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Article de méthode

Microscopie corrélative à la lumière et à l’électronique bicolore pour la visualisation des interactions entre les mitochondries et les lysosomes

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DOI :

10.3791/67020

⸱

27 septembre 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un mécanisme d’utilisation de la lumière corrélative et de la microscopie électronique pour visualiser l’interaction des mitochondries et des lysosomes marqués avec mEosEM et APEX2, respectivement.

Résumé

Les organites cellulaires, tels que les mitochondries et les lysosomes, présentent des structures dynamiques. Malgré la résolution plus élevée de la microscopie électronique à transmission pour l’analyse structurelle, la microscopie optique est essentielle pour la visualisation des organites dynamiques par marquage spécifique à la cible. Le protocole suivant décrit une méthode qui combine la lumière corrélative bicolore et la microscopie électronique (CLEM) pour observer les interactions entre les mitochondries et les lysosomes. Dans cette étude, les mitochondries ont été marquées avec mEosEM (Mito-mEosEM) et les lysosomes avec TMEM192-V5-APEX2. Les résultats obtenus à partir des images CLEM nous permettent d’observer les changements dans les interactions entre les mitochondries et les lysosomes dans des conditions de stress externe. Le traitement à la bafilomycine (BFA), qui inhibe la fonction lysosomale, a entraîné une augmentation du contact entre les mitochondries et les lysosomes, conduisant à la formation de mitochondries fragmentées piégées à l’intérieur des lysosomes. À l’inverse, le traitement à l’U18666A, qui inhibe l’exportation du cholestérol à partir des lysosomes, a fait en sorte que les lysosomes soient entourés de mitochondries, indiquant une forme distincte d’interaction. Cette étude présente une méthode efficace pour observer les interactions entre les mitochondries et les lysosomes dans les cellules fixes. De plus, l’imagerie CLEM avec des sondes bicolores offre un outil puissant pour les études futures de la dynamique des organites et de leurs implications pour la fonction cellulaire et la pathologie.

Introduction

Les mitochondries et les lysosomes sont les principaux organites membranaires essentiels au maintien de l’homéostasie cellulaire. Les mitochondries sont des organites cellulaires hautement dynamiques modulés par des événements de fission et de fusion1. En général, les mitochondries sont considérées comme la centrale électrique de la cellule et sont connues pour leur rôle important dans la phosphorylation oxydative, la production d’ATP et le stockage de métabolites tels que calcium2. En plus de leur rôle dans le métabolisme énergétique, les mitochondries sont impliquées dans un certain nombre d’autres processus de signalisation cellulaire, notamment l’apoptose3,4, la signalisation calcique5,6, et le métabolisme des lipides7,8. De même, les lysosomes sont des organites cellulaires hautement dynamiques qui jouent de multiples rôles en tant que centres de recyclage cellulaire pour maintenir la propreté cellulaire par la dégradation des protéines, l’autophagie, l’endocytose et la phagocytose9. Outre leur rôle dans la dégradation, les lysosomes jouent également des rôles dans la physiologie cellulaire tels que la détection des nutriments, l’homéostasie10, le métabolisme des lipides11 et la dédifférenciation cellulaire12.

Malgré l’existence de nombreuses études sur les fonctions des organites cellulaires individuels, nos recherches récentes se sont concentrées sur la diaphonie moins comprise entre les mitochondries et les lysosomes, dont il a été démontré qu’elle influence à la fois la physiologie cellulaire et la pathologie. Des contacts entre les mitochondries et les lysosomes ont été observés dans divers types de cellules, y compris les cellules cancéreuses, les neurones et les cellules dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC)13, et ils sont principalement observés sous stress cellulaire ou dans des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson13,14 et la maladie de Charcot-Marie-Tooth15. Le contact entre les mitochondries et les lysosomes joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie métabolique par l’échange d’ions (par exemple, Ca2+)16, cholesterol17 et fer18 entre les deux organites. De plus, le contact entre les mitochondries et les lysosomes joue un rôle crucial dans le contrôle de la qualité des organites cellulaires. Par exemple, les mitochondries endommagées peuvent être ciblées pour la dégradation par le processus de mitophagie, dans lequel elles sont englouties par les autophagosomes et livrées aux lysosomes pour la dégradation. Par conséquent, l’élimination des mitochondries dysfonctionnelles peut être facilitée avant qu’elles ne causent d’autres dommages à la cellule ou aux mitochondries normales. Cette interaction entre les mitochondries et les lysosomes est cruciale pour maintenir l’homéostasie cellulaire et prévenir l’accumulation d’organites dysfonctionnels. Ainsi, seules les mitochondries endommagées sont éliminées de manière sélective, ce qui permet aux mitochondries saines de fonctionner de manière optimale au sein de la cellule.

La microscopie corrélative à la lumière et électronique (CLEM) est une technique d’imagerie qui a récemment attiré l’attention en tant que méthode de recherche en combinant les avantages de la microscopie optique (LM) et de la microscopie électronique (EM) pour fournir des informations structurelles détaillées à différentes échelles. Dans CLEM, un échantillon est d’abord imagé à l’aide de LM pour identifier des régions d’intérêt spécifiques, suivi d’étapes de préparation d’échantillon EM telles que la fixation, la déshydratation et l’intégration. Le même échantillon est ensuite observé au microscope électronique. Bien que des méthodes CLEM sur cellules vivantes aient été signalées récemment19,20,21,22, il reste difficile de combiner avec précision des images optiques d’échantillons biologiques hautement dynamiques avec des images de microscopie électronique de cellules fixes dans un seul plan. Pour les organites hautement dynamiques comme les mitochondries et les lysosomes, leur localisation précise peut changer lorsqu’ils sont observés en direct au microscope optique, et ils continuent à se déplacer même pendant le court délai nécessaire à la fixation.

Par conséquent, dans ce protocole, deux marqueurs moléculaires différents qui restent actifs même dans des solutions fixatrices ont été utilisés pour visualiser l’interaction entre les mitochondries et les lysosomes, qui jouent un rôle important dans le maintien de l’homéostasie métabolique par l’échange d’ions (par exemple, Ca2+)16, cholesterol17, et iron18 entre ces organites. Les constructions TMEM192-V5-APEX2 et Mito-mEosEM ont été utilisées pour observer les interactions des mitochondries et des lysosomes dans des cellules cultivées aux niveaux EM et LM. Pour les mitochondries, l’étiquette mEosEM a été sélectionnée pour sa capacité à préserver le signal de fluorescence lors de la préparation d’échantillons EM dans une solution fixatrice et OsO423. Pour les lysosomes, le marqueur APEX2, une protéine d’environ 28 kDa, a été utilisé pour étudier la localisation d’une protéine spécifique aux niveaux EM et LM 24. En présence de peroxyde d'hydrogène, le substrat de l'APEX2, Amplex-Red, forme un polymère insoluble qui peut être observé par microscopie confocale à l'endroit ciblé par l'étiquette. Dans ce protocole, CLEM bicolore a été utilisé pour visualiser la structure des interactions entre les lysosomes et les mitochondries dans les cellules fixes.

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Protocole

Le flux de travail étape par étape pour la préparation des échantillons est illustré dans Figure 1.

1. Culture cellulaire et transfection

  1. Culture de cellules HeLa à une densité de 1 × 105 cellules dans des boîtes de culture en verre de 35 mm contenant du DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal et 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine à 37 °C.
  2. Le lendemain de l'ensemencement des cellules, co-transfectez les cellules à une confluence de 30 % à 40 % avec les plasmides TMEM192-V5-APEX2 et Mito-mEosEM à l'aide du réactif de transfection conformément aux instructions du fabricant (1 μg chacun d'ADN plasmidique TMEM192-V5-APEX2 et Mito-mEosEM avec 3 μL de réactif de transfection). Après la transfection, traiter les cellules avec du DMSO ou du U18666A (2 μg/mL) et de la bafilomycine A1 (100 nM) pendant 18 h.

2. Imagerie microscopique confocale

  1. Après avoir traité les cellules avec de la bafilomycine et de l’U18666A pendant 18 h, retirer le milieu de culture et ajouter immédiatement 250 μL de solution fixatrice tiède (30 °C-37 °C) (2,5 % de glutaraldéhyde et 2 % de paraformaldéhyde dans une solution de cacodylate de sodium 0,1 M [pH 7,0]) par pipetage doux. Retirez immédiatement le fixateur, remplacez-le par 1,5 mL de fixateur frais et incubez sur de la glace pendant 30 min. Ensuite, laver les cellules pendant 3 x 10 min dans 1 mL de tampon de cacodylate de sodium 0,1 M glacé.
    REMARQUE : Les vapeurs d’aldéhyde sont toxiques. Toutes les expériences doivent être menées dans une hotte ventilée.
  2. Ajouter 1 mL de solution de glycine froide 20 mM pour tremper l’aldéhyde et incuber sur glace pendant 10 min. Laver 3 x 10 min dans un tampon de cacodylate de sodium froid 0,1 M.
  3. Préparez une solution fraîche contenant 300 μM d’Amplex-Red en ajoutant 10 mM de H2O2 à une solution de cacodylate de 0,1 M. Ajouter 500 μL de solution Amplex-Red dans la boîte d’échantillonnage et incuber pendant 5 min sur de la glace.
  4. Retirer la solution d’Amplex-Red et rincer 3 x 10 min avec un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M.
  5. Après la coloration Amplex-Red, utilisez un microscope confocal pour imager la zone autour des cellules d’intérêt en mode de balayage de tuiles 3 x 3. Capturez à la fois le contraste interférentiel différentiel (DIC) et le signal de fluorescence pour identifier et enregistrer la grille et les lettres sur la parabole à l’aide d’un objectif 40x (ou 60x).
    REMARQUE : Ces images de synthèse servent de carte pour identifier des cellules cibles spécifiques dans les échantillons enrobés de plastique.
  6. Imagez les cellules cibles à fort grossissement à l’aide d’un objectif 40x (ou 60x) et acquérez une image Z-stack.
    REMARQUE : Cette image à fort grossissement est superposée à une image de microscope électronique pour créer une image corrélative.

3. Préparation de l’échantillon pour le bloc EM

  1. Après l’imagerie LM, ajouter 1 mL de tétroxyde d’osmium réduit à 1 % (préparé en contenant 3 % de ferrocyanure de potassium dans un tampon cacodylate 0,3 M avec un volume égal de tétroxyde d’osmium aqueux à 2 %) pour la postfixation à 4 °C pendant 1 h, puis rincer pendant 3 x 10 min avec de l’eau distillée à 4 °C.
    REMARQUE : Les vapeurs de tétroxyde d’osmium sont toxiques. Toutes les expériences doivent être effectuées dans une hotte ventilée.
  2. Rincer 3 x 10 min avec de l’eau distillée à température ambiante, puis déshydrater dans une série d’éthanol gradué pendant 15 min à chaque fois (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % et 100 %) à température ambiante.
  3. Mélangez de l’éthanol avec de la résine époxy dans des rapports de volume de 3:1, 1:1 et 1:3, en préparant un total de 300 μL de chaque mélange. Versez chaque résine époxy dans le plat, en la laissant incuber à température ambiante pendant 1 h. Ensuite, utilisez la résine époxy à 100 % pour l’imprégnation pendant la nuit.
  4. Préparez la capsule d’enrobage ou le tube PCR en le remplissant de résine époxy fraîche, placez le tube ou la capsule à l’envers sur la région d’intérêt et placez-le dans un four à 60 °C pendant 48 h pour polymériser.

4. Coupe et imagerie TEM

  1. Une fois que la résine époxy a complètement polymérisé, séparez le verre inférieur du bloc de polymère en l’immergeant dans de l’azote liquide.
  2. Placez le bloc d’échantillon dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome et placez-le dans le bloc de coupe. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez la résine en une forme trapézoïdale ou rectangulaire autour de l’objet d’intérêt.
  3. Placez le bloc d’échantillon taillé dans le porte-échantillon et ajustez la lame diamantée. Assurez-vous que le bord d’attaque du bloc d’échantillon est parfaitement parallèle au bord de la lame diamantée.
  4. À l’aide d’un ultramicrotome, coupez des sections ultraminces à environ 60-70 nm des cellules encastrées à plat. Rassemblez les sections de série sur une grille de fentes revêtue de formvar et séchez-les sur une plaque chauffante.
  5. Colorez la section avec le colorant de contraste pendant 2 min et le citrate de plomb pendant 1 min.
  6. Placez la grille dans le porte-échantillon TEM pour l’observation. Identifiez la cellule cible d’intérêt sur la base de l’image DIC du microscope optique. Imagez l’ensemble de la zone de la cellule à l’aide d’images en mosaïque superposées avec un grossissement de 1 700x.

5. Assemblage d’images à l’aide d’imageJ Fidji.

  1. Pour commencer l’assemblage d’images, démarrez imageJ Fiji25 et cliquez sur Fichier | Nouveau | TrakEM2 (vierge) | Sélectionnez le dossier de stockage pour créer un nouveau projet TrakEM226 (Figure 2A1).
  2. Ouvrez le jeu de données d’image de vignette en glissant et en déposant les données d’image de vignette brutes dans l’espace de travail (Figure 2A2).
  3. Cliquez sur le bouton droit de la souris et sélectionnez Aligner | Montage de toutes les images de ce calque | élastique (correspondances de blocs non linéaires), puis cliquez sur OK pour accepter les valeurs par défaut des paramètres restants (Figure 2A3).
  4. Cliquez sur le bouton droit de la souris et sélectionnez Exporter | Créer une image plate pour créer une image assemblée, puis cliquez sur Fichier | Enregistrer sous pour enregistrer l’image.

6. Redimensionnement de l’image de fluorescence

  1. Ouvrez le logiciel d’agrandissement des photos (voir Table des matériaux). Cliquez sur Fichier | Ouvrez et sélectionnez l’image de fluorescence.
  2. Entrez la largeur et la hauteur de la même taille que l’image du microscope électronique, puis sélectionnez l’algorithme à appliquer dans la méthode de redimensionnement (Figure 2B1).
  3. Cliquez sur Fichier | Enregistrer sous pour enregistrer l’image redimensionnée.

7. Enregistrement d’images basé sur des points de repère avec le plugin Big Warp

  1. Ouvrez ImageJ Fiji et glissez-déposez la micrographie à fluorescence redimensionnée (image FM) et la micrographie électronique assemblée (image EM).
  2. Cliquez sur Plugins | Visionneuse de BigData | Big Wrap pour démarrer l’enregistrement, puis cliquez sur le menu déroulant pour sélectionner l’image FM comme image animée et l’image EM comme image cible (Figure 2C1).
    REMARQUE : Chaque image FM et EM aura trois nouvelles fenêtres contextuelles (image animée BigWrap, image fixe BigWrap et points de repère) pour afficher les points de repère.
  3. Comparez les images FM et EM à l’aide de fonctions telles que le zoom (molette de la souris), la rotation de l’image (déplacer la souris tout en maintenant le bouton gauche enfoncé) et le déplacement (déplacer la souris tout en maintenant le bouton droit enfoncé), puis appuyez sur la barre d’espace du clavier pour activer le mode Repère, puis appuyez sur le bouton gauche de la souris pour marquer au moins trois points de repère identifiés dans les images FM et EM ( Figure 2C2, points roses et flèche rouge).
  4. Après avoir marqué tous les points de repère identifiés, allez à Fichier | Exportation d’images animées | OK et une nouvelle fenêtre contextuelle apparaîtra avec l’image FM transformée (Figure 2C3).
    REMARQUE : La fenêtre contextuelle nouvellement créée est une image FM transformée en fonction du point de repère. Examinez l’alignement et apportez des ajustements, si nécessaire, en ajoutant ou en modifiant des points de repère et en recalculant la transformation.
  5. Cliquez sur Fichier | Enregistrer sous pour enregistrer l’image FM transformée.

8. Superposition d’images CLEM

  1. Dans ImageJ, faites glisser et déposez l’image FM transformée et l’image EM assemblée.
  2. Cliquez sur l’image | Type | Couleur 8 bits pour définir le même type d’image pour les images LM et EM (Figure 2D1).
    REMARQUE : L’image EM doit être convertie deux fois dans l’ordre suivant : 8 bits -> Couleur RVB -> Couleur 8 bits.
  3. Cliquez sur l’image | Couleur >| Fusionnez les canaux pour combiner les images en une image composite en sélectionnant les images FM et EM dans le menu déroulant, respectivement (Figure 2D2).
  4. Cliquez sur Fichier | Enregistrer sous pour enregistrer l’image CLEM.

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Résultats

Afin de visualiser les interactions entre les mitochondries et les lysosomes à l'aide de ce protocole CLEM à double coloration, nous avons utilisé Mito-mEosEM et TMEM192-V5-APEX2. Les cellules fixées ont d'abord été observées au microscope optique, puis soumises à un échantillonnage et à une imagerie en microscopie électronique. Les résultats des images corrélées sont présentés dans la Figure 3A,B et la Figure 4A. En suivant le protocole décrit ...

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Discussion

Ce protocole décrit un CLEM bicolore pour observer l’interaction des mitochondries et des lysosomes dans les cellules fixes à l’aide de marqueurs mEosEM et APEX2 génétiquement codés. Au cours des dernières décennies, les progrès de la microscopie ont considérablement amélioré la capacité d’observer les changements dans les réseaux d’organites32,33, et l’étude des interactions entre les organites est devenue de plus en plus intéressante. La microscopie à super-rés...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche fondamentale KBRI par l’intermédiaire de l’Institut coréen de recherche sur le cerveau financé par le ministère des Sciences et des TIC (24-BR-01-03). Les plasmides TMEM192-V5-APEX2 ont été aimablement fournis par Hyun-Woo Rhee (Université nationale de Séoul). Les données TEM ont été acquises dans les installations centrales de recherche sur le cerveau du KBRI.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Produits chimiques et réactifs
25 % GlutaraldéhydeMicroscopie électronique Sciences16200Les fumées d’aldéhyde sont extrêmement toxiques. Utiliser uniquement dans la hotte.
30 % Peroxyde d’hydrogèneSolution Merck107210
4 % Solution de paraformaldéhydeBiosesangPC2031-100-00Les fumées de ldéhyde sont extrêmement toxiques. Utiliser uniquement dans la hotte.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Microscopie électronique Sciences14120
ÉthanolMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Transfection plasmidique
GlycineSIGMAG8898
Citrate de plomb 3 %Microscopie électronique Sciences22410
Tétoxyde d’osmium 4 % solution aqueuseMicroscopie électronique Sciences16320Très toxique. Utiliser uniquement dans la hotte.
Hexacyanoferrate(II) de potassium trihydratéSIGMAP3289
Cacodylate de sodium trihydratéSigma-AldrichC0250-500G
Acétate d’uranyleMicroscopie électronique Sciences22400
Coloration EM UranyLessMicroscopie électronique Sciences22409
Construction plasmidique
Mito-mEosEMaddgene132706DOI :  ; 10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  ; et al.N/ADOI :  ; 10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 um filtre à seringueSartorius16534
35 mm Plat à lamelles quadrilléesMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM Capsules d’enrobageTed Pella130
Formvar Pris en charge Grille en cuivre à fente uniqueTed Pella01705
Couteau diamantéDiATOMEDU4530
Ultra-microtomeLeicaARTOS 3D
Microscopes
Microscopie confocale inverséeNikonA1 Rsi/Ti-E
Microscopie électronique à transmissionFEITecnai G2
Software et Algorithmes
Fiji/Image JNIH / open sourcehttps://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ BigWarp progicielNIH / open sourcehttps://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8  ;BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

Logiciels alternatifs
Image Resizer  : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 resize  : https://www.on1.com/products/resize-ai/

Références

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