Method Article

Assemblage d’organoïdes rétiniens avec la microglie

DOI:

10.3791/67016

⸱

July 26th, 2024

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microglies sont des cellules immunitaires résidentes uniques dans la rétine, jouant un rôle crucial dans diverses maladies dégénératives de la rétine. La génération d’un modèle de co-culture d’organoïdes rétiniens avec des microglies peut faciliter une meilleure compréhension de la pathogenèse et de la progression du développement des maladies rétiniennes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En raison de l’accessibilité limitée de la rétine humaine, les organoïdes rétiniens (OI) sont le meilleur modèle pour étudier les maladies rétiniennes humaines, ce qui pourrait révéler le mécanisme du développement rétinien et l’apparition de maladies rétiniennes. Les microglies (MG) sont des macrophages résidents uniques dans la rétine et le système nerveux central (SNC), remplissant des fonctions immunitaires cruciales. Cependant, les organoïdes rétiniens sont dépourvus de microglie puisque leur origine de différenciation est le sac vitellin. La pathogenèse spécifique de la microglie dans ces maladies rétiniennes reste incertaine ; Par conséquent, l’établissement d’un modèle d’organoïde rétinien incorporé à la microglie s’avère nécessaire. Ici, nous avons réussi à construire un modèle co-cultivé d’organoïdes rétiniens avec des microglies dérivées de cellules souches humaines. Dans cet article, nous avons différencié la microglie, puis co-cultivé à des organoïdes rétiniens à un stade précoce. En tant qu’incorporation de cellules immunitaires, ce modèle fournit une plate-forme optimisée pour la modélisation des maladies rétiniennes et le criblage de médicaments afin de faciliter la recherche approfondie sur la pathogenèse et le traitement des maladies liées à la rétine et au SNC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En tant que source limitée de la rétine humaine, la différenciation des cellules souches humaines en organoïdes rétiniens tridimensionnels (3D) représente un modèle in vitro prometteur pour simuler la rétine1. Il contient différents types de cellules dans la rétine, notamment des photorécepteurs, des cellules ganglionnaires rétiniennes, des cellules bipolaires, des cellules de Müller, des cellules horizontales et des astrocytes2. Ce modèle permet d’émuler et d’étudier à la fois les mécanismes de développement rétinien et la pathogenèse des maladies rétiniennes. Cependant, en raison de la méthode de différenciation directionnelle, les organoïdes rétiniens ont été dérivés du neuroectoderme3, manquant de nombreux autres types de cellules provenant de différentes couches germinales, telles que la microglie du sac vitellin et les cellules périvasculaires du mésoderme 4,5,6.

À l’heure actuelle, il a été prouvé que de nombreuses maladies de la rétine, telles que la rétinite pigmentaire7, le glaucome8 et le rétinoblastome9, sont étroitement liées à la microglie de la rétine. Cependant, en raison du manque de modèles de recherche appropriés, les mécanismes spécifiques illustrant la relation entre la microglie et ces maladies restent encore flous. Alors que les souris ont servi de modèle favorable pour l’étude des maladies rétiniennes, des études récentes ont mis en évidence des différences significatives entre la microglie de la souris et de l’homme en termes de durée de vie, de taux de prolifération et d’absence de gènes homologues humains10,11. Ces résultats suggèrent que les conclusions tirées de modèles murins peuvent ne pas être entièrement fiables, soulignant l’importance de construire des organoïdes rétiniens humains contenant des microglies.

Au cours des dernières décennies, diverses méthodes de différenciation 3D des organoïdes rétiniens ont été développées12,13. Pour faciliter l’opération de co-culture de la microglie au sein d’organoïdes rétiniens, nous avons sélectionné une méthode de différenciation impliquant une transition de la culture adhérente à la culture en suspension. Cette approche permet d’incorporer la microglie dans les organoïdes rétiniens, en les maintenant pendant au moins 60 jours14.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique institutionnelle de l’hôpital Tongren de Pékin, Université de médecine de la capitale. La lignée cellulaire H9 des HESC provient de l’Institut de recherche WiCell. Préchauffez le milieu de culture cellulaire à température ambiante (RT) pendant 30 minutes avant l’expérience.

1. Génération de la microglie humaine

  1. Cultivez les CSEh dans un milieu de cellules souches jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 80 % à 90 %. Ensemencez au moins 1 x 106 cellules dans chaque puits.
  2. Aspirer le milieu de cellules souches et rincer les cellules avec 1 DPBS (1 ml/puits de plaque à 6 puits). L’étape suivante nécessite 2 x 107-1 x 108 cellules. Si ce n’est pas assez, combinez des cellules de 2 à 5 puits pour effectuer les étapes suivantes.
  3. Dissocier les colonies de cellules souches à l’aide de la solution d’EDTA à 0,5 mM pendant environ 5 min dans un incubateur à 37 °C (1 mL/puits de plaque à 6 puits).
  4. Vérifiez la morphologie de la colonie après 5 min. Lorsque les bords de la colonie sont légèrement recroquevillés avec des espaces lâches, les cellules sont prêtes à être différenciées et à aspirer l’EDTA. Sinon, incubez les cellules à 37 °C pendant 1 à 2 minutes supplémentaires. Ne pas incuber plus de 8 min.
  5. Rincer doucement les cellules de chaque puits à l’aide de 6 mL de milieu A (tableau 1) avec 6 μL de solution Y-27632 d’inhibiteur de ROCK à 10 mM. Tapotez doucement le fond du plat pour aider à rincer les cellules. Définissez le jour comme jour 0.
    REMARQUE : Ne pipetez pas les cellules. Les cellules formeront des corps embryoïdes (EB) le lendemain.
  6. Après 24 h, observez les cellules au microscope pour confirmer la formation d’EB. Recueillir les EB dans un tube centrifuge de 15 mL avec une pipette de 10 mL et attendre qu’ils se déposent au fond en 5 min.
  7. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension les EB avec 6 mL de milieu A frais et transférez-les dans un nouveau puits à faible adhérence ou une plaque à 6 puits. Culture dans un incubateur à 37 °C.
    REMARQUE : Le but du transfert de puits le jour 1 est de réduire l’influence d’un grand nombre de cellules mortes pendant le processus de formation de l’EB, ce qui peut affecter l’état de croissance cellulaire.
  8. Rafraîchir le Medium A frais tous les jours jusqu’au jour 4 (6 ml/puits d’une assiette à 6 puits).
  9. Le jour 4, enduire un plat de 10 cm de 3 ml de solution de gélatine de poisson à 0,1 % pendant au moins 1 h dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
    REMARQUE : Si le temps de revêtement est inférieur à 1 h, il est difficile d’effectuer les étapes suivantes.
  10. Recueillir soigneusement les EB dans un tube centrifuge de 15 mL avec une pipette de 10 mL et attendre que les EB se déposent au fond en 5 min.
  11. Retirer la solution de gélatine à 0,1 % et rincer une fois le plat de 10 cm avec 5 à 6 ml de 1 DPBS. Retirez le DPBS.
  12. Remettez doucement les EB en suspension avec 15 mL de Medium B (Tableau 1) dans le tube centrifuge de 15 mL et transférez-les dans le plat enduit de 10 cm. Culture dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 pendant 1 semaine.
    REMARQUE : Au cours des 7 premiers jours, ne déplacez pas le plat.
  13. Rafraîchissez avec du Medium B frais une fois par semaine jusqu’au jour 49 (boîte de 15 ml/10 cm) et examinez les cellules au microscope une fois par semaine.
    REMARQUE : Après le 49e jour, plusieurs cellules sécrétoires peuvent être trouvées dans le surnageant de la boîte de culture.
  14. Centrifuger les cellules surnageantes à 200 x g pendant 5 min à RT.
  15. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension avec 2 mL de milieu B frais et transférez-les dans un nouveau puits à faible adhérence de plaque à 6 puits. Incuber dans un incubateur à 5 % de CO2, 37 °C.
    REMARQUE : Dans les 7 prochains jours, ne déplacez pas la plaque. La microglie pourrait adhérer au fond du puits à faible adhérence.
  16. Le 56e jour, remplacer par du C moyen (tableau 1) (2 ml/puits de plaque à 6 puits). Les microglies adhèrent au fond du puits à faible adhérence et auront l’air ramifiées au microscope.
    REMARQUE : En changeant le milieu C tous les 3 jours (2 ml/puits de plaque à 6 puits), la microglie peut être cultivée dans le milieu C pendant environ 15 jours.

2. Génération d’OI humaines et co-culture des OI avec la microglie

  1. Cultivez les CSEh dans un milieu de cellules souches jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 80 % à 90 %. Ensemencez au moins 1 x 106 cellules dans chaque puits.
  2. Ajouter Dispase (1 ml/puits de la plaque à 6 puits) dans la cellule de culture. Incuber à 37 °C pendant 5 min. Aspirez la solution de Dispase du puits.
  3. Ajouter le milieu D (tableau 1) (1 ml/puits d’une plaque à 6 puits) dans le puits. Coupez la cellule en petits morceaux à l’aide d’une pipette de 10 μL.
  4. Prélevez délicatement tous les morceaux de cellules et le milieu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
  5. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
  6. Remettre doucement les cellules en suspension dans 200 μL d’une matrice froide. Placez le tube de microcentrifugation de 1,5 cylindre dans un incubateur pendant 20 min. Fonctionne rapidement car la matrice se solidifiera à température ambiante (RT). Après 20 minutes dans l’incubateur, la matrice se solidifiera.
  7. Préparez un plat de 10 cm avec 15 ml de Medium D. Remettez la Matrix en suspension avec du Medium D et secouez doucement la boîte de Pétri.
  8. Ensuite, mettez le plat dans un incubateur pendant 5 jours. Ne déplacez pas la plaque. Définissez le jour comme jour 0 (RO). Les cellules adhéreront en 3 jours.
  9. Le jour 5 (RO) et le jour 10 (RO), rafraîchissez le support avec le support D.
  10. Le jour 12 (RO), retirer le milieu et ajouter 3 mL de Dispase dans chaque plat pendant 5 min.
  11. Aspirez le dispase et ajoutez 15 mL de Medium E (tableau 1).
  12. Récolte de la microglie : Le jour 56 (MG), aspirer doucement le Medium C, ajouter l’Accutase (1 mL/puits d’une plaque à 6 puits) et incuber à 37 °C pendant 3 min.
  13. Prélever les cellules microgliales dans un tube centrifuge de 15 mL à l’aide d’une pipette de 5 mL. Cellules de centrifugation à 200 x g à RT pendant 5 min.
  14. Aspirez doucement le surnageant et suspendez la microglie avec 1 mL de Medium E. Ajoutez la microglie aux OI digérées le 12e jour.
    REMARQUE : Le jour 12 (RO), les cellules sont adhésives. Le jour 13 (RO), les cellules se retrouvent en suspension dans le milieu E. Si le milieu passe au jaune entre le jour 12 (RO) et le jour 19 (RO), rafraîchissez le milieu avec le milieu E.
  15. Le jour 19 (RO), agrégez les organoïdes au centre du plat en remuant doucement l’assiette. Aspirez doucement le médium E et rafraîchissez le médium avec le médium F.
  16. Transférez les organoïdes avec le Medium F dans un nouveau plat de suspension.
  17. Changez de milieu une fois par semaine et choisissez des organoïdes pour les expériences.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La procédure de génération d’organoïdes rétiniens est décrite dans notre étude précédente15. Ici, nous montrons les résultats représentatifs de la microglie et de la co-culture de microglies et d’organoïdes rétiniens.

Ici, nous démontrons chaque étape de la différenciation microgliale (Figure 1A). Le jour 0 représente l’étape de la culture de cellules souches. Ensuite, les cellules souches ont été digérées et cultivées pour la formation d’EB. Au cours des 4 premiers jours du processus, les cellules formeront des EB (Figure 1B). Par la suite, nous transférons les EB suspendus dans des plats adhérents de 10 cm. Après environ 7 jours, les cellules sont similaires à celles illustrées à la figure 1C. Au fur et à mesure que la culture progresse, les cellules adhérentes sécrètent des progéniteurs hématopoïétiques dans le surnageant (Figure 1D). Ce processus prend environ 45 jours. À ce stade, les cellules peuvent être récoltées à partir du surnageant et transférées sur des plaques à 6 puits. Au cours des 7 prochains jours, la microglie deviendra mature (Figure 1E) et prête pour d’autres expériences.

Au 12e jour de la différenciation des organoïdes rétiniens, les cellules adhérentes sont digérées en culture en suspension, et le milieu E contenant la microglie est ajouté aux organoïdes rétiniens. La microglie migrera vers les organoïdes rétiniens. Afin d’observer clairement la morphologie de la microglie, nous avons ajouté la transfection EGFP-lentivirus dans les CSEh, ce qui a donné à la microglie différenciée exprimant la GFP avoir une autofluorescence (vert) (Figure 2A-C). Nous avons également examiné la structure tissulaire d’organoïdes rétiniens co-cultivés avec des microglies à l’aide du marqueur de cellules photoréceptrices CRX et du marqueur de cellules microgliales IBA1 par test d’immunofluorescence dans des organoïdes rétiniens co-cultivés de microglie après différenciation pendant 50 jours (Figure 2D).

figure-results-1
Figure 1 : Schéma de principe et chronologie de la cellule microgliale dérivée des CSEh. (A) Le protocole commence par la décongélation et le passage des CSEh dans une plaque à 6 puits. (B) Les EB homogènes formés contenant le milieu A. (C) Les EB sont transférés dans une boîte enrobée, et les progéniteurs hématopoïétiques sont formés aux jours 4 à 56. (D, E) Au jour 56, le surnageant avec les cellules est collecté (D) et transféré dans une plaque à 6 puits à faible adhérence pour former une microglie au jour 63 (E). Barre d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Images représentatives le long de la chronologie lors de la co-culture de microglies et d’organoïdes rétiniens. (A) Images représentatives de cellules microgliales dérivées de l’EGFP-hESC. (B) Co-culture de la microglie EGFP+ avec des organoïdes rétiniens après différenciation pendant 18 jours. (C) Co-culture de la microglie EGFP+ avec des organoïdes rétiniens après différenciation pendant 30 jours. Barre d’échelle : 300 μm. (D) CRX (marqueur de cellule photoréceptrice ; rouge) et IBA1 (marqueur microglial ; vert) ont été utilisés pour détecter la structure tissulaire d’organoïdes rétiniens co-cultivés avec la microglie après 50 jours de différenciation. Le DAPI (bleu) tache le noyau. Barre d’échelle : 30 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition des milieux utilisés dans cette étude. Les composants nécessaires à la préparation d’un volume de 500 mL de chaque milieu sont énumérés dans le tableau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En raison de la disponibilité limitée de la rétine humaine, notre compréhension actuelle des réponses inflammatoires rétiniennes provient presque de modèles animaux. Pour surmonter cette limitation, les organoïdes rétiniens ont été différenciés. Le développement de modèles d’organoïdes rétiniens a été un domaine de recherche actif, visant à récapituler la complexité de la rétine humaine pour la modélisation des maladies et le développement thérapeutique. Plusieurs études ont rapporté avoir réussi à générer des organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines 1,2,12,13. Cependant, la plupart de ces modèles n’ont pas la présence de microglies, qui sont connues pour jouer un rôle crucial dans le développement de la rétine et la pathogenèse de la maladie. Des études récentes ont tenté d’intégrer la microglie dans des organoïdes rétiniens ou des modèles d’organoïdes cérébraux 16,17,18, mais la méthode détaillée n’est pas claire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé, étape par étape, pour la co-culture de la microglie avec des organoïdes rétiniens à un stade précoce, tous deux dérivés de la même lignée hESC. Alors que certaines études ont exploré le rôle de la microglie dans les maladies de la rétine à l’aide de modèles animaux ou de systèmes de culture cellulaire 7,8,9, le modèle de co-culture présenté ici offre un système humain plus pertinent sur le plan physiologique pour étudier les interactions microglie-rétine et leurs implications dans la pathogenèse de la maladie.

Les étapes critiques sont l’état cellulaire des cellules souches humaines et la différenciation de la microglie et des organoïdes rétiniens. La microglie et les OI doivent être différenciées étape par étape, et les réactifs et la boîte corrects (boîte traitée en culture tissulaire ou boîte en suspension) doivent être utilisés à différents stades. Ce modèle peut nous aider à comprendre le processus de contribution de la microglie à l’apparition de maladies rétiniennes. Il a des implications importantes pour le dépistage futur des drogues et les enquêtes sur les mécanismes de la maladie. Cependant, les méthodes que nous publions actuellement ont encore quelques limites. En raison de la période de différenciation prolongée de la microglie et du manque de méthodes de cryoconservation appropriées, nous devons planifier judicieusement notre temps pour la différenciation de la microglie et des organoïdes rétiniens pour la co-culture.

En plus des organoïdes rétiniens, nous pensons que l’intégration de cellules immunitaires dans d’autres modèles d’organoïdes peut également favoriser le développement d’organoïdes. Par conséquent, il est crucial de tester d’autres systèmes organoïdes. L’intégration de différents types de cellules et d’organoïdes pour former des organes complets représente un modèle prometteur pour l’avenir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne sont pas au courant d’affiliations, d’adhésions, de subventions ou de participations financières qui pourraient affecter l’objectivité de cette étude.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude est soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82101145) et la Fondation des sciences naturelles de Pékin (Z200014).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02Anticorps ; dilution selon les instructions du fabricant
Anti-IBA1Abcamab5076Anticorps ; dilution selon les instructions du fabricant
B27Life Technologies17105-041
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies07923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSBiological Industry04-002-1A
GélatineSigmaG7041-100G
Solid GlutamaxGibco35050-061
H9 lignée cellulaireInstitut de recherche
IL-3RD Systems  ;203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
MatrixCorning356231
M-CSFRD Systems  ;216-MC-500  ;
MEM Solution d’acides aminés non essentielsSigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Pen/streptocoqueGibco15140-122
Milieu de cellules souches  ;Stemcell Technologies5990
TaurineSigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
&beta ;-mercaptoethanolLife Technologies21985-023
WiCell

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
  2. Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298(2021).
  3. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  4. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  5. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  6. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  7. O'koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
  8. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
  9. Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
  10. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222(2017).
  11. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  12. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  13. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  14. Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
  15. Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629(2022).
  16. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  17. Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
  18. Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal OrganoidsMicroglia IncorporationHuman Stem CellsCo Culture ModelRetinal Disease ModelingMicroglia DifferentiationImmunofluorescence AnalysisPhotoreceptor MarkerMicroglial MarkerCentral Nervous System

Related Articles