Progrès de la technologie des organoïdes bovins utilisant des interfaces monocouches de l’intestin grêle et du gros intestin

Résumé

Cette étude présente un protocole de génération de monocouches intestinales bovines 2D à partir d’organoïdes, offrant un meilleur accès pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Il comprend des méthodes d’évaluation de l’intégrité et de la fonctionnalité des membranes, faisant progresser des modèles in vitro qui imitent la physiologie gastro-intestinale des bovins. Cette approche promet d’importants avantages biomédicaux et agricoles, notamment des stratégies de traitement améliorées.

Résumé

L’avancement des connaissances sur la physiologie gastro-intestinale et ses maladies dépend de manière critique de la mise au point de modèles in vitro précis, spécifiques à l’espèce, qui imitent fidèlement les tissus intestinaux in vivo . Cela est particulièrement essentiel pour étudier les interactions hôte-pathogène chez les bovins, qui sont des réservoirs importants d’agents pathogènes qui présentent de graves risques pour la santé publique. Les organoïdes 3D traditionnels offrent un accès limité à la surface apicale de l’épithélium intestinal, un obstacle surmonté par l’avènement des cultures monocouches 2D. Ces cultures, dérivées de cellules organoïdes, fournissent une surface luminale exposée pour une étude plus accessible. Dans cette recherche, un protocole détaillé est introduit pour la création et le maintien de cultures monocouches 2D à partir de cellules d’organoïdes intestinaux inférieurs et géniaux bovins. Cette méthode comprend des protocoles d’évaluation de l’intégrité de la membrane par résistance électrique transépithéliale et perméabilité paracellulaire, ainsi que des techniques de coloration immunocytochimique. Ces protocoles jettent les bases de l’établissement et de la caractérisation d’un système de culture monocouche bovine en 2D, repoussant les limites de ces applications méthodologiques dans la recherche biomédicale et translationnelle d’importance pour la santé publique. L’utilisation de cette approche novatrice permet de développer des modèles in vitro physiologiquement pertinents pour explorer les états normaux et pathologiques de la physiologie intestinale des bovins. Les implications pour les progrès biomédicaux et agricoles sont profondes, ouvrant la voie à des traitements plus efficaces pour les affections intestinales chez les bovins, améliorant ainsi à la fois le bien-être des animaux et la sécurité alimentaire.

Introduction

La culture de cellules souches épithéliales intestinales dans des cultures tridimensionnelles (3D), connues sous le nom d’organoïdes intestinaux, marque une avancée significative dans la technologie in vitro pour l’étude des fonctions intestinales, de la nutrition et des interactions avec les agents pathogènes ^1,2. Ces organoïdes imitent la structure complexe de l’épithélium intestinal in vivo en s’auto-répliquant et en s’organisant en formations 3D qui englobent diverses lignées cellulaires intestinales³. Cette caractéristique met en évidence leur potentiel considérable pour faire avancer la compréhension de la biologie intestinale.

L’intérêt croissant pour l’application de la technologie des organoïdes intestinaux aux animaux d’élevage nécessite le perfectionnement des techniques de culture et d’entretien ^4,5. La pertinence de cette technologie est soulignée par son impact potentiel sur l’étude de la santé intestinale des animaux d’élevage, qui joue un rôle essentiel dans leur productivité et, par conséquent, dans l’économie de l’industrie des animaux destinés à l’alimentation en influençant le bien-être animal et les coûts opérationnels ^6,7. Plus précisément, l’utilisation de cultures d’organoïdes intestinaux pour explorer la fonction intestinale des bovins est d’une importance capitale, compte tenu de leur rôle de réservoirs d’agents pathogènes entériques zoonotiques, tels que Salmonella spp. et Escherichia coli (E. coli) O157 :H7⁸. Ces agents pathogènes sont localisés dans des segments particuliers de l’intestin, d’où l’importance de différencier les méthodes de culture d’organoïdes intestinaux par segment intestinal afin d’améliorer la précision des études⁹.

Un obstacle important dans l’étude des organoïdes intestinaux est l’accès restreint à la surface apicale de la cellule épithéliale¹⁰. Lorsqu’elles sont cultivées dans une matrice extracellulaire (MEC), les cellules s’orientent naturellement de sorte que la surface basale soit tournée vers l’extérieur et que la surface apicale soit dirigée vers l’intérieur¹⁰. Pour relever ce défi, des méthodes sont présentées qui consistent à dissocier les organoïdes 3D en cellules uniques et à les ensemencer dans des inserts de culture cellulaire semi-perméables. Cette configuration établit une interface entre la surface apicale et un compartiment basolatéral. Ce protocole démontre que les cellules dérivées d’organoïdes intestinaux bovins peuvent former une monocouche 2D cohérente, comme en témoignent les mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER) et les tests de perméabilité paracellulaire. De plus, le développement de la polarité cellulaire avec des bordures en brosse et des jonctions serrées dans les cellules monocouches 2D dérivées d’organoïdes est confirmé par immunofluorescence et microscopie électronique, reflétant les propriétés de l’épithélium intestinal in vivo .

Dans cette étude, l’iléon représente le tractus intestinal grêle et le rectum signifie le gros tractus intestinal. Ces sélections sont fondées sur des agents pathogènes entériques pertinents, comme Salmonella spp., qui peut déplacer l’iléon¹¹, et E. coli O157 :H7, connu pour coloniser principalement le rectum⁹ chez les bovins. La sélection de ces segments intestinaux spécifiques souligne la nécessité d’adapter les méthodes de culture d’organoïdes intestinaux à la région intestinale pour plus de précision dans la recherche. Ces méthodes détaillent la procédure de culture efficace d’une interface monocouche 2D dérivée d’organoïdes à partir de ces segments intestinaux, fournissant un modèle robuste pour explorer la santé intestinale des bovins, les infections pathogènes et les interactions entre le microbiome intestinal et l’hôte.

Protocole

Les cryptes intestinales ont été obtenues à partir d’échantillons intestinaux excédentaires provenant d’un abattoir local, et le tableau supplémentaire 1 indique la présence de donneurs. Des organoïdes ont été générés à partir de tissus dérivés d’animaux euthanasiés sans cruauté dans un abattoir, et les animaux n’ont pas été achetés uniquement pour cette recherche ; par conséquent, cette étude est exemptée de l’examen de l’IACUC et une déclaration d’éthique n’est pas applicable.

1. Revêtement ECM sur des inserts de culture cellulaire pour la culture monocouche 2D dérivée d’organoïdes

REMARQUE : Toutes les procédures sont effectuées à l’aide de matériaux stérilisés et de techniques aseptiques dans une enceinte de biosécurité. Tous les réactifs sont conservés sur de la glace tout au long de la procédure, sauf indication contraire.

1. Préparez 100 μL d’ECM pour enrober chaque insert de culture cellulaire^{de 0,33 cm 2} en mélangeant soigneusement le milieu basal avec de l’hydrogel à base d’ECM à 2 % (v/v) dans un microtube.
2. Retirer l’insert de culture cellulaire individuel de l’emballage à l’aide d’une pince stérilisée et le placer individuellement dans les puits d’une plaque de culture cellulaire transparente à fond plat de 24 puits.
3. Appliquer 100 μL d’enrobage ECM préparé à l’étape 1.1 sur la chambre apicale de chaque insert de culture cellulaire préparé à l’étape 1.2.
4. Replacez le couvercle et incubez la plaque de culture cellulaire contenant le(s) insert(s) de culture cellulaire enrobé(s) dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 h.
   1. Pour les cellules organoïdes iléales, l’insert est prêt à l’emploi après 1 h d’incubation. Pour les cellules organoïdes rectales, après 1 h d’incubation, remplacer le revêtement ECM par un milieu de culture rectal monocouche et incuber pendant la nuit (tableau 1). Préparez des inserts de culture cellulaire supplémentaires pour les contrôles à blanc si vous prévoyez d’effectuer des mesures TEER.

	Iléon	Rectum
Temps d’incubation du revêtement ECM	1 h	1 h suivi de nuit dans un milieu de culture monocouche
Compléments à milieu de culture organoïde
		CHIR99021
	LY2157299	LY2157299
	Y-27632	Y-27632
	Sérum fœtal bovin	Sérum fœtal bovin
Densité d’ensemencement cellulaire (cellules/puits)	5 x 105	3 x 105

Tableau 1 : Résumé du protocole optimisé de création de monocouches 2D dérivées d’organoïdes iléaux et rectaux bovins adultes.

2. Ensemencement de cellules organoïdes iléales et/ou rectales bovines et culture monocouche 2D

REMARQUE : Le protocole décrit dans cette section utilise des organoïdes iléaux et rectaux bovins, qui ont été cultivés et conservés sur des plaques à 48 puits en utilisant les techniques décrites⁵. Pour des résultats optimaux, il est conseillé d’utiliser des organoïdes maintenus de manière stable qui ont été passés plus de 3 fois après l’établissement initial et qui ont été cultivés pendant plus de 3 jours après le passage le plus récent.

1. Sans perturber le dôme d’hydrogel à base d’ECM contenant des organoïdes matures, prélever le milieu de culture d’organoïdes à l’aide d’une pipette Pasteur en verre jetable fixée à un système de vide et ajouter 300 μL de solution de dépolymérisation ECM glacée par puits. Incuber pendant au moins 1 h à 4 °C.
   REMARQUE : Alternativement, perturber mécaniquement le dôme d’hydrogel à base de MEC contenant un organoïde après l’ajout de solution de dépolymérisation MEC et recueillir la suspension dans un tube conique de 15 mL avant l’incubation à 4 °C. Cette méthode est recommandée lorsque des organoïdes qui ne sont pas destinés à être utilisés pour la culture monocouche 2D sont cultivés simultanément sur la même plaque. La densité des cultures d’organoïdes influence considérablement le nombre de puits de culture d’organoïdes nécessaires pour un ensemencement optimal dans les inserts de culture cellulaire.
   1. Pour les cultures d’organoïdes à haute densité (figure supplémentaire 1A), les inserts de culture de cellules rectales utilisent un rapport d’ensemencement de l’ordre de 1:1 à 1:2, ce qui signifie qu’un puits de culture peut ensemencer un à deux puits. Pour l’iléon, maintenez le rapport à 1:1. En revanche, les cultures à faible densité (figure supplémentaire 1B) nécessitent plus de puits de culture ; Utilisez 3 à 4 puits de culture d’organoïdes rectaux pour un insert de culture de cellules rectales (rapport de 3-4:1) et 4 à 5 puits de culture d’organoïdes iléaux pour un insert de culture de cellules iléales (rapport de 4-5:1).
2. Inspectez visuellement la dissolution complète de l’hydrogel à base d’ECM et prélevez la suspension organoïde dans un tube conique de 15 ml.
3. Granulés organoïdes par centrifugation à 200 x g et 4 °C pendant 5 min. Jeter le surnageant. Mettre en suspension la pastille dans 1 mL de solution d’enzyme de dissociation cellulaire recombinante complétée par 10 μM d’Y-27632.
4. Incuber la suspension d’organoïdes dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 min avec une agitation intermittente de 3 à 5 s avec un vortex toutes les 2 à 3 min pour faciliter une dissociation efficace des organoïdes.
5. Après la digestion enzymatique, ajouter 5 mL de milieu de base et pipeter agressivement avec une micropipette P1000 pour perturber davantage les organoïdes des cellules individuelles. Inspectez la suspension à la recherche d’amas d’organoïdes et, si cela est toujours perceptible visuellement, répétez le pipetage pour améliorer la dissociation d’une seule cellule.
6. Préparez un tube conique de 50 mL avec une crépine à cellules de 70 μm. Prémouiller la passoire en appliquant 1 à 2 mL de milieu de base.
7. Filtrez la suspension cellulaire à travers la crépine pour éliminer les débris d’hydrogel résiduels à base d’ECM et les amas de grandes cellules. Rincer le tube d’origine de 15 mL et la passoire à cellules de 70 μm avec 10 mL supplémentaires de milieu basal.
   REMARQUE : Si la suspension cellulaire ne passe pas facilement à travers une passoire, cela peut être une indication de dissociation incomplète des organoïdes. Il est possible de repasser la suspension cellulaire collectée à travers la même crépine cellulaire de 70 μm. Une perturbation enzymatique ou mécanique supplémentaire peut être nécessaire.
8. Suspension monocellulaire de granulés par centrifugation à 200 x g et 4 °C pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec un volume approprié de milieu basal pour effectuer le comptage cellulaire.
9. Comptez les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre après coloration au bleu de trypan pour calculer le nombre total de cellules collectées.
10. Suspension monocellulaire de granulés par centrifugation à 200 x g et 4 °C pendant 5 min. Retirer les cellules surnageantes et les remettre en suspension jusqu’à la densité d’ensemencement appropriée dans le milieu de culture monocouche respectif (tableau 1).
    1. Pour les cellules organoïdes iléales, remettre les cellules en suspension à la concentration de 2,5 x 10⁶ cellules/mL pour obtenir une densité d’ensemencement de 5 x 10⁵ cellules par insert de culture cellulaire dans 200 μL de milieu de culture monocouche iléal, qui est le milieu de culture organoïde complété par 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632 et 20 % de sérum fœtal bovin (FBS).
    2. Pour les cellules organoïdes rectales, remettre les cellules en suspension à la concentration de 1,5 x 10⁶ cellules/mL pour obtenir une densité d’ensemencement de 3 x 10⁵ cellules par insert de culture cellulaire dans 200 μL de milieu de culture monocouche rectal, qui est le milieu de culture organoïde complété par 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632, et 20 % FBS.
11. Récupérez la plaque de culture cellulaire à 24 puits avec le(s) insert(s) de culture cellulaire revêtu(s) d’ECM et videz la chambre apicale de l’insert de culture cellulaire avec une aspiration sous vide soigneuse pour ne pas perturber le revêtement.
12. Appliquer délicatement 200 μL de suspension unicellulaire préparée à l’étape 2.10 sur la chambre apicale de l’insert de culture cellulaire. Pour le contrôle à blanc, ajouter 200 μL de milieu de culture sans cellules dans la chambre apicale. Pour le contrôle à blanc, ajouter 200 μL de milieu de culture sans cellules dans la chambre apicale.
13. Appliquez 500 μL de milieu de culture monocouche dûment complété (selon les cellules iléales ou rectales) dans la chambre basolatérale de chaque puits.
14. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO₂ pour faciliter l’adhésion et la croissance cellulaires afin de former une monocouche 2D confluente sur l’insert de culture cellulaire.
15. Changer le milieu de culture dans les chambres apicales et basolatérales tous les deux jours à partir de 48 heures après l’ensemencement cellulaire. Assurer un temps d’incubation égal pour le témoin à blanc et l’insert contenant la cellule.

3. Mesure TEER

REMARQUE : La méthode décrite ici utilise un système de mesure manuelle TEER disponible dans le commerce, connu sous le nom de voltohmmètre épithélial, avec une paire d’électrodes Ag/AgCl (figure 1A). La détermination du TEER sur une monocouche 2D nécessite la mesure de puits vierges. Assurez-vous que la lecture à blanc est prise de la même manière que l’échantillon.

1. Récupérez de l’incubateur la plaque contenant des inserts de culture cellulaire avec une ou plusieurs monocouches 2D dérivées d’organoïdes et une pièce brute. Laissez la plaque revenir à température ambiante pendant environ 10 min.
2. Désinfectez les électrodes avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher complètement.
3. Introduisez avec précaution les électrodes avec l’extrémité courte dans la chambre apicale et l’extrémité longue dans la chambre basolatérale (Figure 1A).
   REMARQUE : Une prudence supplémentaire est justifiée afin de ne pas perturber la monocouche de cellules.
4. Laissez la lecture s’équilibrer et enregistrez la valeur en ohm lorsqu’elle se stabilise.
   REMARQUE : La sensibilité du voltohmmètre est telle que des fluctuations de la valeur ohm se produiront lors de la mesure de la résistance électrique. Une lecture fiable est obtenue lorsque les mesures se stabilisent et oscillent constamment autour d’une valeur de plateau.
5. Déterminez le FEER d’une monocouche 2D à l’aide de la formule suivante :
   TEER (Ω x cm²) = surface des inserts de culture cellulaire (cm²) x résistance électrique nette
   où la résistance électrique nette est égale à la résistance mesurée de l’insert monocouche de cellule moins la résistance mesurée de l’insert vierge. Les inserts de culture cellulaire pour plaques à 24 puits ont une surface de 0,33 cm².

Figure 1 : Évaluation de l’intégrité de la barrière épithéliale d’une monocouche 2D dérivée d’organoïdes intestinaux bovins. (A) Schéma de positionnement approprié des électrodes dans les chambres apicales et basolatérales d’un insert de culture cellulaire pour les mesures TEER. L’électrode courte est insérée dans la chambre apicale, et l’électrode longue est placée dans la chambre basolatérale avec soin pour éviter tout contact avec la membrane. (B) Schéma du processus d’essai de perméabilité. Les chambres de culture cellulaire sont lavées 2 fois avec du PBS réchauffé, et 0,5 mg/mL de traceur FITC-dextran 4 kDa dissous dans du PBS est appliqué sur la chambre apicale. Des aliquotes répétées de 50 μL de la chambre basolatérale sont échantillonnées en remplaçant un volume égal de PBS pour maintenir le volume total dans la chambre basolatérale pendant toute la durée de la période d’incubation. L’intensité de fluorescence de l’aliquote est mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques pour quantifier la diffusion d’un traceur FITC-dextran de 4 kDa à travers la monocouche cellulaire. (C) Le développement dynamique de l’intégrité de la barrière au sein des monocouches iléales et rectales au fil du temps a été évalué à l’aide de mesures TEER (représentées par des cercles fermés pour l’iléon et des carrés fermés pour le rectum) et de tests de perméabilité (désignés par des cercles ouverts pour l’iléon et des carrés ouverts pour le rectum) avec un traceur FITC-dextran de 4 kDa. Au troisième jour de la culture, les deux types de monocouches présentaient l’établissement de barrières épithéliales stables et fonctionnelles, comme en témoignent leurs profils respectifs de TEER et de perméabilité. Les résultats sont la moyenne d’au moins deux expériences indépendantes avec deux répliques techniques. Les barres d’erreur représentent le MEB des mesures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Essai de perméabilité paracellulaire

REMARQUE : Ce test implique la détermination de l’intensité de fluorescence résultant de la diffusion de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran de la chambre apicale à la chambre basolatérale à travers des monocouches 2D sur 120 min (Figure 1B). Pour des résultats optimaux, il est conseillé de minimiser l’exposition à la lumière pendant le test et de prendre des mesures dans un lecteur de microplaques immédiatement après chaque échantillonnage afin d’éviter toute diminution ou extinction de la fluorescence. Chaque puits ne peut être utilisé qu’une seule fois et ne peut pas être réutilisé dans les analyses ultérieures. Préparez au moins 2 puits qui serviront de répliques techniques pour chaque essai. Par exemple, un total de 6 puits est nécessaire pour obtenir les résultats présentés à la figure 1C, où les tests ont été exécutés en double à 3 moments différents (jours 1, 3 et 5 de la culture).

1. Préparer une série de dilution de courbe standard avec 4 kDa de FITC-dextran dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Pour chaque dilution, pipeter 50 μL sur une plaque de 96 puits en trois exemplaires.
   REMARQUE : Il est recommandé de créer une série de 5 à 7 dilutions allant de 0 à 0,5 mg/mL.
2. Déterminer l’intensité de fluorescence des étalons dans un lecteur de microplaques pré-calibré à une longueur d’onde d’excitation de 495 nm et une longueur d’onde d’émission de 535 nm.
3. Calculez la régression linéaire avec les résultats de l’intensité de fluorescence pour créer une courbe standard.
4. Récupérez de l’incubateur la plaque contenant des inserts de culture cellulaire avec une ou plusieurs monocouches 2D dérivées d’organoïdes. Retirer le milieu de culture monocouche des chambres apicales et basolatérales de l’insert de culture cellulaire contenant la monocouche 2D dérivée d’organoïdes à évaluer.
5. Lavez délicatement chaque chambre 2 fois avec 200 μL (chambre apicale) et 500 μL (chambre basolatérale) de PBS préchauffé, respectivement.
6. Retirer la solution de lavage de la chambre apicale et appliquer 200 μL de 0,5 mg/mL de 4 kDa FITC-dextran tracer dans du PBS sur la chambre apicale de l’insert de culture cellulaire.
7. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 20 min.
8. Prélever un échantillon de 50 μL dans la chambre basolatérale de la plaque incubée à 24 puits et transférer sur une plaque à 96 puits compatible avec les lecteurs de microplaques.
9. Remplacer 50 μL de PBS frais dans la chambre basolatérale du puits échantillonné.
10. Prenez immédiatement une mesure de l’intensité de fluorescence dans un lecteur de microplaques pré-calibré à une longueur d’onde d’excitation de 495 nm et une longueur d’onde d’émission de 535 nm.
11. Répétez les étapes 4.6 à 4.10 toutes les 20 minutes jusqu’à 120 minutes. À la fin de l’essai, si la préservation de la monocouche 2D est souhaitée, rincer les chambres apicale et basolatérale avec du PBS 2x frais, les remplacer par un milieu de culture monocouche frais et incuber.
    REMARQUE : Une évaluation plus poussée des monocouches 2D peut être effectuée, c’est-à-dire des mesures TEER, une coloration par immunofluorescence, etc. Cependant, il n’est pas recommandé car un traceur fluorescent résiduel est probable et peut avoir un impact sur l’analyse.
12. Déterminez le coefficient de perméabilité apparente (P_app) à l’aide de la formule suivante :
    
    ΔQ / Δt = concentration du traceur fluorescent qui a transmis la monocouche à la chambre basolatérale de l’insert de culture cellulaire pendant une durée spécifique, mesurée par l’intensité de fluorescence et extrapolée à μg/mL via la courbe standard
    A = surface des inserts de culture cellulaire
    C_o = concentration du traceur fluorescent ajouté à la chambre apicale de l’insert de culture cellulaire en μg/mL

5. Coloration par immunofluorescence d’une monocouche 2D dérivée d’organoïdes

1. Retirer le milieu de culture monocouche de l’insert de culture cellulaire à l’aide d’une aspiration sous vide et ajouter 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Incuber à température ambiante pendant 15 à 30 minutes pour la fixation des cellules.
2. Éliminer le PFA avec une aspiration sous vide et laver avec 100 μL de PBS 2x.
3. Perméabiliser les cellules avec 100 μL de Triton X-100 à 0,3 % dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % dans du PBS en les incubant à température ambiante pendant 10 min.
4. Retirer le surnageant avec une aspiration sous vide et laver avec 100 μL de PBS 2x.
5. Retirer le surnageant et le remplacer par 2 % de BSA dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 1 h pour le blocage.
6. Éliminer le surnageant, appliquer 100 μL d’anticorps primaires dilués dans de la BSA à 2 % dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 1 h ou toute la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Les concentrations des anticorps primaires utilisés sont indiquées dans le tableau des matières. Sauf indication contraire, les recommandations du fabricant sont suivies.
7. Retirer le surnageant et laver avec 100 μL de PBS 3x.
8. Appliquer 100 μL d’anticorps secondaires dilués dans de la BSA à 2 % dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 1 h ou toute la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Cette étape peut être ignorée si l’anticorps primaire utilisé est conjugué à une sonde de fluorescence. Les concentrations d’anticorps secondaires utilisés sont indiquées dans le tableau des matières. Sauf indication contraire, les recommandations du fabricant sont suivies.
9. Retirer le surnageant et laver avec 100 μL de PBS 3x.
10. Facultatif : Pour la contre-coloration de l’actine fluorée et des noyaux (DAPI), préparez en mélangeant les deux sondes à la dilution appropriée (selon les recommandations du fabricant) dans du PBS, appliquez 100 μL et incubez à température ambiante pendant 30 min. Retirer le surnageant et laver avec 100 μL de PBS 3x.
11. Découpez soigneusement la membrane d’insertion de culture cellulaire à l’aide d’une lame de scalpel et montez-la sur une lame de verre avec une solution de montage. Placez une lamelle et observez.

Résultats

Ce protocole génère de manière fiable des monocouches 2D robustes dérivées d’organoïdes intestinaux bovins à partir du tractus intestinal grêle et du gros intestin, émulant la complexité de l’épithélium intestinal in vivo . Cette méthode utilise des organoïdes matures développés à partir de spécimens de cryptes intestinales de bovins sains élevés dans des conditions optimisées. Il est intéressant de noter que les conditions réussies et reproductibles pour les monocouches 2D dérivées d’organoïdes sont uniques au segment de l’intestin (Tableau 1). Cela renforce l’importance d’avoir des techniques de culture optimisées pour le segment intestinal d’intérêt.

1 jour après l’ensemencement d’organoïdes matures dissociés sur un insert de culture cellulaire, une monocouche 2D est apparue (Figure 2A). Cependant, malgré cette apparence initiale, les mesures de TEER pour les monocouches iléales et rectales sont restées faibles à ce stade (Figure 1C). De plus, un test de perméabilité paracellulaire a révélé que la monocouche, après seulement 1 jour de culture, permettait le passage d’un traceur FITC-dextran de 4 kDa à travers la couche cellulaire (Figure 1C). Au 3e^{jour de} la culture, les deux types de monocouches 2D dérivées d’organoïdes ont montré une maturation significative, mise en évidence par une augmentation des valeurs TEER et une résistance au traceur FITC-dextran de 4 kDa, une tendance qui s’est poursuivie jusqu’au 5e jour de la culture.

La variabilité interspécifique est particulièrement remarquable, où, malgré des valeurs TEER plus faibles des cultures monocouches 2D dérivées d’organoïdes bovins par rapport à leurs homologues humains et canins dans des conditions similaires 12,13,14,15, l’intégrité de la membrane reste intacte. Cette conclusion est tirée de la réponse appropriée des monocouches dans les tests de perméabilité, suggérant que les faibles valeurs TEER dans les échantillons bovins ne reflètent pas nécessairement un manque de fonction barrière. Cette intégrité est cruciale pour une barrière épithéliale fonctionnelle et est efficacement démontrée par l’interprétation minutieuse des résultats des tests de perméabilité parallèlement aux mesures TEER.

La visualisation de la démarcation cellulaire et des microvillosités bien développées sur la surface apicale des monocouches 2D avec la microscopie électronique à balayage, affichant des structures microanatomiques spécialisées, a encore renforcé la maturation des monocouches 2D dérivées d’organoïdes iléaux et rectaux (Figure 2B). De plus, la coloration par immunofluorescence des monocouches 2D a confirmé la présence d’une bordure de brosse apicale, de jonctions d’adhérence basolatérale et de cellules caliciformes productrices de mucus dans les monocouches 2D dérivées d’organoïdes iléales (Figure 3A) et rectales (Figure 3B). Ces résultats renforcent le fait que la monocouche 2D développée est complexe en composition et en formation, exprimant non seulement les caractéristiques clés d’un épithélium intestinal intact, mais étant composée d’une population cellulaire multilignée.

Le développement réussi d’une monocouche 2D repose sur l’adhérence des cellules à l’ECM et la croissance à la confluence pour créer une couche épithéliale intacte. Notamment, une distribution inégale de l’ECM ou des conditions sous-optimales pendant l’incubation sur l’insert de culture cellulaire peuvent entraîner le détachement partiel de la couche cellulaire, particulièrement visible le long de ses bords (Figure 4Ai). Ce problème est encore aggravé si les cellules sont ensemencées à une densité supérieure à la densité optimale ou si les cellules d’ensemencement ne sont pas uniformément réparties sur la surface de la culture, un scénario résultant souvent de la dissociation incomplète des organoïdes en une seule suspension cellulaire. Une telle distribution inégale peut conduire à la formation de lacunes au sein de la monocouche et/ou à une morphogenèse 3D sur un insert de culture cellulaire (Figure 4Aii). En revanche, le sous-ensemencement des cellules peut également entraîner un développement infructueux ou retardé de la monocouche au cours de la période de culture prévue, ce qui affecte par inadvertance l’efficacité des études ultérieures utilisant le système de monocouche 2D (figure 4Aiii). De plus, la contamination du système de culture peut également entraîner la formation de lacunes au sein de la monocouche, perturbant la monocouche confluente autrefois formée à un stade ultérieur de la culture (Figure 4Aiv). Les valeurs TEER soutenues et la réponse de perméabilité paracellulaire peuvent être influencées par des perturbations de la couche cellulaire dues à des techniques de lavage ou de manipulation agressives, même lorsque les causes potentielles de défaillance susmentionnées n’avaient pas été rencontrées avant ces tests (figure 4B). Ainsi, une manipulation minutieuse des cellules et l’évaluation de la formation ou des perturbations des monocouches sont primordiales pour le développement réussi de monocouches 2D dérivées d’organoïdes grâce à l’application efficace de stratégies de dépannage.

Figure 2 : Caractérisation microscopique des monocouches 2D dérivées d’organoïdes iléaux et rectaux bovins. (A) Images représentatives de microscopie à contraste de phase de monocouches 2D au jour 1 et au jour 3 (J1 et D3) de culture sur un insert de culture cellulaire. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Images représentatives de microscopie électronique à balayage de monocouches 2D avec des grossissements inférieurs (à gauche) et supérieurs (à droite). La structure détaillée de la surface cellulaire, y compris les microvillosités, peut être appréciée dans les monocouches iléales (en haut) et rectales (en bas). Barre d’échelle gauche = 10 μm, barre d’échelle droite = 2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation par immunofluorescence de monocouches 2D dérivées d’organoïdes iléaux et rectaux. (A, B) Le panneau (A) montre l’iléal et le panneau (B) montre les organoïdes rectaux. Sur la gauche, les fibres d’actine F sont mises en évidence par la phalloïdine (rouge), illustrant l’architecture du cytosquelette et la formation de la bordure apicale en brosse. L’image du milieu capture la localisation basolatérale des jonctions adhérentes, marquées par de la E-cadhérine (vert), indiquant l’adhésion cellule-cellule et l’intégrité de la monocouche. À droite, la présence de cellules caliciformes productrices de mucine est identifiée par SNA (vert), avec une image de pile z représentant la sécrétion apicale de mucine dans la monocouche iléale. Les noyaux de toutes les images ont été contre-colorés avec du DAPI (bleu). De plus, l’imagerie z-stack sur toutes les images démontre la formation d’une seule couche cellulaire à l’intérieur de l’insert de culture. Barre d’échelle = 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Caractérisation de la formation sous-optimale de monocouches 2D. (A) des images représentatives à contraste de phase démontrant (i) le détachement partiel de la monocouche le long du bord de l’insert de culture cellulaire ; (ii) le développement de l’excroissance 3D et la formation de lacunes à l’intérieur de la monocouche ; (iii) formation incomplète ou retardée d’une monocouche due à une densité d’ensemencement inférieure à la densité optimale notée par une adhérence inégale des cellules ; et (iv) la formation de lacunes à l’intérieur de la monocouche 2D une fois formée à un stade ultérieur, résultant probablement d’une contamination présumée. Barres d’échelle = 100 μm. (B) Les mesures TEER décroissantes associées à des profils de perméabilité croissants après le jour 3 indiquent un échec à établir des barrières épithéliales stables et fonctionnelles. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ±'erreur type de la moyenne (SEM) à partir d’une seule expérience avec deux répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Variations de densité dans les cultures d’organoïdes intestinaux bovins dans un hydrogel à base de MEC. Organoïdes intestinaux bovins cultivés dans un hydrogel à base de MEC ; (A) haute densité et (B) faible densité. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Résumé des signaux des donneurs de tissus. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La santé du tractus intestinal est primordiale pour la productivité et le bien-être général des bovins¹⁶. En tirant parti de la technologie monocouche 2D dérivée d’organoïdes, les scientifiques peuvent désormais imiter plus précisément la structure complexe de l’épithélium intestinal bovin dans un cadre in vitro ⁵. Cette approche innovante permet non seulement de reproduire la composition cellulaire diversifiée de la muqueuse intestinale, y compris ses lignées multicellulaires, mais aussi de capturer des caractéristiques fonctionnelles clés, telles que la sécrétion de mucus et la présence de microvillosités, essentielles à la compréhension de la physiologie et de la pathologie^{intestinales3}. La mise au point de protocoles de culture sur mesure pour des segments de l’iléon et du rectum a donné naissance à une plateforme avancée qui améliore considérablement la capacité d’étudier la santé intestinale des bovins. Cette approche sophistiquée permet d’étudier en détail les interactions entre les agents pathogènes zoonotiques et l’environnement intestinal bovin. La capacité de reproduire et d’étudier fidèlement les aspects uniques de l’écosystème intestinal bovin in vitro est un pas important vers l’élaboration de stratégies ciblées pour améliorer la santé du bétail et atténuer la propagation des zoonoses.

Néanmoins, pour assurer le succès du développement d’une monocouche 2D à l’aide d’organoïdes intestinaux bovins, il est essentiel de maintenir la santé et la vitalité des organoïdes et de leurs cellules uniques dissociées. Une manipulation soigneuse et la minimisation du stress sont primordiales pour préserver l’intégrité et la fonctionnalité des cellules, qui sont essentielles à la croissance efficace des organoïdes et à la création ultérieure d’une monocouche fonctionnelle. De plus, l’obtention d’une monocouche uniforme repose sur la dissociation réussie des organoïdes en cellules uniques sans former de gros amas. De tels amas peuvent perturber la distribution cellulaire et compromettre la structure de la monocouche. Par conséquent, l’utilisation de techniques précises pour une dissociation en douceur est cruciale, ce qui permet d’obtenir une suspension unicellulaire cohérente. De plus, il est bénéfique de minimiser les perturbations lors de l’adhésion cellulaire et du lavage des cellules non adhérentes en excès. Cette approche est particulièrement importante pour résoudre les problèmes potentiels de morphogenèse 3D, améliorant ainsi la qualité globale de la monocouche.

Un défi notoire avec les hydrogels à base d’ECM qui sont d’origine biologique est la variation de la composition d’un lot à l’autre¹⁷. Bien que cela n’ait pas été observé à l’aide des protocoles et des matériaux décrits, les variations d’un lot à l’autre dans la composition de l’ECM pourraient poser des défis à la réussite du développement d’une monocouche. Si la formation d’une monocouche est compromise lors d’un changement de produits, de marques ou de numéros de lot, des étapes d’optimisation peuvent être nécessaires pour déterminer la concentration appropriée de MEC requise pour le revêtement des inserts de culture cellulaire.

De plus, l’ajustement du milieu de culture à la température ambiante avant d’apporter des modifications est une étape essentielle qui permet d’atténuer les chocs thermiques, de protéger la santé cellulaire et de maintenir la qualité des cultures d’organoïdes et de monocouches. Des pratiques de lavage douces sont également primordiales pour maintenir l’intégrité de la monocouche lors de sa formation et des tests ultérieurs, et éviter les perturbations peut éviter les inexactitudes dans les résultats. Le remplacement du PBS par la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) s’est avéré utile pour minimiser le détachement de la monocouche lorsqu’il est devenu un problème lors de lavages répétés ou d’une exposition prolongée au PBS, comme dans les tests de perméabilité paracellulaire. Enfin, il est essentiel d’adapter le milieu de culture pour répondre aux besoins spécifiques des cellules de différents segments du tractus intestinal, tels que l’iléon et le rectum, pour reproduire avec précision les conditions in vivo . Cette spécificité garantit une santé et une fonctionnalité cellulaires optimales, facilitant la modélisation précise de la physiologie intestinale des bovins et des interactions avec les agents pathogènes, mettant ainsi en évidence ces étapes critiques de la recherche sur les organoïdes.

Outre l’utilisation d’une pratique douce de manipulation des cellules, l’acquisition de bonnes compétences techniques associées au comptage des cellules et aux mesures TEER est cruciale pour le développement réussi d’une monocouche 2D fonctionnelle. Étant donné que des densités de semis trop faibles et trop élevées résultant d’un sur- ou d’un sous-dénombrement des cellules, respectivement, peuvent compromettre la croissance des monocouches. Il est recommandé d’examiner attentivement le nombre de cellules et de s’assurer que la densité de semis est appropriée dans les cas où l’on soupçonne des densités de semis inexactes. De plus, des techniques de mesure TEER inadéquates peuvent entraîner une perturbation de la monocouche par des rayures accidentelles avec les électrodes. L’introduction soigneuse des électrodes dans la chambre apicale et le maintien de leur orientation verticale par rapport à la surface de la membrane pourraient aider à atténuer le risque de dommages accidentels aux monocouches.

Les méthodes de dosage de la perméabilité paracellulaire décrites ici ont été adaptées d’un protocole précédent¹⁸. Des modifications au protocole rapporté, qui comprennent des échantillonnages multiples sur une période de 120 minutes et le remplacement de l’aliquote échantillonnée par des quantités égales de PBS, sont apportées afin d’améliorer l’exactitude et la fiabilité des résultats. Le maintien du volume total à l’intérieur de la chambre est essentiel pour plusieurs raisons : il préserve l’équilibre osmotique, garantit l’intégrité des cellules, maintient le gradient de concentration essentiel à une évaluation précise de la perméabilité et empêche les altérations de la pression hydrostatique qui pourraient affecter les taux de transport. Cette pratique consistant à réapprovisionner la chambre basolatérale avec du PBS frais équivalent au volume du PBS contenant un traceur fluorescent échantillonné est essentielle à la préservation de ces conditions, permettant des évaluations précises et significatives de la perméabilité monocouche. Le test de perméabilité paracellulaire sert de complément à la mesure TEER en évaluant directement le mouvement des molécules traceuses à travers la monocouche. De plus, la comparaison des valeurs TEER entre différents laboratoires peut ne pas fournir d’informations pertinentes, car ces valeurs peuvent être affectées par de nombreuses variables, telles que la température et les conditions spécifiques dans lesquelles les cellules sont cultivées, y compris les types de cellules, les nombres de passages et la composition du milieu de culture¹⁹. Le test de perméabilité paracellulaire fournit une évaluation fonctionnelle in vitro de l’expression effective des adhérents et des jonctions serrées au sein d’une barrière épithéliale²⁰.

Bien que le développement de monocouches 2D à partir d’organoïdes 3D représente une avancée significative dans la technologie de culture, il est important de reconnaître les limites associées aux monocouches 2D. Un inconvénient majeur est qu’il s’agit toujours d’un système de culture statique, dépourvu de la stimulation dynamique que l’on trouve dans l’environnement in vivo . De plus, la modification de la teneur en oxygène dans le système de culture présente des défis en raison de sa configuration ouverte impliquant des plaques de culture avec des couvercles, ce qui le rend moins adapté à la co-culture à long terme avec des bactéries anaérobies. Ces limites pourraient potentiellement être résolues par l’adoption de plateformes de culture plus dynamiques, telles que les systèmes microfluidiques²¹, qui offrent un environnement plus contrôlé et physiologiquement pertinent. De plus, il est crucial de reconnaître que si les conditions de culture actuelles sont riches en nutriments bénéfiques pour le maintien de la croissance des cellules souches, elles peuvent ne pas être optimales pour induire la différenciation physiologique des cellules épithéliales. Cet écart met en évidence la nécessité d’une optimisation dans les recherches futures pour imiter étroitement les conditions in vivo et soutenir le processus de différenciation. En s’attaquant à ces limites et en affinant ces approches, l’utilité et l’applicabilité des technologies de culture d’organoïdes sont améliorées, se rapprochant ainsi de la reproduction de la dynamique et des interactions complexes du tractus gastro-intestinal in vitro.

Le protocole de génération de monocouches 2D à partir de tissus iléaux et rectaux bovins offre aux chercheurs un modèle in vitro précieux de l’interface luminale de l’épithélium de l’intestin grêle et de l’épithélium du gros intestin. Ce modèle ouvre de vastes possibilités d’application dans les études fondamentales de la nutrition animale, en particulier pour examiner comment les nutriments sont absorbés dans diverses conditions. Un domaine d’intérêt notable est l’étude du syndrome de l’intestin perméable, caractérisé par une augmentation anormale de la perméabilité gastro-intestinale, souvent déclenchée par des changements alimentaires et des températures environnementales extrêmes^22,23. De plus, ce modèle sert d’outil essentiel pour explorer les interactions complexes entre le microbiome intestinal et son hôte. Il permet d’étudier comment les micro-organismes commensales peuvent affecter la santé de l’organisme hôte, en abordant un aspect crucial de la science vétérinaire et médicale ^1,24. De plus, les agents pathogènes d’origine alimentaire humaine sont fréquemment trouvés sous forme de commensaux dans différents segments de l’intestin des bovins ^8,9,25, ce protocole permet des études détaillées des conditions spécifiques qui permettent à ces agents zoonotiques de prospérer dans leurs niches respectives.

Tout au long de cette étude, il a été observé que les monocouches dérivées d’organoïdes rectaux et iléaux nécessitent des conditions différentes pour un développement réussi. Plus précisément, lorsque des monocouches dérivées d’organoïdes rectaux ont été initialement ensemencées sur des inserts de culture cellulaire préparés avec de l’hydrogel à base de MEC à 2 % dans un milieu basal pendant 1 h, de grands trous et une desquamation cellulaire ont été notés. Ce problème a été résolu en passant à un milieu de culture monocouche rectal spécialisé et en prolongeant la période d’incubation jusqu’à la nuit avant l’ensemencement, tandis que les monocouches dérivées d’organoïdes iléaux ont été développées avec succès en utilisant un protocole de préparation plus court. De plus, l’ajout de CHIR99021 au milieu de culture a constamment amélioré l’établissement des monocouches rectales²⁶ , mais n’était pas nécessaire pour les monocouches iléales²⁷. De plus, les monocouches iléales nécessitaient une densité cellulaire plus élevée pour un développement réussi par rapport aux organoïdes rectaux²⁷. Ces conditions optimisées (tableau 1) ont permis de développer à maintes reprises des monocouches qui maintiennent l’intégrité de la barrière résistante, soulignant l’importance d’adapter les conditions de culture au segment spécifique de l’intestin.

L’accès à un modèle qui reflète avec précision la complexité de la lignée multicellulaire de l’intestin in vivo est essentiel pour ces recherches. Il permet aux chercheurs d’imiter étroitement les conditions naturelles de l’environnement intestinal, fournissant une base plus fiable pour les expériences. Grâce à ce protocole, les chercheurs sont équipés d’un modèle robuste qui améliore leurs capacités de recherche, conduisant potentiellement à des découvertes révolutionnaires dans leurs domaines d’étude. Cette approche contribue non seulement à la compréhension de la santé et des maladies intestinales, mais aussi à l’élaboration de stratégies visant à améliorer la gestion du bétail et la salubrité des aliments.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Basal Moyen
Advanced DMEM/F12 (1X)	Gibco	12634-010	n/a
GlutaMAX-I (100X)	Gibco	35050-061	2 mM
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	10 mM
Pen Strep Glutamine (100X)	Gibco	10378-016	1X
Milieu de culture organoïde (suppléments au milieu basal)
A-83-01	Sigma-Aldrich	SML0788-5MG	500 nM
B27 Supplement (50X)	Gibco	17504-001	1X
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145-.5MG	10 nM
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG	50 ng/mL
Murine Wnt-3A	PeproTech	315-20-10UG	100 ng/mL
N-acétyl-L-cystéine	MP Biomedicals	194603	1 mM
N-2 MAX Supplément de média (100X)	R& D Systems	AR009	1X
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	10 mM
Noggin Conditionné Medium	n/a	n/a	10 vol/vol %
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	100 µ ; g/mL
R-Spondin-1 Conditionné Moyen	n/a	n/a	20 vol/vol %
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067-25MG	10 & micro ;
Milieu de culture monocouche M (suppléments au milieu de culture organoïde)
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046-5MG	2.5 µ ; M
HI FBS	Gibco	10438-034	20 vol/vol %
LY2157299	Sigma-Aldrich	SML2851-5MG	500 nM
Y-27632	StemCellTechnologies	72308	10 µ ; M
Reagents
Alexa Fluor 488 Souris anti-E-cadhérine	BD Biosciences	560061	dilution 1:200
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287	dilution 1:400
BSA	Cytiva	SH30574.02	2 w/vol %
Cell Recovery Solution	Corning	354253	n/a
Solution DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	dilution 1:1000
DPBS (1X)	Gibco	14190-144	n/a
Isothiocyanate de fluorescéine&ndash ; Dextran	Sigma-Aldrich	FD4-100MG	0,5 mg/mL
Matrigel Matrix	Corning	354234	n/a
Solution de paraformaldéhyde (4 %)	Thermo Scientific	J19943K2	n/a
ProLong Gold réactif anti-décoloration	Invitrogen	P36930	n/a
SNA, EBL, Fluorescéine	Vector Laboratories	FL-1301	dilution
1:100Triton X-100	Thermo Scientific	A16046.AE	0,3 vol/vol %
TrypLE Express	Gibco	12605-028	n/a
Trypan Blue Solution, 0,4 %	VWR Life Science	K940-100ML	n/a
Matériaux et équipements
0.4 µ ; m Insert de culture cellulaire	Falcon	353095
Plaque de culture cellulaire 24 puits	Corning	3524
Plaque de culture cellulaire 48 puits	Thermo Scientific	150687
70 µ ; m Passoire à cellules stériles	Fisher Scientific	22-363-548
Plaque de culture cellulaire à 96 puits	Greiner Bio-One	655086
Centrifugeuse	Eppendorf	5910Ri
CO2 Thermo	Scientific	370
Voltmètre-ohm épithélial	Millipore	Millicell ERS-2
Hémocytomètre	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Microscope confocal inversé	Leica Microsystems	SP8-X
Microscope à contraste de phase inversé	Leica Microsystems	DMi1
Couvercle de microscope Verre	Fisher Scientific	12-540-B
Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires	SpecrtraMax i3x
Lames de microscope	Fisher Scientific	22-034-486
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
Scalpel Blade	iMed Scientific	-	#11 acier au carbone
Vortex	Mixer Scientific Industries	SI-0236
Software
LAS X logiciel d’imagerie	Leica Microsystems	LAS X 3.7.6.25997
Logiciel de lecture de microplaques	Molecular Devces	SoftMax Pro 7.1.2