Ce protocole décrit l’application de la technique chirurgicale utilisée pour transférer des embryons de porc clonés par laparotomie chez des cochenilles.
Article de méthode
Chirurgie de transfert d’embryons par laparotomie chez les cochettes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole vise à démontrer la technique chirurgicale de transfert d’embryons de porcs clonés dans l’oviducte, une méthode largement utilisée dans la production de porcs génétiquement modifiés pour la recherche biomédicale. Neuf cochettes ont subi une synchronisation hormonale et une laparotomie pour le transfert d’embryons clonés produits par transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) à des stades allant jusqu’à 4 cellules au jour 2 vers l’oviducte. Le diagnostic gestationnel a été effectué par échographie 30 jours après la chirurgie de transfert. Six des neuf cochettes opérées présentaient des signes de grossesse à l’échographie. Cependant, comme il n’y avait pas de progression du développement fœtal tel qu’évalué par échographie, les cochettes ont subi une nécropsie à 60 jours pour la collecte de matériel biologique et l’évaluation du système reproducteur. Des adhérences ont été observées dans les cornes utérines, les ovaires et les oviductes. À partir de la lumière utérine de deux des cochettes euthanasiées, une et quatre structures embryonnaires dont l’âge gestationnel variait entre 12 et 20 jours ont été obtenues. Malgré l’absence de porcelets vivants, probablement attribuée au faible taux d’efficacité du transfert d’embryons de porc clonés, qui est influencé par divers facteurs, notamment le nombre et la qualité des embryons transférés, la technique chirurgicale présentée s’est avérée rapide et sûre.
Introduction
Les porcs sont un excellent modèle expérimental pour la recherche biomédicale en raison de leurs similitudes anatomiques, physiologiques et génétiques avec les humains1. Ces animaux ont souvent été utilisés dans la recherche liée à la xénotransplantation, dans le but de produire des organes, des cellules ou des tissus qui favorisent un faible risque de rejet lorsqu’ils sont transplantés chez l’homme. La recherche sur la xénotransplantation vise à augmenter l’approvisionnement en organes pour la transplantation humaine, réduisant ainsi la liste d’attente des patients2.
La production de porcs pour la xénotransplantation implique plusieurs étapes, y compris la production de clones à partir de cellules porcines génétiquement modifiées. Après la production in vitro d’embryons clonés génétiquement modifiés, les embryons sont transférés dans le système reproducteur d’une truie avec un cycle œstral synchronisé afin de préparer la physiologie utérine pour la réception et la gestation du nouveau conceptus3.
Le transfert d’embryons chez les porcs peut être effectué par des méthodes non invasives ou invasives4. Parmi les méthodes non invasives figure le transfert transcervical, qui ne nécessite aucune intervention chirurgicale. Cependant, cette méthode est limitée au transfert d’embryons à des stades de développement ultérieurs (c’est-à-dire aux stades de la morula ou du blastocyste) et ne permet pas de déterminer avec précision le site d’insertion du cathéter ou le dépôt d’embryons5. La laparoscopie et la laparotomie sont considérées comme des méthodes invasives de transfert d’embryons. La laparoscopie est moins invasive mais nécessite un équipement spécifique et coûteux, et son efficacité varie considérablement (de moins de 20 % à plus de 80 %) en raison de divers facteurs tels que la difficulté à manipuler les structures reproductrices et le type de cathéter utilisé 4,6. Par conséquent, le transfert par laparoscopie est encore moins efficace que les méthodes de transfert chirurgical par laparotomie4.
La chirurgie de transfert d’embryons chez les truies par laparotomie est une procédure relativement simple et rapide, qui prend généralement environ 30 minutes. Cependant, il doit être effectué dans un centre chirurgical équipé d’un appareil d’anesthésie par inhalation et d’une équipe spécialisée. Pour les souches porcines commerciales (telles que Landrace, Large White ou leurs croisements), un équipement spécial comme des palans pour soulever les cochettes et une table chirurgicale large et robuste est nécessaire en raison du poids considérable des animaux (environ 130-150 kg).
Pour que l’opération réussisse, les embryons doivent être évalués au préalable pour leur stade de développement. Il est recommandé de transférer des embryons d’un maximum de 4 cellules dans la trompe utérine. Les embryons à des stades supérieurs à 4 cellules, tels que les morulas et les blastocystes, doivent être transférés dans la corne utérine 7,8.
Bien que des groupes de recherche du monde entier effectuent la production et le transfert chirurgical d’embryons de porc clonés génétiquement modifiés, il n’existe toujours pas de protocoles bien définis démontrant cette procédure à travers des vidéos. Cette approche est cruciale pour le succès de la gestation, car la technique nécessite un dépôt précis des embryons à l’endroit exact de l’oviducte, impliquant la localisation de l’ostium tubaire et l’introduction de la pipette contenant les embryons. Cette technique peut être mieux comprise à travers des vidéos explicatives de l’ensemble de la procédure. Par conséquent, cet article vise à démontrer la chirurgie de laparotomie pour le transfert d’embryons clonés dans l’oviducte des cochettes, une condition préalable essentielle pour la production future de porcs génétiquement modifiés destinés à la xénotransplantation ou à d’autres fins connexes.
Protocole
Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’utilisation des animaux dans la recherche du Collège de médecine vétérinaire et de sciences animales de l’Université de São Paulo, numéro de protocole 6088030523. Neuf cochettes de sept mois provenant de l’élevage porcin de base d’Água Branca, situé dans la ville d’Itu, dans l’État de São Paulo, au Brésil, ont été utilisées juste après la deuxième détection d’œstrus9. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Préparation des animaux
- Faites jeûner les animaux pendant 12 h et limitez l’accès à l’eau pendant 4 h avant l’intervention chirurgicale.
- À l’aide d’une aiguille de 40 mm x 12 mm, prélever 10 mg/kg de kétamine et 0,2 mg/kg de midazolam dans la même seringue de 50 ml. Fixez la seringue à un dispositif d’administration IV pour faciliter l’administration des médicaments, en maintenant une distance de sécurité avec l’animal et en lui permettant de se déplacer librement.
- Administrer le médicament pré-anesthésique par injection intramusculaire dans le muscle trapèze, caudal au conduit auditif externe.
- Canuler la veine auriculaire à l’aide d’un cathéter de 20 G et la connecter à un dispositif d’administration de macrogouttes pour une fluidothérapie peropératoire avec une solution de NaCl à 0,9 % à un débit de 10 mL/kg/h.
- Induire une anesthésie avec 4 mg/kg de propofol par voie intraveineuse (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
- Effectuer l’intubation orotrachéale de l’animal à l’aide d’un laryngoscope et d’une sonde orotrachéale de taille 9 avec un brassard10.
- Maintenez l’anesthésie avec une inhalation d’isoflurane de 1,5 % à 2 %. De plus, surveillez l’anesthésie en évaluant les paramètres physiologiques tels que la fréquence cardiaque, qui doit être maintenue entre 100 et 120 battements par minute, la saturation en oxygène, qui doit être maintenue entre 99 % et 100 %, la relaxation musculaire, l’absence de mouvement et l’évaluation des réflexes.
REMARQUE : La température corporelle doit également être surveillée et contrôlée, en restant entre 37,5 et 38,5 °C. Si nécessaire, en plus de l’isoflurane, le propofol peut être utilisé pour maintenir le contrôle des paramètres. Le chlorhydrate de fentanyl doit être administré comme analgésique à une dose de 0,02 mg/kg toutes les 20 minutes. Tous les paramètres doivent être enregistrés toutes les 5 minutes. - Administrer une analgésie périopératoire avec une dose unique de 0,002 mg/kg de fentanyl par voie intraveineuse et de 4 mg/kg de chlorhydrate de tramadol par voie intramusculaire dans le muscle fessier ou trapèze.
- Placez des électrodes cardiaques sur la région thoracique pour la surveillance peropératoire de la fréquence cardiaque. Enregistrez la fréquence cardiaque, la température rectale et la saturation en oxygène toutes les 5 minutes.
2. Intervention chirurgicale
- Positionnez la cochette sur la table d’opération en décubitus dorsal.
- Couvrez les pattes de l’animal avec des gants de procédure pour minimiser la contamination du champ opératoire.
- Effectuez l’épilation abdominale caudale ventrale entre l’avant-dernière paire de glandes mammaires à l’aide d’une tondeuse chirurgicale.
- Effectuez une antisepsie cutanée préopératoire avec une brosse antiseptique imprégnée de chlorhexidine, en effectuant des mouvements circulaires de la région cicatricielle ombilicale à la dernière paire de glandes mammaires. Retirez la chlorhexidine à l’aide d’une compresse propre et humidifiée.
- S’assurer que le chirurgien et l’assistant effectuent l’antisepsie chirurgicale et portent des blouses et des gants chirurgicaux stériles pour la chirurgie.
REMARQUE : L’animal doit être préparé pour la chirurgie dans une zone de préparation séparée du site chirurgical. - Préparez la table d’opération avec les instruments appropriés et préalablement stérilisés énumérés dans la table des matériaux.
- Effectuez l’antisepsie finale sur le terrain chirurgical à l’aide de gaze stérile et d’un antiseptique à la chlorhexidine, en nettoyant la région en arête de poisson, en commençant par le site d’incision et en s’étendant latéralement.
- Répétez cette procédure trois fois avec l’antiseptique à la chlorhexidine, puis répétez la procédure avec de la chlorhexidine alcoolique.
- Couvrez complètement l’animal avec un champ chirurgical stérile et, à l’aide de ciseaux, créez une ouverture rectangulaire dans le champ chirurgical, d’environ 10 x 20 cm², si le champ n’est pas fenestré.
- Placez le champ chirurgical sur l’avant-dernière paire de glandes mammaires inguinales. Placez 4 pinces Backhaus pour fixer le champ chirurgical sur la peau de l’animal.
- Incisez la peau à l’aide d’un scalpel, créant une incision d’environ 10 cm de longueur.
- Réaliser l’hémostase des vaisseaux sous-cutanés à l’aide d’une pince hémostatique et/ou d’une suture résorbable de taille 2.
- Disséquez le tissu sous-cutané avec les doigts ou à l’aide de ciseaux à pointe fine, en approfondissant l’incision pour atteindre la linea alba dans la musculature abdominale.
REMARQUE : Palper la ligne médiane de l’abdomen pour sentir la linea alba comme une zone plus rigide et fibreuse ; Observez la séparation des muscles droits de l’abdomen et notez le changement de consistance des tissus tout en disséquant pour identifier la Linea Alba avec précision 11. - À l’aide d’une pince Allis, saisissez la musculature et soulevez-la pour faire une incision de poignardage dans la ligne blanche à l’aide d’un scalpel.
- Insérez l’index dans l’incision pour évaluer la présence d’adhérences. Étendez l’incision sur la ligne blanche caudale et crânienne avec des ciseaux émoussés/émoussés ou fins/émoussés avec précaution pour éviter de blesser d’autres organes et structures sous-jacentes.
- Faites une incision d’une longueur suffisante pour que la main du chirurgien puisse être insérée dans la cavité abdominale afin de localiser et d’extérioriser les cornes utérines et/ou les ovaires. Un écarteur Gosset peut être utilisé pour faciliter l’entrée dans la cavité abdominale et la suture de la musculature en une seule couche à la fin de l’intervention.
- Si l’une des cornes utérines est située avant les ovaires, suivez-la doucement jusqu’à atteindre l’extrémité de la corne utérine et l’ovaire ipsilatéral. Au cours de cette procédure, évaluez la présence de liquide à l’intérieur de l’utérus, ce qui peut compromettre la gestation.
- Après avoir localisé l’ovaire, tirez-le doucement et exposez-le soigneusement. Évaluez la présence de follicules pré-ovulatoires, de corps jaunes hémorragiques, de corps jaunes cycliques et de corps albicans pour évaluer si la synchronisation de la cochette est comme prévu.
- Retirez doucement les fimbriae de la trompe utérine recouvrant l’ovaire, inversez sa muqueuse et localisez l’ostium de la trompe utérine.
REMARQUE : Si le chirurgien a du mal à identifier l’ostium des fimbriae, une poche sur l’ampoule de l’oviducte peut être réalisée avec une aiguille de suture ronde, en évitant de perforer les vaisseaux sanguins, pour insérer le cathéter Tomcat contenant les embryons. - Insérez soigneusement un cathéter Tomcat contenant les embryons dans l’ostium des fimbriae jusqu’à ce que vous atteigniez la région de l’ampoule de la trompe utérine.
- Fixez une seringue de 1 ml au cathéter Tomcat pour pousser le liquide contenant l’embryon dans la trompe utérine. Couvrez l’ovaire avec les fimbriae et ramenez-le dans la cavité abdominale.
- Localisez la corne utérine et l’ovaire controlatéraux et répétez les étapes 2.17-2.21.
- Repositionnez les structures à l’intérieur de la cavité abdominale et ajoutez 1 L de solution saline ou de solution de lactate de Ringer réchauffée (39 °C) pour prévenir les adhérences avant de commencer l’abdominalgie.
- Suture de la musculature abdominale avec suture résorbable de taille 2 en points de suture en « X » (Sultan) interrompue.
- Approchez le tissu sous-cutané avec une suture continue du matelas à l’aide d’une suture résorbable de taille 2.
- Fermez la peau avec des sutures en nylon de taille 2 en points simples interrompus, des agrafes chirurgicales ou un adhésif éthyl-cyanoacrylate. Dans cette procédure, nous avons opté pour l’utilisation d’adhésif.
- Nettoyez la plaie chirurgicale avec de la gaze imbibée de peroxyde d’hydrogène et séchez-la avec une compresse pour améliorer la fixation de l’adhésif chirurgical sur la plaie chirurgicale. Appliquez de la rifamycine ou de la pommade de Pearson, recouvrez de gaze et enfin, appliquez un adhésif chirurgical.
REMARQUE : La plaie doit rester fermée avec un pansement pendant 5 jours.
3. Soins postopératoires
- Évaluer les animaux pour détecter des signes de douleur clinique caractéristique pendant au moins les 3 prochains jours consécutifs, selon l’échelle proposée par Luna et al.12.
REMARQUE : Cette échelle est basée sur différents comportements manifestés par les porcs lorsqu’ils ressentent différents niveaux de douleur, tels que la posture, l’interaction et l’intérêt pour l’environnement, l’activité, l’appétit et l’attention à la zone touchée. Le score varie de 0 à 3, selon le type de comportement présenté, pour chaque paramètre évalué. À la fin de l’évaluation, la somme de tous les scores reflète l’intensité de la douleur ressentie par l’animal, où 0 représente l’absence de douleur et 18 représente une douleur très intense12. - Administrer une dose unique de 15 mg/kg d’amoxicilline et 0,4 mg/kg de méloxicam à 2 % par voie intramusculaire (dans le muscle fessier ou cervical) une fois par jour pendant 3 jours en tant que soins postopératoires pour prévenir la douleur, les processus inflammatoires et les infections.
REMARQUE : Si le score de douleur est égal ou supérieur à 6 sur l’échelle de douleur utilisée (score de 0 à 18), administrez 5 000 mg/animal de dipyrone de sodium par voie intramusculaire (dans le muscle fessier ou cervical) une fois par jour en plus de l’anti-inflammatoire et de l’antibiotique. Vous pouvez également effectuer une analgésie comme indiqué dans les directives locales de l’IACUC. - Le 6e jour après l’opération, retirez l’adhésif chirurgical pour le nettoyage des plaies avec de la gaze imbibée d’une solution alcoolique de chlorhexidine à 2 % et appliquez une pommade topique de Pearson jusqu’au 10e jour, lorsque l’enlèvement des sutures ou des agrafes chirurgicales, le cas échéant, est recommandé.
4. Diagnostic gestationnel échographique de la grossesse
- Effectuer une évaluation échographique de grossesse transabdominale à l’aide d’un appareil à ultrasons (gamme de fréquences de 4,5 à 8,5 MHz) 30 jours après la chirurgie de transfert d’embryons.
- Appliquez du gel à ultrasons sur la sonde et positionnez-la près de la région abdominale inguinale, face à la médiale.
REMARQUE : La visualisation de vésicules embryonnaires anéchoïques arrondies, dues au liquide dans la lumière utérine, indique une gestation. La non-visualisation du liquide intra-utérin ou la présence de liquide intra-utérin sans délimitation des vésicules embryonnaires suggère l’absence de gestation.
5. Euthanasie des animaux
REMARQUE : Euthanasier les cochettes qui n’ont pas présenté de fœtus de taille et d’apparence correspondant à l’âge gestationnel à l’échographie.
- À l’aide d’une aiguille de 40 mm x 12 mm, prélever 15 mg/kg de kétamine et 2 mg/kg de midazolam dans la même seringue de 50 ml attachée à un dispositif d’administration intraveineuse, et administrer par voie intramusculaire dans le muscle trapèze de la région cervicale caudale au conduit auditif externe, à titre de médicament préanesthésique.
- Canuler la veine auriculaire à l’aide d’un cathéter de 20 G et induire une anesthésie avec 4 mg/kg de propofol par voie intraveineuse en bolus jusqu’à ce qu’une bradycardie se produise (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
- Par la suite, administrer par voie intraveineuse 10 à 20 mL de chlorure de potassium à 19,1 %. Confirmez l’arrêt cardiorespiratoire en observant l’absence de mouvements respiratoires, la pâleur des muqueuses, la perte du réflexe cornéen et l’absence de battements cardiaques en plaçant un stéthoscope sur la région cardiaque.
- Prélever tout type de contenu intra-utérin (tissu embryonnaire, liquide ou sécrétions muqueuses) sur des femelles autopsiées13 et l’envoyer pour analyse microbiologique afin de détecter d’éventuels agents pathogènes et également pour la caractérisation génotypique des clones (si nécessaire). Vérifiez visuellement la présence ou l’absence de corps jaunes, de kystes ovariens, de sécrétions anormales et l’apparition d’adhérences dans l’utérus, les ovaires et les oviductes14.
Résultats
Cet article vise à démontrer la chirurgie de laparotomie pour le transfert d’embryons clonés dans l’oviducte des cochettes. Tous les animaux sont restés dans un plan anesthésique adéquat, sans aucun incident ou complication peropératoire pendant la récupération de l’anesthésie. Les cochettes mettaient en moyenne 2 à 3 heures pour se lever après la fin de l’opération.
Toutes les interventions chirurgicales ont duré en moyenne 44 min. Neuf cochettes ont subi une intervention chirurgicale, avec une moyenne de 185 embryons clonés transférés par cochette, soit un total de 1 664 embryons transférés bilatéralement (tableau 1). La localisation des ovaires, leur extériorisation, et l’introduction du cathéter Tomcat contenant les embryons dans l’ostium de l’oviducte ont correspondu aux moments les plus délicats de l’opération. Les ovaires de toutes les cochettes ont été inspectés pendant l’intervention chirurgicale et tous ont présenté des follicules hémorragiques récemment ovulés, conformément à ce qui était attendu pour le protocole de synchronisation de l’œstrus effectué, qui visait à effectuer des transferts d’embryons peu de temps après l’ovulation. Toutes les procédures se sont déroulées sans incident peropératoire.
Aucun animal n’a montré de signes de douleur intense après la chirurgie, avec un score de douleur moyen de 0,33, 0,33, 3,67, 1,33, 0,33, 1,33, 4,67, 2,00 et 0,33 sur l’échelle de douleur (allant de 0 à 18) effectué sur les 3 jours postopératoires pour chacune des cochettes opérées (tableau 2). Seulement 1 des cochettes opérées présentait une accumulation de liquide sous-cutané (sérome) le 12e jour après l’opération, avec des signes d’infection et d’inflammation localisés près de la plaie chirurgicale. Après avoir drainé le liquide à l’aide d’une aiguille de 40 mm x 1,6 mm guidée par échographie, appliqué des compresses froides sur la zone enflammée pendant 30 minutes par jour pendant 7 jours, administré du ceftiofur (3 injections intramusculaires, avec un intervalle de 72 heures entre les injections) et du méloxicam à 2 % (0,4 mg/kg de SID, par voie intramusculaire, pendant 3 jours), la plaie a fistulé et drainé le contenu mucopurulent restant, entraînant une amélioration complète de l’animal. Les autres cochettes opérées sont restées avec le pansement chirurgical pendant 5 jours sans qu’il soit nécessaire de le changer ou de l’enlever pour le nettoyage de la plaie, qui n’a été effectué que du 6au 10e jour après l’opération.
Chez les cochettes 2, 8 et 9, aucune accumulation de liquide ni formation de vésicules embryonnaires n’ont été observées dans la lumière utérine (Figure 1A). Par conséquent, le diagnostic gestationnel de ces animaux a été considéré comme négatif. Les autres cochettes ont montré une accumulation de liquide intra-utérin et la formation de vésicules embryonnaires visualisées comme des structures arrondies anéchoïques bien définies (figure 1B-D). Il a été possible d’identifier, chez deux des cochettes receveuses, une région hyperéchoïque par rapport à la structure embryonnaire dans la phase précoce de développement à l’intérieur des vésicules embryonnaires au 32e jour de gestation (Figure 1E,F).
Après un diagnostic gestationnel négatif ou une non-progression de la gestation, les cochettes ont été euthanasiées et le système reproducteur a été analysé. Des adhérences plus ou moins importantes dans les régions des ovaires, des oviductes et des cornes utérines ont été observées chez les cochettes 1, 2, 3 et 4, et des kystes ovariens ont été observés chez les cochettes 8 (figure 2). Quatre structures embryonnaires, dont l’âge gestationnel correspond à environ 12 à 20 jours de gestation, ont été obtenues à partir de l’utérus de la cochette 3, et une structure a été obtenue à partir de la cochette 7 (figure 3). L’analyse de fragments de tissu embryonnaire a révélé des résultats négatifs pour la détection du parvovirus, de Leptospira sp., d’Erysipelothrix rhusiopathiae et du circovirus porcin de types 2 et 3 (PCV2/PCV3), qui peuvent provoquer la mort embryonnaire ou des avortements.
Figure 1 : Images échographiques de l’utérus des cochettes receveuses d’embryons 30 jours après l’intervention chirurgicale. (A) L’utérus de la cochette 2 sans présence de liquide à l’intérieur, caractérisant un diagnostic gestationnel négatif. L’utérus gravide des cochettes 1 (B), 3 (C) et 4 (D) contenant des vésicules embryonnaires avec du liquide à l’intérieur (astérisques). L’utérus gravide des cochettes 3 (E) et 7 (F) montrant une structure hyperéchoïque (flèche) à l’intérieur de la vésicule embryonnaire, indiquant la formation fœtale dans la phase précoce à 32 jours de gestation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse de l’appareil reproducteur. Images de l’utérus, des ovaires et des oviductes après la nécropsie des cochettes 1 (A), des cochettes 2 (B), des cochettes 3 (C), des cochettes 4 (D), des cochettes 5 (E), des cochettes 6 (F), des cochettes 7 (G), des cochettes 8 (H) et des cochettes 9 (I). Les flèches mettent en évidence les adhérences dans les cornes utérines, les ovaires et les oviductes, et les pointes de flèches mettent en évidence les kystes ovariens. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Diagnostic gestationnel. Les embryons à un stade précoce retirés des cochettes 3 (A-D) et 7 (E) présentent un diagnostic gestationnel positif et des structures hyperéchogènes à l’intérieur des vésicules embryonnaires à l’examen échographique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Nombre et type d’embryons transférés par cochette, grossesses diagnostiquées et nombre d’embryons obtenus après nécropsie des cochettes opérées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Valeurs attribuées à chacune des cochettes opérées en fonction de la présentation des signes de douleur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Discussion
La méthode chirurgicale décrite a déjà été réalisée par d’autres groupes de recherche travaillant avec la production de porcs clonés ou de porcs clonés génétiquement modifiés, avec des rapports de naissances après la mise en œuvre de cette technique 15,16,17,18,19,20. Les taux de gestation et de natalité des embryons SCNT produits à partir de diverses lignées cellulaires varient entre 20 % et 30 % (sur 264 transferts depuis 2017), avec une moyenne de 3,2 ± 0,4 porcelets nés par portée 3,21. Plusieurs facteurs sont liés à la faible efficacité de cette technique, notamment le protocole de synchronisation utilisé pour les truies receveuses, la synchronisation entre la truie receveuse et le stade des embryons transférés, le site de dépôt des embryons, la qualité des ovocytes utilisés pour le TNCS et les embryons produits, la qualité et le stade cellulaire des cellules somatiques du noyau du donneur, et le nombre d’embryons transférés21.
Selon la présente étude, la chirurgie décrite s’est avérée efficace, rapide et sûre pour effectuer le transfert chirurgical d’embryons clonés (jusqu’au stade de 4 cellules) dans des cochettes, ce qui a entraîné des diagnostics gestationnels échographiques positifs et une visualisation des structures embryonnaires à l’intérieur de la lumière utérine après l’autopsie, l’âge gestationnel se situant environ entre 12 et 20 jours de gestation22. Une autre méthode moins invasive de transfert d’embryons de TNCS dans l’oviducte des truies comprend la laparoscopie. Cependant, l’efficacité de cette technique varie considérablement, de moins de 20% à plus de 80%, en raison de divers facteurs tels que l’anatomie des structures, le type de cathéter utilisé et le site de dépôt de l’embryon 4,6,23,24,25,26,27. Lors du transfert de 2 à 4 embryons de porc blastomère par laparoscopie via l’infundibulum à 6 truies, Wieczorek et al.4 n’ont pas obtenu de grossesses positives 28 à 31 jours après l’intervention, et ce résultat était lié à des difficultés d’insertion du cathéter dans l’oviducte, à l’insertion superficielle du cathéter dans l’oviducte et à l’apparition d’une perforation de l’infundibulum avec le cathéter. Par conséquent, la méthode de transfert d’embryons par laparotomie vers l’oviducte des truies semble toujours être la plus efficace.
Le risque chirurgical associé à la procédure de laparotomie pour le transfert d’embryons chez les truies est faible ; Cependant, il est important de noter la possibilité d’une hyperthermie maligne pendant l’anesthésie, qui est couramment observée chez les porcs commerciaux des races Landrace et Large White28. Dans ce cas, aucune des cochettes opérées n’a montré de signes cliniques d’hyperthermie maligne pendant l’anesthésie. Il existe également un risque de saignement local mineur des gros vaisseaux de la région sous-cutanée, qui peuvent être facilement arrêtés avec des pinces hémostatiques ou des sutures avec des sutures résorbables. La possibilité d’inciser accidentellement n’importe quel organe de la cavité abdominale, tel que la vessie ou les anses intestinales, lors de l’incision avec le scalpel dans le stab et l’incision d’extension dans la linea alba avec des ciseaux peut également se produire. Dans ce cas, le chirurgien doit être très attentif lors de l’incision de la ligne blanche et de la suture des muscles abdominaux pour éviter de couper ou de lacérer les structures sous-jacentes.
La dextérité manuelle du chirurgien est essentielle pour une bonne manipulation des ovaires et une extériorisation soigneuse, évitant la rupture des vaisseaux du pédicule ovarien. Lorsqu’il est difficile de localiser le(s) ovaire(s), il est possible de commencer la procédure en localisant l’une des cornes utérines et en suivant son extension jusqu’à atteindre l’extrémité de la corne utérine à la jonction utéro-tubaire près de l’ovaire. Des précautions doivent être prises pour éviter les adhérences ovariennes et utérines dues à une manipulation excessive de ces organes. L’hydratation de ces structures avec une solution de Ringer lactée ou une solution saline à 39 °C pendant la chirurgie peut aider à prévenir la formation d’adhérences29. La manipulation de la trompe utérine, en particulier dans la région des fimbriae, doit être effectuée très délicatement pour éviter l’étirement et la rupture. Bien que le transfert unilatéral d’embryons, uniquement vers l’une des trompes utérines, puisse être effectué pour éviter une manipulation excessive de l’utérus et réduire le temps chirurgical, le transfert bilatéral peut être plus sûr et plus avantageux, en particulier dans les cas où il y a une rupture accidentelle de l’une des trompes utérines ou des doutes sur le dépôt de l’embryon au bon endroit. De plus, le transfert bilatéral est plus recommandé car il favorise des taux de gestation et un nombre de porcelets plus élevés que le transfert unilatéral16,30. La présence de kystes est associée à un retour régulier ou irrégulier à l’œstrus, jusqu’à 10% des femelles avec des kystes ovariens restant en anestrus. Il est lié à diverses causes telles que le stress, l’utilisation de protocoles hormonaux ou l’héritage génétique31,32. Dans notre cas, des kystes folliculaires sont survenus malgré le respect de la dose et du temps d’administration recommandés par le fabricant d’hormones pour la synchronisation de la chaleur.
Savoir localiser l’ostium de la trompe utérine par l’ouverture des fimbriae est d’une importance fondamentale pour le dépôt correct des embryons à l’endroit approprié. Pour éviter les erreurs concernant l’emplacement du dépôt d’embryons, il est recommandé d’effectuer une formation préalable sur le passage du cathéter Tomcat rempli de solution (par exemple, d’eau) à travers l’ostium de la trompe utérine dans les échantillons d’abattoir. Lorsque la pipette est introduite au bon endroit, il est possible d’observer une augmentation du volume de la trompe utérine lors de l’injection de la solution. Il convient de noter que plus la quantité de liquide transférée avec les embryons est faible, meilleures sont les chances de grossesse33. Si le chirurgien a beaucoup de mal à trouver l’ostium de la trompe utérine, il est possible de faire une poche sur l’oviducte et d’y insérer le cathéter. Bien que cette dernière méthode soit plus rapide et implique moins de manipulation de l’oviducte, le chirurgien doit éviter les vaisseaux sanguins et s’assurer que le cathéter a été correctement inséré à l’intérieur de la lumière de l’oviducte.
Bien que le risque d’infections postopératoires résultant de cette intervention chirurgicale soit faible, elle peut survenir en raison de facteurs tels que le niveau de propreté de la zone où les animaux sont hébergés, la durée de l’intervention chirurgicale, le maintien du pansement pendant une durée adéquate et la prescription correcte de médicaments, tels que l’antibiothérapie préventive et les anti-inflammatoires. L’hypothèse la plus plausible pour la survenue de l’infection observée chez l’une des cochettes opérées est liée à la chute du pansement peu de temps après que l’animal se soit levé après l’anesthésie. Bien que le nettoyage quotidien de la plaie chirurgicale de cette cochette ait été effectué avec de la gaze imbibée de solution saline et l’application topique de la pommade de Pearson, une telle procédure n’a pas suffi à prévenir la contamination ascendante, nécessitant une application d’eau froide sur le site, un drainage, une antibiothérapie systémique et 3 jours supplémentaires de traitement anti-inflammatoire. Même en cas d’infection sous-cutanée, cette cochette a montré des signes de grossesse à l’échographie.
Après avoir utilisé des fils de nylon et des agrafes chirurgicales pour fermer la peau lors de chirurgies précédentes, nous avons choisi d’utiliser un adhésif éthyl-cyanoacrylate pour réduire le stress lors du retrait des points de suture et éviter tout fil ou agrafe restant. La présence de fils ou d’agrafes favorise une petite inflammation locale avec formation de pustules. L’adhésif éthyl-cyanoacrylate a déjà été utilisé en toute sécurité dans des procédures chirurgicales, s’avérant efficace, non toxique et bactéricide34,35. Tous les animaux ont montré une excellente cicatrisation, sans complications, à l’exception de la cochette, dont le pansement est tombé peu de temps après l’intervention chirurgicale.
Déclarations de divulgation
Aucun des auteurs ne divulgue de conflit d’intérêts
Remerciements
Nous tenons à remercier l’Hôpital vétérinaire équin et l’Hôpital vétérinaire des ruminants de la Faculté de médecine vétérinaire de l’Université de São Paulo (FMVZ/USP), São Paulo, Brésil, la FAPESP (subvention 2022/11459-3, Fondation de recherche de São Paulo), EMS Pharma, CNPq (subvention 405254/2022-9), et l’élevage porcin Água Branca, Itu, São Paulo, Brésil.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,25 mL de paille | générique-Matériel | chirurgical | |
| Seringue de 1 mL | Descarpack | 341001 | Matériel chirurgical |
| Seringue de 10 mL | Descarpack | 324601 | Matériel chirurgical |
| Seringue de 20 mL | Descarpack | 324801 | Seringue |
| 3 mL | Descarpack | 324201 | Matériel |
| Seringue de 5 mL | Descarpack | 324401 | Matériel chirurgical |
| Seringue de 60 mL | Descarpack | 323201 | Matériel chirurgical |
| Tube endotrachéal de 9 mm | Rusch | 112482-000090 | Matériel chirurgical |
| Pince Allis | générique-Instrument chirurgical | ||
| Amox LA | JA Saú ; de Animal | MAPA enregistrement : 8.781/2004 | Médicament pharmaceutique |
| Bakhaus forceps | générique-Instrument | chirurgical | |
| Cathéter 20G | Descarpack | 362401 | Cathéter pour accès intraveineux |
| Cetamin | Agener Uniã ; o | Enregistrement MAPA : SP-000292-5.000011 ; | anesthésique |
| Gel clinique conducteur | Enregistrement ANVISA RMC | : 80122200013 | Matériel chirurgical |
| Dipyrone D-500 | Zoetis | Enregistrement MAPA : SP0000728-46 | Médicament pharmaceutique |
| Scalpel jetable n. 22 | Wiltex | Enregistrement ANVISA : 10150470565 | Instrument chirurgical |
| Brosse éponge stérile jetable | Rioquimica | 7.89778E+12 | Asepsie chirurgicale |
| Easy-Scan :Go | IMV | ESCG01 | |
| Échographie Endozime AW Plus | Ruhof | 34514 | Détergent pour instruments chirurgicaux |
| Fentanil (Fentanest) | Cristá ; lia | Enregistrement ANVISA : 1029800810159 | Anesthésique |
| Gosset écarteur | générique-Instrument | chirurgical | |
| Halstead-mosquito pince hémostatique | générique-Instrument | chirurgical | |
| Pommade cicatrisante - Unguento Pearson | Pearson SA | MAPA enregistrement : SP0000094-16 | Médicament pharmaceutique |
| peroxyde d’hydrogène solution | Rioquimica | Enregistrement ANVISA : 218690015 | Matériel chirurgical |
| Isofluorane | Biochimico | Enregistrement ANVISA : 100630222 | Anesthésique |
| IV Sérum perfusionnel extenseur | générique-Thérapie | ||
| fluide IV Macro drip set | Descarpack | 410301 | Fluidothérapie |
| Lactofur (ceftiofur) | Ourofino SA | Enregistrement MAPA : SP0000051-50 | Médicament pharmaceutique |
| Laringoscope | - | - | Instrument chirurgical |
| Maxicam 2 % | Ourofino SA | MAPA enregistrement : SP0000051-69 | Médicament pharmaceutique |
| Adhésif micropore 5 cm x 10 cm ; | générique | 1530 | Matériel chirurgical |
| Midazolam | Hipolabor | Enregistrement ANVISA : 1134301430035 | Anesthésique |
| Multi-Voies IV Infusion Set | Descarpack | 413201 | Aiguille de thérapie liquidienne |
| 40 mm x 1,2 mm | Descarpack | 353601 | Aiguille stérile pour l’application de médicaments et d’anesthésiques. |
| Aiguille 40 mm x 1,6 mm | Wiltex | Enregistrement ANVISA : 10150470664 | Aiguille stérile pour l’application de médicaments et d’anesthésiques. |
| Porte-aiguille | générique-Instrument | chirurgical | |
| Nylon 2 suture trhead | Shalon Medical | N502CTI40 | Matériel chirurgical |
| Stylo ordinaire | générique-Stylo | régulier pour la prise de notes | |
| Solution physiologique 0,9 % Sachet de 500 mL | JP Farma | MS :1.0491.0070 | Fluidothérapie |
| Acide polyglycolique 2 fil de suture | Atramat | G4099-75H | Matériel chirurgical |
| Chlorure de potassium | Samtec | Enregistrement ANVISA : 1559200010139 | Médicament parentéral |
| Gants de procédure | Descarpack | 122401 | Équipement de protection individuelle (EPI) |
| Propofol (Provive) | Uniã ; o Quí ; mica | Enregistrement ANVISA : 1049714490057 | Anesthésique |
| Ringer solution de lactate 500 mL sac | JP Farma | MS :1.0491.0061 | Fluidothérapie |
| Riohex 0,5 % solution d’alcool de clorexidine | Rioquimica | 218690356 | Asepsie chirurgicale |
| Riohex 2 % solution de clorexidine avec tensioactif | Rioquimica | 218690356 | Asepsie chirurgicale |
| cuir chevelu 21 G | Descarpack | 421201 | Matériel chirurgical |
| Couvre-chaussures | générique-Equipement | de protection individuelle (EPI) | |
| Compresses stériles | Cremer | Enregistrement ANVISA : 10071150065 | Matériel chirurgical |
| Gaze stérile Tampon de gaze | Procitex | Enregistrement ANVISA : 80245210083 | Matériel chirurgical Champs chirurgicaux |
| stériles 140 cm x 90 cm ; | Venkuri | 7010003 | Matériel chirurgical |
| Champs chirurgicaux stériles 150 cm x 190 cm ; | PolarFix | F00208 | Matériel chirurgical |
| Gants chirurgicaux stériles | Mucambo | CA : 39.317 | Equipement de protection individuelle (EPI) |
| Stéthoscope | générique-Equipement chirurgical | ||
| Bonnets chirurgicaux | Descarpack | 93201 | Equipement de protection individuelle (EPI) |
| Blouse chirurgicale | Descarpack | 231101 | Equipement de protection individuelle (EPI) |
| Masque chirurgical | Descarpack | 110701 | Equipement de protection individuelle (EPI) |
| Ciseaux chirurgicaux blunt-blunt | générique-Instrument | chirurgical | |
| Instrument chirurgical | |||
| Tradevet-Matériel | chirurgical | ||
| Super colle Tek | Bond | 78072720030 | Matériel chirurgical |
| Thermomètre | générique-Matériel | chirurgical | |
| Robinet d’arrêt à trois voies | Solidor | 374 | Matériel chirurgical |
| Tramadol hydrocloure | Agener Uniã ; o | Enregistrement MAPA : SP-000292-5.000002 | Anesthésique |
| Pansement en film transparent | Skinupper | Enregistrement ANVISA : 82307460014 | Matériau chirurgical |
| Adhésif imperméable 10 cm x 4,5 cm ; | générique | 364828 | Matériel chirurgical |
Références
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Réimpressions et autorisations
