. Déterminez s’il existe des différences statistiquement significatives entre les différentes classes de scénarios par analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec le test post-hoc de comparaison multiple de Bonferroni.
   REMARQUE : Une valeur de P < 0,05 est considérée comme statistiquement significative.

Résultats

L’objectif principal de cette étude est d’établir un cadre solide pour étudier l’interaction goût-odeur chez la souris. Ce cadre intègre l’utilisation de l’intelligence artificielle et de l’ABQ pour développer un modèle de classification prédictive. De plus, les informations obtenues grâce à DL sont validées par une évaluation quantitative MGS pour une analyse interne indépendante. L’application principale de cette méthodologie consiste à examiner l’étendue de la suppression de la nociception invoquée par le wasabi lorsque les souris reniflent des boissons alcoolisées diététiques.

Reconnaissance de 29% des images de co-traitement wasabi-alcool appartenant à la classe du groupe wasabi-négatif alcool-positif par le modèle d’apprentissage profond
Une réaction excessive au visage peut se produire chez l’homme lors de la consommation commerciale de pâte de wasabi. Une expérience similaire a également pu être observée chez la souris (Vidéo supplémentaire 1). Parce que la nociception sensorielle est bien corrélée avec les expressions faciales chez les rongeurs, les comportements de 2 compagnons de portée ont été surveillés pour déterminer leur réponse lorsqu’ils recevaient des chows contenant ou non du wasabi commercial. Dans cette étude, un CNN a été formé à l’aide de techniques DL. Étant donné que 3 répétitions ont été effectuées pour chaque scénario, les matériaux d’image des 1ère^et 3ème^{répétitions} ont été utilisés pour le réglage des hyperparamètres du modèle CNN et la formation et les tests internes de modélisation. L’évolution de l’architecture de CNN dans cette étude est détaillée dans le tableau 2. L’architecture optimisée du CNN se composait d’une couche d’entrée d’une résolution de 268 x 268 pixels, suivie de 4 couches de convolution bidimensionnelles, chacune avec 8 filtres. De plus, 2 couches de regroupement, 2 couches de décrochage, une couche d’aplatissement et 2 couches denses ont été incorporées pour la tâche de classification à 3 classes. Reportez-vous au fichier supplémentaire 2 pour l’architecture de CNN.

Le modèle de cette étude a été formé à l’aide d’un ensemble de données de 35 486 images et testé sur 8 872 images à 7 époques. Les performances du modèle entraîné pendant l’entraînement, y compris les paramètres tels que la perte, le rapport précision-rappel, la précision et la sensibilité (ou rappel), sur les ensembles de données internes d’entraînement et de test, sont illustrées dans la figure supplémentaire 8A-D. Le modèle a démontré son exactitude, sa précision et sa sensibilité de 1 pour les ensembles de formation et de test internes. Cela indique que les prédictions du modèle s’alignaient sur les classes réelles des images dans les ensembles de données d’entraînement interne et de test. Après l’entraînement du modèle, les images de la 2e^{répétition ont} été utilisées pour s’assurer et valider indépendamment que le surajustement n’était pas un problème pour le modèle CNN atteint. Le modèle a montré sa robustesse de prédiction par les valeurs d’exactitude, de précision et de sensibilité de 1 pour 4 820 images dans l’étude de fond (scénario A), 3 900 images dans l’étude de contrôle positif (scénario B) et 2 731 images dans l’étude de contrôle négatif (scénario D). Le modèle prédictif obtenu a été déployé pour classer les images vidéo de souris reniflant de l’alcool et consommant du beurre d’arachide contenant du wasabi (scénario C) dans différents scénarios d’étude, c’est-à-dire les scénarios A, B et D. Les résultats montrent que 0 % et 29 % des images ont été classées dans les classes de l’étude de fond (scénario A, eau pure et beurre de cacahuète sans wasabi présents) et de l’étude de contrôle négatif (scénario D, alcool chinois et beurre de cacahuète sans wasabi présents), respectivement, tandis que 71 % des images ont été classées dans les classes du groupe de contrôle positif (scénario C, où l’eau pure et le mélange de beurre de cacahuète et de wasabi étaient présents). Ces résultats impliquent que la présence de liqueur alimentaire pourrait réduire la nociception évoquée par le wasabi chez la souris. Pour évaluer ce que la machine a appris à partir des supports de formation fournis, des cartes de caractéristiques ont été générées pour chaque couche de convolution. Comme le montre la figure supplémentaire 9A-D, l’attention de l’appareil était concentrée sur diverses caractéristiques faciales telles que les yeux orbitaux, le nez, les bords des joues et du corps, les oreilles, ainsi que sur la surface de contact des chows. Sur la base de ces observations, une autre méthode d’analyse des données, le MGS, a été utilisée. Le MGS se concentre sur les UA faciaux des souris, ce qui permet une évaluation statistique et une validation supplémentaire de la capacité de suppression de la présentation des boissons alcoolisées à la nociception induite par le wasabi.

La notation manuelle de l’échelle de grimace de la souris valide statistiquement les prédictions de l’apprentissage automatique.
L’intensité de la nociception évoquée par le wasabi a été évaluée à l’aide du score MGS, qui attribue des scores allant de 0 à 2, le score 0 représentant la réponse la moins sévère et le score 2 indiquant la réponse la plus sévère. Dans cette étude, les scores MGS de 24 souris (c’est-à-dire que 2 souris ont été présentées dans les 12 images sélectionnées comme la figure supplémentaire 10, la figure supplémentaire 11, la figure supplémentaire 12, la figure supplémentaire 13 montrée) ont été évalués par 22 panélistes formés. L’analyse de la portée de 2 souris, avec des expériences en trois exemplaires, a montré que les précisions intra-lot et les précisions inter-lots avaient une dérivation standard relative allant de 0 % à 25 % et de 9 % à 33 %, respectivement. Cela indique une bonne précision et une bonne cohérence dans le processus de notation MGS. Une différence significative a été observée entre les scores MGS des souris ayant reçu une pâte de beurre d’arachide (figure 3A, 0,73 ± 0,04) et celles ayant reçu un mélange de wasabi et de beurre d’arachide (figure 3B, 1,59 ± 0,11). Cela valide le dispositif expérimental de l’étude comportementale animale et confirme l’efficacité du wasabi à induire des réponses nociceptives. Même si la vapeur d’alcool libérée par le dessous de la boisson alcoolisée fournie (~42% v/v d’alcool) peut être irritante, le score MGS (figure 3D, 0,86 ± 0,16) n’a pas montré de différence significative par rapport au groupe témoin (figure 3A, 0,73 ± 0,04). Cependant, une différence significative a été observée entre les scores MGS des souris ayant reçu le mélange wasabi-beurre d’arachide (figure 3B, 1,59 ± 0,11) et celles exposées à la vapeur d’alcool lors de la consommation de wasabi (figure 3C, 0,95 ± 0,07) avec une valeur P de <0,05. Ces résultats suggèrent que l’application concomitante de wasabi et de boissons alcoolisées pourrait potentiellement diminuer l’irritation induite par le wasabi, s’alignant sur la perspective de l’intelligence artificielle. Des recherches plus approfondies sont nécessaires pour explorer l’ingrédient efficace dans l’alcool chinois fourni qui contribue à la suppression du piquant du wasabi, probablement attribuable à la présence d’éthanol.

Exemple de code déjà disponible. Tout le code permettant d’effectuer la reconnaissance d’image associé à la soumission actuelle est disponible dans un dépôt GitHub public : git@github.com :TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Toute mise à jour sera également publiée sur le référentiel GitHub avec une citation du DOI final de ce travail.

Figure 1 : Dispositif expérimental pour l’étude comportementale animale liée à la douleur. (A) L’ensemble du dispositif d’enregistrement vidéo des expressions faciales de 2 souris à l’aide des caméras de 2 smartphones placées sur les supports de téléphone à chaque terminal. (B) La chambre des chows fournissait deux pâtes de 0,5 g de beurre d’arachide ou un mélange de wasabi et de beurre d’arachide à 2 souris à volonté et 30 mL de liquide (eau ou liqueur à ~42 % v/v) étaient remplis dans la rainure sous les pâtes pour l’inhalation simultanée. (C) Un examen plus approfondi de la rainure qui était remplie de 30 mL de liquide et contenait 2 pâtes de mélange de wasabi et de beurre d’arachide. Le mélange a été préparé en mélangeant 1 g de wasabi commercial dans 4,5 g de beurre de cacahuète. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’architecture du modèle de réseau de neurones convolutif et ses entrées et sorties. Des images de 3 scénarios différents ont été utilisées pour l’entraînement, y compris le scénario A pour l’étude de fond, le scénario B pour l’étude de contrôle positif et le scénario D pour l’étude de contrôle négatif. Les images du scénario C de l’étude d’interaction entre le wasabi et l’alcool ont été classées dans les scénarios A, B ou D après l’entraînement du modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Les scores de l’échelle de grimace de souris (MGS) des souris qui ont reçu différents chows. Le score MGS est de 0 à 2, le score 0 représentant le moins sévère et le score 2 le plus sévère. L’échelle MGS de référence a été adaptée de Langford et coll. (2010)¹⁶. La grimace des souris qui ont reçu (A) du beurre de cacahuète pour la consommation a été notée de 0,73 ± 0,04 ; (B) un mélange de wasabi et de beurre d’arachide (1 g de wasabi commercial pour 4,5 g de beurre d’arachide) pour l’ingestion avec une note de 1,59 ± 0,11 ; (C) un mélange de wasabi et de beurre d’arachide pour l’ingestion, alors que l’inhalation d’alcool était disponible par le dessous de l’alcool fourni (~42% v/v d’alcool), noté 0,95 ± 0,07 ; (D) beurre d’arachide à consommer pendant que l’inhalation d’alcool était disponible par le dessous à condition que l’alcool ait été noté 0,86 ± 0,16. *, P < 0,05 ; **, P < 0,01 ; ns, aucune différence significative via l’analyse à un facteur de variance avec le test post-hoc de comparaison multiple de Bonferroni sous un intervalle de confiance de 95%. Les barres d’erreur représentaient l’erreur type de mesure (MEB). Des mesures en trois exemplaires ont été effectuées pour 2 souris dans chaque scénario. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Résumé des quatre scénarios imités dans l’évaluation du comportement animal. Remarques : ^a Le mélange a été préparé en mélangeant 1 g de wasabi du commerce dans 4,5 g de beurre de cacahuète. ^b Spiritueux chinois contenant ~42% v/v d’alcool. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Résumé des performances du modèle. Les hyperparamètres d’une taille de lot de 64, le numéro de filtre de la 1ère couche de convolution^2D de 8 sans chute suivante, le numéro de filtre de la 2ème^{couche de} convolution 2D de 8, le numéro de filtre de la 3ème^{couche de} convolution 2D de 8 avec 0,1 dropout, le numéro de filtre de la 4ème^{couche de} convolution 2D de 8, et le nombre de filtres de la couche dense de 64 avec une chute de 0,5 a donné la perte la plus faible pour l’ensemble de test fractionné interne. Ces hyperparamètres ont ensuite été adoptés pour entraîner un modèle de classification à 3 groupes (scénarios A, B et D) permettant de prédire les images du scénario C. Le scénario A était destiné à l’étude de fond. Le scénario B concernait l’étude de contrôle positif. Le scénario D concernait l’étude de contrôle négatif. Le scénario C concernait l’étude d’interaction entre le wasabi et l’alcool et l’odeur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire 1 : Exemple de matériel de formation pour l’apprentissage profond de la classe du scénario A (étude de fond). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Exemple de matériel de formation pour l’apprentissage profond de la classe du scénario B (étude de contrôle positif). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Exemple de matériel de formation pour l’apprentissage profond de la classe du scénario D (étude de contrôle négatif). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Prédictions et exemples de matériaux indépendants de la classe du scénario A (étude de fond) pour la validation du modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Prédictions et exemples de matériaux indépendants de la classe du scénario B (étude de contrôle positif) pour la validation du modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : Prédictions et exemples de matériaux indépendants de la classe du scénario D (étude de contrôle négatif) pour la validation du modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 7 : Prédictions et exemples de matériaux de la classe du scénario C (étude d’interaction wasabi-alcool goût-odeur) pour l’application du modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 8 : Performances prédictives du modèle optimal d’apprentissage profond. (A) Perte d’apprentissage et perte de validation interne sur 7 époques ; (B) Courbes de précision-rappel, (C) Précision, et (D) Rappel de la formation et validation interne sur 7 époques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 9 : Cartes des caractéristiques de chaque couche de convolution. Cartes des caractéristiques de la première couche de convolution (A), (B) de la deuxième, (C) de la troisième et (D) dernière couche de convolution dans les scénarios A, B et D, classées par ordre décroissant de la couche supérieure à la couche inférieure. Le scénario A concernait l’étude de fond. Le scénario B concernait l’étude de contrôle positif. Le scénario D concernait l’étude de contrôle négatif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 10 : Images sélectionnées pour l’évaluation manuelle de l’échelle de grimace de la souris pour le scénario A (étude de fond). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 11 : Images sélectionnées pour le score manuel de l’échelle de grimace de la souris pour le scénario B (étude de contrôle positif). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 12 : Images sélectionnées pour le score manuel de l’échelle de grimace de souris pour le scénario C (étude d’interaction entre le goût et l’odeur de wasabi et d’alcool). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 13 : Images sélectionnées pour l’évaluation manuelle de l’échelle de grimace de la souris pour le scénario D (étude de contrôle négatif). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 1 : Grimaces de souris après la consommation de wasabi avec la présence ou l’absence de boissons alcoolisées sous-fournies. De 0 s à 8 s, le clip vidéo présentait les expressions faciales normales de souris lorsqu’elles consommaient du beurre de cacahuète. De 8 s à 17 s, il a illustré les grimaces des souris lors de l’ingestion de wasabi. Les souris ont montré un resserrement orbitaire, un renflement du nez, un renflement des joues, un resserrement des oreilles vers l’extérieur et un changement des moustaches. De 17 s à 29 s, il a montré que la nociception induite par le wasabi pouvait être supprimée lorsque l’esprit était disponible en dessous. De 29 s à la fin, il a montré une collection de grimaces dans différents scénarios décrits ci-dessus. Veuillez noter que la vidéo fournie n’est utilisée qu’à titre d’illustration. Sa qualité est différente des exigences de qualité décrites pour la reconnaissance d’images et la modélisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Fichier supplémentaire 1 : shuffleSlides.pptm. Présentation supplémentaire activée pour les macros Microsoft PowerPoint, nommée « shuffleSlides.pptm ». Ce fichier a été préparé pour le mélange d’images pour le test à l’aveugle de la notation de l’échelle de grimace de la souris. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : L’architecture de CNN. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La méthode proposée pour étudier l’interaction goût-odeur dans ce travail est basée sur la méthode originale de codage comportemental pour l’expression faciale de la douleur chez la souris, qui a été développée par Langford et ^al.16. Plusieurs articles récemment publiés ont introduit CNN pour le suivi automatique du visage de la souris et le score MGS ultérieur^de 21,26,27,28. L’application des CNN offre un avantage par rapport à la méthode uniquement originale, car elle permet de générer une série d’images vidéo qui peuvent être utilisées pour former un modèle de prédiction. En revanche, la méthode originale nécessitait de présélectionner un nombre limité d’images pour MGS, ce qui peut introduire de la subjectivité et des biais.

Parmi les méthodes basées sur CNN précédemment publiées, toutes ont été développées pour évaluer le degré de détresse ou d’inconfort lors d’une injection directe d’un agent causant la douleur dans la circulation sanguine^26,28. L’un des inconvénients de cette approche d’introduction de médicament est qu’il faut déployer des efforts considérables pour filtrer les images vidéo qui ne capturent pas le profil du visage de la souris. Dans cette étude, l’agent causant la nociception wasabi commercial est fourni ad libitum. En plus de masquer l’ingrédient volatil AITC, le beurre de cacahuète est également capable d’attirer les sujets souris pour présenter un geste clair de face, facilitant la capture de leurs profils faciaux pendant l’enregistrement vidéo. De plus, cette approche élimine toute interférence potentielle de la douleur causée par l’insertion de l’aiguille. Cependant, il est important de noter que le mouvement d’ingestion des souris peut interférer avec le score MGS pour le renflement du nez et le renflement des joues. Pour résoudre ce problème, une expérience de contrôle de base doit être menée en fournissant aux souris du beurre de cacahuète pur.

Dans certains algorithmes basés sur CNN pour l’étude du comportement animal, seul un sous-ensemble d’unités d’action faciale de souris est sélectionné à partir d’images d’entraînement et programmé pour être capturé^21,22. Ces méthodes de calcul reposent sur des caractéristiques prédéfinies qui sont associées à la sensation de nociception tout en négligeant potentiellement d’autres caractéristiques importantes spécifiques à des sujets de souris individuels. Par conséquent, cela peut entraîner une perte d’informations. En revanche, cette étude adopte une approche différente en utilisant l’image entière du visage de la souris pour entraîner un modèle CNN. Cette méthode basée sur l’utilisation d’images uniquement (IOU) s’est avérée plus efficace pour la classification^{d’images 25}. Par conséquent, l’approche de modélisation CNN proposée dans la présente étude est similaire à certaines méthodes proposées qui entraînent d’abord un modèle CNN en utilisant l’image entière sans annotation de région, puis valident le modèle par une évaluation humaine manuelle^27,29. Cette approche permet de conserver plus d’informations dans les images et d’éviter l’introduction de subjectivité.

Cependant, une limite du dispositif expérimental de ce travail est que les sujets souris ont été logés comme des compagnons de portée de 2 plutôt que dans des habitats individuels. Cette décision était intentionnelle, étant donné que les souris sont des animaux sociaux et qu’elles prospèrent généralement en groupe. Une découverte intéressante est que, pendant la période de dressage des animaux, seuls 2 compagnons de portée dans 1 cage sur 3 cages ont été entraînés pour être adaptés à la présence de l’esprit chinois. En conséquence, seules des expériences en trois exemplaires ont été menées exclusivement sur ces 2 compagnons de portée. Pour le matériel de formation à la modélisation CNN, une image individuelle contenant les deux compagnons de portée a également été prise comme échantillon individuel sans effectuer de segmentation. Cette approche nous a permis de capturer l’interaction entre les compagnons de portée et d’analyser collectivement leurs comportements ainsi que leurs expressions faciales.

Semblable à la méthode de notation MGS basée sur l’image, la méthode proposée dans cette étude devrait être transférable à d’autres types d’animaux, tels que les félins et les chevaux^30,31. En appliquant la méthodologie proposée, une méthode d’introduction de chows induisant de la nourriture avec l’application de la vision par ordinateur pourrait être une approche pour faciliter l’étude du comportement animal, en particulier pour l’interaction goût-odeur chez divers animaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éthanol absolu (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Briques d’acrylonitrile butadiène styrène	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Plaques d’acrylonitrile butadiène styrène	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Isothiocyanate d’allyle (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
Diméthylsulfoxyde anhydre	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
Spiritueux chinois	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Wasabi commercial	S& B FOODS INC.
Acide formique (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
acétonitrile de qualité HPLC (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
Méthanol de qualité HPLC (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016		Microsoft https ://www.microsoft.com  ;
Microsoft PowerPoint 2016	Système	https://www.microsoft.com
Milli-Q	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Souris :	Centre de services aux animaux de laboratoire ICR (Université chinoise de Hong Kong, Hong Kong, Chine)	N/A
	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Fondation du logiciel Python	https ://www.python.org  ;
Plaques acryliques transparentes	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0& spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU