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Synthèse de nanoparticules lipidiques par écoulement turbulent dans des mélangeurs à jet d’impact confinés

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DOI :

10.3791/67047

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23 août 2024

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1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Dans cet article

Résumé

Un protocole détaillé pour la synthèse de nanoparticules lipidiques (LNP) à l’aide de technologies de mélangeur à jet d’impact confiné (CIJ), y compris un CIJ à deux jets et un mélangeur vortex multi-entrées à quatre jets (μMIVM), est présenté. Les mélangeurs CIJ génèrent des environnements de micro-mélange reproductibles et turbulents, ce qui permet de produire des LNP monodispersés.

Résumé

Les nanoparticules lipidiques (LNP) ont démontré leur énorme potentiel en tant que vecteurs d’administration thérapeutique, comme en témoigne l’approbation et l’utilisation mondiale de deux vaccins à ARN messager (ARNm) contre la COVID-19. À petite échelle, les LNP sont souvent fabriqués à l’aide de la microfluidique ; Cependant, les limites de ces appareils empêchent leur utilisation à grande échelle. Les vaccins contre la COVID-19 sont fabriqués en grandes quantités à l’aide de mélangeurs turbulents à jet d’impact confiné (CIJ). La technologie CIJ permet une production à l’échelle du laboratoire avec la certitude qu’elle peut être mise à l’échelle des volumes de production. Les concepts clés du mélange CIJ sont que la longueur et l’échelle de temps du mélange sont déterminées par l’intensité de la turbulence dans la cavité de mélange et que la formation de nanoparticules se produit loin des parois, éliminant ainsi le problème du dépôt sur les surfaces et de l’encrassement. Ce travail démontre le processus de fabrication de LNP à l’aide de la technologie de mélangeur à jet d’impact confiné avec deux géométries : le CIJ à deux jets et le mélangeur vortex multi-entrées à quatre jets (MIVM). Les avantages et les inconvénients de chaque géométrie de mélange sont discutés. Dans ces géométries, les LNP sont formés par le mélange rapide d’un flux de solvants organiques (généralement de l’éthanol contenant les lipides ionisables, les colipides et les lipides PEG stabilisants) avec un flux aqueux anti-solvant (tampon aqueux contenant de l’ARN ou de l’ADN). Les paramètres de fonctionnement des mélangeurs CIJ et MIVM sont présentés pour préparer des LNP reproductibles avec une taille, un potentiel zêta, une stabilité et une efficacité de transfection contrôlés. Les différences entre les LNP fabriqués avec un mauvais mélange (solutions de pipetage) et le mélange CIJ sont également présentées.

Introduction

Les thérapies à base d’ARNm présentent un grand potentiel pour le traitement et la prévention d’un large éventail de maladies, notamment les maladies infectieuses, les troubles génétiques et les cancers1. Contrairement aux thérapies à petites molécules, qui peuvent diffuser passivement à travers la membrane cellulaire, les acides nucléiques doivent être encapsulés pour une administration intracellulaire2. L’encapsulation fournit à la fois structure et stabilité à l’ARNm, facilitant leur livraison intracellulaire via les voies endocytaires et empêchant la dégradation des composants intra et extracellulaires tels que les nucléases3. Une multitude de matériaux et de nanovecteurs ont été développés pour l’encapsulation et l’administration d’ARNm, notamment des nanoparticules inorganiques, des polymères, des lipides et des matériaux de type lipidique1. Parmi ceux-ci, les LNP sont apparus comme la plateforme d’administration la plus importante pour les thérapies à base d’ARNm4.

Les LNP sont composés de quatre composants lipidiques : le lipide ionisable, le cholestérol, le lipide zwitterionique et le stabilisateur lipidiquePEG 5. Les lipides ionisables adaptés à l’administration d’ARNm présentent un équilibre délicat entre l’hydrophobicité des lipides et la constante de dissociation (pKa) d’un groupe d’amines ternaires6. Le lipide ionisable pKa a généralement un pH compris entre 6,0 et 6,7, comme KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) et ALC-03157. Cette restriction pKa sur le lipide ionisable permet à la fois l’encapsulation des polymères d’acides nucléiques sous forme de sels lipidiques hydrophobes et l’administration intracellulaire par un processus d'« échappement de l’endosome ». Les LNP pénètrent dans une cellule cible par des voies d’endocytose (diverses) qui impliquent toutes une acidification de l’endosome de pH 7,4 à pH ~5,8. Le lipide ionisable pKa garantit que les LNP ont des surfaces presque neutres dans des conditions physiologiques, mais deviennent cationiques dans un endosome9 acidifiant. Cette réponse au pH permet la rupture sélective de la membrane endosomale uniquement, la libération du polymère d’acide nucléique encapsulé et préserve la viabilité cellulaire, contrairement aux lipides cationiques permanents utilisés dans les systèmes de transfection tels que la lipofectamine. Le cholestérol est une molécule interstitielle hydrophobe de la structure LNP qui améliore la fluidité des lipides. Le lipide zwitterionique joue un rôle structurel et forme une bicouche à la surface de la LNP. Le poly(éthylène glycol)-lipide (PEG-lipide) est un stabilisant colloïdal qui améliore la stabilité de la LNP en conférant un stabilisant stérique polymère sur la surface de la LNP, qui résiste à l’agrégation des LNP. Cela stabilise la LNP, en particulier lors des changements de pH qui régénèrent la forme de base libre du lipide ionisable qui se comporte comme une huile hydrophobe. La recette d’Onpattro (patisiran) (ci-après, appelée formulation LNP) est souvent utilisée comme point de départ pour la formulation LNP avec un lipide ionisable MC3, du cholestérol, de la distéaroylphosphatidylcholine (DSPC) et de la PEG2000-DMG dissoute dans de l’éthanol mélangés à une solution aqueuse d’ARN10.

Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour fabriquer des LNP encapsulant des polymères d’acides nucléiques, la plupart d’entre elles reposant sur un thème commun : le mélange rapide d’un flux d’éthanol contenant des lipides avec un flux aqueux incorporant l’acide nucléique d’intérêt (siRNA, mRNA ou DNA)9,11,12,13,14 . À cet égard, les procédés de mélange en vrac tels que le mélange à pipettes et le mélange à vortex offrent une stratégie simple pour former des LNP qui élimine le besoin d’utiliser des instruments sophistiqués12. Cependant, le mélange en vrac n’offre pas une distribution homogène des composants, ce qui conduit à une distribution granulométrique de la LNP sous-optimale ainsi qu’à une variabilité significative d’un lot à l’autre15.

Les laboratoires utilisent régulièrement des techniques de mélange microfluidique pour obtenir des LNP reproductibles en obtenant un contrôle plus précis des conditions de mélange 12,13,16. Pourtant, les conditions d’écoulement laminaire dans les dispositifs microfluidiques, qui sont inhérentes en raison des petites échelles de longueur et des faibles vitesses dans une chambre microfluidique, entraînent un mélange solvant/antisolvant relativement lent17. Les petites dimensions de la chambre limitent considérablement le débit et l’évolutivité nécessaires à la production GMP de LNP, mais les chercheurs ont parallélisé les chambres microfluidiques pour tenter d’augmenter les volumes de production de15. Une géométrie microfluidique parallélisée n’élimine pas le problème de l’adsorption des lipides sur les surfaces lors du traitement de grands volumes, un problème communément appelé « encrassement » du dispositif de mélange, et il existe des problèmes d’uniformité et de stabilité des écoulements qui rendent la mise à l’échelle microfluidique difficile pour la production à l’échelle industrielle18,19. Il n’est pas surprenant que les sociétés pharmaceutiques aient utilisé des mélangeurs à jet d’impact turbulents pour fabriquer l’ARNm-LNPs20 de la vaccination contre la COVID-19.

Le processus de production de LNP chargés d’ARN implique le mélange d’un flux tampon aqueux contenant la charge utile d’ARN avec un flux d’éthanol contenant les quatre composants lipidiques distincts. Ces formulations utilisent un tampon acide avec un pH de 4,0 ou moins, qui charge le lipide ionisable lorsque les flux aqueux et éthanoliques se mélangent. Les lipides ionisables chargés positivement interagissent électrostatiquement avec les ARN chargés négativement, formant un sel hydrophobe ARN-lipide. Les espèces lipidiques hydrophobes, y compris le sel ARN-lipide, précipitent dans les solvants mélangés et forment des noyaux hydrophobes. Ces noyaux se développent par la précipitation des lipides zwitterioniques et du cholestérol jusqu’à atteindre un point critique où suffisamment de lipides pégylés s’adsorbent à la surface des LNP, arrêtant la croissance ultérieure -nucléation et le mécanisme de croissance 21,22,23. L’ajout d’un tampon aqueux à la solution lipidique, dans la mesure où les lipides précipitent et où les LNP se forment, dépend de deux échelles de temps distinctes : la période de mélange solvant-antisolvant,τ mélange, et la période de croissance des noyaux, τagg. Le nombre de Damköhler sans dimension, défini comme Da = τmix/τagg, capture l’interaction entre ces échelles de temps24. Dans les cas de mélange lent (Da > 1), la taille finale des LNP est contrôlée par le transport et varie avec le temps de mélange. Inversement, lors d’un mélange rapide (Da < 1), le fluide est fragmenté en stries ou couches de la longueur de Kolmogrov, la formation de LNP étant uniquement régie par la diffusion moléculaire de chaque constituant, ce qui entraîne une cinétique homogène de la formation de LNP. La réalisation de ce dernier scénario exige que la concentration lipidique dépasse un seuil critique, établissant un état de sursaturation propice à une nucléation homogène uniforme.

On estime que τagg varie de quelques dizaines à quelques centaines de millisecondes25. Dans sa configuration la plus basique, les deux flux, l’un contenant de l’éthanol avec des lipides et l’autre contenant un tampon aqueux avec une cargaison d’ARN, sont injectés dans une chambre connue sous le nom de mélangeur à « jet d’impact confiné » (CIJ). Les tourbillons turbulents produisent des échelles de longueur de striation solvant/antisolvant de 1 μm en 1,5 ms lorsqu’ils fonctionnent à des vitesses appropriées. Les vitesses des courants et la géométrie de mélange déterminent la conversion de la quantité de mouvement linéaire en tourbillons turbulents qui mélangent les courants. Ceci est paramétré par le nombre sans dimension, le nombre de Reynolds (Re), qui est linéairement proportionnel aux vitesses d’écoulement. Re est calculé à partir de Re = Σ (ViDi/vi), où Vi est la vitesse d’écoulement dans chaque vapeur, vi est la viscosité cinématique de chaque flux et Di est le diamètre d’entrée du flux dans les dispositifs CIJ à 2 jets26 ou le diamètre de la chambre dans les MIVM à 4 jets27. Remarque : Certaines références pour le CIJ n’utilisent qu’un seul diamètre et une seule vitesse de jet pour définir Re28. Re est dans la gamme de 1 à 100 dans un dispositif microfluidique, tandis que dans les dispositifs CIJ, Re de 125 000 peut être atteint. Dans un mélangeur CIJ, les flux avec une quantité de mouvement égale entrent en collision, dissipant leur quantité de mouvement lors de l’impact sous forme de mélange turbulent, ce qui conduit à un micromélange efficace en raison des petites micro-échelles de Kolmogorov et du petit nombre de Damköhler. Un autre type de mélangeur est le « mélangeur à vortex à entrées multiples » (MIVM), où quatre flux sont dirigés dans une chambre centrale. Dans cette configuration, des flux continus dans la chambre de mélange confinée garantissent une échelle de temps de mélange bien définie. Tous les éléments fluides passent par la zone de mélange à haute énergie dans les deux types de mélangeurs. En revanche, les dispositifs de mélange simples comme les jonctions en T ne contiennent pas de chambre qui fournit une zone de mélange, ce qui entraîne moins de mélange des deux flux en raison de la quantité de mouvement du flux entrant largement déviée vers la direction de sortie plutôt que dans la génération de vortex turbulent. Les mélangeurs CIJ et MIVM peuvent fonctionner en mode batch ou continu, ce qui offre une flexibilité pour la production LNP à différentes échelles.

Ce protocole décrit comment les formulations optimales de LNP sont obtenues en utilisant deux technologies de jets à impact confiné : le CIJ à 2 jets et les mélangeurs MIVM à 4 jets. Le fonctionnement des mélangeurs CIJ et MIVM a déjà été démontré pour la préparation de NP avec des matériaux de base hydrophobes29. Cet article et cette vidéo devraient être consultés comme une ressource supplémentaire sur la formation des NP avec ces mélangeurs. Cette mise à jour se concentre sur la formation de NP à base de lipides. La capacité d’ajuster la taille des LNP en faisant varier les conditions de micro-mélange est démontrée. De plus, l’utilité des technologies CIJ dans la formation de LNP stables et monodispersés avec des efficacités de transfection in vitro améliorées dans les cellules HeLa par rapport aux LNP fabriquées à l’aide d’un mauvais mélange de pipettes est démontrée. De plus, les avantages et les inconvénients de chaque géométrie de mélange CIJ, ainsi que les conditions appropriées nécessaires à la mise à l’échelle de ces mélangeurs, sont discutés.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des tampons, des flux de solvants et d’antisolvants

  1. Dissoudre tous les composants lipidiques dans l’éthanol à des concentrations massiques données, comme indiqué dans le tableau 1, pour obtenir une formulation de patisiran LNP10. Avant utilisation, chauffez les solutions à 37 °C par sonication douce pour dissoudre à nouveau les solides précipités.
    REMARQUE : Des solutions mères plus grandes de plusieurs millilitres peuvent être préparées et stockées à 4 °C.
  2. Préparer une solution mère tampon d’acétate à une concentration de 100 mM, pH 4, en combinant 186 mg d’acétate de sodium et 464 mg d’acide acétique dans 80 mL d’eau exempte de nucléases. Ajustez le pH avec du HCl ou du NaOH concentré au besoin et augmentez le volume final à 100 ml.
  3. Préparer une solution mère tampon HEPES à une concentration de 1 M, pH 7,5, en dissolvant 23,82 g de sel HEPES dans 80 mL d’eau exempte de nucléases. Ajustez le pH avec du HCl ou du NaOH concentré au besoin et augmentez le volume final à 100 ml.
  4. Diluer le polymère d’acide nucléique d’intérêt et la masse tampon d’acétate de 100 mM avec de l’eau sans nucléase pour produire une solution d’ARN de 300 μg/mL dans un tampon d’acétate de 30 mM. Préparez un volume adéquat de solution de travail pour les expériences conçues, et ce protocole nécessite un total de 1500 μL pour les mélangeurs CIJ et MIVM.
    REMARQUE : L’ARN obtenu du fournisseur sera déjà dans un tampon approprié, généralement à une concentration de 10 mg/mL (ARN de levure) ou de 1 mg/mL (ARNm codant pour la luciférase, LucRNA ou ARNm codant pour la GFP, ARN-GFP). L’ARN de levure peut être utilisé comme ARN modèle à faible coût pour les précipitations.

2. Formulation de LNP à l’aide d’un mélangeur CIJ à deux jets

  1. Préparation et nettoyage de l’équipement
    1. Nettoyez les mélangeurs CIJ immédiatement avant utilisation en rinçant le mélangeur avec de l’éthanol. Remplissez deux seringues de 5 ml d’éthanol et verrouillez chacune d’entre elles dans un orifice d’entrée du CIJ. Enfoncez rapidement les seringues et collectez l’effluent du mélangeur comme déchet.
      REMARQUE : Les mélangeurs CIJ peuvent être construits et utilisés comme décrit précédemment29. Différents supports peuvent être utilisés pour maintenir le mélangeur CIJ, notamment un support annulaire, un support de tube à centrifuger ou un erlenmeyer. Les fournisseurs du CIJ sont énumérés dans la Table des matériaux et le Dossier supplémentaire 1.
    2. Retirez les seringues à rinçage à l’éthanol du CIJ. Ces seringues peuvent être stockées et réutilisées pour des rinçages supplémentaires à l’éthanol du CIJ.
    3. Séchez les canaux internes du CIJ en soufflant un flux d’azote sec à travers les adaptateurs d’entrée. N’utilisez que de l’air sec et filtré qui n’est pas contaminé par du brouillard d’huile de pompe ou des aérosols si l’azote n’est pas disponible.
  2. Préparation des flux de solvants et d’antisolvants
    1. Mélanger les solutions mères de lipides et diluer avec de l’éthanol supplémentaire pour produire 500 μL de la solution lipidique à 6 mg/mL indiquée au tableau 1 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
      REMARQUE : Cette formulation est la composition Onpattro couramment utilisée contenant 50% molaire de MC3, 10% molaire de DSPC, 38,5% molaire de cholestérol et 1,5% molaire de DMG-PEG2000.
    2. Diluer la matière tampon d’acétate de pH 4 de 100 mM à 10 mM dans un volume total de 4 mL comme bain d’extinction des effluents du mélangeur CIJ.
      REMARQUE : Une barre d’agitation magnétique peut également être ajoutée au bain de trempe.
    3. Prélever 500 μL de la solution d’ARN préparée à l’étape 1.4 dans une seringue de 1 mL. Retournez la seringue et expulsez l’air de ce flux aqueux d’antisolvant contenant un polymère d’acide nucléique.
    4. Prélever 500 μL de la solution lipidique préparée à l’étape 2.2.1 dans une seringue de 1 mL. Renversez la seringue et expulsez l’air de ce flux de solvant éthanolique contenant des lipides.
  3. Production de LNP dans un mélangeur CIJ
    1. Placez le mélangeur CIJ propre sur le flacon du bain de trempe.
      REMARQUE : Une pince de support annulaire ou un support de tube constitue un support pratique pour la table de mixage CIJ. Voir la figure 1A pour une configuration CIJ typique.
    2. Accouplez les deux seringues remplies aux étapes 2.2.3 et 2.2.4 aux orifices d’entrée du mélangeur CIJ.
    3. Appuyez rapidement sur les deux seringues pour mélanger les flux de solvant et d’antisolvant et recueillir les NP lipidiques dans le bain de trempe.
      REMARQUE : les seringues doivent être avancées rapidement (en moins de 1 s) mais en douceur et uniformément. Un écoulement asymétrique ou lent produira des LNP polydispersés de grande taille.
    4. Retirez le mélangeur CIJ au-dessus du bain de trempe avec les seringues toujours attachées.
      REMARQUE : Ne retirez pas les seringues et ne laissez pas le volume de maintien s’écouler dans le bain de trempe, car ce matériau est mal mélangé et aura un impact négatif sur les propriétés de dispersion de la production s’il est mélangé dans le bain de trempe.
    5. Tenez le CIJ au-dessus d’un conteneur à déchets et retirez les seringues, permettant au volume de rétention résiduel de s’écouler dans le conteneur à déchets. Jetez ces seringues et répétez le processus de nettoyage comme décrit à la section 2.1.
    6. Analysez les LNP produits avec le CIJ comme décrit à la section 5 ci-dessous.

3. Formulation de LNP à l’aide d’un mélangeur MIVM à quatre jets

  1. Assemblage d’une table de mixage MIVM, appelée MIVM de taille micro (μMIVM) pour la distinguer des modèles plus grands utilisés pour la production à grande échelle
    1. Rassemblez tous les composants individuels nécessaires à l’assemblage d’une table de mixage MIVM : le récepteur inférieur, le disque de géométrie de mélange, le disque supérieur, le joint torique et la clé à molette.
      REMARQUE : La construction, l’assemblage et le fonctionnement du MIVM ont déjà été démontrés pour l’encapsulation d’espèces hydrophobes, et les fournisseurs sont énumérés dans le dossier supplémentaire 1 et la table des matériaux29. Voir la figure 2 pour un schéma des composants et la terminologie du support de mélangeur.
    2. Insérez le joint torique dans la rainure du disque de mélange.
    3. Alignez les trous du disque de mélange avec les chevilles du disque supérieur et poussez-les ensemble sans déloger le joint torique.
    4. Vissez le disque de mélange accouplé, le joint torique et l’ensemble du disque supérieur dans le récepteur inférieur sans serrer.
      REMARQUE : Retirez le tube de sortie du récepteur inférieur avant cette étape.
    5. Serrez le disque supérieur dans le récepteur inférieur à l’aide de la clé.
      REMARQUE : Un composé antigrippant de qualité alimentaire ou pharmaceutique peut être appliqué sur les filetages du disque supérieur si un grippage du fil est observé.
    6. Insérez et serrez le raccord du tube de sortie dans le récepteur inférieur pour terminer le MIVM.
    7. Montez le MIVM assemblé dans le support du mélangeur de sorte que le tube de sortie sorte par la plaque de support.
      REMARQUE : La procédure de réglage du support de mélangeur MIVM doit être effectuée périodiquement pour s’assurer que les butées mécaniques sur le support de mélangeur sont correctement configurées29.
  2. Préparation des flux de solvants et d’antisolvants
    1. Mélanger les deux solutions de solvant lipidique éthanolique dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, comme indiqué au tableau 2, en diluant les solutions mères de lipides et en ajoutant de l’éthanol supplémentaire au besoin pour atteindre une concentration finale de lipides de 6 mg/mL.
      REMARQUE : Il s’agit de la même composition de solution lipidique que celle de 2.2.1, mais avec un volume total de 1000 μL.
    2. Diluer la matière tampon d’acétate de pH 4 de 100 mM à 10 mM dans un volume total de 8 mL comme bain d’extinction de l’effluent MIVM.
      REMARQUE : Une barre d’agitation magnétique peut également être ajoutée au bain de trempe.
  3. Formulation de LNP à l’aide d’un mélangeur MIVM
    1. Placez le bain de trempe de 8 ml sous le support du mélangeur de sorte que le tube d’évacuation se vide dans le bain de trempe.
    2. Prélever les flux de solvant et d’antisolvant dans des seringues étanches au gaz de 1 mL à l’aide d’une aiguille à pointe émoussée. Retirez toutes les bulles d’air et jetez l’aiguille. Amorcez chaque seringue en inversant et en expulsant l’air de la seringue.
    3. Assemblez les quatre seringues sur le mélangeur dans le sens des aiguilles d’une montre (seringues 1 à 4, tableau 2) avec les mêmes jets sur les côtés opposés. Voir la figure 1B pour le schéma de l’apparence finale.
    4. Tenez le boîtier de roulement des deux côtés de la plaque mobile. Évitez de placer les doigts sur la face inférieure du boîtier, car cela présente un risque de pincement dû aux butées mécaniques. Abaissez avec précaution la plaque mobile jusqu’à ce qu’elle repose uniformément sur les seringues.
      REMARQUE : Les pistons de la seringue doivent tous être à la même hauteur avant l’utilisation.
    5. Appuyez régulièrement et doucement sur la plaque, en visant à terminer l’opération en environ 0,5 s à 1 s pour ces volumes de flux.
    6. Boucher le bain de trempe, qui contient la dispersion de LNP.
    7. Effectuez le nettoyage de la MIVM après utilisation, en suivant les instructions de l’étape 3.5 ci-dessous.
  4. Formulation de LNP à l’aide d’un mélangeur MIVM entraîné par une pompe à seringue
    1. Assemblez la MIVM comme décrit à l’étape 3.1.
    2. Préparez les solutions de solvant et d’antisolvant dans la composition souhaitée et à un volume suffisant pour la taille de formulation requise (tableau 3).
      REMARQUE : Il s’agit des mêmes compositions que celles des flux d’antisolvant aqueux (étape 1.4) et de solvant éthanolique (étape 3.2.1), mais elles sont mises à l’échelle pour être utilisées avec les plus grands volumes de seringue du tableau 3.
    3. Chargez les solutions dans des seringues étanches au gaz d’un volume de 20 ml et fixez le tube en PTFE à l’aide d’un adaptateur Luer monté à l’extrémité. Préparez les seringues et le tube en inversant la seringue et le tube, puis en expulsant l’air.
    4. Montez les seringues dans un pousse-seringue et fixez-les aux entrées du mélangeur sur le MIVM, comme illustré à la Figure 3A.
      REMARQUE : Le CIJ peut également être utilisé par des pompes de la même manière, mais avec une seule seringue d’antisolvant et de flux de solvant.
    5. Diluer la matière tampon d’acétate de pH 4 de 100 mM à 10 mM dans un volume total de 320 mL comme bain d’extinction de l’effluent MIVM.
    6. Placez le bain de trempe sous la sortie MIVM.
    7. Réglez le débit volumétrique sur le pousse-seringue à 20 mL/min.
      REMARQUE : Les débits volumétriques peuvent varier de 2 mL/min à 40 mL/min en réglant manuellement les valeurs sur le pousse-seringue pour former des LNP avec différentes conditions de micromélange.
    8. Démarrez la pompe à seringue, mais laissez les 10 premières secondes de l’effluent s’écouler dans un bécher à déchets. Récupérer l’effluent MIVM dans le bain de trempe après cette période d’écoulement de démarrage de 10 s.
    9. Retirer et boucher le bain de trempe contenant la dispersion de LNP effectuée au débit volumétrique sélectionné (20 mL/min).
      REMARQUE : Cette procédure peut être répétée pour synthétiser des LNP à différents débits en sélectionnant les volumes de bain de trempe appropriés.
    10. Nettoyez la MIVM entre chaque expérience (lors de la modification du débit) en rinçant au moins deux fois le volume du tube de sortie pour empêcher la collecte de LNP effectués dans les conditions de débit précédentes avant de commencer la synthèse suivante de LNP.
  5. Nettoyage de l’équipement après utilisation
    1. Détachez le batteur du support tout en gardant les seringues attachées et tenez-le au-dessus d’un récipient à déchets. Retirez les seringues en laissant le volume de retenue s’écouler dans le récipient. Ensuite, tenez le mélangeur à l’envers et utilisez la clé à molette pour démonter le mélangeur.
    2. Rincez le tube de sortie avec un solvant (par exemple, de l’éthanol) et séchez-le à l’air ou à l’azote.
    3. Rincez la géométrie de mélange avec un solvant approprié, tel que de l’eau déminéralisée ou de l’éthanol, suivi d’un rinçage à l’éthanol. Séchez les composants à l’aide d’un courant d’air ou d’azote.
    4. Rincez le joint torique à l’eau déminéralisée et séchez-le.
      REMARQUE : Si le joint torique semble étiré ou déformé, laissez-le sécher à l’air libre pendant la nuit avant de l’utiliser. Maintenez un stock important de joints toriques car ce sont des pièces consommables. Si la forme ne se rétablit pas le lendemain, jetez le joint torique.
    5. Rincez abondamment le disque supérieur avec un solvant, en utilisant un jet d’air ou d’azote pour sécher la surface et les raccords de la seringue.
    6. Rincez chaque seringue avec un bon solvant (p. ex., de l’eau déminéralisée ou de l’éthanol). Appliquez un dernier rinçage à l’éthanol et séchez à l’air libre avant la prochaine utilisation.

4. Post-traitement des LNP

  1. Échange de tampon et élimination de l’éthanol
    1. Dialysez la dispersion LNP contre un tampon HEPES de 10 mM à pH 7,4 à l’aide d’une cassette de dialyse de taille appropriée avec une cartouche de dialyse de coupure de poids moléculaire de 20 kDa.
      REMARQUE : Cette étape élimine à la fois l’éthanol résiduel à 10% et augmente le pH de dispersion en remplaçant le tampon d’acétate par HEPES.
    2. Diluer le tampon HEPES de 1 M à 10 mM dans un volume total de 1 L.
    3. Chargez la dispersion LNP dans une cassette de dialyse de 12 ml à l’aide d’une seringue et d’une aiguille.
    4. Plongez la cartouche de dialyse dans 1 L de tampon HEPES et remuez magnétiquement le tampon externe. Changez le tampon HEPES externe après 3 h et retirez la cartouche de dialyse après 3 h supplémentaires pour un temps total de dialyse de 6 h.
    5. Retirer la dispersion de LNP dialysée de la cartouche de dialyse et jeter la cartouche usagée.
  2. Concentration de suspension de LNP par ultracentrifugation
    1. Pipeter la suspension dans un filtre centrifuge de taille appropriée avec un MWCO de 100kDa30.
      REMARQUE : Les filtres centrifuges sont disponibles dans une gamme de tailles, généralement de 0,5 ml à 12 ml.
    2. Centrifuger la dispersion à 2000 x g pendant 10 à 20 minutes (à température ambiante) pour augmenter la concentration d’un facteur d’environ 5 à 20 fois.
      REMARQUE : Pendant la centrifugation, vérifiez l’échantillon toutes les 5 minutes pour vous assurer qu’il reste une quantité appropriée de liquide.

5. Caractérisation des TNL

  1. Mesures de diamètre hydrodynamique avec diffusion dynamique de la lumière (DLS)
    1. Distribuer 750 μL ou 900 μL de la dispersion LNP préparée (sans aucune dilution) dans une cuvette en plastique, micro ou carrée, respectivement.
      REMARQUE : Des volumes plus petits peuvent également être utilisés dans des cuvettes appropriées.
    2. Régler la viscosité appropriée pour le solvant dans lequel les LNP sont dispersés (c.-à-d. 1,26 cP pour un mélange d’éthanol à 10 % en volume).
    3. Recueillir la lumière rétrodiffusée à un angle de 173° à 25 °C, suivie de la détermination de la taille de la LNP à l’aide du modèle de Stokes-Einstein et du premier cumulant de l’expansion de la série de la fonction de corrélation de diffusion de la lumière telle que définie dans le document de norme ISO 13321:1996 E.
    4. Répétez les mesures au moins trois fois.
  2. Mesures du potentiel zêta
    1. Ajouter ~800 μL de dispersion LNP telle que préparée dans des cellules capillaires pliées de zêta.
      REMARQUE : Pour éviter le piégeage des bulles dans le canal capillaire, la moitié du liquide est distribuée dans les cellules, maintenue à l’envers, puis tournée.
    2. Répétez les mesures au moins trois fois.
      REMARQUE : La conductivité du tampon doit être comprise entre 0,2 et 2 milliSiemens/cm pour de meilleurs résultats.
  3. Mesures de l’efficacité d’encapsulation (EE) à l’aide d’un kit de quantification d’ARN disponible dans le commerce
    1. Diluer la quantité appropriée du tampon Tris-EDTA (TE) 20x à pH 7,5 fourni dans le kit de dosage à une concentration 1x en utilisant de l’eau sans nucléases.
    2. Préparez une solution de Triton X-100 à 2 % en poids.
    3. Diluer la quantité appropriée de dispersions LNP dans le tampon 1x TE pour obtenir une concentration massique totale d’environ 0,6 μg/mL pour l’ARN, avec une teneur en éthanol inférieure à 0,2 % en volume.
    4. Préparez des échantillons similaires à ceux de l’étape précédente, mais contenant 0,5 % en poids de Triton X-100, qui dissout efficacement les LNP, facilitant la différenciation entre les concentrations d’ARN « libres » et totales en l’absence et en présence de Triton X-100, respectivement.
    5. Préparer des quantités appropriées de solutions d’ARN témoin aux concentrations de 0 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,4 μg/mL, 0,6 μg/mL, 0,8 μg/mL et 1,0 μg/mL dans le tampon 1x TE.
      REMARQUE : Le kit d’ARN peut initialement avoir besoin d’être dilué.
    6. Répétez l’étape précédente mais à 0,5 % en poids de Triton X-100.
    7. Diluez le colorant Ribogreen (fourni dans le kit) 200 fois dans le tampon 1x TE.
    8. Ajouter des volumes appropriés du colorant Ribogreen dilué à toutes les solutions d’ARN de contrôle et d’échantillons préparées, avec ou sans Triton X-100. Le colorant doit être dilué de manière égale dans les solutions d’ARN de contrôle et d’échantillon à un facteur de deux. Par conséquent, la dilution totale du colorant est 400 fois supérieure à sa concentration d’origine dans le kit de dosage.
    9. Vortex mélange les contenants.
    10. Préparez une plaque opaque à fond plat à 96 puits, non traitée, pour l’analyse dans un lecteur de plaques.
    11. Distribuez des volumes de 100 μL d’échantillons et de commandes d’ARN dans des cellules séparées de la plaque.
      REMARQUE : Surveillez la formation de bulles dans les solutions contenant du Triton X-100. Au moins trois répétitions sont effectuées pour chaque échantillon, ce qui nécessite au moins 350 μL d’échantillons.
    12. Enregistrez l’intensité de fluorescence à l’aide du lecteur de plaques à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 528 nm, avec une durée d’éclairage d’environ 10 s par lecture. Aucune secousse n’est nécessaire.
      REMARQUE : L’EE est déterminé à partir de figure-protocol-1, où Iavec Triton et Isans Triton représentent l’intensité de fluorescence moyenne de trois répétitions d’échantillons avec et sans Triton X-100, respectivement, et aavec Triton et asans Triton désignent la pente des ajustements linéaires aux deux courbes d’étalonnage moyennées avec et sans Triton X-100, respectivement31.

Résultats

Le criblage de formulations LNP optimales peut être réalisé rapidement avec des quantités relativement faibles de matériau à l’aide de mélangeurs turbulents CIJ à deux flux, à condition qu’ils fonctionnent à des vitesses appropriées. Un mélangeur μMIVM entraîné par une pompe à seringue programmable, comme illustré à la figure 3A, est utilisé pour souligner l’importance d’obtenir un micromélange suffisant, au-dessus d’un nombre critique de Reynolds, pour former de petits LNP monodispersés. Le tableau 3 contient le résumé des formulations utilisées pour produire des LNP, et la configuration du mélangeur suit le protocole décrit à l’étape 3.4. Les tailles des LNP ont été caractérisées par une diffusion dynamique de la lumière (DLS) en fonction du nombre de Reynolds. Comme le montre la figure 3B, au-delà d’un Re critique de 5000, des LNP petits et monodispersés sont observés. De plus, des nombres de Reynolds élevés (~104-10 5) peuvent être atteints lorsque les seringues sont enfoncées uniformément par une opération manuelle ou à l’aide du support de mélange (point de données le plus à droite dans la figure 3B). Le support de mélange, illustré à la figure 2A, enfonce uniformément toutes les seringuessimultanément 27. Par conséquent, ces LNP ont également des tailles optimales. Avec un mélange inadéquat (c’est-à-dire un Re trop petit), des LNP plus grands se forment. La figure 3B montre des photos représentatives de LNP formées à Re faible (photo 1) et à Re élevé (photo 2). Les échantillons prélevés à un faible Re sont troubles, indiquant la présence de grandes structures de diffusion de la lumière colloïdale (effet Tyndall), mais les LNP formées à un Re élevé semblent claires en raison d’une diffusion plus faible et décalée vers le bleu des colloïdes plus petits.

Les lipides ionisables ont des propriétés physico-chimiques différentes, qui affectent les propriétés physicochimiques des LNP produits avec des formulations lipidiques par ailleurs identiques. Un mélangeur CIJ (Figure 1A) est utilisé pour tester cela. Le tableau 4 répertorie les formulations fabriquées à partir de deux lipides ionisables approuvés par la FDA : ALC-0315 et MC3. La figure 4A montre que les LNP fabriqués à pH 5 à partir de l’ALC-0315 sont de ~80 nm, tandis que les LNP fabriqués à l’aide de MC3 sont de ~60 nm. De plus, à un pH de 5, les MC3-LNP ont un potentiel zêta positif (~28 mV), tandis que les ALC-LNP ont un potentiel zêta neutre (<10 mV). Cette distinction dans la charge de surface, ainsi que dans la taille globale des LNP, provient du pKa des deux lipides. MC3 a un pKa plus élevé (6,44) par rapport à ALC0315 (6,09)32 ; par conséquent, une fraction plus élevée de lipides MC3 est chargée à pH 5. Les deux formulations ont un stabilisateur lipidique PEG de 1,5 % molaire ; cependant, les MC3-LNP se stabilisent à une taille plus petite en raison de répulsions électrostatiques plus grandes lors de l’assemblage de la LNP lors de l’agrégation limitée par diffusion, ce qui arrête la croissance à la plus petite taille. Les deux formulations présentent des efficacités d’encapsulation élevées (>90%), comme le montre la figure 4B. La chimie des lipides est cruciale pour déterminer les propriétés globales ainsi que les performances des LNP, et ils doivent donc être choisis avec soin en fonction de l’application cible.

Les LNP fabriqués à l’aide des deux géométries du mélangeur turbulent (étape 2.3 et étape 3.3) ont des propriétés physicochimiques similaires. Cette comparaison est étendue aux LNP fabriqués à partir de techniques de mélange médiocres, telles que le mélange à la pipette en vrac, afin d’illustrer davantage la distinction entre les mélangeurs turbulents et les techniques de mélange non uniformes (figure 1C). Le tableau 5 présente un résumé des formulations utilisées pour la fabrication des LNP, comme le montre la figure 5. Dans le cas de la technique de mélange à la pipette, des volumes égaux d’éthanol et de flux aqueux sont rapidement mélangés par pipetage de haut en bas pendant 15 à 20 s, puis par pipetage du mélange dans un bain tampon d’acétate à pH 4. La figure 5A montre que les tailles des LNP dans le bain tampon d’acétate de 10 mM (pH 4, 10 % d’éthanol en volume) sont étonnamment similaires et petites (~50 nm), quelle que soit la géométrie du mélangeur utilisé (CIJ ou MIVM). Cependant, les LNP fabriqués à l’aide d’un mélange de pipettes sont deux fois plus grands que les LNP fabriqués à l’aide de mélangeurs turbulents. Cela montre que les LNP fabriqués à partir de différentes géométries CIJ présentent des propriétés similaires lorsqu’ils sont fabriqués à des vitesses suffisamment élevées (régime turbulent au-dessus du nombre critique de Reynolds), tandis qu’un mauvais mélange entraîne des LNP plus grands et polydispersés.

Ensuite, les LNP sont dialysés contre un tampon HEPES de 10 mM, pH 7,4 (volume 100x), pour éliminer l’éthanol et passer le pH à 7,4. Au cours de ce processus, il y a une certaine fusion LNP et une croissance jusqu’à une taille légèrement plus grande, comme le montre la figure 5A, ce qui est conforme au mécanisme de fusion bien étudié dans la littérature33. Dans l’ensemble, les LNP fabriqués à l’aide de mélangeurs CIJ et MIVM sont inférieurs à 100 nm, tandis que les LNP fabriqués à l’aide d’un mélange à pipette sont d’environ 140 nm. Comme le montre la figure 5B, les potentiels zêta de ces formulations sont inférieurs à 10 mV, ce qui indique qu’ils sont tous neutres à un pH de 7,4. De plus, ils présentent tous des rendements d’encapsulation élevés de >95 % (Figure 5C). Ainsi, les LNP aux propriétés physico-chimiques optimales peuvent être facilement fabriqués à l’aide de technologies de mélangeur turbulent. Les performances de ces LNP sont évaluées par la réalisation d’une transfection in vitro dans des cellules HeLa.

Le protocole d’essai de transfection in vitro basé sur la luciférase est adopté à partir d’une publication précédente34. La figure 6A représente la luminescence (RLU) pour 1000 cellules pour les trois formulations résumées dans le tableau 5. Lipofectamine 3000 est utilisé comme contrôle positif. Il est important de noter que la lipofectamine 3000 est généralement utilisée pour les formulations d’ADN ; Cependant, il a fonctionné comme un contrôle adéquat dans ces expériences. Les LNP fabriqués à l’aide de mélangeurs CIJ à 2 jets et MIVM à 4 jets transfectent beaucoup mieux que les LNP fabriqués à l’aide d’un mélange à pipette. Même si l’on s’attend à ce que les particules plus grosses transfectent mieux que les petites particules en raison de la charge utile plus importante par LNP, les LNP fabriquées à l’aide d’un mélange à pipette ici transfectent moins efficacement. Cela implique clairement qu’il existe une différence significative dans les structures des LNP fabriqués avec les technologies CIJ par rapport aux LNP fabriqués avec un mélange de pipettes. Les rendements de transfection des LNP fabriqués avec les mélangeurs CIJ et MIVM sont essentiellement identiques. La lipofectamine 3000 présente l’efficacité de transfection la plus faible. La figure 6B évalue la toxicité de la LNP in vitro sur des cellules HeLa à l’aide d’un test de viabilité cellulaire basé sur le sel de résazurine de sodium35. Toutes les formulations présentent une faible cytotoxicité, caractérisée par des niveaux élevés de viabilité cellulaire lorsqu’ils sont représentés en pourcentage de cellules vivantes par rapport au témoin qui n’a pas de traitement par nanoparticules.

figure-results-1
Figure 1 : Méthodes de mélange pour la production de LNP. (A) Le mélangeur à jet impactant confiné à deux jets (CIJ) montrant une photographie d’un mélangeur transparent et d’un mélangeur en Delrin assemblé régulièrement utilisé en laboratoire. (B) Le mélangeur vortex à entrées multiples à quatre jets (μMIVM) montrant une photographie d’un mélangeur transparent et d’un mélangeur assemblé en acier inoxydable et en Delrin. Les flux d’entrée du mélangeur transparent ont été déplacés sur les côtés du mélangeur pour une meilleure visualisation de la géométrie du mélange, tandis que dans le mélangeur pratique, les flux d’entrée entrent par le haut. Le CIJ et le MIVM fonctionnent tous deux à une vitesse de liquide suffisante pour que les écoulements soient en régime turbulent, et le mélange produit des micro-échelles de Kolmogorov inférieures à 1 μm, ce qui permet d’atteindre la sursaturation en ~1,5 ms. (C) Le dispositif de mélange par pipette est largement utilisé pour préparer de petits volumes de dispersions LNP en mélangeant des solutions aqueuses et éthanoliques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Vue agrandie du μMIVM et de son support de mélange. (A) Assemblé μMIVM, avec des seringues en verre, sous le support du mélangeur qui facilite une descente uniforme et rapide des seringues. Cette figure est reproduite d’après Markwalter et al.29. (B) MIVM démonté montrant les composants intérieurs. Cette géométrie de mélange est identique à celle du mélangeur transparent de la figure 1B, sauf que les flux d’entrée entrent par le disque supérieur et non par la surface cylindrique latérale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : L’augmentation du nombre de Reynolds dans un mélangeur turbulent diminue le diamètre hydrodynamique de la LNP jusqu’à un nombre de Reynolds critique de plateau. (A) Représentation schématique de la pompe à seringue et de la configuration du μMIVM utilisée pour contrôler le nombre de Reynolds dans le mélangeur turbulent en réglant les débits volumétriques du flux. (B) Diamètre hydrodynamique de la LNP par rapport au nombre de Reynolds dans le MIVM. L’augmentation du nombre de Reynolds et de la dissipation d’énergie turbulente améliore le mélange et conduit à un mélange plus homogène, à une sursaturation et à une croissance des particules. Au-dessus du nombre critique de Reynolds, les tailles des LNP restent constantes avec des débits croissants en raison de la condition Da<<1, c’est-à-dire que le temps de diffusion solvant/antisolvant est plus court que le temps d’assemblage du NP. Les débits indiqués sont les débits totaux des quatre flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Propriétés colloïdales des LNP produites avec différents lipides ionisables. (A) Diamètres hydrodynamiques et potentiels zêta des LNP produits avec deux lipides ionisables différents : ALC-0315 et MC3. Les mesures sont effectuées à pH 5 dans le bain de trempe après la formation de LNP. Les différences de pKa apparent des lipides ionisables affectent les propriétés colloïdales des LNP. (B) Mesures de l’efficacité d’encapsulation des deux LNP (n = 3, les barres d’erreur représentent un écart-type). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Propriétés colloïdales des LNP produites avec différents mélangeurs encapsulant l’ARNm de la luciférase à l’aide d’un lipide ionisable MC3. (A) Diamètres hydrodynamiques des LNP produits avec des mélangeurs à 2 jets, 4 jets et des mélangeurs à pipettes. Les mesures sont effectuées à la fois dans les conditions acides du bain de trempe après la formation de LNP (côté gauche) et après dialyse dans un tampon HEPES neutre (côté droit). La taille des LNP augmente lors de la neutralisation du pH en raison de la déionisation du lipide ionisable, ce qui entraîne la fusion et la croissance des LNP. Le stabilisateur lipide-PEG arrête la croissance de cette coalescence de particules avant la formation de précipités de la taille d’un micron. (B) Mesures de charge de surface (en tant que potentiel ζ) sur des LNP dialysés dans la condition HEPES de 10 mM, pH 7,4. Tous les LNP se trouvent à moins de 2 mV de 0 mV, ce qui indique que ces surfaces de particules sont neutres et n’ont qu’une quantité presque indétectable de charge cationique. (C) Mesures de l’efficacité d’encapsulation après dialyse des LNP (n = 3, les barres d’erreur représentent un écart-type). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Transfection de cellules HeLa avec des LNP préparés. (A) Luminescence de l’enzyme luciférase exprimée après traitement par la luciférine. (B) Viabilité des cellules HeLa après incubation avec des LNP. Les cellules ne montrent aucun changement statistiquement significatif de viabilité, comme l’indique un essai métabolique de la résazurine (n = 4, les barres d’erreur représentent un écart-type). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Flux(s) /
Bain de trempe		ComposantFormulationStockVolume
Seringue 1 -
Flux d’éthanol
(6 mg/mL de lipides totaux)		Lipide ionisable (MC3)50 % molaire50 mg/mL0,5 mL
Zwitterion lipidique (DSPC)10 % molaire5 mg/mL
Cholestérol38,5 % molaire5 mg/mL
Lipide pégylé (DMG-PEG2000)1,5 % molaire4 mg/mL
Seringue 2 -
Courant aqueux
(0,3 mg/mL d’ARN)		ARN de levureN/P 610 mg/mL0,5 mL
Tampon en acétate20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Bain de trempeTampon en acétate10 mM, pH 4100 mM, pH 44 ml

Tableau 1 : Formulation standard de patisiran LNP produite par un mélangeur CIJ. L’ARN de levure est utilisé comme ARN modèle pour ce protocole. Toutes les solutions sont dissoutes moléculairement et soigneusement mélangées avant d’être chargées dans les seringues.

Flux(s) /
Bain de trempe		ComposantFormulationStockVolume
Seringue 1 -
Flux d’éthanol
(6 mg/mL de lipides totaux)		Lipide ionisable (MC3)50 % molaire50 mg/mL0,5 mL
Zwitterion lipidique (DSPC)10 % molaire5 mg/mL
Cholestérol38,5 % molaire5 mg/mL
Lipide pégylé (DMG-PEG2000)1,5 % molaire4 mg/mL
Seringue 2 -
Courant aqueux
(0,3 mg/mL d’ARN)		ARN de levureN/P 610 mg/mL0,5 mL
Tampon en acétate20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Seringue 3 -
Flux d’éthanol
(6 mg/mL de lipides totaux)		Lipide ionisable (MC3)50 % molaire50 mg/mL0,5 mL
Zwitterion lipidique (DSPC)10 % molaire5 mg/mL
Cholestérol38,5 % molaire5 mg/mL
Lipide pégylé (DMG-PEG2000)1,5 % molaire4 mg/mL
Seringue 4 -
Courant aqueux
(0,3 mg/mL d’ARN)		ARN de levureN/P 610 mg/mL0,5 mL
Tampon en acétate20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Bain de trempeTampon en acétate10 mM, pH 4100 mM, pH 48 ml

Tableau 2 : Formulation standard de patisiran LNP produite par un mélangeur MIVM. Un mélangeur MIVM utilise quatre flux : deux solvants et deux antisolvants. Des courants à impulsion inégale peuvent être utilisés ; Cependant, des flux avec le même moment sont choisis pour ce protocole.

Flux(s) /
Bain de trempe		ComposantFormulationStockVolume
Seringue 1 -
Flux d’éthanol
(6 mg/mL de lipides totaux)		Lipide ionisable (MC3)50 % molaire50 mg/mL20 mL
Zwitterion lipidique (DSPC)10 % molaire5 mg/mL
Cholestérol38,5 % molaire5 mg/mL
Lipide pégylé (DMG-PEG2000)1,5 % molaire4 mg/mL
Seringue 2 -
Courant aqueux
(0,3 mg/mL d’ARN)		ARN de levureN/P 610 mg/mL20 mL
Tampon en acétate20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Seringue 3 -
Flux d’éthanol
(6 mg/mL de lipides totaux)		Lipide ionisable (MC3)50 % molaire50 mg/mL20 mL
Zwitterion lipidique (DSPC)10 % molaire5 mg/mL
Cholestérol38,5 % molaire5 mg/mL
Lipide pégylé (DMG-PEG2000)1,5 % molaire4 mg/mL
Seringue 4 -
Courant aqueux
(0,3 mg/mL d’ARN)		ARN de levureN/P 610 mg/mL20 mL
Tampon en acétate20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Bain de trempe
(Temps de collecte
= 30 s)		Tampon HEPES10 mM, pH 7,51 M, pH 7,5320 ml

Tableau 3 : Formulation LNP produite par un mélangeur MIVM entraîné par une pompe à seringue. Le DODMA est utilisé comme lipide ionisable avec l’ARN de levure comme ARN modèle. Un exemple d’exécution avec 40 mL/min est choisi pour ce protocole.

Flux(s) /
Bain de trempe		ComposantFormulationStockVolume
Seringue 1 -
Flux d’éthanol
(12 mg/mL de lipides totaux)		Lipide ionisable (MC3 ou ALC0315)50 % molaire50 mg/mL0,5 mL
Zwitterion lipidique (DSPC)10 % molaire5 mg/mL
Cholestérol38,5 % molaire5 mg/mL
Lipide pégylé (DMG-PEG2000)1,5 % molaire4 mg/mL
Seringue 2 -
Courant aqueux
(0,6 mg/mL d’ARN)		ARN de levureN/P 610 mg/mL0,5 mL
Tampon en acétate20 mM, pH 5100 mM, pH 5
Bain de trempeTampon en acétate10 mM, pH 5100 mM, pH 59 mL

Tableau 4 : Formulations de LNP à partir de deux lipides ionisables différents produits par un mélangeur CIJ. Les formulations sont fabriquées à partir d’ALC-0315 ou de MC3, tandis que tous les autres composants sont conservés identiques.

Flux(s) /
Bain de trempe		ComposantFormulationStockVolume
Seringue 1 -
Flux d’éthanol
(6 mg/mL de lipides totaux)		Lipide ionisable (MC3)50 % molaire50 mg/mL0,5 mL
Zwitterion lipidique (DSPC)10 % molaire5 mg/mL
Cholestérol38,5 % molaire5 mg/mL
Lipide pégylé (DMG-PEG2000)1,5 % molaire4 mg/mL
Seringue 2 -
Courant aqueux
(0,3 mg/mL d’ARN)		ARNm FLucN/P 61 mg/mL0,5 mL
Tampon en acétate20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Bain de trempeTampon en acétate10 mM, pH 4100 mM, pH 44 ml

Tableau 5 : Formulation standard de patisiran LNP produite par un mélangeur CIJ. L’ARNm FLuc qui exprime une protéine luciférase est utilisé pour mesurer l’expression des gènes à l’aide d’un test de bioluminescence.

Dossier supplémentaire 1 : Fournisseurs de mélangeurs CIJ et MIVM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La synthèse de LNP contenant des polymères d’acides nucléiques à l’aide de deux mélangeurs turbulents à jet d’impact confinés a été présentée. Lorsqu’ils sont effectués à des vitesses appropriées, les mélangeurs turbulents CIJ garantissent que l’échelle de temps de mélange est plus courte que le temps d’assemblage des LNP, produisant des conditions de sursaturation homogènes pour la formation de petits LNP avec des distributions de taille étroites21. Par conséquent, les LNP fabriqués avec la même chimie à l’aide de différentes géométries de mélangeur turbulent (le CIJ à 2 jets et le mélangeur MIVM à 4 jets) présentent des propriétés physicochimiques similaires et présentent de bonnes efficacités de transfection (Figure 5 et Figure 6). En revanche, les LNP fabriqués à l’aide d’un pipetage qui produit un mélange plus médiocre permettent d’obtenir des LNP plus grands et plus polydispersés (Figure 5A) avec des efficacités de transfection plus faibles. On sait depuis longtemps que la cinétique de mélange et d’assemblage joue un rôle important dans le traitement des LNP ; Cullis et al. ont noté que le mélange convectif-diffuseur rapide de l’éthanol et du tampon conduit à la formation de petites particules avec une distribution de taille étroite, tandis qu’un mélange diffusif lent conduit à des particules plus grosses avec des distributions de taille larges9. L’échelle de temps de mélange dans les mélangeurs turbulents CIJ diminue proportionnellement aux débits d’entrée des flux vers le mélangeur27. Ceci est quantifié par le nombre de Reynolds sans dimension (Re), qui mesure le rapport entre les forces d’inertie et visqueuses. La turbulence à l’intérieur des chambres de mélange du CIJ et du MIVM se produit à un Re suffisamment élevé, de sorte que l’étirement turbulent du vortex entraîne de petites échelles de longueur qui produisent un mélange rapide solvant/antisolvant par diffusion. L’échelle de longueur turbulente dépend du Re et non de la géométrie spécifique du dispositif de mélange. C’est pourquoi le CIJ ou le MIVM produit les mêmes particules LNP, et pourquoi différentes tailles de mélangeurs MIVM produisent les mêmes tailles NP27. À Re élevé, correspondant à des vitesses d’entrée élevées, les LNP peuvent être fabriqués de manière reproductible sans variations d’un lot à l’autre (Figure 3B).

Ce protocole permet la formulation d’une variété de LNP d’ARNm, d’ADN ou d’ARNi avec différentes propriétés physicochimiques à l’aide de mélangeurs CIJ turbulents. En plus de permettre une polyvalence dans la composition et les concentrations, cette technique offre une voie claire pour cribler rapidement les formulations en vente en laboratoire (quelques milligrammes) et étendre les formulations principales à des lots industriels plus grands à des taux de production de 5 L/min36. Cela a été un obstacle majeur pour plusieurs autres techniques, y compris le mélange en vrac et la microfluidique. Par exemple, les techniques de traitement en vrac ne parviennent pas à fabriquer de manière cohérente des LNP de manière reproductible, même à des échelles de quelques millilitres. Les techniques microfluidiques apportent une amélioration significative par rapport aux techniques de mélange en vrac pour permettre la production de LNP uniformes et reproductibles ; Cependant, ils ne sont que de l’ordre de29 milligrammes. Comme détaillé dans l’introduction, la parallélisation des dispositifs microfluidiques permet une tentative de mise à l’échelle à l’échelle de la production, mais n’élimine pas le problème de l’encrassement, et elle ne peut pas être mise à l’échelle avec autant de succès que les mélangeurs basés sur la technologie des jets d’impact confinés.

Outre ces avantages, les mélangeurs CIJ joueront un rôle déterminant dans la fabrication de LNP de nouvelle génération qui présentent des capacités de ciblage ou d’édition de gènes. Les formulations actuelles de LNP ont des lipides et des acides nucléiques qui ont des diffusivités similaires, et par conséquent, elles peuvent être fabriquées même avec un mélange légèrement médiocre à l’échelle du laboratoire. Cependant, les approches d’édition de gènes peuvent nécessiter l’encapsulation d’espèces d’acides nucléiques de poids moléculaires très différents, telles que de petites molécules d’ARN guide et de grands transcrits d’ARNm, pour coder une protéine CAS937. Les échelles de temps de diffusion très différentes de ces différentes espèces rendent difficile l’encapsulation uniforme à des rapports stœchiométriques. Ce problème d’encapsulation uniforme s’accentue à mesure que l’efficacité du mélange diminue. De même, le ciblage des cellules non hépatiques pourrait nécessiter l’incorporation de stabilisants à diffusion lente fortement liés (tels que des copolymères séquencés de grand poids moléculaire avec des ligands de ciblage). Des ligands ciblés d’une taille aussi grande que 14 kDa peuvent être conjugués à des copolymères séquencés avant l’assemblage de nanoparticules, ce qui permet leur incorporation uniforme dans les NP à l’aide du mélange CIJ38. Les mélangeurs turbulents CIJ sont des outils utiles pour la fabrication de LNP fabriqués avec des composants ayant des diffusivités différentes.

Bien que les mélangeurs turbulents CIJ présentent plusieurs avantages par rapport aux autres mélangeurs pour la formulation de LNP, il est important de noter les limites associées à chaque géométrie. Le mélangeur CIJ à 2 jets exige que les deux flux d’entrée (éthanol et eau) aient une quantité de mouvement égale (entre 10 % et 30 %) pour obtenir un micromélange turbulent uniforme dans la chambre. Le fait que le flux de sortie comprenne 50:50 solvant/antisolvant limite le niveau de sursaturation dans la cavité de mélange où se produisent les précipitations29. Cet inconvénient est résolu par le mélangeur MIVM à 4 jets, car il peut utiliser quatre jets avec une quantité de mouvement inégale pour atteindre des conditions de sursaturation élevées dans la chambre de mélange. De plus, les deux mélangeurs doivent être de l’ordre du milligramme de masse totale, ce qui en fait un choix non idéal pour le criblage à haut débit de nombreuses formulations de LNP différentes. Pour les formulations LNP simples, le criblage peut être effectué de manière microfluidique ou de stratégies de pipetage à l’échelle du microgramme, puis transféré à la technologie des jets à impact confiné lorsque quelques formulations principales ont été identifiées. Il est également crucial de prendre en compte les volumes morts dans les mélangeurs. Dans le CIJ, deux mélangeurs à jet, les volumes de maintien sont de 50 à 100 microlitres. Cette quantité de matériau doit être soustraite de la quantité capturée dans le bain de trempe lors du calcul de la récupération du processus. Ces pertes sont insignifiantes lorsqu’elles sont exploitées à grande échelle, mais elles représenteraient des pertes de 10 % lorsque des volumes totaux de 5 mL sont produits, comme le montre le présent document. Les mélangeurs turbulents à jet d’impact sont un outil précieux pour produire des LNP à l’échelle GMP, comme en témoignent les deux vaccins COVID-19 approuvés par la FDA.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Bourse NSF à BKW (DGA1148900), soutien de Tessera Therapeutics Inc., de la Fondation Bill et Melinda Gates (BMGF, numéros de contrat OPP1150755 et INV-041182), et de la FDA sous la sentence 75F40122C00186.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
18:0 PC (DSPC)Avanti Polar Lipids850365PLipide auxiliaire
21 G x 1-1/2 po. Aiguille BD PrecisionGlideBD305167
96 Well Black Wall Black Bottom PlateFisher Scientific07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC SurfaceThermo Fisher Scientific165306
Acide acétique, GlacialFisher ScientificA38-212
ALC-0315Avanti Polar Lipids890900Lipides ionisables
Filtre centrifuge Amicon Ultra, 100 kDa MWCO, 15 mLFiltre centrifuge Millipore SigmaUFC910024
Amicon Ultra, 100 kDa MWCO, 4 mLMillipore SigmaUFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2620
CholestérolMillipore SigmaC8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)Trilink BiotechnologiesL-7202
Mélangeur à jets impactants confinésHolland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)N/AContactez Holland ou DTD pour les commandes personnalisées et le système Helix Biotech est Nova BT. Texte de révision pour la validation du nouveau mélangeur
D-Lin-MC3-DMA  ;MedChemExpressHY-112251  ;Lipide ionisable
DMEM, hyperglucose, pyruvateThermo Fisher Scientific11995065
DMG-PEG 2000Avanti Polar Lipids880151PPEG-lipid
DODMAAvanti Polar Lipids890899PLipide ionisable
Éthanol 200 ProofDecon Labs, Inc.2701
Falcon 15 mL Tubes coniques à centrifugerFisher Scientific14-959-70C
Falcon 50 mL Tubes coniques à centrifuger haute clartéFisher Scientific14-959-49A
Sérum fœtal bovin, certifié, États-UnisThermo Fisher Scientific16000044
HeLaATCCCCL-2
HEPES, acide libreIBI ScientificIB01130
HSW HENKE-JECT en deux parties 1 mL LuerHenke Sass Wolf4010.200V0
HSW HENKE-JECT en deux parties 5 mL (6 mL) Luer LockHenke Sass Wolf4050.X00V0
Idex 1648 Tube ETFE figure-materials-1” OD 0,093 po IDIdex Santé & Science1648
Idex P-678 & frac14 ; "-28 à Luer raccordIdex Health & ScienceP-678
Idex P-940 virole pour tube ETFEIdex Health & ScienceP-940
Lipofectamine 3000 Réactif de transfectionThermo Fisher ScientificL3000001
Raccord LuerIdex Santé & ScienceP-604Assembler sur l’entrée d’un mélangeur CIJ ou MIVM avec les filetages correspondants. Les pièces Idex sont également disponibles auprès de VWR et de nombreux autres fournisseurs
Support de table de mixageHolland Applied TechnologiesN/AVoir Markwalter &   ; Prud’homme for design.26 Contactez Holland pour l’achat
Mélangeur vortex multi-entréesHolland Applied Technologies et Diamond Tool and Die (DTD)N/AContactez Holland ou DTD pour les commandes personnalisées. Texte de révision pour le nouveau joint torique de validation du mélangeur
(MIVM)C.E. ConoverMM1.5 35.50 V75Commande en vrac - pièce consommable. Assurez-vous de la compatibilité avec les solvants si vous utilisez une source alternative.
Virole de sortie - CIJIdex Health & ScienceP-200Assembler avec raccord de sortie (grande extrémité affleurante avec tubulure)
Raccord de sortie - CIJIdex Santé & ScienceP-205Assembler avec virole et tube sur la sortie de la chambre CIJ
Raccord de sortie - MIVMIdex Santé & ScienceP-942Combinaison avec virole
Tube de sortie - CIJIdex Health & Science1517Utilisez un coupe-tube pour nettoyer les pointes. Assurez-vous que le tube supplémentaire ne dépasse pas dans la chambre de mélange
Tube de sortie - MIVM N/AN/AAjustement à l’ID de la virole.
PBS - Solution saline tamponnée au phosphate (10x) pH 7,4, sans RNaseThermo Fisher ScientificAM9624
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
PHD 2000 Pompe à seringue programmableHarvard ApparatusN/A
Seringue en plastique en deux parties 1 mLThermo Fisher ScientificS7510-1
Raccordà ficheIdex Santé & ScienceP-309Assembler sur les côtés du mélangeur CIJ (point d’accès par joint de forage)
Kit de dosage d’ARN Quant-it RiboGreen et réactif d’ARN RiboGreen, RediPlate 96 Kit de quantification de l’ARN RiboGreenInvitrogen by Thermo Fisher ScientificR11491
Résazurine, sel de sodiumThermo Fisher ScientificR12204
RNase AWAY Décontaminant de surfaceThermo Fisher Scientific7000TS1
Flacon à scintillationDWK Lifesciences74504-20
SGE Seringues étanches au gaz, Luer Lock, 100 mLSGE100MR-LL-GT
SERINGUES ÉTANCHES AU GAZ, Luer Lock, 50 mLSGE50MR-LL-GT
Cassettes de dialyse Slide-A-Lyzer, 20 K MWCOThermo Fisher Scientific66012
Acétate de sodiumMillipore Sigma32319-500G-R
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificS320-500
SaccharoseMillipore SigmaS7903-1KG
Filtres pour seringues,stériles Genesse Scientific25-243
Triton X-100Millipore Sigma9036-19-5
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge phénolThermo Fisher Scientific25200056
Eau, sans endotoxinesARNase biologique118-325-131
(10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM7118
et ARN de levure sans DNAse

Références

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