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Caractérisation des plaquettes procoagulantes par mesure de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à partir de plaquettes humaines purifiées

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DOI :

10.3791/67042

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29 novembre 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

Dans cet article

Résumé

La formation de plaquettes procoagulantes a été corrélée à un risque accru de thrombose. Voici un protocole précis d’isolement des plaquettes lavées du sang humain, destiné à quantifier l’exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules, qui sont des caractéristiques distinctives des plaquettes procoagulantes.

Résumé

Les plaquettes activées favorisent la coagulation principalement en exposant le procoagulant phospholipide phosphatidylsérine (PS) sur les surfaces externes de leur membrane et en libérant des microvésicules exprimant le PS qui conservent l’architecture membranaire d’origine et les composants cytoplasmiques de leurs cellules d’origine. L’accessibilité de la phosphatidylsérine facilite la liaison des principaux facteurs de coagulation, amplifiant considérablement l’efficacité catalytique des enzymes de coagulation, tandis que la libération de microvésicules agit comme un médiateur essentiel de la signalisation intercellulaire. Les plaquettes procoagulantes jouent un rôle crucial dans la stabilisation des caillots pendant l’hémostase, et leur proportion accrue dans la circulation sanguine est corrélée à un risque accru de thrombose. Il a également été démontré que les microvésicules plaquettaires sont riches en facteurs de croissance qui favorisent la cicatrisation des plaies et la modulation inflammatoire. L’analyse de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à l’aide de la cytométrie en flux pose des défis importants en raison de leur petite taille et du nombre limité d’événements positifs pour les marqueurs d’intérêt. Malgré des progrès considérables au cours de la dernière décennie, les méthodes d’évaluation de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules restent en cours de développement. Malheureusement, il n’existe pas de protocole unique universellement applicable, et plusieurs facteurs doivent être évalués pour déterminer la méthodologie la plus appropriée pour chaque application spécifique. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler les plaquettes lavées du sang humain, suivi de l’activation du collagène et/ou de la thrombine, afin de mesurer l’exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules qui caractérisent les plaquettes procoagulantes. Ce protocole est conçu pour faciliter la préparation initiale du plasma riche en plaquettes et l’isolement des plaquettes lavées. Enfin, l’exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules sont quantifiées par cytométrie en flux, permettant l’identification des plaquettes procoagulantes.

Introduction

La formation de procoagulant plaquettaire est cruciale pour maintenir l’hémostase 1,2,3. Ce processus implique l’expression induite par agoniste des phospholipides sur la membrane plaquettaire, ce qui est essentiel pour l’assemblage des complexes ténase et prothrombinase 1,3,4. Après l’activation plaquettaire, les microvésicules plaquettaires sont également libérées en continu 5,6. Les microvésicules (de 50 nm à plus de 1 μm de diamètre) encapsulent à la fois la structure membranaire et les constituants cytoplasmiques des cellules d’origine 7,8. Les microvésicules sont des médiateurs importants de la signalisation intercellulaire 9,10 et sont également dépositaires de facteurs de croissance qui favorisent la cicatrisation des plaies et la modulation inflammatoire11,12. Il a également été suggéré que les microvésicules étaient 50 à 100 fois plus procoagulantes que les plaquettes activées13. Notamment, des preuves récentes suggèrent que les plaquettes stockées s’activent, ce qui entraîne la production de microvésicules, ce qui a des ramifications potentielles pour la pratique de la thérapie par transfusion de plaquettes. La durée de conservation prolongée des microvésicules et l’activité procoagulante accrue en font un substitut prometteur aux plaquettes dans les applications de transfusion14.

Des innovations méthodologiques ont été apportées pour, directement et indirectement, évaluer la formation de procoagulants plaquettaires dans des conditions de santé et de maladie 4,14,15. L’évaluation de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à l’aide de plaquettes purifiées a fourni de nouvelles données sur la façon dont les réponses procoagulantes plaquettaires sont perturbées dans diverses maladies humaines 1,4. Ce domaine de recherche en pleine croissance ouvre également des avenues pour des interventions thérapeutiques 1,4. Cependant, l’isolement et l’analyse des plaquettes purifiées du sang prennent du temps, nécessitent de l’équipement de laboratoire spécialisé et ne sont donc pas adaptables actuellement aux diagnostics cliniques de routine16,17. L’analyse de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules est également difficile en raison de leur petite taille et du nombre d’événements positifs pour les marqueurs d’intérêt18,19.

La cytométrie en flux, qui s’appuie sur la liaison fluorescente de l’annexine-V, a été la pierre angulaire de l’évaluation de l’expression de la PS sur les plaquettes et les microvésicules depuis sacréation il y a deux décennies. Il a été largement accepté dans l’examen des plaquettes et des microvésicules procoagulantes21,22. Par conséquent, un protocole optimisé est présenté ici qui peut être utilisé pour l’isolement des plaquettes purifiées à partir d’échantillons de sang à l’aide de la technique développée par le groupe23 de Cazenave, et la caractérisation ultérieure de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules par cytométrie en flux après activation plaquettaire24. Ce protocole facilitera l’étude plus poussée et la caractérisation approfondie des plaquettes procoagulantes dans les populations cliniques d’intérêt.

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices et a été approuvé par la Commission d’éthique de la recherche humaine du CHU de Bordeaux. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des volontaires en bonne santé qui ont donné leur consentement éclairé, et ces échantillons ont été traités conformément aux protocoles de l’établissement. Les donneurs qui avaient pris des substances susceptibles d’affecter la fonction plaquettaire ont été exclus si ces substances avaient été prises dans les 10 jours précédant les expériences. Le consentement éclairé a été obtenu auprès de volontaires en bonne santé pour prélever leur sang et publier leurs données. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Prélèvement sanguin et préparation des plaquettes lavées

  1. Prélever le sang veineux périphérique dans des tubes de prélèvement contenant l’anticoagulant actif citrate trisodique avec acide citrique et dextrose (ACD) après avoir jeté les 3 premiers mL.
  2. Après le prélèvement, retournez doucement le tube pour mélanger le sang avec l’ACD et laissez reposer le mélange à température ambiante pendant 15 min avant la centrifugation.
  3. Compter les plaquettes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avant la centrifugation afin de déterminer la vitesse correcte de centrifugation (tableau 1). Préparez du plasma riche en plaquettes (PRP) par centrifugation à 250 x g pendant 10 min à température ambiante (RT) sans appliquer le frein pour optimiser la récupération plaquettaire.
    REMARQUE : Cette étape produira trois couches dans l’échantillon : la couche supérieure contenant du plasma, des plaquettes et une petite fraction de globules blancs ; une couche intermédiaire enrichie en globules blancs ; et une couche inférieure composée de globules rouges. Transférez soigneusement le PRP de la couche supérieure dans un nouveau tube conique de 50 ml pour éviter la contamination par des globules rouges et blancs.
  4. Au PRP, ajouter 1 mL d’ACD-A (voir le tableau 2) et 6,25 μL d’apyrase par 9 mL.
    REMARQUE : L’apyrase, à une concentration de 0,02 U/mL, dégrade les traces d’ATP ou d’ADP sécrétées par les plaquettes, empêchant ainsi la désensibilisation des récepteurs plaquettaires de l’ADP et maintenant la forme des plaquettes25. Un inhibiteur de la prostacycline PGI2 (0,5 μM) peut également être inclus avec l’apyrase pour prévenir l’activation plaquettaire.
  5. Préparez la pastille de plaquettes par centrifugation à RT à 1100 x g pendant 10 min. Aspirer le surnageant contenant du plasma pauvre en plaquettes (PPP) à l’aide d’une méthode douce, telle qu’une pipette Pasteur, et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lavage (voir tableau 3 et tableau 4). Homogénéiser doucement à l’aide d’une pipette, puis ajouter 3 à 4 ml supplémentaires de tampon de lavage.
    REMARQUE : Le taux de calcium est réduit pour empêcher la coagulation avec des facteurs de caillot présents dans le plasma. À ce stade, le plasma pauvre en plaquettes a été complètement éliminé, empêchant la formation de caillots et l’activation plaquettaire par la production de thrombine.
  6. Centrifuger à nouveau à RT à 1100 x g pendant 10 min. Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lavage. Transférez 150 μL de la suspension plaquettaire dans un tube de 1,5 mL pour le comptage des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Ensuite, remettez le granulé en suspension avec 3-4 mL de tampon de lavage.
  7. Effectuer une centrifugation finale à 1100 x g pendant 10 min (à RT). Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille plaquettaire dans un volume de tampon réactionnel (voir tableau 5 et tableau 6) pour obtenir une concentration finale de 5 x 1011 plaquettes/L.
  8. Laissez les plaquettes lavées reposer pendant au moins 30 minutes avant les expériences pour permettre aux inhibiteurs résiduels de s’estomper et aux plaquettes de s’acclimater au tampon.

2. Préparation du dosage

  1. Préparez tous les agonistes et fluorochromes dans le tampon de réaction. Ajouter 5 μL de thrombine à 45 μL de tampon (dilution 1:10) et 5 μL d’ionophore à 495 μL de tampon (dilution 1:500).
    1. Pour les tests internes, comparez les plaquettes non activées à celles traitées avec des agonistes simples et doubles. Ajouter, dans différentes aliquotes, 100 μL de plaquettes lavées à 50 x 109 plaquettes/L à : (i) 10 μL de tampon de réaction, (ii) 3 μL de collagène non dilué (concentration finale de 30 μg/mL), (iii) 10 μL de thrombine pré-diluée (0,5 UI/mL), (iv) 3 μL de collagène non dilué + 10 μL de thrombine pré-diluée, et (v) 10 μL d’ionophore pré-dilué (concentration finale de 2 μM), qui est connu pour augmenter directement les niveaux de calcium intracellulaire, comme indiqué précédemment26.
      REMARQUE : Le traitement avec un ionophore de calcium, tel que A23187 ou ionomycine, est essentiel car il induit un brouillage important de la membrane phospholipidique et une externalisation accrue de la PS.
    2. Agitez doucement chaque aliquote à la main et incubez à 37 °C pendant 5 min.
      REMARQUE : Une incubation plus longue des agonistes (30 min) peut permettre une meilleure différenciation entre les populations de plaquettes pendant le processus d’analyse par cytométrie en flux.
  2. Ajouter 5 μL d’Annexin-V FITC non dilué dans chaque microtube et incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.
    REMARQUE : Un anticorps monoclonal dirigé contre l’un des récepteurs plaquettaires spécifiques, GPIX (CD42b) ou l’intégrine αIIb (CD41, GPIIb), pourrait également être inclus pour mieux identifier les cellules plaquettaires.
  3. Ajouter 500 μL de tampon de réaction pour arrêter le processus et procéder à l’analyse de l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux.

3. Caractérisation des plaquettes et microvésicules procoagulantes par cytométrie en flux (FC)

REMARQUE : Pour une analyse fiable de la fonction plaquettaire, utilisez un instrument de cytométrie en flux (FC) configuré conformément aux normes établies27. L’instrument doit être capable de détecter la diffusion directe (FSC) et au moins un signal de fluorescence. Réglez les détecteurs de diffusion de la lumière et de fluorescence sur le gain logarithmique. Diluez les échantillons de manière appropriée pour la FC afin de vous assurer que seules les plaquettes individuelles sont comptées à une vitesse d’acquisition de données réduite.

  1. Réglez le cytomètre en flux sur un débit « lent » avec un seuil d’au moins 10 000 événements plaquettaires. Surveillez l’émission de fluorescence à l’aide d’un filtre passe-passe pour FITC.
  2. Gate la population plaquettaire à l’aide de la diffusion vers l’avant (FSC). Examinez les plaquettes et les microvésicules libérées en fonction de leur taille. Utilisez des diagrammes de densité pour identifier les plaquettes et les microvésicules libérées pour les plaquettes au repos et stimulées ; Analysez chaque population fermée indépendamment.
  3. Distinguer les plaquettes procoagulantes selon l’axe FL1. Placez le seuil négatif à l’extrême droite de la population plaquettaire à l’état de repos (c’est-à-dire en présence d’un tampon de réaction). Après l’activation plaquettaire, classez tous les événements localisés à droite de cette coupure comme des plaquettes exposant la phosphatidylsérine.
  4. Différencier les microvésicules, plus petites que les plaquettes, par leurs caractéristiques uniques de diffusion de la lumière. Fixer le seuil à la valeur FSC la plus basse observée dans la population de plaquettes au repos. Après activation, classez tous les événements positifs à la phosphatidylsérine tombant en dessous de ce seuil comme des microvésicules.
    REMARQUE : Tenez compte des variations individuelles de la taille des plaquettes en ajustant la coupure si nécessaire. Assurez-vous que moins de 1 % des microvésicules sont présentes à l’état de repos.

Résultats

La quantification des plaquettes et des microvésicules procoagulantes est réalisée à l’aide de la coloration à l’Annexine-V, avec au moins 50 000 événements enregistrés par échantillon. Comme indiqué à l’étape 2.2, les mesures plaquettaires de base ont été prises à partir d’échantillons incubés avec un tampon de réaction, comme illustré à la figure 1A. La taille des plaquettes a été mesurée à l’aide de la valeur médiane de diffusion vers l’avant (FSC). Bien que la FSC soit influencée par divers facteurs, elle reste un indicateur courant de l’estimation de la taille des cellules, y compris celle des plaquettes. Des graphiques de densité de surface (figure 1A) ont été utilisés pour identifier et détecter les plaquettes au repos et les microvésicules libérées.

Dans le cas des plaquettes non activées, moins de 2,9 % présentaient de la phosphatidylsérine (PS), déterminée par coloration à l’annexine-V. Lors de l’activation des plaquettes lavées avec du collagène seul ou en conjonction avec de la thrombine ou de l’ionophore de calcium, il y a eu une augmentation observable de l’exposition au PS. Le collagène à lui seul a entraîné une augmentation de 26,7 % des plaquettes PS positives. La thrombine a eu des effets minimes sur l’exposition au PS (9,1%), mais lorsqu’elle est associée au collagène, elle a augmenté le pourcentage de plaquettes exposant le PS à 36,2%. À titre de référence, le traitement avec un ionophore de 2 μM a entraîné une procoagulation de 49,6 % des plaquettes.

La figure 1 montre que la proportion de base de microvésicules provenant de plaquettes lavées chez un individu en bonne santé était minime (0,3 %). Bien que la thrombine et le collagène aient légèrement augmenté la formation de microvésicules, ce n’est qu’avec la combinaison de collagène et de thrombine que la formation de microvésicules a augmenté de manière significative (figure 1D ; 11,4 %). L’ajout de 2 μM d’ionophore a permis d’exposer 44,0 % des microvésicules formées par les plaquettes de contrôle au PS.

La figure 2 fournit des informations sur la variation, la répétabilité et la reproductibilité attendues de ce processus.

figure-results-1
Figure 1 : Exposition au PS et formation de microvésicules dans les plaquettes de contrôle au repos et activées. Les plaquettes étaient activées ou non activées (au repos) (A), avec 30 μg/mL de collagène (B), avec 0,5 U/mL de thrombine (C), avec des combinaisons de collagène et de thrombine (D) avec 2 μM d’ionophore. Les diagrammes à points représentatifs montrent la taille des plaquettes (diffusion vers l’avant (FSC log)) par rapport à la liaison Annexin-V. Des lignes horizontales et verticales (E) délimitent la population plaquettaire négative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Répétabilité et reproductibilité de l’exposition au PS et de la formation de microvésicules après incubation avec un ionophore. Analyse de l’exposition au PS et de la formation de microvésicules après incubation avec un ionophore 2 μM ou 5 μM dans des plaquettes lavées, traitées ou non traitées avec du citrate (un chélateur calcique) : (A) de 4 témoins sains différents ; (B) à partir d’un témoin sain, répété 5 fois ; et (C) à partir de deux témoins sains préparés par deux techniciens différents. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Numération plaquettaire dans le sang total (10,9 par ml)Forces centrifuges relatives (g)
30 <70
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

Tableau 1 : Forces centrifuges relatives pour la préparation du plasma riche en plaquettes en relation avec la numération plaquettaire dans le sang total.

RéactifQuantité
Acide citrique monohydraté (C6H8O7. H2O, 38 mM)8 grammes
Citrate trisodique dihydraté (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)180 grammes
Glucose (C6H12O6, 136 mM)24,6 grammes
Le pH de la solution ne doit pas être ajusté. Maintenir la solution à 4 °C.

Tableau 2 : Préparation d’une solution aqueuse de 1 L d’acide-citrate-dextrose (ACD).

RéactifQuantité
Acide citrique monohydraté (C6H8O7. H2O, 36 mM)7,56 grammes
NaCl (103 mM)6 grammes
NaOH4 grammes
MgCl2,6 H2O (1 mM)0,203 g
Ajustez le pH à 6,5. Maintenir la solution à 4 °C.

Tableau 3 : Préparation de la solution mère du tampon de lavage.

RéactifQuantité
30% d’albumine sérique bovine (BSA)583 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Glucose40 mg
Apyrase31,5 μL

Tableau 4 : Préparation d’une solution extemporanée de 50 mL de tampon de lavage à partir de la solution mère.

RéactifQuantité
NaCl (137 mM)8 grammes
KCl (2,7 mM)0,2 g
MgCl2,6 H2O (1 mM)0,203 g
HEPES (5 mM)1,19 g
NaHCO3 (12 mM)1 g
NaH2PO4.2H 2O ; 0,3 million de kilomètres0,05 g
Ajustez le pH à 7,4. Maintenir la solution à 4 °C.

Tableau 5 : Préparation d’une solution mère de tampon de réaction.

RéactifQuantité
30% d’albumine sérique bovine (BSA)167 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
Glucose50 mg

Tableau 6 : Préparation d’une solution extemporanée de 50 mL de tampon de réaction à partir de la solution mère.

Discussion

Des études récentes sur les plaquettes procoagulantes ont mis en évidence leurs modifications au cours de plusieurs maladies 1,28,29, soulignant l’importance de leur analyse détaillée et de leur caractérisation 30,31,32. Bien que les essais cliniques actuels pour évaluer la formation de procoagulants plaquettaires soient limités, il y a eu une augmentation significative de l’intérêt clinique au cours des deux dernières décennies. Par exemple, la scramblase dépendante du calcium TMEM16F (ANO6) est impliquée dans l’exposition à la phosphatidylsérine (PS) procoagulante33. Des variantes de TMEM16F sont associées au syndrome de Scott 33,34,35, un trouble hémorragique rare caractérisé par une altération du brouillage des phospholipides et une réduction de la production de thrombine dans les plaquettes activées36. De plus, des taux élevés de plaquettes procoagulantes sont liés aux accidents vasculaires cérébraux thrombotiques et aux maladies coronariennes, ce qui suscite l’intérêt pour les thérapies visant à réduire l’activité des procoagulants plaquettaires37. Parmi les méthodes actuellement disponibles pour évaluer la formation de plaquettes procoagulantes, l’évaluation de l’exposition au PS par la liaison à l’annexine-V et la libération de microvésicules est l’une des plus couramment utilisées38,39.

Le protocole décrit ici permet l’isolement des plaquettes purifiées chez l’homme et la caractérisation des plaquettes procoagulantes en mesurant l’exposition au PS et la libération de microvésicules à l’aide de la cytométrie en flux. Il est crucial de conseiller aux volontaires en bonne santé de s’abstenir de prendre des médicaments susceptibles d’avoir un impact sur la fonction plaquettaire pendant au moins 10 jours avant le prélèvement sanguin. Le prélèvement sanguin nécessite des précautions pour éviter les traumatismes veineux ou le débit excessivement lent, car ceux-ci peuvent induire la génération de thrombine et l’activation plaquettaire. Le sang anticoagulé au citrate de sodium n’est pas recommandé pour la préparation des plaquettes lavées, car le calcium résiduel peut permettre la génération de thrombine et l’activation plaquettaire pendant la centrifugation17. Le pH du sang anticoagulé ACD est de 6,5 et la concentration de citrate est plus élevée (22 mmol/L) que ceux du sang anticoagulé au citrate (7,5) et que la concentration de citrate (17) est de13 mmol/L. Le pH acide et la baisse de la concentration de calcium extracellulaire dans le sang anticoagulé ACD empêchent l’agrégation plaquettaire24. Il est essentiel de minimiser la génération de thrombine pendant le processus de collecte. Une ponction veineuse non traumatique à l’aide d’une aiguille d’au moins 21 G est recommandée pour prévenir la stase veineuse ou une pression excessive. De plus, les premiers millilitres de sang doivent être jetés pour éviter la contamination par des facteurs tissulaires et des traces de thrombine17. Il est également essentiel de minimiser le temps entre la ponction veineuse et le traitement de l’échantillon, car un stockage prolongé du sang peut entraîner une activation plaquettaire, augmentant ainsi l’exposition au PS et la libération de microvésicules40. Une attention particulière doit être accordée tout au long de la procédure de préparation plaquettaire pour éviter la préactivation spontanée des plaquettes, qui peut se produire pendant le processus de préparation lui-même41,17. De plus, l’isolement des plaquettes purifiées nécessite d’éviter soigneusement la contamination par d’autres cellules sanguines17. Il s’agit d’aspirer soigneusement le surnageant après avoir centrifugé les plaquettes pour assurer une préparation propre. Comme la pastille est généralement visible et fermement collée à la paroi du tube, le surnageant peut être facilement aspiré à l’aide d’une pointe de pipette.

Au cours des étapes de lavage par centrifugation, les plaquettes sont remises en suspension dans un tampon qui simule les conditions physiologiques. L’utilisation de plaquettes lavées dans un tampon physiologique les isole des anticoagulants et du plasma, empêchant ainsi les artefacts médiés par la thrombine. Bien que le plasma riche en plaquettes (PRP) soit une méthode rapide pour obtenir des concentrations élevées de plaquettes, son utilisation pour des études fonctionnelles est limitée par les changements de pH induits par les anticoagulants et la teneur extracellulaire en calcium et en protéines du plasma, qui peuvent influencer l’activation plaquettaire17. De plus, des niveaux élevés de PS générés lors de l’activation plaquettaire seraient suffisants pour favoriser l’assemblage de complexes de coagulation plasmatique, l’explosion ultérieure de thrombine et la formation de caillots dans le PRP, rendant les résultats expérimentaux ininterprétables. En revanche, la remise en suspension dans un tampon contenant de l’apyrase est recommandée pour maintenir la fonctionnalité plaquettaire en empêchant la désensibilisation des récepteurs purinergiques par la dégradation de l’ATP et de l’ADP42,43. Bien que les étapes répétées de centrifugation et de lavage nécessitent plus de temps, les suspensions de plaquettes lavées préparées par cette méthode offrent l’avantage d’une plus grande stabilité (5-8 h) par rapport aux préparations de PRP citraté, qui ne sont pas stables plus de 1-3 h23.

Cette étude démontre la faisabilité et la simplicité de la quantification des microvésicules par cytométrie en flux. Cependant, la production de microvésicules peut se perdre dans les débris et le bruit de la machine. Par conséquent, il est essentiel de s’assurer que le cytomètre en flux a subi un nettoyage approfondi et que les tampons utilisés ne contiennent pas de particules contaminantes qui pourraient entraîner un bruit de fond élevé lors de l’analyse par cytométrie en flux. Alternativement, des cytomètres en flux spécialisés avec des capacités de détection de petites particules peuvent être utilisés pour identifier la formation de microvésicules. La liaison de l’Annexine-V marquée à la fluorescéine en fonction de la teneur en PS membranaire a également été étudiée, mettant en évidence le rôle critique de concentrations suffisantes de calcium dans le tampon pour la liaison de l’Annexine-V et la réponse plaquettaire procoagulante44.

Les données soutenant la stabilité des échantillons de plaquettes dans le temps sont actuellement rares. Plusieurs laboratoires se sont attaqués à ce problème en stabilisant les échantillons par l’ajout d’une solution fixatrice, telle qu’un tampon contenant du formaldéhyde. L’ajout d’un fixateur à des échantillons de plaquettes fraîchement collectés présente l’avantage de conserver les échantillons pour une analyse ultérieure. Néanmoins, la fixation au formaldéhyde peut provoquer une augmentation artificielle de la liaison de l’Annexine-V. Rochat et al. ont démontré que la fixation des plaquettes avec une solution de formaldéhyde à faible concentration et sans calcium ne modifie pas la proportion de plaquettes positives à l’annexine-V45. Cependant, les chercheurs qui ont besoin d’une fixation doivent optimiser leur protocole spécifique pour s’assurer qu’il ne provoque pas de résultats artificiellement altérés. Sinon, les échantillons doivent être traités immédiatement.

Une autre voie qui peut également conduire à l’exposition au PS implique l’apoptose intrinsèque, un processus connu pour réguler la durée de vie des plaquettes dans la circulation46. L’activation des protéines pro-apoptotiques BAK et BAX entraîne l’activation de la caspase, ce qui favorise l’externalisation de la PS, conduisant à la clairance in vivo des plaquettes. Récemment, il a été suggéré d’utiliser un autre marqueur de surface plaquettaire, la P-sélectine/CD62P, en plus de l’Annexine-V, pour distinguer les procoagulants des plaquettes apoptotiques47. Les plaquettes procoagulantes devraient être positives pour les marqueurs PS et P-selectin, tandis que les plaquettes apoptotiques sont positives pour l’annexine-V mais négatives pour la P-sélectine. Cependant, le temps est également un facteur de différenciation entre les plaquettes procoagulantes et apoptotiques47. La génération de plaquettes procoagulantes in vitro est un processus rapide, tandis que l’apoptose intrinsèque est un processus plus lent, prenant48 heures. Dans ce contexte, l’utilisation de marqueurs supplémentaires pour évaluer les plaquettes procoagulantes n’est pas nécessaire, ce qui simplifie la méthode. Des augmentations soutenues de la formation intracellulaire de Ca2+ et de plaquettes procoagulantes se produisent en quelques minutes avec des agonistes très puissants, tels que l’ionophore ou une activation combinée avec du collagène et de la thrombine, tandis qu’un inhibiteur de BCL-XL (ou mimétique BH3) déclenche la formation de plaquettes apoptotiques en activant les pro-apoptotiques BAK et BAX, provoquant la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale, la libération de cytochrome C, et l’activation de la caspase49.

En conclusion, le protocole décrit ici facilite l’isolement des plaquettes purifiées et leur caractérisation ultérieure de l’activité procoagulante à l’aide d’un équipement de laboratoire standard et de la cytométrie en flux. Cette procédure ouvre la voie à de futures recherches sur les plaquettes procoagulantes dans les échantillons de sang des patients, avec des applications potentielles dans la pratique clinique, comme le diagnostic du rare syndrome de Scott50.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A Tubes de prélèvement sanguinBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Albumine sérique bovine 30 %Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25MSigma-AldrichC3881
Acide citrique monohydratéMerck5949-29-1
Collagène  ;Stago86924
Glucose  ;Sigma-AldrichG8270
Hepes  ;Sigma-AldrichH3375
Ionophore  ;Calbiochem/VWR100105
KCl  ;Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl  ;VWR27810.295
NaOH  ;Merck1.06498
Hydrogénocarbonate de sodiumMerck6329NaHCO3
Thrombin  ;Hyphen BiomedEZ 006 A
Citrate trisodique dihydratéSigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
&alpha ; Intégrine IIb (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Références

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