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Imagerie moléculaire d’organoïdes cérébraux humains à l’aide de la spectrométrie de masse

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DOI :

10.3791/66997

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27 septembre 2024

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1Department of Pediatrics -Neurology, Baylor College of Medicine, 2Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 3Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 4Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Une méthode avancée a été mise au point pour l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) des organoïdes cérébraux qui permet de cartographier la distribution des métabolites au sein de ces modèles. Cette technologie offre un aperçu des voies métaboliques cérébrales et des signatures des métabolites au cours du développement précoce et de la maladie, promettant une compréhension plus profonde du fonctionnement du cerveau humain.

Résumé

Les modèles d’organoïdes cérébraux constituent un outil puissant pour étudier le développement et le fonctionnement du cerveau humain. L’imagerie par spectrométrie de masse (MSI), une technologie de pointe, nous permet de cartographier la distribution spatiale de diverses molécules telles que les lipides, les sucres, les acides aminés, les médicaments et leurs métabolites au sein de ces organoïdes, le tout sans avoir besoin de sondes moléculaires spécifiques. Des données MSI de haute qualité reposent sur une préparation méticuleuse des échantillons. Les fixateurs jouent un rôle central, mais les options conventionnelles telles que le glutaraldéhyde, le paraformaldéhyde et la cryoconservation comme le saccharose peuvent avoir un impact par inadvertance sur les métabolites tissulaires. Une fixation optimale implique une congélation instantanée dans de l’azote liquide. Cependant, pour les petits organoïdes, une approche plus appropriée consiste à faire passer les organoïdes directement de l’incubateur à une solution d’enrobage réchauffée, suivie d’une congélation dans de l’éthanol refroidi à la glace sèche. Une autre étape critique est l’enrobage avant la cryosection, qui nécessite également des matériaux compatibles avec les MSI, car les options traditionnelles peuvent interférer avec le dépôt de matrice et l’ionisation. Ici, un protocole optimisé pour la MALDI-MSI à haute résolution des organoïdes du cerveau humain est présenté, englobant la préparation d’échantillons, la coupe et l’imagerie à l’aide de la spectrométrie de masse. Cette méthode met en évidence la distribution moléculaire de petits métabolites, tels que les acides aminés, avec une précision de masse et une sensibilité élevées. En tant que tel, associé à des études complémentaires sur les organoïdes cérébraux, il peut aider à éclairer des processus complexes régissant le développement précoce du cerveau, les trajectoires métaboliques du destin cellulaire et les signatures métabolites distinctives. De plus, il fournit des informations sur les emplacements précis des molécules dans l’organoïde, enrichissant ainsi notre compréhension de l’organisation spatiale des modèles d’organoïdes cérébraux 3D. À mesure que le domaine continue de progresser, un nombre croissant d’études exploitant le MSI pour approfondir les organoïdes cérébraux et les systèmes biologiques complexes sont attendus, approfondissant ainsi la compréhension des aspects métaboliques de la fonction et du développement du cerveau humain.

Introduction

Les modèles organoïdes, dérivés de cellules souches de tissus primaires, de cellules souches embryonnaires ou de cellules souches pluripotentes induites (iPSC)1,2,3 ont fait progresser la recherche en biologie humaine en proposant des modèles tridimensionnels qui imitent étroitement les fonctions spécifiques des organes, aidant à l’étude du développement humain, des mécanismes de la maladie et de la découverte de médicaments 4,5. Dans ce contexte, il est essentiel de démêler les complexités des organoïdes cérébraux pour comprendre le développement physiologique et pathologique du cerveau 6,7, ce qui nécessite des technologies telles que l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI)8,9. La MSI, distincte de la spectrométrie de masse traditionnelle, permet une cartographie directe et sans marquage de centaines à des milliers de biomolécules au sein d’une seule section de tissu, fournissant des informations détaillées sur la distribution spatiale des molécules - comme les lipides, les peptides, les acides aminés, les médicaments et leurs métabolites - sans avoir besoin de sondes moléculaires spécifiques10,11. De plus, les images moléculaires MSI peuvent être co-enregistrées sur des coupes histologiques et immunomarquées, fournissant une vue complète de la morphologie des tissus, de la spécificité cellulaire et du contenu moléculaire.

Le MSI est très prometteur pour la recherche sur les organoïdes, car il offre des informations sur la base moléculaire des maladies, les relations génétiques-phénotypes et les réponses aux stimuli environnementaux 12,13,14,15. Dans l’industrie pharmaceutique, MSI facilite les analyses de l’absorption, de la distribution, du métabolisme et de l’élimination des médicaments dans des modèles précliniques11,16. De plus, il aide à résoudre leurs métabolites bio-transformés, qui peuvent être pharmacologiquement actifs17.

Parmi les méthodes MSI, la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI), l’ionisation par électronébulisation par désorption (DESI) et la spectrométrie de masse d’ions secondaires (SIMS) prédominent 9,18,19,20,21. Parmi ceux-ci, MALDI-MSI se distingue par sa polyvalence, sa large gamme de masses, ses capacités d’analyse directe et sa compatibilité avec divers composés chimiques spécifiques aux tissus22. Cependant, malgré son potentiel, l’application de MALDI-MSI dans la recherche sur les organoïdes cérébraux reste sous-explorée. Pour combler cette lacune, un protocole sur mesure pour l’analyse MALDI-MSI (HR-MALDI-MSI) à haute résolution des organoïdes cérébraux a été introduit afin d’optimiser la préservation des tissus, la sélection de matrices et les conditions d’imagerie, garantissant ainsi une acquisition fiable de données de haute qualité15. Ce protocole détaillé met en évidence les capacités de HR-MALDI-MSI à fournir aux chercheurs l’arsenal supplémentaire nécessaire pour exploiter la puissance de cette technologie afin d’explorer le paysage métabolique des organoïdes avec des détails sans précédent.

Protocole

Le débordement général du protocole est illustré à la figure 1. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation de la section organoïde cérébrale

  1. Préparez des organoïdes cérébraux (d’une taille de 2 à 3 mm lorsqu’ils atteignent 30 à 60 jours de culture) à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) conformément aux rapports précédemment publiés23,24 et collectez-les au moment souhaité à l’aide d’embouts à large diamètre.
    1. Lavez les organoïdes préparés trois fois avec 1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sans CaCl2 et MgCl2 à température ambiante pour rincer le support, puis très rapidement avec de l’eau distillée à température ambiante pour rincer les sels du DPBS.
  2. Préparez 10 % de la solution de gélatine à partir de la peau de poisson froide en remuant et en chauffant la gélatine (10 mg dans 100 mL de DPBS) à 70-80 °C pendant 2 h, puis déplacez la solution dans un incubateur à 37 °C pendant 30 minutes pour éliminer les bulles et équilibrer à la température de l’incubateur où les organoïdes ont été cultivés.
    REMARQUE : Il est recommandé de préparer la gélatine fraîche pour chaque expérience, mais elle peut être utilisée jusqu’à 1 semaine (à conserver à 4 °C) si nécessaire. La gélatine se solidifie à température ambiante et doit être réchauffée avant d’être utilisée comme solution d’enrobage afin de devenir liquide.
  3. Fixez l’organoïde au centre d’un moule en plastique (25 mm x 20 mm x 5 mm) avec la petite pointe de pipette et versez doucement la solution d’enrobage de gélatine à 10 % dans le moule jusqu’à ce que l’organoïde soit complètement immergé (le moule doit être à peu près à moitié rempli).
    1. Placez le moule dans une boîte de Pétri sur de la glace carbonique contenant du 100 % éthanol froid pour le congeler rapidement (1-2 min). Lorsqu’il est complètement congelé, comme en témoigne le changement de couleur en blanc uni, sortez le bloc de gélatine organoïde de la boîte de Pétri, enveloppez-le dans du papier d’aluminium ou placez-le dans une tasse en fer-blanc, scellée pour éviter la concentration d’eau, et conservez-le à -80°C jusqu’au moment de la cryosection.
  4. Pour la cryosection, placez les blocs de plastique contenant des organoïdes dans la chambre cryogénique à -20 °C à -25 °C pendant 10-15 min pour équilibrer avec la température de la chambre. Sectionner les organoïdes en sections de 14 μm à l’aide d’un cryotome et d’un montage au dégel sur des lames de verre recouvertes d’oxyde d’indium et d’étain (lames ITO) pour MSI.
  5. Soit on scanne immédiatement des coupes structurellement uniformes dans le spectromètre de masse, soit on les scelle dans le conteneur et on les stocke à -80 °C pour des études ultérieures.

2. Préparation et application de la matrice pour MALDI-MSI

  1. Pour MALDI-MSI, vaporisez les lames et enduisez les sections de tissu avec la matrice, un composé organique qui aide à ioniser différents métabolites25. Différentes matrices sont utilisées pour imager différentes espèces de molécules ; Par conséquent, il faut d’abord choisir la matrice la plus appropriée pour l’étude.
    REMARQUE : Cette étude s’est concentrée sur la localisation et la distribution de petits métabolites et d’acides aminés liés aux voies métaboliques mitochondriales, et la matrice a été choisie en conséquence (pour cartographier les lipides, veuillez consulter Cappuccio et al.)15. Traduction
  2. Tout d’abord, après avoir retiré les lames ITO à partir de -80 °C, placez immédiatement la lame dans un dessiccateur pendant 20 minutes pour minimiser la condensation de l’eau atmosphérique sur les surfaces.
  3. Préparez le dichlorhydrate de N-(1-naphtyl)éthylènediamine (NEDC), qui est une matrice appropriée pour les petits métabolites car il donne un signal fort de l’analyte d’intérêt sans interférer avec les signaux de fond inférieurs au m/z de 500 Da26. Pulvériser une solution NEDC de 10 mg/mL dans du méthanol à 70 % sur les sections organoïdes après dessiccation sur lame à l’aide d’un pulvérisateur pneumatique chauffé.
  4. Réglez les paramètres du pulvérisateur matriciel comme suit : température de la buse = 75 °C, vitesse de la buse = 1 250 mm/min, débit de la pompe = 100 μL/min, nombre de passages = 8, espacement des chenilles = 2,5 mm, débit de gaz 3 L/min, temps de séchage = 10 s et pression d’azote gazeux de 10 psi.

3. Instrumentation MALDI-MSI

  1. Pour obtenir une plate-forme MALDI-MSI à haute résolution pour visualiser les métabolites organoïdes cérébraux, montez une source d’ions MALDI avec une interface d’entonnoir à deux ions sur un spectromètre de masse.
  2. Utilisez un laser Nd connecté à commutation Q, à fréquence triplée, avec une longueur d’onde de 349 nm, un taux de répétition de 1 kHz et une énergie d’impulsion d’environ 1,3 à 1,4 μJ.
  3. Pour éviter le suréchantillonnage, focalisez le laser sur une taille de spot de ~15 μm de diamètre.
  4. Fixez l’échantillon à l’étage d’injection MALDI. Faites fonctionner et entretenez l’entonnoir ionique haute pression à 7,4-7,5 Torr, et maintenez l’entonnoir ionique basse pression à 1,6-1,8 Torr.
  5. Appliquez des tensions de fréquence radio de 604 kHz, 80 V0-crête et 780 kHz, 191 V0-crête aux entonnoirs d’ions haute et basse pression, respectivement.
  6. Pour améliorer la sensibilité des petits métabolites dans la gamme des faibles masses, réduire les amplitudes RF dans l’entonnoir basse et haute pression de la source MALDI-MSI à environ 20 % et 15 %, respectivement.
  7. Réglez la résolution de masse sur 70 000. Sélectionnez la zone et la taille de pixel (25 μm/pixel) à mesurer dans le logiciel d’injection MALDI.

4. Acquisition et analyse de données MALDI-MSI

  1. Acquisition de données dans la plage m/z de 80 à 900 en modes ions négatifs et positifs. Numérisez les échantillons avec une résolution latérale de 25 μm par pixel pour des coupes organoïdes de 14 μm.
  2. Réglez le temps d’injection d’ions sur le spectromètre de masse à 250 ms et acquérez des spectres de masse à transformée de Fourier (FTMS) en mode profil pendant que le contrôle automatique du gain (AGC) est désactivé26.
  3. Utilisez les pics de matrice NEDC comme étalonnage de masse interne en ligne, ce qui permet d’obtenir une précision de masse supérieure à ±5 ppm.
  4. Utilisez un logiciel compatible pour traiter les données. Importez les données spectrales MSI directement dans le logiciel, puis effectuez une correction de base à l’aide d’un algorithme de convolution et normalisez les données à l’aide du nombre total d’ions (TIC).
  5. Générez la liste des caractéristiques des images ioniques à partir des fichiers de données brutes en utilisant une largeur de bac de Δm/z = 0,01 ou ±5 ppm pour distinguer les images m/z en fonction du défaut de masse et de la couverture de pixels.
  6. Générez des images en fausses couleurs (Jet) ou RVB (rouge-vert et bleu) à partir d’espèces d’ions métabolites individuelles. Téléverser la liste m/z des fichiers de données brutes obtenus à partir de MALDI-MSI dans la base de données sur les métabolomes humains (HMDB) (tolérance de masse <5 ppm par rapport au m/z théorique) pour identifier les métabolites.
    REMARQUE : La masse exacte, la formule prédite et la structure du métabolite obtenues à partir des données LC-MS/MS sont également utilisées pour interroger les bases de données métabolomiques (p. ex., HMDB, Metlin) pour la comparaison et l’identification des métabolites.

Résultats

Voici un protocole qui optimise l’imagerie moléculaire (métabolique) à l’aide de MSI (Figure 1, voir aussi Cappuccio et al.)15. Les données les plus fiables et la préservation de la morphologie des tissus ont été obtenues avec 10 % de gélatine provenant de peau de poisson froide, comme le confirme la coloration histologique des coupes en série. À l’aide d’organoïdes cérébraux humains de 60 jours incorporés dans de la gélatine de poisson, les métabolites liés au cycle de Krebs ont été cartographiés à l’aide de MSI, démontrant leur distribution spatiale (figure 2).

Dans l’ensemble, le protocole optimisé a toujours donné des résultats robustes, avec 10 % de gélatine provenant de peau de poisson froide comme matériau d’enrobage privilégié et des paramètres de pulvérisation de matrice NEDC affinés pour améliorer la résolution de l’image. Les petits métabolites détectés dans les organoïdes cérébraux fournissent des informations précieuses sur les complexités moléculaires de ce tissu.

figure-results-1
Figure 1 : Pipeline général de l’étude du métabolome organoïde du cerveau humain. Des organoïdes dérivés des fibroblastes d’un individu via des cellules souches pluripotentes induites sont utilisés pour la LC-MS et la MSI afin de mettre en évidence la distribution spatiale des métabolites. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Cartographie des métabolites liés au cycle de Krebs. Identification et distribution des métabolites liés au cycle de Krebs à l’aide d’organoïdes de 60 jours dérivés de témoins sains à l’aide de MSI. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine est illustrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole affiné pour le MALDI-MSI haute résolution des organoïdes du cerveau humain aborde méticuleusement les étapes cruciales pour garantir la fiabilité des résultats. La préservation des échantillons apparaît comme primordiale et, pour éviter la fissuration et les dommages aux tissus, une méthode de congélation alternative est proposée impliquant une solution d’enrobage réchauffée et de l’éthanol refroidi à la glace sèche. Ce protocole fonctionne mieux pour les tissus de taille minuscule, tels que les organoïdes du cerveau humain15. L’incorporation de matériaux tels que le composé à température de coupe optimale (OCT) et l’incorporation de paraffine fixée au formol (FFPE) est déconseillée en raison de leur interférence avec le dépôt de matrice et l’ionisation. Au lieu de cela, la gélatine à 10 % de la peau de poisson froide est mise en évidence comme la solution d’enrobage optimale, démontrant son efficacité à préserver l’intégrité des tissus lors de lacryo-sectionnement 15. De plus, le choix de la matrice et de ses techniques de dépôt, telles que la pulvérisation à sec, est impératif pour minimiser la délocalisation des petits métabolites à faible m/z et améliorer la résolution de l’image.

La robustesse et la fiabilité du protocole sont étayées par la détection et la visualisation réussies d’un large éventail de molécules dans les organoïdes du cerveau humain15, ce qui permet d’obtenir des informations inestimables sur leur distribution spatiale et leur signification biologique potentielle. Ces résultats augmentent considérablement la compréhension du paysage moléculaire complexe au sein des organoïdes cérébraux, élucidant les voies de signalisation essentielles et les processus métaboliques qui sous-tendent le développement et le fonctionnement du cerveau.

Bien que les données actuelles fournissent de nouvelles informations sur la localisation de diverses espèces, la source d’imagerie Spectroglyph MALDI utilisée dans cette étude n’a pas encore atteint la résolution au niveau de la cellule unique (actuellement à ~10-20 μm). D’autres plateformes, telles que timsTOF de Bruker et MRT de Water, peuvent fournir une résolution de cellule unique à 5 μm, et il est donc important de garder à l’esprit l’instrument à utiliser pour l’expérimentation.

Malgré ces contraintes, la technologie HR-MALDI-MSI à haute résolution des organoïdes cérébraux est très prometteuse. La capacité de cartographier la distribution des métabolites et des lipides dans les organoïdes offre un point unique sur les trajectoires métaboliques des cellules, les voies et les signatures distinctes cruciales pour le développement et la maturation des organoïdes. Cette méthodologie sert de pont entre l’histologie conventionnelle et l’analyse moléculaire, facilitant une compréhension plus profonde des interconnexions entre le génome, le phénomène et les réponses environnementales.

En résumé, le protocole optimisé pour HR-MALDI-MSI des organoïdes cérébraux humains constitue un atout précieux pour les chercheurs explorant des modèles d’organoïdes. Cette méthode jette les bases d’une élucidation plus poussée des subtilités moléculaires qui sous-tendent le développement et le fonctionnement du cerveau en abordant méticuleusement les étapes critiques, le dépannage et la reconnaissance des limites. À mesure que la technologie MSI évolue et devient de plus en plus accessible, elle est sur le point de faire progresser notre compréhension du développement humain précoce, de la modélisation des maladies et de la découverte de médicaments.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Maletic-Savatic, en particulier Danielle Mendonca, une étudiante diplômée, pour les discussions et les commentaires utiles sur ce travail, ainsi que le soutien du Baylor College of Medicine Advanced Technology Core de la RMN et du Drug Metabolism Core. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’Institut national de la santé mentale (1R01MH130356 à M.M.S.), de l’Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain (R61/R33HD099995 à F. L.), de l’Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain des Instituts nationaux de la santé (P50HD103555) pour l’utilisation de la plateforme de microscopie. la plateforme de pathologie et la plateforme de modèles cellulaires de maladies humaines. De plus, ce travail a été financé en partie par des fonds fédéraux de l’Institut de recherche translationnelle pour la santé spatiale par le biais de l’accord de coopération NNX16AO69A de la NASA, de la subvention RAD01013 (M.M.S), de la NASA dans le cadre du contrat 80ARC023CA004 intitulé « MORPH : Multi-Organ Repair Post Hypoxia » (M.M.S.) ainsi que d’Autism Speaks (G.C), du Simons Foundation Pilot Award (M.M.S.) et de Cynthia et Antony Petrello
Fonds de dotation (M.M.S).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphtyl-éthylènediamine dichlorhydrateSigma-Aldrich (St. Louis, MIA)1052707-27-3Substance matricielle pour MALDI-MS, &ge ; 99,0 % (HPLC)
1& fois ; Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)Life Technologies, USA14190-144Sans CaCl2 et MgCl2
ART Embouts de pipette filtrés à large alésageThermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis2069GRéduire la contamination potentielle
CryomoulesTissue-Tek25608-916Moule standard avec surface plane  ;
EntellanFisher ScientificM1079610500Plaques de protection
Eosin YFisher Scientific (Waltham, MA, USA)E511-25Coloration biologique certifiée
Gélatine de poissonSigma-Aldrich (St. Louis, MIA)G7041Forme de poudre de peau de poisson d’eau froide
HématoxylineFisher Scientific (Waltham, MA, USA)517-28-2Coloration biologique certifiée Pression élevée source d’imagerie avec
pulvérisateur HTX M5+HTX Technologies LLC, Carrboro, États-UnisPulvérisateur matriciel
Indium étainHudson Surface Technology,PL-IF-000010-P25Fournir une surface conductrice pour l’imagerie MALDI
Source d’ions MALDISpectroglyph LLC, États-UnisInterface d’entonnoir à deux ions
MéthanolFisher Scientific (Waltham, MA, États-Unis)67-56-1HPLC oxyde de qualité
(ITO) conducteur&ndash ; lames revêtues  ;   ;New York, États-Unis
Gélatine porcineSigma-Aldrich (St. Louis, MIA)G1890Forme de poudre de peau porcine
Spectromètre de masse Q-Exactive ThermoFisher Scientific, Massachusetts, États-UnisSpectrométrie de masse haute résolution
SCiLS Logiciel de laboratoire  ; version 2024a Pro  ;pour le traitement des données  ;
WaterFisher Scientific (Waltham, MA, États-Unis)Grade
(Waltham, MA, États-Unis)
HPLC W6500

Références

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