Photobiomodulation sous contrôles électroencéphalographiques du sommeil pour la stimulation de l’élimination lymphatique des toxines du cerveau de souris

Résumé

Cette étude présente la technologie non invasive et portable de photobiomodulation transcrânienne sous contrôle électroencéphalographique pour la stimulation lymphatique élimination des toxines (par exemple, la bêta-amyloïde soluble) du cerveau de souris mâles BALB/c âgées et non anesthésiées pendant le sommeil profond naturel.

Résumé

Les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) jouent un rôle important dans l’élimination des toxines du cerveau. Le développement de technologies innovantes pour la stimulation des fonctions du MLV est une direction prometteuse dans le progrès du traitement de diverses maladies cérébrales associées à des anomalies du MLV, notamment les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, les tumeurs cérébrales, les lésions cérébrales traumatiques et les hémorragies intracrâniennes. Le sommeil est un état naturel lorsque les processus de drainage du cerveau sont les plus actifs. Par conséquent, la stimulation du drainage cérébral et des MLV pendant le sommeil peut avoir les effets thérapeutiques les plus prononcés. Cependant, de telles technologies commerciales n’existent pas à l’heure actuelle.

Cette étude présente une nouvelle technologie portable de photobiomodulation transcrânienne (tPBM) sous contrôle électroencéphalographique (EEG) du sommeil, conçue pour photostimuler l’élimination des toxines (par exemple, la bêta-amyloïde soluble (Aβ)) du cerveau de souris BALB/c âgées, avec la possibilité de comparer l’efficacité thérapeutique de différentes ressources optiques. La technologie peut être utilisée dans l’état naturel d’une cage domestique sans anesthésie, en maintenant l’activité motrice des souris. Ces données ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de phototechnologies non invasives et cliniquement prometteuses pour la correction des modifications liées à l’âge des fonctions MLV et des processus de drainage du cerveau, ainsi que pour le nettoyage efficace des tissus cérébraux des métabolites et des toxines. Cette technologie est destinée à la fois aux études précliniques des fonctions du cerveau endormi et au développement de traitements cliniquement pertinents pour les maladies cérébrales liées au sommeil.

Introduction

Les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) jouent un rôle important dans l’élimination des toxines et des métabolites des tissus cérébraux ^1,2,3. Les dommages causés par les MLV dans diverses maladies cérébrales, y compris les tumeurs, les lésions cérébrales traumatiques, les hémorragies et les processus neurodégénératifs, s’accompagnent d’une diminution des fonctions MLV conduisant à la progression de ces pathologies 1,2,3,4,5,6 . Par conséquent, le développement de méthodes de stimulation des MLV ouvre de nouveaux horizons dans l’émergence de technologies efficaces pour le traitement des maladies du cerveau. Récemment, une technologie non invasive de photobiomodulation transcrânienne efficace (tPBM) a été proposée pour stimuler les MLV et éliminer les toxines telles que le sang et l’Aβ du cerveau 5,7,8,9,10,11,12. Il est intéressant de noter que le sommeil profond est un facteur naturel pour l’activation des processus de drainage lymphatique dans le cerveau^13,14. Sur la base de ce fait, il est logique de supposer que le tPBM des MLV pendant le sommeil peut avoir des effets thérapeutiques plus efficaces que pendant l’éveil 9,11,12,15. Cependant, il n’existe actuellement aucune technologie commerciale pour le tPBM pendant le sommeil¹⁶. De plus, des expériences sur des animaux pour étudier les effets thérapeutiques du tPBM sont effectuées sous anesthésie, qui est nécessaire pour fournir avec précision de la lumière au cerveau. Cependant, l’anesthésie affecte considérablement le drainage du cerveau, ce qui réduit la qualité des résultats de recherche¹⁷.

Aβ est un produit métabolique de l’activité neuronale normale¹⁸. Comme il a été établi dans les neurones corticaux de rat en culture, Aβ est libéré à des taux élevés dans l’espace extracellulaire (2-4 molécules/neurones/s pour Aβ)¹⁹. Il existe des preuves que la forme dissoute de Aβ, située dans les espaces extracellulaires et périvasculaires, est la plus toxique pour les neurones et les synapses²⁰. L’Aβ soluble est rapidement éliminé du cerveau humain en 1 à 2,5 h²¹. Les MLV sont les tunnels d’élimination de l’Aβ soluble du cerveau ^1,7 qui diminue avec l’âge, conduisant à l’accumulation d’Aβ dans le cerveau âgé ^1,22. Il existe des preuves que les anomalies extracellulaires des niveaux d’Aβ dans le cerveau sont corrélées avec les performances cognitives au cours du vieillissement et sont associées au développement de la maladie d’Alzheimer (MA)^23,24. Par conséquent, les rongeurs âgés et âgés sont considérés comme des alternatives aux modèles transgéniques pour l’étude de l’amylose, y compris AD^25,26.

Cette étude présente une technologie tPBM originale et portable sous contrôle électroencéphalographique (EEG) du sommeil profond ou à mouvements oculaires non rapides (NREM) chez des souris BALB/c mâles non anesthésiées d’âges différents pour stimuler la clairance lymphatique de Aβ du cerveau vers le système lymphatique périphérique (les ganglions lymphatiques cervicaux profonds, dcLNs).

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire », à la Directive 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, et aux directives du Ministère des Sciences et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie (Nº 742 du 13.11.1984), qui ont été approuvées par la Commission de bioéthique de l’Université d’État de Saratov (Protocole n° 7, 22.09.2022).

1. Assemblage du matériel

1. Coupez un morceau de textolite en aluminium de 1,5 mm d’épaisseur aux dimensions de 1,5 mm x 2 mm. Cette pièce sera appelée carte de circuit imprimé (PCB) à diode électroluminescente (LED) (Figure 1C).
2. Soudez une LED à un circuit imprimé, comme illustré à la Figure 1.
3. Soudez deux fils de cuivre toronnés aux broches d’une LED, puis couvrez-les d’un manchon.
4. Imprimez le modèle 3D du cadre (Figure 1A) ; placez une LED (Figure 1B) et des aimants (Figure 1D) sur le cadre ; placez une rondelle (Figure 1E) sur la tête de la souris.
5. Pour assembler le circuit (Figure 2), procédez comme suit.
   1. Tout d’abord, connectez la résistance (Figure 2 ; R1) entre une anode LED et un port 5 V sur l’Arduino.
   2. Ensuite, connectez une cathode LED au transistor à effet de champ (MOSFET) à semi-conducteur à oxyde métallique (Figure 2 ; Q1) Égoutter. Ensuite, connectez la source MOSFET à la terre.
   3. Connectez la résistance de traction (Figure 2 ; R2) entre la porte du MOSFET et le sol. Enfin, connectez la porte MOSFET à la broche 3 de l’Arduino.
6. Connectez un écran à cristaux liquides (LCD) à l’Arduino.
7. Imprimez les modèles 3D du boîtier, de la plaque de recouvrement et des boutons. Insérez la carte Arduino avec le clavier LCD, le MOSFET et le connecteur LED dans le boîtier, comme illustré à la Figure 3.

2. Guide du logiciel (Figure 4)

1. Téléchargez l’esquisse Arduino (fichier .ino) et ouvrez-la via l’environnement de développement intégré (IDE) Arduino (Supplementary Coding File 1).
2. Sélectionnez le port de communication (COM) approprié et flashez le micrologiciel.
3. L’interface comprend deux colonnes. Utilisez les boutons Gauche et Droite pour naviguer entre ces colonnes. L’indicateur de sélection est situé à gauche de la colonne.
4. La colonne de gauche à l’écran est le champ de sélection du rapport cyclique par modulation de largeur d’impulsion (PWM). Utilisez les boutons Haut et Bas pour régler le cycle de service. Atteignez la dose de PBM de 10/20/30 Dj/cm² avec un rapport cyclique PWM correspondant de 2 %/4 %/6 % en une session de 17 minutes.
5. La colonne de droite de l’écran est le champ RUN/Off. Pour sélectionner cette colonne, appuyez sur le bouton droit du clavier, puis appuyez sur Sélectionner. Lorsque le processus est en cours d’exécution, l’indicateur d’activité clignote et le texte du bouton RUN passe à OFF.
   NOTE. Les souris sont préparées pour les expériences sur une période de 10 jours, y compris l’implantation d’électrodes EEG, l’implantation d’un cathéter chronique dans le ventricule latéral droit pour l’injection d’Aβ fluorescent et la mise en place d’une plaque pour la PBM.

3. Implantation d’un système d’enregistrement EEG (Figure 5)

1. Pesez la souris et anesthésiez-la avec un mélange de Zoletil 100 et de Xylanite (100 mg/kg ; 10 mg/kg, respectivement) par injection intramusculaire dans la cuisse.
2. Lorsque les réflexes de retrait du pied arrière et la réponse de pincement de la queue cessent, placez la souris dans un cadre stéréotaxique au-dessus d’un coussin chauffant (Figure 5A).
3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les paupières pour éviter le dessèchement des globes oculaires pendant la chirurgie. Répétez cette procédure chaque fois que nécessaire.
4. Rasez la tête dans la zone allant des os nasaux aux os occipitaux à l’aide d’une machine à raser et stérilisez d’abord la peau exposée avec de l’alcool.
5. À l’aide de ciseaux de dissection droits, coupez le cuir chevelu, maintenez-le avec une micro-pince, nettoyez le crâne du fascia et séchez-le avec des cotons-tiges. Si nécessaire, utilisez les agents hémostatiques.
6. À l’aide d’une perceuse d’un diamètre de 1,3 mm, faites 2 trous dans les os temporaux de chaque côté le long des coordonnées : PA = -1 mm pour la première paire de vis et AP = -3 mm pour la deuxième paire de vis.
7. Placez les vis EEG avec les fils conducteurs dans de l’alcool pendant 5 min. Ensuite, placez les vis EEG dans la solution saline.
8. Insérez quatre vis plaquées argent avec électrodes dans les trous à une profondeur de 1 mm (Figure 5B).
9. Fixez les vis à la surface du crâne à l’aide d’acrylique dentaire de manière à ce que les électrodes qui s’étendent à partir d’elles soient situées vers le nez de l’animal (Figure 5C). Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 15 min.
10. Fixez un capteur d’enregistrement EEG sur le nez de l’animal à l’aide d’acrylique dentaire. Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 30 min (Figure 5D).
11. Placez les électrodes EMG à l’arrière du muscle orbicularis oculi à l’aide d’une pince à épiler incurvée et fixez-les avec l’acrylique dentaire. Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 15 minutes (Figure 5E).
12. Connectez les électrodes EEG à l’évidement plaqué argent du capteur et soudez-les à l’aide d’une station de soudage. Ensuite, fixez les électrodes EEG à l’aide de l’acrylique dentaire (Figure 5F).
13. Après l’opération, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle jusqu’à ce que l’animal se remette complètement de l’anesthésie.
14. Ensuite, placez la souris dans une cage domestique individuelle avec un accès libre à de la nourriture et de l’eau avec de l’ibuprofène (40 mg/kg dans 200 ml d’eau) pour l’analgésie après la chirurgie pendant 10 jours.

4. Implantation d’une plaque pour PBM

1. Pesez la souris et anesthésiez-la avec un mélange de Zoletil 100 et de Xylanite (100 mg/kg ; 10 mg/kg, respectivement) par injection intramusculaire dans la cuisse 7 jours après l’implantation du système d’enregistrement EEG.
2. Lorsque les réflexes de retrait du pied arrière et la réponse de pincement de la queue cessent, fixez la souris dans un système stéréotaxique.
3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les paupières pour éviter le dessèchement des globes oculaires pendant la chirurgie. Répétez cette procédure chaque fois que nécessaire.
4. Fixez une plaque métallique d’un diamètre de 5 mm sur l’os occipital du crâne à l’aide d’acrylique dentaire et d’une pince Dumont. Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 15 minutes (Figure 6).

5. Préparation d’un cathéter chronique

1. Marquez sur l’aiguille à insuline un segment à 2 cm du côté de l’extrémité biseautée.
2. Fixez l’aiguille à insuline dans le porte-aiguille du côté de l’embout biseauté au segment marqué.
3. Placez un cathéter en polyéthylène PE-10 de 2 cm sur toute la longueur restante de l’aiguille.
4. Remplissez le cathéter d’une solution saline et couvrez-le d’un capuchon en plastique pour le sceller.

6. Implantation d’un cathéter chronique dans le ventricule latéral droit

1. Après implantation de la plaque pour PBM, faites un trou de trépanation aux coordonnées AP = -0,5 mm et ML = 1,2 mm, avec un diamètre de 1,5 mm, à l’aide d’une perceuse.
2. Placez le cathéter en polyéthylène PE-10 dans un support stéréotaxique et insérez-le dans le crâne de la souris (DV = 2 mm). Ensuite, fixez-le à l’aide de l’acrylique dentaire. Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 15 minutes (Figure 7).
3. Après l’opération, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle jusqu’à ce que l’animal se remette complètement de l’anesthésie.
4. Ensuite, placez la souris dans une cage domestique individuelle avec un accès libre à de la nourriture et de l’eau avec de l’ibuprofène (40 mg/kg dans 200 ml d’eau) pour l’analgésie après la chirurgie pendant 10 jours.

7. tPBM sous contrôle EEG du sommeil NREM

1. Connectez n’importe quel système d’enregistrement EEG commercial au connecteur situé sur la tête de la souris et définissez la valeur requise du cycle de service PWM.
2. Surveillez le signal EEG et attendez l’activité du rythme delta. Si vous observez un sommeil NREM, lancez le processus PBM et arrêtez-le si le sommeil NREM passe au sommeil paradoxal ou à l’éveil. La dose augmente à chaque interaction jusqu’à ce qu’elle atteigne la valeur requise.
3. Lorsque la dose requise de PBM est obtenue, la séance est terminée.

8. Imagerie confocale de l’élimination lymphatique de Aβ du cerveau de souris

1. Connectez un cathéter de 10 cm à une aiguille à insuline.
2. À l’aide d’une seringue Hamilton munie d’une aiguille de 29 G, préparer une perfusion de bêta-amyloïde fluorescente (FAβ) d’un volume de 5 μL dans le cathéter. Laissez le cathéter sur une seringue Hamilton.
3. Fixez la main de la souris et connectez le cathéter à l’aide d’une aiguille au cathéter chronique implanté.
4. Connectez le cathéter à un micro-injecteur. Ensuite, placez la souris dans une boîte individuelle ;
5. Sélectionnez le taux d’injection 0,1 μL/min dans le menu des micro-injecteurs et appuyez sur le bouton Démarrer.
6. Injecter du FAβ dans le ventricule latéral droit.
7. Après l’administration de FAβ, effectuer le PBM à l’aide d’une LED pendant 61 min en suivant l’algorithme : 17 min - lumière et 5 min - pause sur 61 min.
8. Après la PBM, injecter par voie intraveineuse tout traceur pour marquer les vaisseaux cérébraux via la queue.
9. Après l’injection, euthanasiez les souris à l’aide de la chambre d’euthanasie au CO₂ .
10. À l’aide de ciseaux droits et tranchants, faites une petite incision transversale dans la peau le long de la trachée, en tenant la peau avec une pince à épiler droite non tranchante.
11. Faites une incision longitudinale sur toute la longueur du cou à l’aide de ciseaux droits.
12. À l’aide d’une pince à épiler incurvée, prenez les glandes salivaires et séparez-les soigneusement du tissu conjonctif. Placez un écarteur de plaie sur la partie ouverte de l’incision et fixez-le de manière à repousser les tissus environnants.
13. Examinez la zone située entre la trachée et le muscle cléido-mastoïdien à l’aide de deux pinces à épiler incurvées des deux côtés du cou.
14. Lorsque le ganglion lymphatique cervical profond (dcLN) est détecté de chaque côté, enlevez les dcLN à l’aide d’une pince à épiler droite aux extrémités émoussées et coupez-le du tissu conjonctif.
15. Placez les dcLNs dans une boîte de Pétri avec une solution saline et couvrez-les d’un verre de couverture orienté horizontalement (25 mm × 50 mm × 0,17 mm).
16. Utilisez n’importe quel microscope confocal commercial pour obtenir des images de dcLNs entiers.

9. Analyse de l’Aβ dans les lysats des tissus cérébraux

1. Préparez les échantillons pour le dosage.
   1. Euthanasiez des souris à l’aide de la chambre d’euthanasie au CO₂ .
   2. Décapitez la souris, retirez la peau de sa tête et retirez les muscles du crâne.
   3. Faites deux incisions avec des ciseaux pointus et droits du grand foramen occipital au conduit auditif.
   4. À l’aide d’une pince à épiler droite, séparez la partie ventrale du crâne, l’os occipital et les os formant les cavités de l’oreille moyenne.
   5. À l’aide d’une pince à épiler, séparez le cerveau des os pariétals et frontaux.
   6. À l’aide de ciseaux droits, retirez la mâchoire supérieure et coupez les bulbes olfactifs.
   7. Placez le cerveau dans la solution physiologique.
   8. Rincez le cerveau dans une solution saline froide tamponnée au phosphate pour éliminer soigneusement l’excès de sang et pesez avant l’homogénéisation.
   9. Préparez un tampon de lyse pH 7,2 contenant 1,5 mm KH₂PO₄, 8 mm Na₂HPO₄, 3 mm KCl, 137 mm NaCl et 0,1 % de Tween20, 10 mM EDTA avec un mélange inhibiteur de protéase fraîchement préparé.
   10. Homogénéiser le cerveau dans un tampon de lyse frais (1 mL de tampon de lyse pour un échantillon de tissu de 200 à 500 mg) avec un homogénéisateur en verre sur de la glace.
   11. Sonicer une suspension résultante avec un perturbateur cellulaire à ultrasons jusqu’à ce que la solution soit clarifiée.
   12. Centrifuger les homogénats à 10 000 × g pendant 5 min.
   13. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette mécanique monocanal (100-1000 μL) et doser immédiatement ou aliquote et stocker à ≤-20 °C.
2. Préparez les matériaux suivants : lecteur de microplaques avec filtre de 450 nm ± 10 nm ; tubes de microcentrifugation ; pipettes monocanaux ou multicanaux avec pointes de haute précision et jetables ; papier absorbant pour éponger la microplaque ; récipient pour solution de lavage ; 0,01 mol/L (ou 1x) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ; et l’eau déminéralisée ou distillée.
3. Préparez les réactifs.
   1. Amenez les composants du kit et les échantillons à température ambiante (RT ; 18-25 °C) avant utilisation.
   2. Reconstituez l’étalon avec 1,0 mL de diluant standard, conservez-le pendant 10 min à RT et agitez-le doucement (pour ne pas mousser). La solution mère standard est de 300 pg/mL. Préparez 5 tubes contenant un volume de 0,6 mL de diluant standard et faites une série de dilutions triples.
   3. Mettre en place 5 points (300 pg/mL, 100 pg/mL, 33,33 pg/mL, 11,11 pg/mL et 3,70 pg/mL) de l’étalon dilué, et les derniers tubes avec comme blanc contenant uniquement le diluant standard (0 pg/mL).
   4. Essorez rapidement les solutions mères du réactif de détection A et du réactif de détection B avant de les utiliser. Diluez-les 100 fois avec les diluants d’essai A et B pour préparer la concentration de travail.
   5. Diluer 20 mL de la solution de lavage concentrée (30x) avec 580 mL d’eau désionisée ou distillée pour obtenir 600 mL de solution de lavage (1x).
   6. Aspirez la dose nécessaire de la solution avec des embouts stérilisés et ne versez pas à nouveau la solution résiduelle dans le flacon.
4. Effectuez le test.
   1. Déterminer les puits pour un étalon dilué, un blanc et un échantillon.
   2. Préparez 5 puits pour les points standard et un puits pour les blancs.
      1. Ajouter 50 μL de dilutions standard, blanches et d’échantillon dans les puits correspondants, respectivement. Ensuite, ajoutez immédiatement 50 μL de réactif de détection A dans chaque puits.
      2. Secouez doucement la plaque (un agitateur de microplaques est recommandé) et couvrez-la d’un scelleur de plaques. Incuber la plaque à 37 °C pendant 1 h. Le réactif de détection A peut sembler trouble. Réchauffez la solution à RT et mélangez doucement jusqu’à ce qu’elle apparaisse uniforme.
   3. Aspirez la solution et lavez chaque puits avec 350 μL de 1x solution de lavage à l’aide d’un flacon pulvérisateur, d’une pipette multicanaux, d’un distributeur de collecteur ou d’un lave-auto. Laissez l’assiette tranquille pendant 1 à 2 min. Enclenchez la plaque sur du papier absorbant pour éliminer complètement le liquide restant de tous les puits. Répétez cette procédure 3 fois.
   4. Après le dernier lavage, aspirez ou décantez tout tampon de lavage restant. Assurez-vous d’éliminer complètement la solution de lavage en inversant la plaque et en l’épongeant contre du papier absorbant.
   5. Ajouter 100 μL de solution de travail du réactif de détection B dans chaque puits et incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C après l’avoir recouverte avec la scelleuse de plaques.
   6. Répétez les étapes d’aspiration/lavage pendant un total de 5 min.
   7. Ajoutez 90 μL de solution de substrat dans chaque puits et recouvrez la plaque d’un nouveau scelleur de plaques. Incuber pendant 10-20 min à 37 °C (ne pas dépasser 30 min) à l’abri de la lumière. Après avoir ajouté la solution de substrat, le liquide deviendra bleu.
   8. Ajouter 50 μL d’une solution d’arrêt dans chaque puits pour terminer la réaction. L’ajout de la solution d’arrêt rendra le liquide jaune. Tapotez la plaque sur le côté pour mélanger le liquide. Si le changement de couleur est incohérent, tapotez doucement la plaque pour assurer un mélange complet.
   9. Assurez-vous de l’élimination complète de l’eau et des empreintes digitales sur le fond de la plaque et de l’absence de formation de bulles sur la surface du liquide. Ensuite, lisez immédiatement la plaque dans un lecteur de microplaques à 450 nm.
5. Calculez les résultats.
   1. Déterminez la moyenne des relevés en double pour chaque étalon, témoin et échantillon. Tracez une courbe standard avec le log de la concentration Aβ 1-42 sur l’axe des y et de l’absorbance sur l’axe des x.
   2. Tracez une courbe de meilleur ajustement à travers les points, qui peut être déterminée par analyse de régression.
   3. Si des échantillons dilués ont été utilisés, multipliez la concentration obtenue à partir de la courbe standard par le facteur de dilution.
      REMARQUE : Pour l’étude ELISA, un kit de dosage de Aβ 1-42 a été utilisé dans cette étude.

Résultats

Dans un premier temps, l’étude s’est concentrée sur l’établissement de la dose lumineuse efficace (une LED de 1050 nm) pour la stimulation de l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau vers les dcLNs chez des souris BALB/c mâles adultes éveillées (2-3 mois, 26-29 g). Les doses de lumière ont été sélectionnées au hasard comme 10 J/cm^2, 20 J/cm² et 30 J/cm² sur la base de nos études précédentes sur les effets du tPBM sur l’élimination des différents colorants et des globules rouges du cerveau ^{7,8,9,10,11,12}. Les résultats de l’imagerie confocale présentés dans la figure 8A-E démontrent clairement les effets liés à la dose du tPBM sur l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau vers les dcLNs. La dose lumineuse de 30 J/cm² s’est avérée la plus efficace par rapport aux doses de lumière de 10 J/cm² et 20 J/cm² en raison d’une intensité plus élevée d’un signal fluorescent de Aβ dans les dcLNs.

Dans un deuxième temps, la recherche visait à trouver les longueurs d’onde les plus efficaces pour l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau de souris mâles BALB/c adultes (2-3 mois, 26-29 g) éveillées à l’aide des plates-formes photo portables avec les différentes longueurs d’onde lumineuses (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) et modes (1050 nm en régimes continus et pulsés) avec la même dose (30 J/cm²). La figure 9A-E montre les résultats d’imagerie confocale des dcLNs dans les groupes testés. Les résultats ont révélé que la longueur d’onde lumineuse de 1050 nm en mode impulsion par rapport aux autres longueurs d’onde testées (880 nm et 1300 nm) et la longueur d’onde de 1050 nm en régime continu provoquait une élimination significativement plus élevée de l’Aβ fluorescent du cerveau vers les dcLN.

Dans la dernière étape, les effets d’une LED de 1050 nm en mode impulsion sur le niveau d’Aβ soluble dans le cerveau de souris âgées avant et après le traitement de 10 jours de tPBM sous un contrôle EEG de NREM et d’éveil ont été étudiés. L’analyse immunologique a révélé que la teneur en Aβ soluble dans le cerveau était significativement plus élevée chez les souris BALB/c mâles âgées (16-18 mois, 30-33 g) que chez les souris BALB/c mâles adultes (2-3 mois, 26-29 g). Le traitement de 10 jours par tPBM pendant le sommeil profond, mais pas pendant l’éveil, a effectivement réduit le niveau d’Aβ soluble dans le cerveau des souris âgées à l’indice d’Aβ soluble dans le cerveau des souris adultes (Figure 10).

Figure 1 : Processus d’assemblage du matériel. (A) Cadre imprimé en 3D, (B) LED, (C) Carte de circuit imprimé LED, (D) aimants, (E) rondelle métallique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : circuit de commande des LED. R1 - résistance de régulation de courant, R2 - résistance de traction pour la grille MOSFET, Q1 - MOSFET à canal n. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

(A) Plaque de recouvrement imprimée en 3D, (B) Boutons imprimés en 3D, (C) Écran de clavier LCD pour Arduino, (D) Arduino, (E) Boîtier imprimé en 3D, (F) Connecteur LED, (G) MOSFET de canal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Logiciel. (A) Bouton de sélection, (B) Bouton gauche, (C) Bouton haut/bas, (D) Bouton droit, (E) Indicateur de sélection, (F) Champ de sélection du cycle de service PWM, (G) Champ RUN/OFF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Implantation d’un système d’enregistrement EEG. (A) Préparation du crâne ; (B) Implantation de vis ; (C) Fixation des vis avec l’acrylique dentaire ; (D) Fixation du capteur d’enregistrement EEG ; (E) Implantation et fixation des électrodes EMG à l’arrière du muscle orbicularis oculi ; (F) Les électrodes soudées à l’évidement plaqué argent du capteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Fixation d’une plaque pour PBM sur l’os occipital du crâne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Implantation d’un cathéter chronique dans le ventricule latéral droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Les effets de différentes doses de LED 1050 nm sur l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau vers les dcLNs. (A-D) Images représentatives des dcLNs du groupe (A) témoin et du groupe PBM avec (B) 10 J/cm², (C) 20 J/cm² et (D) 30 J/cm² ; (E) Analyse quantitative de l’accumulation d’Aβ fluorescent dans les dcLNs des groupes testés (n = 8, ANOVA unifacteur avec test post hoc de Duncan, **p < 0,01, *p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Effets de différentes longueurs d’onde LED sur l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau vers les dcLNs. (A-D) Images représentatives des dcLNs du groupe PBM avec le mode d’impulsion 1050 nm (ImpMode_1050, A), 880 nm (ImpMode_880, B), 1300 nm (ImpMode_1300, C) et le mode continu 1050 nm (ContMode_1050 nm, D) ; (E) Analyse quantitative de l’accumulation d’Aβ fluorescent dans les dcLNs des groupes testés (n = 8, ANOVA à un facteur avec test post hoc de Duncan, **p < 0,01). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Les effets PBM (LED 1050 nm en mode impulsion, 30 J/cm²) pendant le NREM et l’état de veille sur le niveau d’Aβ soluble (pg/mL) dans le cerveau de souris de souris adultes et âgées. Une ANOVA à un facteur avec test post hoc de Duncan, **p < 0,01, *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les MLV sont une cible importante pour le développement de technologies innovantes pour la modulation du drainage cérébral et l’élimination des débris et des déchets cellulaires du cerveau, en particulier chez les sujets âgés dont la fonction MLV décline ^1,22. Dans un état homéostatique, le sommeil profond est associé à l’activation naturelle du nettoyage des tissus cérébraux^13,14. Par conséquent, il est évident de s’attendre à ce que la stimulation des MLV pendant le sommeil profond soit plus efficace que pendant l’éveil^15,16. La nouvelle technologie non invasive et portable de tPBM sous contrôle EEG du sommeil pour la stimulation de l’élimination lymphatique de l’Aβ soluble du cerveau de souris mâles âgées est présentée ici.

La petite taille de la plate-forme photo (7 mm x 11 mm) et son poids léger (1 g) lui permettent d’être montée fermement et en toute sécurité sur la tête des souris, en maintenant leur activité motrice naturelle. Cela élimine également le besoin d’utiliser une anesthésie pendant le tPBM. Le tPBM pendant le sommeil profond peut être effectué à l’aide de n’importe quel appareil commercial pour un contrôle EEG des phases de sommeil. Ainsi, notre technologie permet d’effectuer l’étude dans une cage domestique, en préservant les conditions les plus naturelles pour les animaux.

Dans un premier temps, une longueur d’onde LED de 1050 nm a été sélectionnée au hasard pour l’étude de la dose efficace de photo-effets sur l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau vers les dcLNs chez des souris adultes éveillées (âgées de 2 à 3 mois). Le choix de cette longueur d’onde est lié aux données précédentes sur la stimulation efficace des MLV avec un laser de 1267 nm 8,10,27,28,29,30,31,32,33,34. Cette longueur d’onde favorise la génération directe de l’oxygène singulet en petites quantités dans le tissu cérébral et dans ses méninges, ce qui est l’un des mécanismes sous-jacents au PBM des MLV ^8,28,34. Cependant, les effets biologiques d’un laser de 1267 nm et d’une LED de 1050 nm sont liés à la génération d’une excitation d’oxygène singulet³⁵. En effet, les bandes d’un laser de 1267 nm ± 20 nm et d’une LED de 1065 nm ± 15 nm sont liées à la formation de l’oxygène singulet à partir de l’état fondamental d’une molécule d’oxygène. Une bande d’un laser de 1267 nm pompe une molécule d’oxygène directement dans le premier état singulet excité, tandis qu’une bande de LED de 1065 nm correspond à une énergie vibratoire supplémentaire, qui décroît très rapidement, libérant de la chaleur dans l’environnement. De plus, l’absorption d’eau dans la longueur d’onde de 1065 nm est dix fois inférieure à celle de 1267 nm, ce qui la rend plus favorable à la recherche biologique³⁵. De plus, une LED de 1050 nm est disponible dans le commerce sur le marché et beaucoup moins chère que le rare et coûteux laser de 1267 nm. Notez que la bande d’émission d’une LED de 1050 nm utilisée dans cette étude avait une largeur de 40 nm et qu’elle ne chevauche que partiellement une bande d’oxygène singulet. Cependant, nous avons démontré l’effet significatif du tPBM sur l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau vers les dcLNs à l’aide d’une LED de 1050 nm (30 J/cm²). La dose lumineuse de 30 J/^cm2 s’est avérée la plus efficace par rapport aux doses de lumière de 10 J/^cm2 et 20 J/^cm2 sur la base de l’intensité plus élevée d’un signal fluorescent de Aβ dans les dcLNs. Ainsi, une LED de 1050 nm peut être très utile pour l’application de la technique tPBM à l’homme, ce qui est cohérent avec la tendance courante d’utiliser des LED au lieu de lasers pour le PBM^36,37.

Dans un deuxième temps, la recherche visait à répondre à la question de savoir quelles longueurs d’onde lumineuses sont les plus efficaces pour l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau de souris adultes éveillées. Cette étape de l’étude a été réalisée à l’aide d’une plate-forme photo portable avec différentes longueurs d’onde lumineuses (880 nm, 1050 nm, 1300 nm) et modes (1050 nm en régimes continus et pulsés) avec la même dose (30 J/cm²). Ces longueurs d’onde ont été choisies en raison de l’utilisation généralisée en pratique clinique du tPBM (880 nm) et des nouvelles LED coûteuses (1300 nm), qui pourraient potentiellement être cliniquement significatives. De plus, les modes pulsé et continu uniquement pour la LED de 1050 nm en tant que ressource lumineuse ont été comparés. Ces données démontrent clairement que seule une LED de 1050 nm en mode impulsion par rapport aux autres longueurs d’onde et une LED de 1050 nm en mode continu provoque une élimination lymphatique significative de Aβ du cerveau vers les dcLNs. Ces résultats sont cohérents avec les conclusions d’autres chercheurs, qui indiquent également l’avantage d’utiliser un PBM pulsé pour obtenir efficacement des effets biologiques 38,39,40.

Dans la dernière étape, lorsque la longueur d’onde effective, la dose et le mode ont été sélectionnés, l’étude des effets d’une LED de 1050 nm en mode impulsion sur le niveau d’Aβ soluble dans le cerveau de souris âgées avant et après le traitement de 10 jours de tPBM sous un contrôle EEG de NREM et d’éveil a été réalisée. L’analyse immunologique a révélé que la teneur en Aβ soluble dans le cerveau était significativement plus élevée chez les souris âgées (16-18 mois) que chez les souris adultes (2-3 mois). Il est intéressant de noter que le traitement de 10 jours de tPBM pendant le sommeil profond, mais pas pendant l’éveil, a effectivement réduit le niveau d’Aβ soluble dans le cerveau des souris âgées au niveau d’Aβ soluble dans le cerveau des souris adultes. Une augmentation de la teneur en Aβ dans le tissu cérébral de souris et de rats sains avec l’âge a également été notée dans d’autres études^25,26, qui peut être associée à une diminution liée à l’âge des fonctions MLV conduisant à un nettoyage inefficace du tissu cérébral de cette protéine toxique ^1,22. L’élimination plus efficace de l’Aβ soluble du tissu cérébral chez les souris endormies par rapport aux souris éveillées peut s’expliquer par l’activation naturelle du drainage du tissu cérébral pendant le sommeil. La morphologie du MLV change considérablement avec l’âge, ce qui entraîne une réduction de l’élimination lymphatique des métabolites du cerveau âgé²². Cependant, le tPBM pendant le sommeil aide à rétablir l’élimination lymphatique de l’Aβ soluble du tissu cérébral des souris vieillissantes au niveau des animaux adultes.

Compte tenu de la diffusion de l’énergie lumineuse lors du passage à travers le crâne, le tPBM limite ses effets uniquement sur les MLV sans pénétrer profondément dans les tissus cérébraux. Cependant, malgré le fait que les vaisseaux lymphatiques n’ont pas encore été trouvés directement dans les tissus cérébraux des humains et des animaux, de plus en plus de preuves émergent indiquant la présence du système lymphatique cérébral 41,42,43,44. Cela explique les résultats montrant l’élimination des toxines (sang et Aβ) des structures profondes du cerveau (le système ventriculaire, l’hippocampe) vers les MLV et plus loin vers la périphérie (dcLNs^)5,7. Au cours d’un siècle, les connaissances se sont accumulées, indiquant un lien étroit entre le drainage du cerveau et le système lymphatique périphérique⁴⁵. Même en l’absence d’un réseau lymphatique généralement reconnu dans le système nerveux central, il existe des faits indiquant l’élimination lymphatique des macromolécules des parties profondes du cerveau vers la périphérie ^{1,2,3,4,5,6,7} Cela explique également pourquoi le tPBM, agissant uniquement sur les MLV, stimule l’élimination du sang et de l’Aβ du cerveau ^{5, 7}. Aéroport

En résumé, cette étude présente une technologie portable de tPBM sous contrôle EEG du sommeil conçue pour photo-stimuler l’élimination des toxines en utilisant l’exemple de l’Aβ soluble du cerveau de souris âgées avec la possibilité de comparer l’efficacité thérapeutique de différentes ressources optiques. La technologie peut être utilisée dans les conditions naturelles d’une cage domestique sans anesthésie, en maintenant l’activité motrice naturelle des souris. Ces données ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de phototechnologies non invasives et cliniquement prometteuses pour corriger les modifications liées à l’âge dans les fonctions de la MLV et les processus de drainage du cerveau, et pour le nettoyage efficace des tissus cérébraux des métabolites et des toxines. La technologie proposée pour la photostimulation du drainage du cerveau et l’élimination lymphatique des toxines du cerveau a des effets limités sur les MLV en raison de la diffusion de l’énergie lumineuse lors du passage à travers le crâne. Par conséquent, la technologie peut être utilisée pour développer de nouvelles méthodes de traitement des maladies cérébrales associées au dysfonctionnement de la MLV. Les photo-effets stimulants les plus prononcés sur les MLV sont observés dans le sommeil profond (NREM), qui nécessite l’utilisation de PBM sous contrôle EEG. Cela crée certaines difficultés (techniques, de programmation) pour le contrôle simultané de l’apparition du sommeil profond et de l’apport d’exposition à la lumière.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,1 % Tween20	Hélicon,  ; Russie	SB-G2009-100ML
Catheter	Scientific Commodities Inc., États-Unis	PE-10, 0,28 mm ID × ; 0,61 mm OD
CO2 chambre	Binder, Allemagne	CB-S 170
Microscop confocal	Nikon, Japon	A1R MP
Acrylique dentaire	Zermack, Pologne-Russie	Villacryl S, V130V4Z05
Foret	Foredom, Russie	SR W-0016
Pince Dumont	Stoelting,	États-Unis 52100-07
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Suisse	Aiguille
Ibuprofène	Sintez OJSC, Russie	N/A	; Médicament analgésique
Aiguille à insuline	INSUPEN, Italie	31 G, 0,25 mm x 6 mm
Levomekol pommade antibactérienne	Nizhpharm	D06C	Pour usage externe à une dose de 40 mg/g, 1 fois par jour
Micro pince	Stoelting, États-Unis	52102-02P
Microcentrifugeuse	Gyrozen, Corée du Sud	GZ-1312
Microinjecteur	Stoelting, États-Unis	53311
Pince à épiler non tranchante	Stoelting, USA	52108-83P
Système PINNACLE	Pinnacle Technology, USA	8400-K3-SL	Système pour l’enregistrement de l’EEG (2 canaux) et de l’EMG (1 canal) des souris
Machine à raser	Braun	Series 3310s
Pipettes mono et multicanaux	Eppendorf, Autriche	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Chlorure de sodium	Kraspharma, Russie	N/A
Station de soudage	AOYUE, Chine	N/A
Cadre stéréotaxique	Stoelting, USA	51500
Ciseaux de dissection droits	Stoelting, USA	52132-10P
Tetracycline	JSC Tatkhimfarmpreparaty, Russie	N/A	Pommade pour les yeux
Pince à épiler	Stoelting, États-Unis	52100-03
Perturbateur cellulaire à ultrasons	Biobase, Chine	USD-500
Écarteur de plaie	Stoelting, États-Unis	52125
Xylanit	Nita-Farm, Russie	N/A	Relaxant musculaire
Zoletil 100	Virbac Santé Animale, France	N/A	Anesthésie générale