Ce protocole démontre la combinaison de l’imagerie et de l’électrophysiologie pour détecter de manière fiable les dépolarisations propagées chez les souris adultes à la suite d’un traumatisme craniocérébral léger.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
* These authors contributed equally
Ce protocole démontre la combinaison de l’imagerie et de l’électrophysiologie pour détecter de manière fiable les dépolarisations propagées chez les souris adultes à la suite d’un traumatisme craniocérébral léger.
Les dépolarisations qui se propagent sont des événements massifs dans le cerveau qui passent souvent inaperçus en raison de leur lente propagation à travers la matière grise. Comme la détection SD peut être insaisissable, elle est confirmée de manière optimale à l’aide de plusieurs méthodes. Ce protocole décrit des méthodes permettant de combiner l’imagerie et l’électrophysiologie pour détecter les SD d’une manière que la plupart des laboratoires peuvent adopter de manière fiable et facile. Les SD surviennent à la suite de lésions cérébrales traumatiques, d’un accident vasculaire cérébral, d’hémorragies sous-arachnoïdiennes, d’une ischémie et d’une aura migraineuse. Historiquement, les SD ont été enregistrées à l’aide d’amplificateurs à courant continu, qui peuvent résoudre le lent décalage extracellulaire et la dépression de l’activité à haute fréquence. Cependant, les amplificateurs à courant continu sont presque impossibles à utiliser pour les enregistrements chroniques in vivo. Ce protocole utilise un amplificateur CA commun pour les enregistrements électrophysiologiques in vivo afin de confirmer la dépression à haute fréquence, ainsi que l’imagerie non invasive nécessaire pour détecter l’onde de SD se propageant. Ces méthodes peuvent être adoptées et/ou modifiées de manière fiable pour la plupart des approches expérimentales afin de confirmer la présence ou l’absence de SD à la suite d’une lésion cérébrale.
Les dépolarisations étalées (DS) sont associées à diverses affections neurologiques, notamment les lésions cérébrales traumatiques (TCC), les accidents vasculaires cérébraux, les hémorragies sous-arachnoïdiennes, l’ischémie et l’aura migraineuse1. Les SD ont été impliqués dans la progression des lésions tissulaires lors d’accidents vasculaires cérébraux et de TCC2. Le mécanisme exact sous-jacent à la progression de la perte de tissus n’est pas clair3,4. Cependant, les SD se produisent lorsque les demandes métaboliques des neurones ne sont pas satisfaites par suffisamment d’oxygène et de glucose, car la fonction de la pompe sodium-potassium dépendante de l’ATP devient inadéquate pour maintenir les gradients ioniques. Pour comprendre le rôle des SD dans la perte de tissus, des techniques précises sont nécessaires pour les mesurer et les étudier, ce qui est crucial pour faire progresser les connaissances scientifiques. Les SD sont des événements neurologiques importants qui peuvent souvent passer inaperçus en raison de la conception expérimentale et/ou des limites de l’instrumentation.
Le rôle des dépolarisations étalées (DS) dans la progression des lésions est actuellement élucidé, mais leur rôle dans les lésions cérébrales traumatiques légères (TCL) reste incertain. Des études récentes utilisant les techniques décrites dans ce manuscrit ont montré que les SD sont initiés dans des modèles murins de TCLm à crâne fermé, même lorsqu’il n’y a pas de lésions tissulaires manifestes ou de saignements5, 6. Ces études suggèrent que les SD peuvent contribuer à des troubles neurologiques aigus et à la neuroinflammation. De plus, la présence de SD induits par un TCLm a été étroitement associée à des déficits comportementaux aigus 6,7. Par conséquent, il est probable que les DS soient amorcés dans tous les modèles de TCC, mais leur rôle demeure difficile à déterminer sans confirmation. La confirmation de la présence de DS est cruciale pour évaluer avec précision les résultats des TCL.
Les dépolarisations étalées (SD) sont identifiées par une baisse significative du potentiel extracellulaire, connue sous le nom de « décalage DC », et par une dépression de l’activité à haute fréquence8. La résolution du « décalage DC » prend généralement quelques secondes (~10 s)9. Pour capturer le « décalage CC », un amplificateur CC et des électrodes en fil d’argent sont nécessaires. Cependant, l’électrophysiologie in vivo est généralement réalisée avec des amplificateurs CA, qui sont conçus pour filtrer les événements à basse fréquence afin de réduire les artefacts de mouvement. Malheureusement, ce filtrage à basse fréquence supprime également le « décalage DC ». De plus, l’argent est toxique et ne convient pas aux enregistrements chroniques. Les amplificateurs à courant alternatif couramment utilisés peuvent détecter la dépression de l’activité à haute fréquence, mais sans le « décalage CC » qui l’accompagne, il est difficile de confirmer la présence d’une carte SD.
Les dépolarisations étalées (SD) peuvent également être détectées à l’aide de diverses techniques d’imagerie. Le plus souvent, les SD sont imagés à l’aide d’une imagerie par contraste de chatoiement laser, qui mesure le flux sanguin cérébral à travers le crâne intact10. Les SD influencent considérablement le système vasculaire cérébral et le flux sanguin. Chez la plupart des espèces autres que les souris, les SD induisent une onde d’hyperperfusion qui se propage avec le bord d’attaque de la classe SD11. Les SD peuvent également être imagés à l’aide d’indicateurs fluorescents au calcium ou au glutamate12, bien que cela nécessite de charger les tissus avec des colorants ou des indicateurs fluorescents génétiquement codés12,13. Il est intéressant de noter que les SD peuvent être observées à l’œil nu grâce aux signaux optiques intrinsèques (iOS) associés à la classe SD14. Les iOS sont des signaux complexes composés de molécules autofluorescentes telles que NAD(P)H et FADH15,16, gonflement des tissus17, et des modifications potentielles du flux sanguin cérébral. Malgré leur complexité, les signaux iOS sont fiables et peuvent être capturés chez des souris de type sauvage18. Ce protocole décrit la méthode d’imagerie iOS, car cette technique peut être mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire sans avoir besoin de virus spécialisés ou d’animaux transgéniques.
L’objectif global de cette méthode est de confirmer expérimentalement la présence ou l’absence d’une dépolarisation étalée (DS) à la suite d’un traumatisme craniocérébral léger (TCL) en utilisant simultanément l’imagerie et l’électrophysiologie. L’électrophysiologie in vivo, facilitée par des amplificateurs avancés, est une technique couramment utilisée. Cependant, ces amplificateurs sont incapables de détecter le « décalage continu » caractéristique. Par conséquent, les techniques d’imagerie, telles que décrites dans ce protocole, sont utilisées pour confirmer avec certitude la présence ou l’absence de DS. L’avantage de combiner l’imagerie et l’électrophysiologie est que l’imagerie peut détecter la propagation du SD, tandis que l’électrophysiologie peut identifier la dépression à haute fréquence associée.
Dans l’ensemble, cette méthode est adaptée pour étudier la présence de dépolarisations étalées (DS) à la suite d’un traumatisme crânien (TCC). Son application pourrait améliorer la compréhension de la fonction du réseau cortical après un TCC et un SD. Ce protocole peut être adapté d’un modèle d’impact crânien fermé à d’autres modèles, tels que l’impact cortical contrôlé, la percussion fluide ou la perte de poids. La mise en œuvre de ce protocole dans plusieurs laboratoires pourrait élucider le rôle des SD dans diverses sévérités de TCC. Tout modèle de TCC établi peut être utilisé, suivi des procédures d’imagerie et d’électrophysiologie iOS décrites dans ce protocole.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Comité de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Institut de l'Université du Nouveau-Mexique. Les souris C57BL/6J ont été obtenues d’une source commerciale. Un nombre égal de souris mâles et femelles ont été utilisées dans la tranche d’âge de 8 à 14 semaines. Toutes les souris pesaient environ 20 g. Les détails des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux. Le fichier supplémentaire 1 contient la liste des abréviations.
1. Préparation du crâne pour l’imagerie et l’électrophysiologie
2. Détection des dépolarisations étalées avec l’imagerie du signal optique intrinsèque (iOS) et l’électrophysiologie AC
3. Visualisation et quantification d’images iOS
4. Analyse électrophysiologique
REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser massivement l’expertise du laboratoire Buzsaki et son code généré par MATLAB pour visualiser et analyser les données d’électrophysiologie. L’analyse nécessitera le téléchargement de MATLAB avec un code d’activation institutionnel et du fichier zip « Buzcode » du Buzsaki lab via GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Figure 1 illustre une représentation graphique du dispositif expérimental. Les vis d'enregistrement sont positionnées dans le cortex visuel primaire, une électrode en vis étant placée dans le vermis cérébelleux servant d'électrode de masse. Les vis crâniennes et les broches en or sont fixées au crâne à l'aide de colle cyanoacrylate et de ciment dentaire. Il est essentiel de limiter le ciment dentaire à la partie caudale du crâne afin de laisser de l'espace pour l'impact et l'imagerie. L'empl...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
La propagation des dépolarisations est cruciale dans divers modèles de maladies, notamment les lésions cérébrales traumatiques (TCC), les accidents vasculaires cérébraux et la migraine1. La détection précise des SD est essentielle pour comprendre leur rôle dans les déficits comportementaux aigus et/ou l’activation du système neuroimmunitaire après des lésions cérébrales traumatiques légères (TCL)23,24. Pour atténuer le risque de manquer de...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Ce travail a été soutenu par le NIGMS P20GM109089 et le ministère de la Défense PR200891 subventions.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| #00-90 x .118 Vis à métaux | US Micro Screw | 00.90-118-M-SS-P, | |
| de 0,8 mm de diamètre Foret | PCB | WYTP21, Amazon | |
| 16-A Headstage | Intan ; | C3335 | |
| 2,1 mm Meules micro foret | Fine Science Tools | 19007-21 | |
| Amplificateur AC | d’enregistrement | Intan | |
| C57BL/6J souris ; | Laboratoire Jackson ; | Jax#000664 | |
| Caméra CCD | Mightex | TCE-1304-U | |
| Objectif d’extension | Zeikos ; | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (buprénorphine à libération lente) | Midwest Veterinary Supply | Numéro de produit 267.10000.3 | |
| Broche de connecteur dorée (femelle) | A-M Systems | 520100 | |
| Goupille de connecteur dorée (mâle) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impactor One | Leica | 39463930 | |
| Panneau LED | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | Code d’activation | |
| Colle cyanoacrylate de qualité médicale | MasterBond | MB287 | |
| Micro-Manager Camera Software | Image J | NA | |
| Perceuse à ongles/polisseuse à ongles | Makartt Lime à ongles électrique | JD700 | |
| Connecteurs omnétiques | Omnetics | A79014-001 | |
| Logiciel d’acquisition de données RHX | Intan | NA | |
| Fil non revêtu en acier inoxydable (0,005") | A-M Systems | 792800 | |
| Cadre stéréotaxique | Kopf Intruments | 1923-B | |
| Teets 'cold cure' ciment dentaire | A-M systems | 525000, 526000 | |
| Objectif d’appareil photo XLR | Nikon | NIKKOR 50 mm f/1.8-16 |
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.