Combinaison de l’imagerie et de l’électrophysiologie pour visualiser et enregistrer les dépolarisations d’étalement chez la souris

Résumé

Ce protocole démontre la combinaison de l’imagerie et de l’électrophysiologie pour détecter de manière fiable les dépolarisations propagées chez les souris adultes à la suite d’un traumatisme craniocérébral léger.

Résumé

Les dépolarisations qui se propagent sont des événements massifs dans le cerveau qui passent souvent inaperçus en raison de leur lente propagation à travers la matière grise. Comme la détection SD peut être insaisissable, elle est confirmée de manière optimale à l’aide de plusieurs méthodes. Ce protocole décrit des méthodes permettant de combiner l’imagerie et l’électrophysiologie pour détecter les SD d’une manière que la plupart des laboratoires peuvent adopter de manière fiable et facile. Les SD surviennent à la suite de lésions cérébrales traumatiques, d’un accident vasculaire cérébral, d’hémorragies sous-arachnoïdiennes, d’une ischémie et d’une aura migraineuse. Historiquement, les SD ont été enregistrées à l’aide d’amplificateurs à courant continu, qui peuvent résoudre le lent décalage extracellulaire et la dépression de l’activité à haute fréquence. Cependant, les amplificateurs à courant continu sont presque impossibles à utiliser pour les enregistrements chroniques in vivo. Ce protocole utilise un amplificateur CA commun pour les enregistrements électrophysiologiques in vivo afin de confirmer la dépression à haute fréquence, ainsi que l’imagerie non invasive nécessaire pour détecter l’onde de SD se propageant. Ces méthodes peuvent être adoptées et/ou modifiées de manière fiable pour la plupart des approches expérimentales afin de confirmer la présence ou l’absence de SD à la suite d’une lésion cérébrale.

Introduction

Les dépolarisations étalées (DS) sont associées à diverses affections neurologiques, notamment les lésions cérébrales traumatiques (TCC), les accidents vasculaires cérébraux, les hémorragies sous-arachnoïdiennes, l’ischémie et l’aura migraineuse¹. Les SD ont été impliqués dans la progression des lésions tissulaires lors d’accidents vasculaires cérébraux et de TCC². Le mécanisme exact sous-jacent à la progression de la perte de tissus n’est pas clair^3,4. Cependant, les SD se produisent lorsque les demandes métaboliques des neurones ne sont pas satisfaites par suffisamment d’oxygène et de glucose, car la fonction de la pompe sodium-potassium dépendante de l’ATP devient inadéquate pour maintenir les gradients ioniques. Pour comprendre le rôle des SD dans la perte de tissus, des techniques précises sont nécessaires pour les mesurer et les étudier, ce qui est crucial pour faire progresser les connaissances scientifiques. Les SD sont des événements neurologiques importants qui peuvent souvent passer inaperçus en raison de la conception expérimentale et/ou des limites de l’instrumentation.

Le rôle des dépolarisations étalées (DS) dans la progression des lésions est actuellement élucidé, mais leur rôle dans les lésions cérébrales traumatiques légères (TCL) reste incertain. Des études récentes utilisant les techniques décrites dans ce manuscrit ont montré que les SD sont initiés dans des modèles murins de TCLm à crâne fermé, même lorsqu’il n’y a pas de lésions tissulaires manifestes ou de saignements^{5, 6}. Ces études suggèrent que les SD peuvent contribuer à des troubles neurologiques aigus et à la neuroinflammation. De plus, la présence de SD induits par un TCLm a été étroitement associée à des déficits comportementaux aigus ^6,7. Par conséquent, il est probable que les DS soient amorcés dans tous les modèles de TCC, mais leur rôle demeure difficile à déterminer sans confirmation. La confirmation de la présence de DS est cruciale pour évaluer avec précision les résultats des TCL.

Les dépolarisations étalées (SD) sont identifiées par une baisse significative du potentiel extracellulaire, connue sous le nom de « décalage DC », et par une dépression de l’activité à haute fréquence⁸. La résolution du « décalage DC » prend généralement quelques secondes (~10 s)⁹. Pour capturer le « décalage CC », un amplificateur CC et des électrodes en fil d’argent sont nécessaires. Cependant, l’électrophysiologie in vivo est généralement réalisée avec des amplificateurs CA, qui sont conçus pour filtrer les événements à basse fréquence afin de réduire les artefacts de mouvement. Malheureusement, ce filtrage à basse fréquence supprime également le « décalage DC ». De plus, l’argent est toxique et ne convient pas aux enregistrements chroniques. Les amplificateurs à courant alternatif couramment utilisés peuvent détecter la dépression de l’activité à haute fréquence, mais sans le « décalage CC » qui l’accompagne, il est difficile de confirmer la présence d’une carte SD.

Les dépolarisations étalées (SD) peuvent également être détectées à l’aide de diverses techniques d’imagerie. Le plus souvent, les SD sont imagés à l’aide d’une imagerie par contraste de chatoiement laser, qui mesure le flux sanguin cérébral à travers le crâne intact¹⁰. Les SD influencent considérablement le système vasculaire cérébral et le flux sanguin. Chez la plupart des espèces autres que les souris, les SD induisent une onde d’hyperperfusion qui se propage avec le bord d’attaque de la classe SD¹¹. Les SD peuvent également être imagés à l’aide d’indicateurs fluorescents au calcium ou au glutamate¹², bien que cela nécessite de charger les tissus avec des colorants ou des indicateurs fluorescents génétiquement codés^12,13. Il est intéressant de noter que les SD peuvent être observées à l’œil nu grâce aux signaux optiques intrinsèques (iOS) associés à la classe SD¹⁴. Les iOS sont des signaux complexes composés de molécules autofluorescentes telles que NAD(P)H et FADH^15,16, gonflement des tissus¹⁷, et des modifications potentielles du flux sanguin cérébral. Malgré leur complexité, les signaux iOS sont fiables et peuvent être capturés chez des souris de type sauvage¹⁸. Ce protocole décrit la méthode d’imagerie iOS, car cette technique peut être mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire sans avoir besoin de virus spécialisés ou d’animaux transgéniques.

L’objectif global de cette méthode est de confirmer expérimentalement la présence ou l’absence d’une dépolarisation étalée (DS) à la suite d’un traumatisme craniocérébral léger (TCL) en utilisant simultanément l’imagerie et l’électrophysiologie. L’électrophysiologie in vivo, facilitée par des amplificateurs avancés, est une technique couramment utilisée. Cependant, ces amplificateurs sont incapables de détecter le « décalage continu » caractéristique. Par conséquent, les techniques d’imagerie, telles que décrites dans ce protocole, sont utilisées pour confirmer avec certitude la présence ou l’absence de DS. L’avantage de combiner l’imagerie et l’électrophysiologie est que l’imagerie peut détecter la propagation du SD, tandis que l’électrophysiologie peut identifier la dépression à haute fréquence associée.

Dans l’ensemble, cette méthode est adaptée pour étudier la présence de dépolarisations étalées (DS) à la suite d’un traumatisme crânien (TCC). Son application pourrait améliorer la compréhension de la fonction du réseau cortical après un TCC et un SD. Ce protocole peut être adapté d’un modèle d’impact crânien fermé à d’autres modèles, tels que l’impact cortical contrôlé, la percussion fluide ou la perte de poids. La mise en œuvre de ce protocole dans plusieurs laboratoires pourrait élucider le rôle des SD dans diverses sévérités de TCC. Tout modèle de TCC établi peut être utilisé, suivi des procédures d’imagerie et d’électrophysiologie iOS décrites dans ce protocole.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Comité de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Institut de l'Université du Nouveau-Mexique. Les souris C57BL/6J ont été obtenues d’une source commerciale. Un nombre égal de souris mâles et femelles ont été utilisées dans la tranche d’âge de 8 à 14 semaines. Toutes les souris pesaient environ 20 g. Les détails des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux. Le fichier supplémentaire 1 contient la liste des abréviations.

1. Préparation du crâne pour l’imagerie et l’électrophysiologie

1. Anesthésie l’animal dans une boîte d’induction d’isoflurane avec 2 à 3 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène, en assurant une profondeur d’anesthésie appropriée sans broncher d’un pincement de la patte.
2. Administrer des analgésiques préopératoires (buprénorphine à libération lente, 3,25 mg/kg, SQ) avant de placer l’animal dans un cadre stéréotaxique et maintenir l’anesthésie (2 % d’isoflurane).
3. Ajoutez une pommade ophtalmique et maintenez la température corporelle de l'animal avec un coussin chauffant qui a un retour de température corporelle.
4. Rasez les cheveux au-dessus du crâne où se trouvera l’incision, le long de la ligne médiane de la fissure oculaire jusqu’au lambda.
5. Retirez les poils coupés avant de stériliser la peau avec un gommage et une solution antiseptiques et désinfectants. Terminez avec de l’éthanol à 70 % et répétez l’opération trois fois pour vous assurer que le site chirurgical est stérile.
6. À l’aide d’une lame de scalpel #10, faites une incision sur la ligne médiane du rostral à la caudale, immédiatement suivie de l’application de colle cyanoacrylate de qualité médicale sur l’incision. Écartez la peau latéralement pour exposer le crâne.
7. Ajoutez une ou deux gouttes de colle cyanoacrylate sur le crâne pour ajouter une protection supplémentaire au crâne.
   REMARQUE : L’application de la colle est sensible au temps car le crâne commencera à devenir opaque lorsqu’il est exposé à l’air pendant plus de 10 s. Cela obscurcira la visualisation de l’SD par des méthodes d’imagerie.
8. Pendant que la colle sèche, utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour augmenter la taille de l’incision sur le cervelet. Une fois la colle prise, commencez l’implantation des électrodes de vis crânienne.
   1. Stérilisez les vis du crâne à l’aide d’un stérilisateur à billes pendant 20 à 30 secondes avant l’implantation.
   2. Placez les vis du crâne dans une région éloignée du site d’initiation du SD pour maintenir une fenêtre visuelle ouverte.
      REMARQUE : Pour les enregistrements chroniques dans le cortex visuel primaire, trois vis crâniennes sont utilisées. La première vis est placée approximativement à y = -6,00 mm du bregma, dans le cervelet, servant d’électrode de référence. Les électrodes d’enregistrement sont positionnées à y = -2,79 mm du bregma et x = ±2,5 mm de la ligne médiane, dans les hémisphères gauche et droit.
   3. À l’aide d’un foret de 0,8 mm, percez des avant-trous à travers le crâne. Pour éviter d’endommager les tissus sous-jacents, l’idéal est de -0,5 mm en z. Utilisez des vis #00-90 qui sont pré-soudées à des broches dorées avec du fil d’acier inoxydable.
   4. Tournez les vis vers le bas dans le crâne.1.5-2 tours complets feront passer la vis à travers le crâne et entreront en contact avec la surface corticale.
   5. Enroulez l’excédent de fil autour de la vis, en laissant un peu de mou dans le fil pour un placement ultérieur dans la tête.
   6. En utilisant les mêmes procédures, placez les autres vis crâniennes.
   7. Une fois que toutes les vis du crâne sont en place, branchez toutes les broches dorées dans le connecteur de tête souhaité. Maintenez le connecteur en place à l’aide du bras stéréotaxique et maintenez les broches du connecteur près au-dessus des têtes de vis tout en vous assurant que les fils ne se touchent pas.
   8. Scellez toute la zone avec de la colle cyanoacrylate, en veillant à ne pas perturber la zone d’imagerie devant les vis du crâne.
   9. Construisez du ciment dentaire autour de la base des broches dorées, en vous assurant que les broches dorées des vis du crâne ne sont pas connectées aux broches dorées de la tête.
   10. Laissez le ciment dentaire durcir avant de retirer le connecteur de foulée.
   11. Retirez l’animal du cadre stéréotaxique et remettez-le dans la cage familiale pour qu’il se rétablisse. Suivez les soins postopératoires standard et gardez les animaux sur un coussin chauffant pendant leur convalescence après l’anesthésie.
       REMARQUE : Après l’opération, les animaux ont été logés individuellement et surveillés quotidiennement pour détecter la douleur. Suivez les directives de l’établissement local pour l’analgésie. Si vous utilisez une buprénorphine à libération lente, surveillez la douleur et donnez potentiellement une dose supplémentaire à 72 h.
9. Retirez tous les objets qui pourraient s’accrocher aux électrodes, y compris le boîtier et l’enrichissement. Utilisez une litière standard avec un accès ad libium à la nourriture et à l’eau.
   REMARQUE : Prévoyez une période de récupération de deux jours entre la chirurgie et l’enregistrement.

2. Détection des dépolarisations étalées avec l’imagerie du signal optique intrinsèque (iOS) et l’électrophysiologie AC

1. Anesthésier les animaux avec 2 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène.
   REMARQUE : La partie imagerie de cette procédure devrait prendre ~5 min, et la quantité d’exposition à l’isoflurane devrait être constante.
2. Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique. À travers le cône nasal, maintenez 1 à 2 % d’isoflurane dans l’oxygène.
   REMARQUE : Il est essentiel de maintenir une profondeur d’anesthésie appropriée, car l’isoflurane est connu pour réduire les DS. Le maintien de 60 à 70 respirations / min est recommandé tout au long de l’expérience.
3. Placez l’animal sous l’appareil photo et assurez-vous que l’appareil photo est focalisé sur la surface corticale en ajustant la bague de mise au point.
4. Appliquez de l’huile minérale sur la zone d’imagerie pour augmenter la transparence.
5. Allumez les ordinateurs, le panneau LED et l’équipement d’électrophysiologie.
   REMARQUE : Le panneau LED fonctionne mieux lorsqu’il est positionné devant l’animal pour éclairer la fenêtre d’imagerie lorsque les lumières zénithales sont éteintes. La lumière a été réglée à ~2 400 lux (95 % de puissance) avec un réglage de température froide de 4000K.
6. Réglage de charge pour iOS à l’aide de Micro-Manager^19,20,21,22.
   1. Appuyez sur Live pour voir la souris sous la caméra et centrer le crâne de l'animal sous la caméra. Fermez la fenêtre « Live ».
   2. Appuyez sur Multi-D Acq.
   3. Dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle, sélectionnez les points temporels souhaités.
      REMARQUE : Il est recommandé de compter 750 images à un intervalle de 250 ms.
   4. Enregistrez les images dans le chemin d’accès au fichier et le préfixe de nom souhaités.
7. Connectez les broches dorées de l’animal au connecteur de l’avant-scène, puis à l’avant-scène.
8. Réglage de charge pour le logiciel Intan.
   1. Cliquez sur l’icône Choisir le format de fichier, et dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Un fichier par format de type de signal. Cela permet d’enregistrer le fichier en tant que « .dat » pour une utilisation ultérieure dans MATLAB.
   2. Dans l’onglet BW, sous Bande passante matérielle, sélectionnez la bande passante de l’amplificateur de 0,13 à 500 Hz.
   3. Sous Sélecteur d’affichage de filtre, sélectionnez WIDE pour couvrir la plus large gamme de signaux.
   4. Pour sélectionner le chemin d’accès au fichier à enregistrer, cliquez sur l’icône Sélectionner le nom du fichier.
9. Effectuer un impact à l’aide d’un impacteur électromagnétique.
   REMARQUE : Les réglages de l’impacteur sont une vitesse d’impact de 4 m/s et une déviation de 5 mm.
   1. Allumez l’impacteur et assurez-vous que l’embout se rétracte et s’étend correctement en actionnant la bascule à 3 voies pour rétracter l’embout et étendre l’embout. La pointe doit être allongée avant de placer l’animal sous la pointe.
   2. En vous déplaçant rapidement, placez l’animal sur un lit en mousse et glissez le lit sous la pointe.
   3. Alignez l’extrémité de l’impacteur sur la ligne médiane et sur 1 mm rostral de la bregma.
   4. Abaissez l'embout de l'impacteur jusqu'à ce qu'il touche fermement le haut de la tête de l'animal.
      REMARQUE : N’enfoncez pas la pointe dans la tête.
   5. Appuyez sur le levier pour rétracter l’extrémité de l’impacteur, puis abaissez-le manuellement de 5 mm avant d’activer le levier d’impact.
   6. Retirez immédiatement l’animal du lit de mousse et placez-le sous la caméra pour l’imagerie dans les 5 s, lorsque le SD est initié par l’impact.
10. Démarrez l’imagerie iOS en cliquant sur Acquérir ! dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle. Image pendant 4 min pour capturer l’intégralité de la SD.
11. Démarrez l’enregistrement électrophysiologique en cliquant sur l’icône Enregistrer sur le logiciel Intan.
12. Retirez l’animal du coussin en mousse et laissez-le se rétablir dans une arène ouverte ou une cage domestique.
    REMARQUE : Il est recommandé d’enregistrer l’électrophysiologie pendant au moins 1 h pour permettre à la fonction du réseau cortical de se rétablir.
13. Une fois l’enregistrement terminé, débranchez l’animal de la scène et du connecteur et remettez-le dans sa cage.
    REMARQUE : Il est recommandé de prévoir 24 h entre chaque impact et la session d’enregistrement. L’animal peut rester dans sa cage d’origine pendant tout le temps en dehors des sessions d’enregistrement.

3. Visualisation et quantification d’images iOS

1. Dans ImageJ^19,20,21,22, ouvrez la pile d’images en cliquant sur la séquence Fichier > Importer > Image.
2. Faites défiler manuellement les images pour vous assurer de l’absence de mouvement ou de tout autre artefact.
3. Pour générer le tracé de l’ET, créez un retour sur investissement en utilisant le curseur pour dessiner un carré.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un carré de 30 x 30 pixels. On peut utiliser n’importe quelle forme ou taille, mais assurez-vous que la taille du retour sur investissement ne change pas d’un animal à l’autre.
4. Créez un tracé en cliquant sur Piles de > d’images > Tracer le profil de l’axe Z. Sur le graphique nouvellement créé, cliquez sur le bouton en direct. Revenez à la pile d’images du SD et déplacez le retour sur investissement jusqu’à ce que le graphique montre la courbe SD. Le graphique doit ressembler à une vague de Sin avec une première hausse suivie d’une chute en dessous de la ligne de base et d’un retour lent à la ligne de base en quelques minutes.
   REMARQUE : Les tracés peuvent être exprimés en unités arbitraires (AU) ou en pourcentage de référence en utilisant les premières images comme moyenne de base.
5. Sur le tracé généré, cliquez sur Liste pour générer une liste de valeurs qui peuvent être tracées dans d’autres logiciels de génération de graphiques ou Matlab.
6. Pour la visualisation, transformez l’image en niveaux de gris en table de correspondance dans ImageJ by Image > Lookup Tables > Fire.

4. Analyse électrophysiologique

REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser massivement l’expertise du laboratoire Buzsaki et son code généré par MATLAB pour visualiser et analyser les données d’électrophysiologie. L’analyse nécessitera le téléchargement de MATLAB avec un code d’activation institutionnel et du fichier zip « Buzcode » du Buzsaki lab via GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).

1. Dans le logiciel d’électrophysiologie Intan, assurez-vous que les données brutes exportées sont enregistrées au format « .dat ».
   REMARQUE : Matlab peut être installé à partir du site Web de MathWorks. Un code d’activation institutionnel ou individuel est nécessaire pour l’achat et l’utilisation de Matlab. Une expérience préalable de l’exécution de code dans Matlab est nécessaire pour effectuer cette analyse.
2. Utilisez la fonction de bz_LoadBinary de code Buzaki pour charger les données dans Matlab.
   REMARQUE : Exemple "'data' = bz_LoadBinary ('chemin d'accès complet au fichier de données', 'fréquence', fréquence d'échantillonnage, nChannels, nombre de canaux) ;
3. Filtrez le bruit AC à l’aide d’un filtre coupe-bande centré à 60 Hz.
   REMARQUE : Exemple notch_freq = 60 ; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)) ; filtered_data = filtfilt(b, a, données) ;
4. Isoler l’activité haute fréquence à l’aide d’un filtre passe-bande d’une gamme de 0,5 à 100 Hz, conformément aux recommandations du groupe COSBID pour l’analyse et la visualisation des dépolarisations d’étalement (SD).
5. Calculez le spectrogramme de puissance à l’aide de la commande pspectrum dans MatLab.
6. Pour visualiser, tracez le spectrogramme haute fréquence et le spectrogramme de puissance sur la même échelle de temps et dans une colonne.
   REMARQUE : À partir des parcelles, il y aura une extension de la dépression à haute fréquence et une perte de puissance.

Résultats

La figure 1 illustre une représentation graphique du dispositif expérimental. Les vis crâniennes d’enregistrement sont positionnées dans le cortex visuel primaire, avec une électrode de vis crânienne placée dans le vermis cérébelleux comme électrode de terre. Les vis du crâne et les goupilles dorées sont fixées au crâne à l’aide de colle cyanoacrylate et de ciment dentaire. Il est crucial de limiter le ciment dentaire à la partie caudale du crâne pour laisser de l’espace pour l’impact et l’imagerie. L’emplacement de l’impact, centré sur la ligne médiane et à environ 1 mm rostrale par rapport à la bregma, est indiqué en < classe forte = « xfig » >Figure 1.

Les images représentatives des signaux optiques intrinsèques (iOS) sont montrées dans Figure 2A. Les images en niveaux de gris sont converties à l’aide d’une table de correspondance d’incendie pour améliorer la visualisation des dépolarisations étalées (SD). L’iOS englobe divers signaux, notamment NAD(P)H, FADH et la réflectance tissulaire, ce qui rend l’interprétation et la comparaison de ces signaux difficiles. Les grands récipients doivent être clairement visibles à travers la fenêtre de la super colle (indiquée par des flèches), tandis que la ligne pointillée Figure 2A marque la propagation de l’onde SD. Bien que les SD soient difficiles à observer en temps réel, elles deviennent plus apparentes lorsque les images sont accélérées (voir la vidéo supplémentaire 1). Certaines petites branches peuvent sembler « disparaître » en raison d’une vasoconstriction (Figure 2A). Une petite région d’intérêt (ROI) extraite de la pile d’images doit produire un tracé de l’axe Z similaire à Figure 2B). D’après les enregistrements électrophysiologiques, le signal haute fréquence extrait doit ressembler aux panneaux supérieurs de Figure 2C,D. Ces enregistrements ont été lancés immédiatement après le traumatisme craniocérébral léger (TCL), les animaux restant sous anesthésie à l’isoflurane pendant les 4 minutes d’imagerie iOS. Après l’élimination de l’isoflurane, l’activité à haute fréquence devrait revenir rapidement en moins d’une minute chez les animaux fictifs, comme le montre Figure 2C (encadré rouge). À l’inverse, si un SD se produisait, l’activité à haute fréquence resterait déprimée pendant plusieurs minutes avant de se rétablir (Figure 2D, encadré rouge). Les panneaux inférieurs de Figure 2C,D affichent la puissance calculée (V²) pour chaque graphique à haute fréquence. Ces graphiques de puissance aident à identifier la suppression et la récupération de l’activité à haute fréquence par l’augmentation rapide de la puissance (indiquée par le bord droit des cases rouges).

Figure 1 : Configuration expérimentale et localisation des vis d’impact et de crâne. La surface dorsale du crâne est exposée par une incision cutanée. Le crâne et la peau sont scellés avec de la colle cyanoacrylate pour améliorer la transparence. Un trou de bavure pour le sol est percé à y = -6,00 et x = 0 à partir de bregma. Les trous de bavure pour les électrodes d’enregistrement sont placés à y = -2,79 et x = ±2,5 à partir de bregma. Les vis en acier inoxydable sont filetées à travers le crâne et soudées à des broches dorées avec du fil d’acier inoxydable non revêtu. On prend soin d’éviter de couvrir excessivement la surface du crâne avec du ciment dentaire afin d’assurer un espace adéquat pour l’impact et l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images iOS représentatives et enregistrements AC. (A) Images iOS représentatives avec des flèches indiquant les vaisseaux sanguins. Les images en niveaux de gris sont converties en table de correspondance Fire dans ImageJ pour une meilleure visualisation. La ligne noire pointillée indique la propagation de l’écart, visualisée comme une vague d’intensité accrue dans l’iOS. La SD est clairement visible lorsque vous faites défiler rapidement l’ensemble de la pile d’images. Le signal iOS reflète divers changements physiologiques et métaboliques associés au SD, y compris la production mitochondriale de NAD(P)H et FADH et l’œdème neuronal. La boîte noire met en évidence la région d’intérêt (ROI) utilisée pour générer le tracé dans (B). Barre d’échelle : 1 mm. (B) Trace représentative de la carte SD iOS exprimée en pourcentage de la ligne de base. Le signal iOS monte et revient près de la ligne de base en 60 s environ. Bien que les modifications des signaux iOS soient faibles (environ 10 %), elles sont suffisantes pour identifier la SD. Dans les enregistrements AC pour les animaux fictifs (C) et SD (D), les traces supérieures montrent une activité à haute fréquence et les traces inférieures représentent la puissance (V²). Les cases bleues indiquent les périodes d’anesthésie à l’isoflurane, tandis que les cases rouges indiquent la période de récupération de l’activité à haute fréquence de l’isoflurane et de l’écart-type. La dépression prolongée induite par le SD est contrastée avec la reprise rapide de l’activité après l’isoflurane seul (placebo). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Visualisation des vagues de propagation. Le fichier vidéo est accéléré jusqu’à une vitesse d’environ 8 fois pour faciliter l’identification visuelle de l’onde qui se propage. L’image en niveaux de gris a été convertie dans la table de correspondance Fire et enregistrée en tant que fichier .AVI dans ImageJ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Liste des abréviations. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La propagation des dépolarisations est cruciale dans divers modèles de maladies, notamment les lésions cérébrales traumatiques (TCC), les accidents vasculaires cérébraux et la migraine¹. La détection précise des SD est essentielle pour comprendre leur rôle dans les déficits comportementaux aigus et/ou l’activation du système neuroimmunitaire après des lésions cérébrales traumatiques légères (TCL)^23,24. Pour atténuer le risque de manquer des SD lors de l’utilisation d’une seule méthode, une approche multi-méthodes est nécessaire pour une visualisation et un enregistrement efficaces des DS.

Bien que la combinaison des techniques permette de confirmer l’étalement des dépolarisations (DS), chaque technique peut présenter des pièges potentiels. Les techniques d’imagerie décrites dans ce protocole sont accessibles à la plupart des laboratoires et sont détaillées par Zepeda et ses collègues²⁵. La préparation de la fenêtre crânienne est cruciale, car des fenêtres opaques peuvent conduire à des images non concluantes²⁶. Ce problème peut être atténué en minimisant l’exposition du crâne à l’air avant d’appliquer de la colle cyanoacrylate. De plus, la transparence de la fenêtre peut être améliorée avec une goutte d’huile minérale avant l’imagerie. Les artefacts de mouvement peuvent également compliquer la confirmation SD, il est donc essentiel de les minimiser pour obtenir une vidéo claire. Pour y remédier, il est important de garder l’animal sous isoflurane tout au long du processus d’imagerie²⁷. L’utilisation d’un cône de nez facilite le transfert efficace de l’animal entre l’impacteur et la configuration d’enregistrement. Il est essentiel de replacer rapidement l’animal sous le cône nasal après l’impact pour capturer autant de propagation SD que possible. Dans ce modèle de traumatisme craniocérébral léger (TCL), l’enregistrement d’environ 4 minutes est généralement suffisant pour capturer l’ensemble du DS. Cependant, dans les traumatismes crâniens plus graves, des SD spontanés peuvent être générés par des lésions tissulaires²⁸. L’imagerie continue peut détecter ces SD spontanés, mais l’anesthésie prolongée à l’isoflurane peut rendre difficile l’observation de la dépression à haute fréquence. Les SD spontanés peuvent être détectés par électrophysiologie par des dépressions supplémentaires dans l’activité à haute fréquence, mais il est difficile de confirmer la relation entre la dépression et les SD sans imagerie.

Avec le développement des amplificateurs Open-Ephys et Intan, l’électrophysiologie in vivo est aujourd’hui accessible à de nombreux laboratoires. Tous les enregistrements électrophysiologiques nécessitent l’implantation de vis crâniennes et/ou d’électrodes. Dans ce protocole, il y a une période de latence de deux jours entre l’implantation des vis du crâne et l’enregistrement pour favoriser la récupération. Bien que cette période puisse ne pas être suffisante pour que le cerveau se remette complètement de l’implantation, les dommages devraient être minimes car les vis du crâne ne pénètrent pas dans le tissu cérébral. De plus, la transparence du crâne scellé au cyanoacrylate diminue avec le temps, de sorte que l’imagerie doit être effectuée dès que possible pour obtenir une transparence optimale. Pour l’électrophysiologie, il est crucial de minimiser le bruit de 60 Hz. Assurez-vous que la zone d’expérimentation est isolée de l’alimentation CA et correctement mise à la terre par rapport à l’amplificateur Intan. Bien que les artefacts de mouvement ne puissent pas être complètement éliminés, les accéléromètres sur la scène de tête peuvent aider à identifier et à supprimer les périodes de mouvement pendant le post-traitement. Dans l’ensemble, ces techniques peuvent fournir des informations précieuses sur la récupération du SD et le fonctionnement du réseau cortical après des lésions cérébrales traumatiques légères (TCL).

L’une des limites de ces techniques est que les animaux sont sous anesthésie pendant l’imagerie. Cependant, la plupart des modèles de TCC nécessitent une anesthésie, et il est peu probable que l’anesthésie prolongée ait un impact significatif sur la conception expérimentale. L’isoflurane réduit considérablement l’activité à haute fréquence²⁷. Si l’exposition à l’isoflurane se prolonge au-delà de la période d’imagerie, cela peut compliquer la détection de la récupération de l’activité à haute fréquence après l’écart-type. Par conséquent, il est essentiel d’inclure un groupe simulé ou isoflurane seul dans le plan expérimental pour comparer la récupération de l’activité à haute fréquence, comme le montre la figure 2. Une autre limitation est que les enregistrements électrophysiologiques ne détectent pas le décalage du courant continu. L’amplitude et la durée du décalage du DC sont des indicateurs de la santé des tissus et de la récupération du SD²⁸. Néanmoins, la confirmation des DS à l’aide de ces techniques fournira tout de même des informations précieuses sur la recherche sur les traumatismes crâniens.

Tous les chercheurs sur les traumatismes crâniens bénéficieraient des techniques décrites ici, car il est fort probable que tous les modèles de traumatismes crâniens produisent des dépolarisations étalées (DS). Le domaine des traumatismes crâniens gagnerait beaucoup à comprendre le rôle des DS dans les blessures, la progression des blessures, l’activation neuroimmunitaire et la récupération. Des recherches récentes suggèrent que les SD contribuent aux déficits comportementaux et peuvent être un mécanisme sous-jacent de la déficience neurologique ^5,7. Les techniques décrites dans ce protocole aideront à élucider le lien entre les TCC et les DS. Les applications futures de ces techniques pourraient s’étendre à d’autres domaines de recherche, notamment les accidents vasculaires cérébraux, l’épilepsie et la migraine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#00-90 x .118 Vis à métaux	US Micro Screw	00.90-118-M-SS-P,
de 0,8 mm de diamètre Foret	PCB	WYTP21, Amazon
16-A Headstage	Intan  ;	C3335
2,1 mm Meules micro foret	Fine Science Tools	19007-21
Amplificateur AC	d’enregistrement		Intan
C57BL/6J souris  ;	Laboratoire Jackson  ;	Jax#000664
Caméra CCD	Mightex	TCE-1304-U
Objectif d’extension	Zeikos  ;	ZE-ETN
Ethiqa XR (buprénorphine à libération lente)	Midwest Veterinary Supply	Numéro de produit 267.10000.3
Broche de connecteur dorée (femelle)	A-M Systems	520100
Goupille de connecteur dorée (mâle)	A-M Systems	520200
ImageJ2/Fiji	Image J	NA
Impactor One	Leica	39463930
Panneau LED	Supon	L122t
MATLAB	MathWorks	Code d’activation
Colle cyanoacrylate de qualité médicale	MasterBond	MB287
Micro-Manager Camera Software	Image J	NA
Perceuse à ongles/polisseuse à ongles	Makartt Lime à ongles électrique	JD700
Connecteurs omnétiques	Omnetics	A79014-001
Logiciel d’acquisition de données RHX	Intan	NA
Fil non revêtu en acier inoxydable (0,005")	A-M Systems	792800
Cadre stéréotaxique	Kopf Intruments	1923-B
Teets 'cold cure' ciment dentaire	A-M systems	525000, 526000
Objectif d’appareil photo XLR	Nikon	NIKKOR 50 mm f/1.8-16