Article de méthode

Immunodosage fluorescent à flux latéral basé sur des nanobilles de points quantiques

DOI :

10.3791/67000

⸱

28 juin 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shanghai Skin Disease Hospital, School of Medicine, Tongji University, 2Department of Dermatology, Shanghai Skin Disease Hospital, Institute of Dermatology, School of Medicine, Tongji University, 3Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Naval Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de nanobilles de points quantiques (QDNB) et la détection de biomarqueurs de maladies à l’aide de bandelettes d’immunodosage à flux latéral basées sur QDNB. Les résultats des tests peuvent être évalués qualitativement sous un éclairage à la lumière UV et mesurés quantitativement à l’aide d’un lecteur de bande fluorescente dans les 15 minutes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les points quantiques, également connus sous le nom de nanocristaux semi-conducteurs, sont de nouveaux marqueurs fluorescents pour l’imagerie et la détection biologiques. Cependant, les conjugués d’anticorps à points quantiques de petites dimensions (~10 nm), préparés par des procédures de purification laborieuses, présentent une sensibilité limitée dans la détection de certains marqueurs de maladies à l’état de traces à l’aide de bandelettes d’immunodosage à flux latéral. Ici, nous présentons une méthode de préparation de nanobilles de points quantiques (QDNB) à l’aide d’une méthode d’évaporation d’émulsion en une étape. À l’aide du QDNB tel que préparé, un test immunologique fluorescent à flux latéral a été fabriqué pour détecter les biomarqueurs de la maladie en utilisant la protéine C-réactive (CRP) à titre d’exemple. Contrairement aux nanoparticules à point quantique unique, les conjugués nanobilles-anticorps sont plus sensibles en tant que marqueurs d’immunodosage en raison de l’amplification du signal en encapsulant des centaines de points quantiques dans une nanobille composite polymère. De plus, la plus grande taille des QDNB facilite la séparation par centrifugation lors de la conjugaison des QDNB avec des anticorps. L’immunodosage fluorescent à flux latéral basé sur les QDNB a été fabriqué, et la concentration de CRP dans l’échantillon a été mesurée en 15 min. Les résultats des tests peuvent être évalués qualitativement sous un éclairage à la lumière UV et mesurés quantitativement à l’aide d’un lecteur fluorescent dans les 15 minutes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les bandelettes d’immunodosage à flux latéral (LFIA) constituent des outils de détection rapide essentiels au point de service 1,2, en particulier dans le dépistage des maladies pendant les épidémies. Cependant, les bandelettes de test LFIA traditionnelles à base d’or colloïdal présentent une faible sensibilité de détection et ne fournissent que des résultats qualitatifs3. Pour améliorer la sensibilité de détection du LFIA, diverses nouvelles nanoparticules ont émergé, notamment du latex coloré 4,5, des nanoparticules fluorescentesà conversion ascendante 6, des microsphères fluorescentes résolues en temps 7,8 et des points quantiques 9,10,11. Les points quantiques (QD)12,13, également connus sous le nom de nanocristaux semi-conducteurs, offrent des longueurs d’onde d’émission accordables, une large plage d’excitation et une efficacité de luminescence élevée, ce qui en fait des marqueurs idéaux pour l’imagerie biologique.

Cependant, le signal de fluorescence émis par les points quantiques individuels reste faible, ce qui entraîne une sensibilité de détection relativement faible dans les immunoessais. L’encapsulation de nombreux points quantiques dans des microsphères peut amplifier les signaux et améliorer la sensibilité des immunoessais basés sur les points quantiques. Diverses méthodes, telles que l’auto-assemblage couche par couche 14,15,16,17,18, la méthode de gonflement19,20 et l’encapsulation de microsphères de silice 21,22,23,24, ont été utilisées pour encapsuler des points quantiques à l’intérieur de microsphères. Par exemple, il est possible d’obtenir des marquages de nanosphères de silice fonctionnalisés par des points quantiques en augmentant la charge QD par immunoréaction prise en sandwich25. Un sécheur par atomisation équipé d’un atomiseur à ultrasons a également été utilisé pour préparer des nanosphères QD-BSA26 à l’échelle nanométrique. Cependant, les méthodes susmentionnées souffrent de plusieurs étapes complexes, d’une extinction par fluorescence et d’une faible productivité.

Dans nos travaux précédents27, une méthode d’évaporation émulsion-solvant pour encapsuler des points quantiques à l’intérieur de nanobilles de polymère a été rapportée. Cette technique de préparation est simple, maintient l’efficacité fluorescente des QD, assure une efficacité d’encapsulation élevée et permet une production facile et évolutive. Plusieurs groupes de recherche ont réussi à mettre au point des bandelettes LFIA à l’aide de QDNB préparés par cette méthode pour des applications, notamment la détection des toxines alimentaires 28,29,30, la détection des biomarqueurs de maladies infectieuses 31,32 et la surveillance environnementale33.

Ce protocole présente des étapes spécifiques de préparation pour la conjugaison des nanobilles de points quantiques (QDNB), des QDNB et des anticorps, la préparation de LFIA à base de QDNB et la mesure de la protéine C-réactive (CRP) dans des échantillons de plasma humain.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude a été approuvée par le Conseil d’examen institutionnel de l’hôpital des maladies de la peau de Shanghai (n° 2020-15). Toutes les procédures expérimentales impliquant des échantillons de sang humain ont été menées dans un laboratoire de niveau de biosécurité II. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des nanobilles de QDs

REMARQUE : Pour la synthèse de nanobilles QD, une technique d’évaporation émulsion-solvant a été utilisée pour synthétiser des nanobilles QD, avec un rapport entre la phase huileuse et la phase aqueuse de 1:5. La mini-émulsion est générée par ultrasonication, et les nanobilles sont solidifiées par évaporation par solvant (chloroforme). L’hydroxyde de sodium a été utilisé pour catalyser l’hydrolyse des groupes anhydrides à la surface des nanobilles, les convertissant en groupes carboxyles.

  1. Préparation des solutions en phase huileuse et en phase aqueuse
    1. Préparez 1 mL de phase huileuse : 0,4 mL de solution de poly (styrène-co-anhydride maléique) (PSMA) (50 mg/mL), 0,1 mL de solution de QDs (100 mg/mL), remplissez tout volume inférieur à 1 mL de chloroforme.
    2. Préparer 5 mL de solution aqueuse en phase aqueuse : SDS (0,5 % en poids).
  2. Préparation de l’émulsion et de la solidification
    1. Ajouter 1 mL de phase huileuse et 5 mL de phase aqueuse dans un flacon (15 mL) et placer le flacon sur un agitateur magnétique. Allumez l’agitateur magnétique.
    2. Une fois que les phases huileuse et aqueuse sont complètement mélangées, transférez immédiatement le ballon à l’ultrasonication programmée (60 s, une impulsion de 3 s suivie d’une pause de 3 s, amplitude de 50 %) et mettez l’appareil sous tension.
    3. Observez la solution après l’échographie. La solution initialement de couleur cramoisi est passée à une phase opalescente qui conserve encore une nuance rougeâtre.
    4. Replacez le flacon sur l’agitateur magnétique à température ambiante, en remuant continuellement pendant la nuit. Le chloroforme s’est progressivement évaporé et l’émulsion s’est solidifiée en nanobilles composites.
  3. Modification de surface des nanobilles
    1. Ajouter 0,1 mL d’hydroxyde de sodium 0,1 mM à la suspension de nanobilles pendant 1 h. Les groupes anhydrides à la surface des nanobilles sont hydrolysés en groupes carboxyles.
  4. Purification de nanobilles
    1. Éteignez l’agitateur magnétique et déplacez les nanobilles solidifiées dans un tube à centrifuger. Centrifugez le tube à 13523 x g pendant 10 min à température ambiante et jetez le surnageant.
    2. Ajoutez le volume initial d’eau déminéralisée à la précipitation, couvrez le tube avec son couvercle, immergez-le dans le bain d’eau à ultrasons et maintenez l’immersion jusqu’à ce que le précipité soit complètement dispersé.
    3. Répétez les étapes 1.4.1-1.4.2 deux fois, et enfin, transférez les nanobilles dans la bouteille en verre. Conservez-le à 4 °C jusqu’à utilisation.
  5. Caractérisation des nanobilles
    1. Caractériser la taille et la morphologie des nanobilles de QDs à l’aide de l’imagerie par microscopie électronique en transmission (MET)22.
      REMARQUE : Différentes tailles de nanobilles peuvent être obtenues en modifiant la proportion de solution de QDs et de solution PSMA. La taille des nanobilles QDs peut également être déterminée par diffusion dynamique de la lumière (DLS)27.

2. Préparation des conjugués d’anticorps QDNB

  1. Activation des groupes carboxyle
    1. Ajouter 100 μL de QDNB préparé (10 mg/mL) dans 200 μL de tampon phosphate (PB, 20 mM, pH 6,0), puis ajouter 6 μL d’EDC (20 mg/mL).
    2. Incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante sur un mélangeur rotatif.
    3. Après l’incubation, centrifugez le mélange à 13523 x g pendant 10 min à température ambiante et jetez le surnageant.
    4. Ajouter 100 μL de PB (20 mM, pH 6,0) à la précipitation, couvrir le tube avec son couvercle et immerger le tube dans le bain-marie à ultrasons opérationnel jusqu’à ce que le précipité soit complètement dispersé.
  2. Conjugaison d’anticorps et de nanobilles
    1. Dispersez 100 μg d’anticorps dans 200 μL de PB (20 mM, pH 6,0) et ajoutez la suspension QDNB activée obtenue à l’étape 2.1 dans la solution d’anticorps.
    2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min avec une rotation continue. Éliminer l’excès d’anticorps par centrifugation à 6010 x g pendant 5 min (à température ambiante), puis jeter soigneusement le surnageant.
  3. Blocage des nanobilles
    1. Ajouter 200 μL de solution de caséine à 1 % (dans un tampon PB de 20 mM, pH 7,4) au résidu (obtenu à l’étape 2.2.2), couvrir le tube avec son couvercle et l’immerger dans le bain-marie à ultrasons opérationnel jusqu’à ce que le résidu soit complètement dispersé.
    2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 2 h avec une rotation continue.
      REMARQUE : L’objectif de cette étape est de bloquer tout site n’ayant pas réagi à la surface du QDNB.
  4. Stockage des conjugués
    1. Ajouter 100 μL de solution de préservation (tampon PB 20 mM, pH 7,4, 1 % BSA, 5 % de tréhalose, 6 % de saccharose, 0,1 % S9, pH 7,4) au mélange et conserver à 4 °C pour une utilisation ultérieure.

3. Préparation de bandelettes d’immunodosage à flux latéral

REMARQUE : La bandelette immunochromatographique est composée d’une membrane de nitrocellulose (NC), d’un tampon d’échantillon, d’un tampon conjugué, d’un tampon absorbant et d’un panneau de polychlorure de vinyle (PVC) (Figure 1). Toutes les solutions doivent être préparées et utilisées immédiatement. Il est recommandé de préparer les bandelettes d’immunodosage à flux latéral dans une salle blanche à humidité contrôlée.

  1. Préparation de la membrane NC
    1. Préparer la solution d’enrobage de la ligne d’essai (ligne T) et de la ligne témoin (ligne C) : diluer l’anticorps de capture de la CRP et les IgG anti-lapin de chèvre avec du PB à une concentration finale de 1 mg/mL.
    2. Placez correctement le panneau PVC et retirez le papier de protection situé à 25 mm du bord du panneau PVC. Alignez et collez la membrane NC le long du bord inférieur du papier de protection restant sur le panneau PVC.
    3. Distribuez les solutions de revêtement T-line et C-line sur la membrane CN à une vitesse de jet de 1 μL/cm, en veillant à ce qu’elle soit placée à 20 mm du bord supérieur, formant une ligne d’essai (1 mm de large).
    4. Placez la membrane NC dans des conditions avec une humidité inférieure à 30 % et une plage de température de 18 à 26 °C pour le séchage. Le temps de séchage doit être d’au moins 24 h.
      REMARQUE : Assurez-vous que les bords supérieur et inférieur de la membrane NC affleurent les bords correspondants des zones adjacentes. Les membranes NC ne doivent pas être touchées avec les mains. L’humidité au cours de cette étape doit être contrôlée dans une plage de 45 % à 65 %. Avant de continuer, la solution de revêtement de la ligne T, la solution de revêtement de la ligne C et la membrane NC doivent être équilibrées à la même température.
  2. Préparation du tampon conjugué
    1. Immergez le tampon conjugué dans la solution de traitement du tampon conjugué (tampon PB 20 mM, pH 7,4, 1 % BSA).
    2. Placez le tampon conjugué trempé dans une étuve de séchage pour le traitement de séchage (température ambiante) pendant la nuit.
    3. Collez délicatement le tampon conjugué modifié sur le panneau de PVC.
    4. Diluer la solution préparée de conjugué d’anticorps QDNB avec la solution de conservation (tampon PB 20 mM, pH 7,4, 1 % BSA, 5 % de tréhalose, 6 % de saccharose, 0,1 % S9, pH 7,4).
    5. Verser la solution conjuguée d’anticorps QDNB sur le tampon conjugué à une vitesse de jet de 1 μL/cm et sécher le tampon conjugué pendant 24 h.
      REMARQUE : Le taux de dilution spécifique doit être ajusté en fonction de la cible de détection.
  3. Préparation du tampon d’échantillonnage
    1. Immergez le tampon d’échantillonnage dans la solution de traitement du tampon d’échantillon (tampon PB 20 mM, pH 7,4, 1 % BSA, 5 % tréhalose, 6 % saccharose, 0,1 % S9, pH 7,4).
    2. Placez le tampon d’échantillon trempé dans une étuve de séchage (45 °C) et séchez-le pendant 24 h.
  4. Assemblage de la carte et découpe en bandes
    1. Comme le montre la figure 1, placez successivement le papier absorbant (tampon absorbant), le tampon conjugué et le tampon d’échantillon sur le panneau PVC avec membrane CN.
    2. Coupez la carte en bandes de 3,8 mm de large.
  5. Emballage des bandes
    1. Enfermez les bandelettes de test dans une cassette en plastique et scellez un sachet en papier d’aluminium contenant un déshydratant.

4. Opération de dosage et évaluation qualitative

REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer les opérations impliquant des échantillons de sang humain dans un laboratoire de niveau de biosécurité II. Les échantillons de plasma humain ont été prélevés dans un laboratoire clinique (sur des sujets humains anonymisés). En règle générale, le sang humain a été prélevé à l’aide d’un tube à vide EDTA, et le plasma a été isolé selon le protocole standard34. Centrifugeuse à 3 000 × g pendant 10 min à température ambiante pour la séparation du plasma. Prélever la couche supérieure de plasma jaune à l’aide d’une pipette et stocker le plasma dans un tube de 1,5 ml à -80 °C jusqu’à utilisation.

  1. Pipeter 10 μL d’échantillon de plasma ou de solution d’étalonnage dans 1 mL d’un tampon PBS contenant 0,1 % de Tween 20. Ensuite, transférez 100 μL de l’échantillon dilué préparé sur le tampon d’échantillonnage de la bandelette de test.
  2. Après une course de 15 minutes, observez les signaux de fluorescence de la ligne T et de la ligne C sous exposition à la lumière ultraviolette pour obtenir des résultats qualitatifs.
  3. Insérez la carte de bandelette dans un lecteur de test à flux latéral fluorescent pour obtenir les intensités de fluorescence pour l’analyse quantitative.
    REMARQUE : Dans cet exemple, la méthode d’immunodosage sandwich est utilisée35,36 ; Une ligne rouge (ligne de contrôle) indique un résultat négatif, tandis que les deux lignes rouges (lignes de test et de contrôle) indiquent un résultat positif. L’absence de la ligne de contrôle indique que l’essai effectué n’est pas valide.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les procédures de préparation du QDNB sont illustrées schématiquement à la figure 1A. La phase huileuse contenant des QD et un polymère sous chloroforme a été mélangée à la phase aqueuse, et une mini-émulsion a été obtenue par sonication. L’émulsion a été solidifiée par évaporation progressive du chloroforme. La micrographie électronique à transmission (MET) de QDNB est présentée à la figure 2A. Les QDNB ont une morphologie sphérique, avec des diamètres moyens de 96 nm, mesurés sur 50 QDNB dans les images TEM. Des nanoparticules QD sont clairement observées à l’intérieur des nanobilles, ce qui indique une encapsulation réussie. La figure 2B et la figure 2D montrent respectivement les spectres de fluorescence et d’absorption de QDNB.

Le QDNB et l’anticorps ont été conjugués à l’aide de la chimie des carbodiimides, comme le montre la figure 1B. Le conjugué d’anticorps QDNB a été utilisé pour préparer l’AIFA à base de QDNB. La structure de l’AFFI est illustrée à la figure 1C. Si l’antigène CRP est présent dans l’échantillon, les conjugués QDNB-anti-CRP s’accumulent sur la ligne de test.

Comme le montre la figure 3, la mesure est effectuée en ajoutant 100 μL d’échantillon dilué dans le trou d’échantillon. Après un temps de réaction de 15 min, les résultats du test peuvent être lus qualitativement sous un éclairage à la lumière UV. Les résultats quantitatifs peuvent être obtenus à l’aide d’un lecteur de bandes fluorescentes, et la concentration de l’échantillon peut être calculée à l’aide d’une équation d’étalonnage intégrée dans le logiciel du lecteur de bandes37,38.

figure-results-1
Figure 1 : Illustration de l’immunodosage fluorescent à flux latéral basé sur des nanobilles de points quantiques. (A) Procédures de préparation du QDNB. (B) Principe des conjugués d’anticorps QDNB. (C) Principe de la LFIA basée sur QDNB pour la détection de la CRP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Caractérisation des QDNB. (A) Image TEM des QDNB. Barre d’échelle : 100 nm. (B) Spectres d’émission fluorescente de QDNB. (C) Spectres d’absorption de QDNB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Procédures d’immunodosage à flux latéral pour la CRP. (A) Illustration de la détection. (B) Photographies de bandelettes LFIA basées sur le QDNB détectant des échantillons de CRP dans une gamme de 0 à 30 mg/L sous lumière UV. (C) Lecteur fluorescent pour la quantification des résultats. (D) Photographie des résultats quantitatifs. (E) Détection de la protéine C-réactive (CRP) à l’aide d’une transformation logistique suivie d’une régression linéaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de nanobilles de points quantiques (QDNB)27 et l’utilisation de QDNB pour la préparation d’immunoessais fluorescents à flux latéral (LFIA). La mesure qualitative et quantitative de la CRP dans les échantillons est démontrée. Cette LFIA basée sur QDNB peut également être appliquée à d’autres biomarqueurs de maladies25,32, toxines alimentaires29,30, virus16,27, etc.

Les étapes critiques de ce protocole sont la préparation du QDNB et des conjugués d’anticorps QDNB. La taille des particules de QDNB et la teneur en QD des nanobilles doivent être optimisées pour obtenir des QDNB hautement fluorescents avec de faibles signaux de fond dans le LFIA. Les paires d’anticorps de capture et de détection sont essentielles pour l’immunodosage et doivent être examinées par divers fournisseurs pour trouver les meilleures correspondances. La conjugaison de l’anticorps avec le QDNB doit être optimisée, y compris le rapport anticorps/QDNB, le pH tampon et les réactifs bloquants. Plus précisément, l’agrégation des QDNB et des anticorps doit être évitée en optimisant le pH du tampon, la concentration en sel et le temps de réaction dans les procédures de conjugaison.

Comparé à d’autres méthodes de préparation pour les nanobilles de points quantiques, ce protocole présente les avantages de la simplicité, de la facilité d’utilisation et de la productivité élevée. De plus, les nanobilles composites polymères sont biocompatibles, contrairement aux nanobilles de silice, qui nécessitent généralement une modification de surface supplémentaire avec des polymères. Cependant, les QDNB préparés à l’aide de ce protocole ne sont pas aussi monodispersés que ceux préparés à l’aide de nanobilles de matrice de polymère19 ou de silice21 . La taille des particules des QDNB varie généralement de 70 nm à 200 nm.

Les bandelettes d’immunodosage à flux latéral (LFIA) basées sur QDNB sont préparées de la même manière que les autres LFIA fluorescentes. En raison des rendements quantiques élevés des QD et de l’amplification du signal des QDNB, le LFIA basé sur QDNB utilisant ce protocole est plus sensible que les autres LFIA basés sur des microsphères fluorescentes, tels que les microsphères fluorescentes résolues dans le temps et les microsphères de fluorescéine. De plus, la stabilité de la QDNB est supérieure à celle de la fluorescéine traditionnelle, ce qui permet aux LFIA à base de QDNB d’avoir une durée de stockage plus longue.

Cependant, le cadmium à la surface des points quantiques est sujet à la chélation avec les groupes sulfhydryles dans les protéines, en particulier dans les environnements aqueux. Il est essentiel d’éviter l’utilisation de fortes concentrations de protéines pour la stabilité des LFIA à base de QDNB. Le cadmium est toxique et son utilisation est limitée dans certaines situations, ce qui nécessite la préparation de points quantiques sans cadmium avec des rendements quantiques et une stabilité élevés.

En résumé, une méthode polyvalente pour préparer des nanobilles de points quantiques en une seule étape est fournie, et elle est évolutive pour la production industrielle. À l’aide des QDNB préparés, des bandelettes d’immunodosage fluorescentes à flux latéral ont été créées pour la détection qualitative et quantitative des biomarqueurs de la maladie. Le QDNB idéal pour le LFIA est une nanobille de petite taille encapsulée avec de nombreux QD sans extinction par fluorescence.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pengfei Zhang est l’un des fondateurs de Shanghai Kundao Biotech et a des intérêts financiers potentiels dans cette société.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le Projet du Comité des sciences et de la technologie de Shanghai (STCSM) (22S31902000) et le Programme d’incubation de la recherche clinique de l’Hôpital des maladies de la peau de Shanghai (NO. lcfy2021-10).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
chlorhydrate de (diméthylamino)-N'-éthylcarbodiimideSigma-Aldrich03450
Papier absorbant  ;Kinbio BiotechCH37K
Albumine sérique bovineSigma-AldrichB2064
CaséineSigma-AldrichC8654
CdSe/ZnS quantum dotSuzhou Mesolight Inc.CdSe/ZnS-625
CholoroformeSino Pharm10006818
Anticorps CRPHytest Biotech4C28
Lecteur de test fluorescent à flux latéralSuzhou Helmence Instrument de précisionFIC-H1
Tampon en fibre de verreKinbio BiotechSB06
Chèvre anti-lapin IgG SangonBiotechD111018
Membrane nitrocellulosique  ;Copolymère satoriousCN140
poly(styrène-anhydride maléique)  ;Sigma-AldrichS458066
Rabbit IgGSangon BiotechD110502
Dodécylsulfate de sodiumSino Pharm30166428
Hydroxyde de sodiumSino Pharm10019718

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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