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Méthodologie d’étude des interactions des récepteurs membranaires de la vitamine A et de la protéine opsine avec leurs ligands dans la génération de la protéine rétinylidène

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DOI :

10.3791/67036

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4 octobre 2024

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1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons deux méthodes quantitatives pour étudier les interactions protéine-ligand des récepteurs membranaires de la vitamine A et de l’opsine photorécepteur avec leurs ligands physiologiques respectifs.

Résumé

La distribution de la vitamine A/rétinol tout-trans (ROL) alimentaire dans tout le corps est essentielle pour maintenir la fonction rétinoïde dans les tissus périphériques et générer la protéine rétinylidène pour la fonction visuelle. RBP4-ROL est le complexe de ROL avec la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4), qui est présente dans le sang. Deux récepteurs membranaires, le récepteur 2 de la protéine de liaison au rétinol 4 (RBPR2) dans le foie et le récepteur STimilé par l’acide rétinoïque 6 (STRA6) dans l’œil, se lient à RBP4 circulatoire et ce mécanisme est essentiel à l’internalisation du ROL dans les cellules. L’établissement de méthodes pour étudier la cinétique récepteur-ligand est essentiel pour comprendre la fonction physiologique des récepteurs de la vitamine A pour l’homéostasie rétinoïde. À l’aide de tests de résonance plasmonique de surface (SPR), nous pouvons analyser les affinités de liaison et les paramètres cinétiques des récepteurs membranaires de la vitamine A avec son ligand physiologique RBP4.

Ces méthodologies peuvent révéler de nouvelles informations structurales et biochimiques sur les motifs de liaison à RBP4 dans RBPR2 et STRA6, qui sont essentiels pour comprendre les états pathologiques de carence en vitamine A. Dans l’œil, le ROL internalisé est métabolisé en 11-cis rétinien, le chromophore visuel qui se lie à l’opsine dans les photorécepteurs pour former la protéine rétinylidène, la rhodopsine. L’absorbance de la lumière provoque l’isomérisation cis-trans de la rétine 11-cis, induisant des changements conformationnels de la rhodopsine et l’activation ultérieure de la cascade de phototransduction. Une diminution des concentrations sériques et oculaires peut avoir un impact sur la formation de la protéine rétinylidène, ce qui peut entraîner une mauvaise localisation de la rhodopsine, une accumulation d’apoprotéine opsine, une cécité nocturne et une dégénérescence du segment externe des photorécepteurs, entraînant une rétinite pigmentaire ou une amaurose congénitale de Leber.

Par conséquent, les méthodologies spectrophotométriques permettant de quantifier le complexe rétinien opsine-11-cis du récepteur couplé aux protéines G dans la rétine sont essentielles pour comprendre les mécanismes de dégénérescence des cellules rétiniennes dans les états pathologiques mentionnés ci-dessus. Grâce à ces méthodologies complètes, les chercheurs seront en mesure de mieux évaluer l’apport alimentaire en vitamine A dans le maintien de l’homéostasie rétinoïde systémique et oculaire, qui est essentielle à la génération et au maintien des concentrations de protéines de rétinylidène dans les photorécepteurs, qui est essentielle au maintien de la fonction visuelle chez les humains.

Introduction

La vitamine A/rétinol tout-trans/ROL obtenue par voie alimentaire est un composant important jouant un rôle dans la fonction visuelle 1,2. Le chromophore 11-cis rétinal, un métabolite de la vitamine A alimentaire, se lie à l’opsine du récepteur couplé aux protéines G (RCPG) pour générer la protéine rétinylidène, la rhodopsine, dans les photorécepteurs. Lorsque la lumière tombe sur l’œil, la configuration de la rhodopsine subit un changement fondamental via la conversion de sa composante 11-cis-rétinienne en tout-trans-rétinienne. Ce changement de configuration déclenche une cascade de phototransduction dans les photorécepteurs à bâtonnets, convertissant la lumière en un signal électrique, qui est transmis au cortex visuel du cerveau via le nerf optique 3,4,5,6,7,8,9,10 . Une diminution des concentrations sériques et oculaires peut avoir un impact sur la formation de la protéine rétinylidène, ce qui provoque à son tour une mauvaise localisation de l’opsine, une accumulation d’opsine apoprotéique, une cécité nocturne et une dégénérescence des photorécepteurs OS, conduisant à une rétinite pigmentaire ou à une amaurose congénitale de Leber, qui peut provoquer la cécité 3,10.

Le rétinol tout-trans est la forme de transport fondamentale de la vitamine A alimentaire, et c’est la source à partir de laquelle tous les rétinoïdes fonctionnels et les métabolites de la vitamine A alimentaire sont dérivés. Le foie sert d’organe principal pour le stockage de la vitamine A alimentaire. Le rétinol hépatique est transporté par le sérum sous forme de complexe avec la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4). RBP4, principalement exprimé dans le foie, forme un holo-complexe avec le substrat du rétinol et la transthyrétine (TTR), qui entre dans la circulation 11,12,13,14,15,16,17. Dans les années 1970, l’apparition d’un récepteur de surface cellulaire pour RBP4 a conduit à l’hypothèse que les protéines de transport membranaire aident au transport des rétinoïdes à l’intérieur et à l’extérieur des cellules. Le récepteur de surface cellulaire du rétinol lié à RBP4 (RBP4-ROL) a été identifié comme étant STimulé par l’acide rétinoïque 6 rétinol (STRA6) dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de l’œil. STRA6 se lie au complexe holo-RBP4 circulatoire et transporte le rétinol lié à RBP4 à travers l’EPR pour être utilisé par les photorécepteurs18,19. Les mutations de STRA6 peuvent entraîner une myriade de maladies et de phénotypes associés à des concentrations oculaires réduites de ROL. Les mutations STRA6 au cours du développement peuvent entraîner une anophtalmie, une microphtalmie et d’autres symptômes non oculaires qui se chevauchent avec les phénotypes associés au syndrome de Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 est exprimé dans différents organes et tissus, tels que l’EPR dans l’œil, mais pas dans tous les tissus26,27. Bien que le principal site de stockage des rétinoïdes soit le foie, STRA6 n’est pas exprimé dans le foie.

Alapatt et ses collègues ont découvert que le récepteur 2 de la protéine de liaison au rétinol 4 (RBPR2) liait RBP4 avec une grande affinité et était responsable de l’absorption du rétinol lié à RBP4 dans le foie, similaire à STRA6 dans le RPE28. RBPR2 a été signalé comme partageant une homologie structurale avec STRA6 29,30,31. Il est proposé que RBP4 se lie aux résidus S294, Y295 et L296 sur RBPR2, un domaine de liaison aux acides aminés partiellement conservé entre RBPR2 et STRA6 ainsi que 29,30,31. D’après ces études, il est proposé que les récepteurs membranaires de la vitamine A tels que STRA6 et RBPR2, qui contiennent un ou plusieurs résidus/domaines de liaison extracellulaires, interagissent avec RBP4-ROL circulatoire. Les récepteurs membranaires jouent donc un rôle important dans la liaison des récepteurs à RBP4 circulatoire pour l’internalisation de ROL dans les tissus cibles, tels que le foie et l’œil.

Dans la première partie de cette étude, nous avons utilisé la résonance plasmonique de surface (SPR) pour étudier l’interaction de deux récepteurs membranaires de la vitamine A (RBPR2 et STRA6) avec leur ligand physiologique RBP431. Les affinités de liaison et la cinétique d’association/dissociation des complexes protéiques et ligands peuvent être mesurées en temps réel à l’aide de la SPR. Cette méthodologie visait à fournir des informations cinétiques, structurelles et biochimiques critiques sur les motifs de liaison à RBP4 dans RBPR2 et STRA6, qui sont essentiels pour comprendre les états pathologiques de carence en vitamine A31,32. Comme mentionné ci-dessus, le ROL circulatoire est internalisé dans l’EPR via STRA6 pour générer le chromophore 11-cis rétinal, qui se lie à l’opsine pour générer la protéine rétinylidène, la rhodopsine, dans les photorécepteurs33. Nous avons utilisé des méthodologies de spectrophotométrie pour quantifier le GPCR-opsine et son ligand 11-cis complexe rétinien dans les lysats rétiniens murins, ce qui est essentiel pour comprendre les mécanismes de la protéine rétinylidène réduite, la rhodopsine, dans la rétinite pigmentaire ou l’amaurose congénitale de Leber34. En général, ces protocoles peuvent être appliqués pour étudier in vitro les conséquences physiologiques des mutants RBP4, STRA6 ou RBPR2 dans l’influence de l’homéostasie systémique et oculaire de la vitamine A ou l’impact des protéines mutantes du cycle de la rhodopsine ou des rétinoïdes sur la fonction visuelle35,36.

Protocole

1. Méthodologie de la résonance plasmonique de surface (SPR)

  1. Préparation et purification de la protéine RBP4 de souris
    1. Concevez des amorces pour générer de l’ADNc RBP4 (msRBP4) de souris pleine longueur (séquence de référence NCBI : NM_001159487.1). Clonez l’ADNc msRBP4 dans un vecteur d’expression résistant à la kanamycine pET28a His-tag et exprimez-le dans les cellules BL-21 DE3 (Table des matériaux).
    2. Transformer les cellules compétentes BL-21 DE3 (selon le protocole du fabricant) avec le vecteur msRBP4-pET28a ligaturé puis déposer sur des plaques de gélose au bouillon Luria-Bertani (LB) contenant de la Kanamycine 50 μg/mL30,37. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur et dépister les colonies positives le lendemain.
    3. Cueillir une seule colonie et incuber toute la nuit à 37 °C dans 5 mL de bouillon LB contenant 50 μg/mL de kanamycine.
    4. Pour la culture secondaire dans 500 mL de bouillon LB contenant 50 μg/mL de Kanamycine, utiliser 1 % du volume de la culture primaire (à partir de l’étape 1.1.3) et incuber à 37 °C pendant 3 à 4 h ; Vérifiez la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre. Idéalement, si la valeur de la DO est comprise entre 0,6 et 1, il faut induire l’expression de la protéine avec 0,5 mM d’IPTG à 24 °C pendant la nuit.
    5. Utilisez plusieurs concentrations IPTG de 0,1 à 1 mM et une plage de température de 16 à 30 °C pour optimiser l’expression et la stabilité de msRBP4.
    6. Centrifugez la culture (à partir de l’étape 1.1.5) à 16 000 × g pendant 10 min, jetez le surnageant et conservez la pastille sur de la glace.
    7. Homogénéiser la pastille avec un tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1 % (v/v) de Triton X-100, 10 % de glycérol, 0,5 mM de PMSF et inhibiteurs de protéase [pH 8,0]). Sonicez le lysat pendant un cycle de 15 secondes et 30 secondes d’arrêt à l’aide d’un homogénéisateur d’une puissance de 250 watts et d’une fréquence de sortie de 40 à 50 % à 20 kHz. Répétez l’opération 5 fois.
    8. Retirer les débris cellulaires et les cellules non lysées par centrifugation à 16 000 × g pendant 20 min. Faites passer le surnageant du lysat à travers une colonne de nickel NTA équilibrée par un tampon.
    9. Laver la colonne avec un tampon de lyse (à partir de l’étape 1.1.8) contenant 30 mM d’imidazole.
    10. En fractions, éluer la protéine RBP4liée à ms à l’aide d’un tampon contenant 250 mM d’imidazole. Analysez les fractions éluées et surveillez visuellement la quantité de protéines avec un gel de polyacrylamide SDS à 12 %, coloré au Coomassie Brilliant Blue R-250 dans une solution méthanol :eau :acide acétique (45:45:10) et décolorez avec une solution sans colorant Coomassie méthanol :eau :acide acétique (45:45:10).
    11. Regrouper les fractions inutilisées et dialyser les fractions regroupées à l’aide d’une cassette de dialyse 10K de 10 kDa MWCO.
    12. Évaluer la qualité de la fraction dialysée sur un gel SDS-PAGE à 12 % et quantifier la concentration en protéines.
      REMARQUE : La protéine Apo-RBP4 a été utilisée dans l’analyse SPR. Pour la génération de l’holo-RBP4 (RBP4-rétinol), reportez-vous aux protocoles détaillés publiés ailleurs36,37.
  2. Validation initiale de la structure et de l’interaction des peptides RBPR2 et STRA6 avec RBP4 par dosage de fluorescence du tryptophane et spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD)
    1. Essai de fluorescence du tryptophane
      1. Utilisez l’outil d’analyse de la composition des protéines en ligne (https://web.expasy.org/protparam/) et collez la séquence d’acides aminés dans un code d’une lettre pour évaluer la composition structurelle de la protéine recombinante RBP4 et des peptides individuels de RBPR2 et STRA6 afin de déterminer les résidus d’acides aminés tryptophane dans les peptides et les protéines individuels (Tableau des matériaux).
      2. Cliquez sur le bouton de calcul des paramètres et évaluez la composition en acides aminés pour les résidus de tryptophane (Trp).
        REMARQUE : Des résidus de tryptophane doivent être présents dans les peptides ou les protéines analysés.
      3. Diluer les peptides RBPR2 et STRA6 individuels à différentes concentrations micromolaires et incuber individuellement avec 3 μg msde RBP4 dans une plaque à 96 puits à température ambiante pendant 5 min. Excité le mélange à 290 nm et balayage de l’émission de 300 nm à 400 nm de longueur d’onde.
      4. Normalisez les données avec le blanc (tampon uniquement, pas de peptide et pas de protéine) et la condition de contrôle du peptide (pas de protéine) et le graphique.
        REMARQUE : L’augmentation de la fluorescence du tryptophane lors de l’exposition à une concentration peptidique faible à élevée suggère une interaction positive entre les deux peptides individuels et la protéine RBP4.
    2. Spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD)
      1. Diluer les peptides individuels et la protéine RBP4 recombinante dans 1 tampon PBS, pH 7,0. Pour un contrôle de qualité, veuillez utiliser diverses concentrations de peptides RBPR2 et STRA6 et de protéine RBP4 de 0,1 à 10 μg/mL, comme décrit ci-dessous.
      2. Ajouter des peptides dilués et des protéines individuels dans une cuvette de 0,1 cm de longueur de trajet et mesurer l’absorbance/ellipticité du CD à l’aide d’un spectrophotomètre CD (195-250 nm). Utilisez la formule ci-dessous pour calculer l’ellipticité moyenne du résidu (θ).
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S représente le signal CD en mθ ; mRw représente la masse moyenne du résidu ; c représente la concentration de la protéine en mg/mL ; et l représente la longueur du chemin en cm.
      3. Calculez le pourcentage de changement de la structure moléculaire à l’aide de l’analyse de la structure secondaire BeStSel pour la prédiction du repliement des protéines par spectroscopie CD (https://bestsel.elte.hu).
        REMARQUE : La structure secondaire indique le pliage correct et les confirmations conservées cruciales pour l’étude des interactions et le résultat des interactions. Inspectez la structure prédite du domaine et poursuivez l’étude d’interaction.

2. Analyse SPR pour déterminer les affinités de liaison et les paramètres cinétiques des récepteurs membranaires de la vitamine A (RBPR2 et STRA6) avec leur ligand physiologique RBP4

  1. Pour l’immobilisation de RBP4 sur la configuration de surface de la puce CM5, nous utilisons la puce de capteur SPR, qui porte un linker carboxyméthyl dextran étendu à une taille de ~100 nm fixé de manière covalente sur une surface dorée. En présence de chlorhydrate de carbodiimide (EDC) 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl), le N-hydroxysuccinimide (NHS) convertit les groupes carboxyle à la surface de la puce en esters de N-hydroxysuccinimide, qui réagissent spontanément avec les groupes amines des acides aminés et des protéines, forçant le ligand à se lier de manière covalente à la surface de la puce (Tableau des matériaux).
    1. Immobiliser la protéine msRBP4 purifiée sur la puce du capteur (Figure 1 et Figure 2). Dans le menu Exécuter du logiciel, choisissez l’Assistant et procédez à l’option d’immobilisation . Diluer le ligand (protéine RBP4 msobtenue à l’étape 1.1) dans un tampon d’immobilisation (tampon d’acétate de sodium 10 mM, pH 5,0) à 10 μg/mL (4 μL de ligand + 396 μL de tampon) et aliquote les réactifs de couplage dans les flacons. Ouvrez la fenêtre de l’assistant de configuration de l’immobilisation à partir de la commande logicielle, sélectionnez la puce CM5 et l’option Cellule d’écoulement d’immobilisation 2 et le niveau cible de 1 200 unités de réponse (RU) pour atteindre un Rmax de 30 RU dans l’étude cinétique et la solution de lavage : éthanolamine. Entrez le nom RBP4 et cliquez sur Suivant.
      REMARQUE : Facultatif : La boîte de dialogue Préparations du système pour l’option Amorcer avant l’exécution n’est pas nécessaire si l’amorçage avec un tampon de fonctionnement PBST (solution saline tamponnée au phosphate avec une solution détergente Tween 20 à 0,05 %) a été effectué précédemment.
    2. Dans la boîte de dialogue Position du rack , cliquez sur Éjecter le rack. Prenez le support et placez les flacons avec les volumes attribués à chaque réactif : 156 μL de msRBP4, 177 μL d’éthanolamine, 89 μL d’EDC, 89 μL de NHS et un flacon vide. Insérez le support contenant les flacons d’échantillons et cliquez sur OK et Suivant.
    3. Dans la boîte de dialogue Préparer le protocole d’exécution , cliquez sur Démarrer et enregistrer.
  2. Configuration du dosage cinétique des peptides RBPR2 et STRA6
    1. Diluer en série les peptides RBPR2, RBPR2 mutant et STRA6 de souris (synthétisés chimiquement précédemment31 et répertoriés dans la table des matériaux) dans un tampon de fonctionnement dans une plage de 0,8 à 26,6 μM.
    2. Ouvrez le logiciel de contrôle et sélectionnez l’assistant Cinétique/Affinité. Cliquez sur Fichier | Ouvrez le modèle et sélectionnez Cinétique/Affinité. Saisissez le chemin d’écoulement 2-1 de la boîte de dialogue de séquence d’injection (cellule d’écoulement 2 active et cellule d’écoulement 1 comme référence), vérifiez le type de puce CM5 et cliquez sur Suivant. Dans la boîte de dialogue de configuration, cochez la case Exécuter les cycles de démarrage, entrez Solution : tampon et cycles : et cliquez sur Suivant.
    3. Dans la boîte de dialogue des paramètres d’injection , entrez les valeurs des paramètres de l’échantillon : temps de contact : 120 s, débit 30 μL/min, temps de dissociation 300 s ; pour les paramètres de régénération : entrez le nom de la solution de régénération : Glycine-HCl (pH 2,5), temps de contact : 30 s, débit : 30 μL/min et cliquez sur Suivant.
    4. Dans la boîte de dialogue des échantillons , entrez le nom des peptides, la masse moléculaire et les concentrations , puis cliquez sur Suivant. Dans la boîte de dialogue Position du rack , attribuez les peptides dilués sous forme d’échantillons individuels de ~120 μL de différentes concentrations de 1 à 100 μM et de ~230 μL de tampon, ~120 μL de tampon et ~1 000 μL de glycine, pH 2,5, aux positions sur le rack. Cliquez sur Eject Rack (Éjecter le rack ) et insérez tous les flacons. Cliquez sur Suivant, puis dans la boîte de dialogue Préparer le protocole d’exécution , cliquez sur Démarrer, entrez un nom de fichier et enregistrez (Figure 2).
    5. Dans le logiciel, cliquez sur le menu Démarrer et sélectionnez Évaluation. Choisissez d’ouvrir le fichier dans le logiciel, et dans le menu déroulant de sélection, choisissez Fc2-1 pour analyser la cellule de référence Blank-subtracted Active sensorgram pour les phases d’association et de dissociation des peptides msRBP4 et mutant msRBPR2 et msSTRA6.
    6. Cliquez sur le bouton déroulant Cinétique/Affinité et choisissez Limité à la surface ; pour ouvrir la boîte de dialogue Sélectionner les courbes , cochez la case Inclure la colonne dans le tableau et cliquez sur Suivant. Sélectionnez la boîte de dialogue Données pour afficher les sensorgrammes soustraits à blanc ; cliquez sur Cinétique et Affinité, conservez les paramètres par défaut, puis cliquez sur l’option Ajuster pour l’ajustement de la courbe. Inspectez l’onglet Rapport pour trouver la constante de dissociation d’équilibre Kd et Ka ou Ksur le tauxd’association et K d ou K sur le tauxde dissociation. Enregistrez le sensorgramme de données Kinetics dans .txt format délimité par des tabulations et utilisez les valeurs pour tracer des graphiques (Figure 3).
    7. Pour déterminer la constante de cinétique d’affinité Kd (concentration de ligands qui se lie à la moitié des récepteurs à l’équilibre), copiez et collez les colonnes de données dans le fichier au format .txt généré à partir du graphique Évaluation en XY utilisé dans le logiciel. Cliquez sur Analyser et régression non linéaire (ajustement de courbe), vérifiez la colonne de données, puis cliquez sur OK. Dans la boîte de dialogue des paramètres , cliquez sur Saturation de la liaison et Modèle d’ajustement de liaison spécifique à un site avec la formule suivante :
      Y= (Bmax*X)/(Kd + X)
      Où Bmax est le nombre maximal de sites de liaison (unité de réponse), X est la concentration des peptides et Y est la liaison (unité de réponse) (figure 3).

3. Méthodologie de spectrophotométrie pour quantifier le complexe protéique rétinien cis GPCR-11-(protéine rétinylidène rhodopsine) dans les lysats rétiniens

  1. Transportez le groupe de souris prédéterminé composé de souris adultes WT-C57BL/6J dans la chambre noire.
  2. Adaptez les souris pendant la nuit pendant 12 à 16 h, et sous lumière rouge, placez la souris dans une chambre d’euthanasie et ouvrez la vanne de gaz CO2 sur le régulateur à 5 L / min pendant ~5 min. Assurer la mort en appliquant une pression sur le cou et la queue tirée vers l’arrière (luxation cervicale).
  3. Énucléer les globes oculaires et homogénéiser les yeux dans un tampon glacé contenant 20 mM de bis-tris propane (1,3-bis (tris(hydroxyméthyl)méthylamino)propane ; BTP) pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA et avec inhibiteur de protéase (Tableau des matériaux).
  4. Centrifuger l’homogénat pendant 15 min à 16000 x g à 4 °C, jeter le surnageant contenant des protéines cytosoliques solubles dans l’eau. Remettre en suspension et solubiliser la membrane granulée et les protéines membranaires dans un tampon contenant 20 mM de n-dodécyl-β-d-maltoside (DDM), 20 mM de bis-tris propane (BTP) pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA et avec un inhibiteur de protéase pendant 1 h à 4 °C sur une plate-forme rotative.
  5. Centrifuger la fraction membranaire résoluble pendant 1 h à 16000 x g, 4 °C. Mélangez le surnageant avec 30 μL de billes d’anticorps Rho 1D4 et incubez pendant 1 h à 4 °C sur une plate-forme rotative.
  6. À l’aide d’un support magnétique, séparez le dispositif rétractable à l’aide de billes, jetez le surnageant et lavez les billes avec un tampon de 20 mM de bis-tris propane (BTP) pH 7,4, 500 mM de NaCl et 2 mM de DDM.
  7. Eluter la protéine de rhodopsine en l’incubant pendant 5 à 10 minutes à température ambiante avec un tampon de 20 mM de bis-tris propane (BTP) pH 7,4, 100 mM de NaCl, 2 mM de DDM contenant 0,2 mg/mL de peptide 1D4 (-TETSQVAPA) (Figure 4 et Figure 5).
  8. Analysez l’absorbance de l’élu de 200 nm à 800 nm à l’aide d’une cuvette rectangulaire, submicro, quartz, de 2 mm, de 10 mm de longueur de trajet, de 50 μL dans un réglage de balayage rapide avec un spectrophotomètre.
    REMARQUE : N’utilisez que des cuvettes en quartz de haute qualité (Figure 4).
  9. Pour valider et déterminer la qualité, vérifiez et exposez l’élu à une lumière vive pendant 1 min, puis répétez l’étape 3.8.
  10. Soustrayez l’absorbance à blanc et calculez le rapport entre les spectres d’absorbance analysés et l’absorbance à 500 nm pour l’opsine rétinienne 11-cis , à 380 nm pour l’opsine liée à la rétine tout-trans exposée à la lumière et à 280 nm pour la protéine Apo-Opsin sans ligand (Figure 6). L’opsine libre sans ligand rétinal donne une absorbance de base à 500 nm.
  11. Pour quantifier la concentration en rhodopsine, utilisez la loi de Beer-Lambert :
    A=ε· C·l ou C=A/ε·l
    Où A est l’absorbance, ε le coefficient d’extinction molaire (rhodopsine ε500 = 40 600 M−1 cm−1 pour l’Apo Opsin libre ε280 = 81 200 M−1 cm−1), C est la concentration et l la longueur du trajet.
  12. Pour quantifier l’opsine ligandée en pourcentage, utilisez un rapport A280/A500.
  13. Tracez les spectres d’absorbance soustraits à blanc et calculez la valeur d’opsine libre32.
  14. Calculez la concentration de rhodopsine en utilisant le coefficient d’extinction ε500 = 40600 M−1 cm−1. La concentration d’opsine sans ligand est calculée à l’aide de la loi de Beer-Lambert en utilisant le coefficient d’extinction ε280 = 81 200 M−1 cm−1.

Résultats

Des méthodes quantitatives sont décrites pour étudier les interactions protéine-ligand des récepteurs membranaires de la vitamine A et de l’opsine photorécepteur avec leurs ligands physiologiques respectifs. La souris recombinante RBP4 doit être exprimée dans E. coli et la protéine purifiée doit être utilisée comme ligand conjugué sur une puce SPR. Le RBPR2, STRA6 et le mutant S294A RBPR2 « SYL motif RBP4 interagissant avec le site extracellulaire » synthétisés chimiquement d’un peptide d’acides aminés ~40 sont utilisés comme analyte à diverses concentrations pour mesurer la cinétique de liaison et la saturation d’équilibre Kd de l’interaction (Figure 1 et Figure 2).

La protéine RBP4 recombinante, en tant que ligand de RBPR2 et STRA6, a montré une affinité de liaison envers les sites d’interaction dans ces peptides, mesurée à Kd ~22,38 μM et ~26,73 μM, respectivement. Le motif d’acide aminé « SYL » joue un rôle essentiel dans la stabilisation de ces interactions à la fois dans RBPR2 et STRA6, et comme prédit, le peptide mutant S294A avait augmenté Kd de ~114,9 μM, suggérant une augmentation du nombre de copies des besoins en peptides mutants-RBPR2 pour atteindre la saturation de liaison (Figure 3). L’absorption du rétinol dans l’œil via STRA6 et la conversion en divers rétinoïdes jusqu’à la conversion finale du rétinien 11-cis en chromophore avec liaison à la lysine 296, résidu de la rhodopsine constituent un récepteur fonctionnel pour la détection des photons et la vision. La liaison covalente rétinienne 11-cis à la protéine Opsine pour former la rhodopsine présente certaines caractéristiques d’absorbance. L’absorbance des protéines se produit à 280 nm et l’absorbance du rétinol libre est à ~325 nm. Cependant, l’holo-Opsine avec absorbance rétinienne 11-cis ou rhodopsine se produit à une longueur d’onde de 500 nm.

Tout défaut dans la formation de ce complexe en raison d’un faible rétinol systémique ou d’un défaut d’absorption du rétinol par une mutation de RBPR2 ou STRA6 conduit à l’accumulation d’opsine libre ou d’apoprotéine opsine dépourvue de chromophore 11-cis rétinal, modifiant l’absorbance caractéristique passe à une faible absorbance à 500 nm. En quantifiant l’absorbance et en utilisant le rapport d’absorbance de 280 nm et de 500 nm de longueur d’onde, il est possible d’estimer les opsines ligandées ou la rhodopsine. Grâce à une brève exposition à la lumière, il est possible de recouper la photo-isomérisation de l’absorbance de l’opsine liée à la rétine 11-cis à 500 nm à l’absorbance de l’opsine liée à la trans-rétine (méta II rhodopsine) à 380 nm (Figure 4, Figure 5 et Figure 6). Dans un dispositif expérimental, le risque d’artefacts et de contaminants est élevé ; les deux principales sources d’artefacts trouvées sont l’exposition involontaire à la lumière des instruments et l’eau de sel à faible concentration sans élimination des molécules contaminantes de l’EPR ou de la lentille (figure 7).

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Figure 1 : Espace de travail Résonance plasmonique de surface. Matériel nécessaire et aperçu de l’instrumentation SPR. (A) Quai de chargement des copeaux SPR. (A') Puce CM5 avec surface dorée fixée de manière covalente au dextran carboxyméthylé pour l’immobilisation via les groupes -NH2, -SH, -CHO, -OH ou -COOH. (B) Rack d’injecteur robotisé de chargement d’échantillons. (B') bouchons en caoutchouc de type 3. (B'') flacons en plastique de 7 mm pour les aliquotes d’échantillons. (C, D) Réservoir tampon d’équilibre/fonctionnement et réservoir de collecte des déchets. (E) Panneau de contrôle du logiciel Biacore. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Vue d’ensemble schématique de la résonance plasmonique de surface et des étapes d’acquisition des sensorgrammes. Étape 1 : La surface de la puce CM5 immobilisée avec la protéine RBP4 avec une cible de 1 200 unités de réponse. Étape 2 : Diverses concentrations de peptides RBPR2 sont analysées, et cette interaction biomoléculaire modifie la densité de charge électronique à la surface de la puce d’or, entraînant la modification/réduction de la réflexion de la lumière à un angle spécifique ou à un angle de résonance. Étape 3 : Le lavage inverse le phénomène du plasmon de surface, ce qui entraîne l’inversion de l’intensité de la réflexion et la chute du sensorgramme jusqu’à la ligne de fond. La cinétique de ces interactions a ensuite été utilisée pour déterminer les constantes de dissociation d’association et la force des interactions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Études de liaison par résonance plasmonique de surface de peptides individuels de domaine de liaison au récepteur de la vitamine A avec son ligand physiologique RBP4. (A) L’invite logicielle montrant l’immobilisation réalisée de RBP4 sur la surface de la puce CM5. (B, C, D) Sensogrammes des interactions peptide-ligand RBPR2-RBP4, STRA6-RBP4 et des interactions mutantes S294A RBPR2-RBP4 à diverses concentrations. (B',C',D') Cinétique de liaison et déterminationde l’équilibre K d montrant la différence et la proximité du motif de liaison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Espace de travail de l’absorbance rétinienne Opsin-11-cis et aperçu de l’instrumentation. (A) Centrifugeuse de paillasse réfrigérée, tous les indicateurs LED étant recouverts de ruban rouge ; (B) spectrophotomètre UV-visible, un indicateur LED recouvert de ruban rouge ; (B') Cellule ultra-micro rectangulaire, cuvette en quartz et support magnétique. (C) Logiciel d’application de numérisation ; (D) Couvercle du compartiment du spectrophotomètre : glissière ouverte, support de cuvette pour l’analyse et couvercle du compartiment fermé. (E) Configuration de la lumière éteinte avec moniteur désactivé pour la préparation des échantillons sous une seule source de lumière rouge. (F) Rotateur réfrigéré pour la préparation et la solubilisation des échantillons. (G) Configuration de la lumière éteinte avec moniteur allumé pour la mesure de l’absorbance de l’échantillon. (H) Analyse de l’absorbance dans le graphique XY. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Vue d’ensemble du flux de travail de la méthodologie d’absorbance rétinienne Opsin-11-cis. Étape 1 : Les rétines de souris adaptées à l’obscurité sous une seule source de lumière rouge sont isolées, homogénéisées et solubilisées pour obtenir des fractions de membrane rétinienne. Étapes 2 à 4 : Dans une séquence de centrifugations, la pastille est solubilisée en l’absence de détergent et en présence de tampon détergent DDM. Étapes 5-6 : La pastille solubilisée contenant des photorécepteurs rétiniens et d’autres protéines membranaires prêtes pour l’extraction et la purification des anticorps. Étape 7 : L’opsine éluée à l’aide du peptide VAPA 1D4 est prête pour l’analyse de l’absorbance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Spectres d’absorbance de la rhodopsine. (A) Extrait de rétine de souris adapté à l’obscurité utilisant de la rhodopsine purifiée 1D4 montrant l’absorbance maximale de 500 nm, et (B) extrait de rétine exposé à la lumière utilisant de la rhodopsine purifiée 1D4 montrant l’absorbance maximale de 380 nm. (C) Western blot utilisant un anticorps 1D4 contre la rhodopsine montrant la qualité de la purification de la rhodopsine et la distribution de la taille. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Artéfact des spectres d’absorbance de la rhodopsine. (A) L’artefact dans les spectres d’absorbance de l’extrait d’œil adapté à l’obscurité est montré avec le pic d’absorbance à 380 nm ; L’exposition involontaire à la lumière des indicateurs LED des instruments ou la défaillance du bloqueur de lumière de la porte de la chambre noire provoque le blanchiment de la protéine de rhodopsine. (B) Des lavages insuffisants avec un tampon salin élevé provoquent une accumulation de contaminants provenant de l’EPR, du cristallin ou d’autres sources provenant de l’extrait oculaire, ce qui entraîne une propagation élevée du spectre d’absorbance et des artefacts. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 8 : Représentation schématique des interactions entre les récepteurs membranaires de la vitamine A (RBPR2 et STRA6) et la protéine Opsine avec leurs ligands respectifs (RBP4 et 11-cis rétiniens) essentiels à la génération de la protéine rétinylidène dans les photorécepteurs de la fonction visuelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Intensités intrinsèques de fluorescence du tryptophane. Preuves préliminaires d’interaction et de changement dans les orientations des résidus de tryptophane intrinsèques de RBP4 lors de l’interaction avec diverses concentrations de peptides RBPR2 et STRA6. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Amarrage et interaction protéine-protéine RBPR2 et RBP4. Les résidus d’interface sont visualisés dans PyMOL et l’orientation de RBPR2 dans la membrane est visualisée à l’aide de l’outil serveur https://opm.phar.umich.edu/. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Pipeline pour l’analyse in silico de l’interaction d’amarrage protéine-protéine et des sites de contact possibles. Le pipeline d’analyse démontre la séquence d’exécution du script Python et l’utilisation de la ligne de commande PyMOL des étapes 1 à 6, garantissant la fiabilité de l’acquisition des sites d’interactions. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Analyse de la structure secondaire de la spectroscopie CD montrant la composition des peptides RBP4, RBPR2 et STRA6. Le graphique circulaire montre les parts des structures secondaires présentes dans la molécule. À l’aide de l’outil de structure secondaire BeStSel, la prédiction du repliement des protéines par spectroscopie de dichroïsme circulaire (https://bestsel.elte.hu) a été analysée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Étapes critiques du protocole
Méthodologie SPR
Modélisation in silico et analyse d’amarrage : La structure prédite de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) et STRA6, ainsi que la structure connue de la base de données PDB msRBP4 (RSCB PDB ID : 2wqa), doivent être utilisées pour l’étude d’amarrage29,31. De plus, des méthodes in vitro (culture cellulaire) doivent être utilisées pour confirmer l’interaction des sites de liaison présumés sur les récepteurs de la vitamine A (RBPR2 et STRA6) avec son ligand (RBP4)29,31 (figure supplémentaire S1, figure supplémentaire S2 et figure supplémentaire S3). Déterminez la qualité des peptides à l’aide de la spectroscopie CD. Auparavant, pour le spectre CD UV lointain, on utilisait31 cellules rectangulaires de 1 mm 0,1 μg/μL ~ 200 μL (3-4 μg de protéine RBP4, 32 μM RBPR2 et 32 μM de peptides STRA6) (figure supplémentaire S4). Le flux d’azote gazeux doit être utilisé pour empêcher la formation d’ozone nocif sous émission de lampes au xénon et réduire l’absorbance de fond à 200-300 nm. En utilisant le paramètre par défaut, le spectre a été mesuré de 185 nm à 300 nm. La ligne de base doit être corrigée par soustraction avec le Blank. Le contenu de l’hélice alpha et de la feuille bêta est calculé en fonction de la propriété d’absorbance, telle que les pics négatifs de l’hélice alpha à 222 nm.

Analyser les protéines RBPR2 et STRA6 et les données des domaines topologiques dans la base de données (https://www.uniprot.org), confirmer les sites d’interaction possibles précédemment connus à partir de régions extracellulaires et utiliser la séquence ~40-50 acides aminés pour synthétiser chimiquement les peptides. L’étude nécessite la protéine RBP4 de souris recombinante purifiée (msRBP4) et les peptides RBPR2 et STRA6 synthétisés chimiquement englobant les résidus de liaison RBP4 proposés pour étudier les interactions récepteur-ligand 18,19,29,31. Avant de présélectionner les peptides, la séquence peptidique extracellulaire des protéines réceptrices de la vitamine A en interaction doit être déterminée à l’aide d’une analyse in silico (amarrage protéine-ligand informatisé)31. Le dosage SPR est effectué pour comprendre la cinétique des interactions récepteur-ligand. Il est crucial de connaître les sites d’interactions prévus par des tests in-silico in-silico ou par des analyses in vitro. Dans cette étude, le peptide conçu fait référence à la région extracellulaire des protéines membranaires RBPR2 et STRA6, qui sont connues pour interagir avec RBP4. Pour garantir des résultats précis et éviter les artefacts potentiels et les capteurs SPR négatifs, il est crucial de normaliser les tampons, les concentrations peptidiques et la solubilité. Pour les études d’absorbance de la rhodopsine, l’isolation du lysat rétinien nécessite des conditions d’obscurité strictes et des étapes de lavage pour éviter les artefacts et les pics d’absorbance indésirables (Figure 7).

Pour comprendre l’importance du motif SYL sur les transporteurs de vitamine A dans la liaison de RBP4, RBPR2, STRA6 et d’un mutant S294A-RBPR2, les peptides31 ont été synthétisés chimiquement en utilisant une réaction de condensation des groupes carboxyle et amino entre deux acides aminés. Le protocole a suivi l’ajout précis et progressif d’acides aminés séquentiels à la résine d’ancrage. Le processus de synthèse des acides aminés subit des modifications chimiques de protection et de déprotection de l’unité d’acide aminé N-terminale, permettant la synthèse et la formation de polymères peptidiques. Une fois terminé, le peptide est récupéré de la résine et purifié. La validation initiale des interactions entre la protéine RBP4 et les peptides récepteurs de la vitamine A doit être confirmée à l’aide d’un test interne de fluorescence du tryptophane et vérifiée à l’aide d’un spectromètre CD (figure supplémentaire S1). La qualité de l’interaction initiale de la protéine recombinante RBP4 avec STRA6 (msSTRA6), RBPR2 (msRBPR2) et les peptides témoins de souris doit être confirmée à l’aide d’un test de fluorescence de tryptophane intrinsèque (figure supplémentaire S1). Le test de fluorescence intrinsèque du tryptophane est une procédure expérimentale essentielle pour évaluer l’extinction ou l’amélioration des résidus d’acides aminés de tryptophane dans les protéines pour la fluorescence lors de la liaison du récepteur et du ligand. La fluorescence mesurée est une indication directe du changement de l’environnement local à la suite de l’interaction.

Modifications et dépannage des méthodes
Optimisez le SPR avec des tampons courants : 1x solution saline tamponnée au phosphate (Tween 20) ou 1x HEPES (P20). Pour éviter les précipités, les peptides dilués doivent être centrifugés et filtrés avant utilisation. Normaliser l’absorbance de la rhodopsine avec divers tampons à haute teneur en sel (300-500 mM NaCl). Pour confirmer les pics d’absorbance de la rhodopsine dans l’obscurité à 500 nm, exposez les échantillons à la lumière pendant 30 s et répétez la mesure pour garantir la qualité grâce au décalage du pic d’absorbance à 380 nm et à l’efficacité de la rétraction.

Limites des méthodes
La SPR peut fournir des informations spécifiques sur l’interaction de deux protéines ; Cependant, si l’interaction nécessite un troisième composant inconnu, les données peuvent devenir complexes à comprendre. Le changement de conformation de la molécule restera non identifié dans l’interaction. Étant donné que la protéine RBP4 est préparée en l’absence de rétinol (apo-RBP4), ce qui est mesuré, c’est la liaison de l’apo-RBP4 à ses récepteurs. Par conséquent, RBP4 chargé de rétinol (holo-RBP4) peut avoir une affinité altérée pour les récepteurs RBPR2 et STRA6 par rapport à l’apo-RBP435,36. Il est intéressant de noter que les affinités pour l’apo- et l’holo-RBP4 pour STRA6 ont déjà été démontrées dans la gamme micromolaire, et qu’aucune différence statistique n’a été observée entre les liaisons de l’apo- et de l’holo-RBP4 au récepteur STRA635. La méthodologie d’absorption de la rhodopsine peut identifier la présence d’opsine non ligandée (apoprotéine opsine) dans l’œil mais ne peut pas identifier le(s) mécanisme(s) causal(s).

Spectres d’absorbance de la rhodopsine
POINT DE CONTRÔLE CRITIQUE : La photo-isomérisation de la rétine 11-cis à la rétine tout-trans est très sensible et instantanée32. La quantification de la rhodopsine (holo-opsine) doit être effectuée dans des conditions d’obscurité strictes pour mesurer le contenu rétinien en opsine et en 11-cis dans l’obscurité (500 nm) ou dans des conditions adaptées à la lumière comme la rhodopsine Meta II (380 nm)32. Les souris doivent donc être adaptées à l’obscurité dans une pièce sombre pendant 12 à 16 h pour mesurer la rhodopsine32 non blanchie. À cette fin, la pièce noire doit être complètement sombre, avec la porte d’entrée recouverte d’un tissu occultant et des sources de lumière LED externes sur tous les équipements recouvertes de ruban rouge. Couvrez l’écran de l’ordinateur portable avec une feuille de plastique rouge et gardez-le fermé jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Une source de lumière rouge suspendue est également requise.

ÉTAPE CRITIQUE : Normaliser les étapes de lavage à diverses concentrations élevées de sels afin d’éliminer les protéines de lentille ou d’EPR ou les contaminants moléculaires qui ont une absorbance de longueur d’onde de 300 à 500 nm et qui pourraient potentiellement interférer avec la mesure de l’absorbance de l’opsine.

Importance des méthodes par rapport aux méthodes existantes ou alternatives
Il n’existe aucune approche réalisable pour étudier l’utilisation systémique des rétinoïdes, les contributions multitissulaires et l’impact des mutations dans les récepteurs des protéines de liaison au rétinol pour les mécanismes de distribution du rétinol. Ce protocole utilise deux techniques essentielles pour comprendre et combler les connexions manquantes dans la déplétion du rétinol dans les photorécepteurs avec l’Apo-Opsine et l’utilisation du stockage des rétinoïdes hépatiques via les interactions récepteur-ligand RBPR2-RBP4 (Figure 3, Figure 6 et Figure 8).

Importance et applications potentielles de la méthode dans des domaines de recherche spécifiques
Les tests SPR et spectroscopie de rhodopsine basés sur l’absorbance fournissent une stratégie significative pour étudier les mécanismes systémiques et oculaires d’homéostasie de la vitamine A pour la génération de la protéine rétinylidène (rhodopsine). En résumé, ces techniques et approches expérimentales peuvent élucider la cinétique du transport dépendant des récepteurs membranaires des rétinoïdes alimentaires à travers le foie et dans l’œil, facilitant ainsi la génération de rhodopsine (Figure 8). Ils aident également à comprendre les mécanismes et les conséquences oculaires des mutations des récepteurs de la vitamine A et des protéines d’opsine, en particulier dans la liaison à leurs ligands respectifs. Ces interactions peuvent influencer la génération de la protéine rétinylidène, qui est cruciale pour la fonction visuelle.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude ; dans la collecte, l’analyse ou l’interprétation des données ; dans la rédaction du manuscrit, ou dans la décision de publier les résultats.

Remerciements

Les auteurs remercient la Dre Beata Jastrzebska, Ph.D. (Département de pharmacologie, Case Western Reserve University, OH) pour ses conseils sur le protocole d’absorption de la rhodopsine. Ces travaux ont été financés par une subvention NIH-NEI (EY030889 et 3R01EY030889-03S1) et, en partie, par les fonds de démarrage de l’Université du Minnesota versés à G.P.L.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit Quant 2DCytiva80648356
Amine Kit de couplageCytivaBR100050
Logiciel d’évaluation Biacore BiacoreS200Version 1.1
Biacore Puce de capteur CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 cellules compétentesThermo Spectrophotomètre CD scientifiqueEC0114
SpectropolarimètreJascoJ-815 Glycine
HCLFisher BioreagentsBP381-1
GraphPad Prism  ;Ajustement du modèle, analyse des données
LB bouillonFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-&beta ;-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Vecteur d’expression résistant à la kanamycine  ;Addgene69864-3
Kit de purification de plasmidesQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysecassette Thermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05 %
UV vis SpectrophotomètreAgilent  ;Cary 60 UV-Vis
Nom du peptide Séquence peptidiqueHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14 %Conforms
Mouse Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84 %Conforme
Souris Rbpr2 mutant S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92 %Conforme

Références

  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411(2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676(2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987(2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229(2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236(2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371(2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099(2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293(2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).

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Mots-clés

R cepteurs de la vitamine Aprot ine liant le r tinolr sonance plasmonique de surfacecin tique de liaison du ligandquantification de la rhodopsinecascade de phototransductionanalyse spectrophotom triquehom ostasie des r tino desinteraction ligand opsine

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