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Radiosynthèse, contrôle de la qualité et imagerie par tomographie par émission de positons chez les petits animaux de 68nanomolécules marquées au Ga

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DOI :

10.3791/67048

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4 octobre 2024

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1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit la radiosynthèse, la formulation et le contrôle de la qualité d’une nouvelle sonde radiomarquée (c’est-à-dire un nanocorps NM-02 marqué à 68Ga), et son utilisation pour l’imagerie TEP/TDM de petits animaux dans un modèle de xénogreffe.

Résumé

Les techniques d’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) et par tomographie par émission de photons uniques (SPECT) chez les petits animaux sont cruciales dans la recherche préclinique sur le cancer, nécessitant une attention méticuleuse à la synthèse des radiotraceurs, à l’assurance qualité et aux protocoles d’injection in vivo . Cette étude présente un flux de travail complet conçu pour améliorer la robustesse et la reproductibilité des expériences TEP sur de petits animaux. Le processus de synthèse dans le laboratoire de radiochimie à l’aide de 68Ga est détaillé, mettant en évidence des protocoles stricts de contrôle et d’assurance qualité pour chaque production de radiotraceurs. Des paramètres tels que la concentration, l’activité molaire, le pH et la pureté sont rigoureusement surveillés, conformément aux normes applicables aux études humaines. Cette méthodologie introduit une préparation simplifiée de la seringue et une canule 30G conçue sur mesure pour des injections intraveineuses précises chez la souris. La surveillance de la santé des animaux pendant le balayage, y compris la température et la fréquence cardiaque, garantit leur bien-être tout au long de la procédure. Les dosages pour la TEP et la SPECT sont prédéterminés afin d’équilibrer l’acquisition de données et la minimisation de l’exposition aux rayonnements des animaux et des chercheurs. De même, les tomodensitogrammes utilisent des paramètres préprogrammés pour limiter l’exposition aux rayonnements, ce qui est particulièrement pertinent dans les études à long terme évaluant les effets du traitement. En optimisant ces étapes, le flux de travail vise à normaliser les procédures, à réduire la variabilité et à améliorer la qualité de l’imagerie TEP/SPECT/TDM des petits animaux. Cette ressource fournit des informations précieuses aux chercheurs qui cherchent à améliorer la précision et la fiabilité des investigations précliniques en imagerie moléculaire, ce qui permet de faire progresser le domaine.

Introduction

La recherche dans le domaine du cancer du sein est un sujet de la plus haute importance. Le cancer du sein reste un cancer fréquent, représentant environ 1/3de tous les cancers chez les femmes. Le traitement est adapté aux caractéristiques biologiques et histologiques de la tumeur et au stade de la maladie. Les chances de survie sont généralement bonnes, sauf si la tumeur a déjà métastasé, auquel cas la survie à 5 ans n’est que d’environ 30 %1. D’autres cancers gynécologiques connaissent un sort similaire, avec, par exemple, le cancer de l’ovaire montrant > 95 % de survie à 5 ans pour les tumeurs de stade 1 mais seulement 15 % pour les tumeurs métastasées de stade4 2,3.

L’imagerie non invasive, en particulier la tomographie par émission de positrons (TEP), a transformé la recherche sur le cancer car elle offre des informations inégalées sur les aspects moléculaires de la tumeur, tels que le métabolisme, l’expression des récepteurs et la réponse thérapeutique 4,5,6. Il permet à la fois la visualisation et la quantification de zones métaboliques spécifiques - ce qui permet non seulement de diagnostiquer avec précision, mais aussi de surveiller l’effet des (nouvelles) thérapies à des moments très courts. En effet, la TEP permet d’évaluer la réponse par rapport à la non-réponse après 1 à 3 cycles de traitement et le fait mieux et plus rapidement par rapport aux changements morphologiques observés par l’imagerie classique par tomodensitométrie (TDM)7. La nature non invasive de la TEP permet également des études longitudinales.

Tout modèle animal nécessite une standardisation maximale afin d’évaluer en profondeur la capacité thérapeutique des nouveaux produits pharmaceutiques (radioactifs), de sorte que l’accent doit être mis sur cela - à la fois dans la génération du modèle tumoral et dans l’imagerie/analyse des données TEP chez les petits animaux. On pourrait débattre du meilleur modèle tumoral chez l’animal (inoculation sous-cutanée ou implantation orthotopique, souris, tumeurs humaines ou syngéniques, accompagnées ou non de soins cliniques de routine), mais cela dépasserait l’objectif de cette publication. Nous utilisons plusieurs modèles pour les études sur le cancer, et celui décrit ici est un modèle sous-cutané relativement simple.

Le contrôle de la qualité en radiochimie est primordial pour la sécurité des animaux et l’efficacité du traitement. Cela n’affecte pas seulement le produit radiopharmaceutique lui-même, mais aussi la formulation du produit. Il existe une législation étendue sur la production de produits radiopharmaceutiques pour des applications cliniques 8,9 (voir 10 pour un aperçu complet de la législation et des directives actuelles), et plusieurs directives sur les propriétés des produits radiopharmaceutiques pour la recherche préclinique (voir 11 pour un aperçu détaillé). Nous produisons des produits radiopharmaceutiques à la fois pour des applications cliniques et précliniques, simplifiant la traduction du contrôle de qualité haut de gamme que l’on trouve dans les synthèses pour les applications cliniques à ceux pour les applications précliniques.

Nos recherches se concentrent sur le théranostique dirigé, en particulier sur les cancers positifs au récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2). Par conséquent, nous développons de nouveaux produits radiopharmaceutiques pour diagnostiquer et surveiller le cancer pendant le traitement. Les produits radiopharmaceutiques diagnostiques efficaces sont également évalués en tant que composés thérapeutiques à l’aide de différents radio-isotopes. L’évaluation de ces produits radiopharmaceutiques est effectuée dans un premier temps sur des modèles animaux, en s’efforçant d’obtenir une traduction clinique après des résultats précliniques prometteurs. Dans cet article, nous présenterons les protocoles utilisés, illustrés par un produit radiopharmaceutique, pour assurer le contrôle et l’assurance de la qualité, ainsi que la pratique standard pour l’injection intraveineuse de souris et la TEP/TDM, afin d’améliorer la précision et la fiabilité des investigations précliniques en imagerie moléculaire. Le protocole est divisé en trois sections différentes : la radiochimie (synthèse de traceurs et contrôle de la qualité), la génération de modèles animaux (modèle de tumeur sous-cutanée) et l’imagerie.

Protocole

Le protocole de recherche respecte les normes les plus élevées en matière de bien-être animal et est strictement conforme aux directives de protection des animaux de l’hôpital universitaire RWTH d’Aix-la-Chapelle. Nous nous engageons à assurer le traitement éthique et humain de tous les animaux impliqués dans les études, et les procédures sont examinées et approuvées par le comité local d’éthique animale. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par une autorité compétente allemande (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV) pour leur conformité à la loi sur la protection des animaux, en liaison avec le règlement sur la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques.

REMARQUE : Une liste complète de l’équipement, des matériaux et des réactifs utilisés dans cette étude est fournie dans la table des matériaux. Il est important de noter que la manipulation du 68Ga doit se faire à l’aide d’une pipette dans la mesure du possible et éviter tout métal, car le fer peut réduire considérablement le rendement de l’étiquetage. Cela signifie qu’il faut éviter les aiguilles jusqu’à ce que les procédures de radiochimie soient terminées.

1. Radiochimie

  1. Radiomarquage de NM-02-DOTA-GA avec 68Ga
    ATTENTION : Le protocole implique la manipulation et la manipulation de matières radioactives. Les chercheurs doivent respecter la législation locale sur la manipulation des matières radioactives, les pratiques ALARA (aussi bas que raisonnablement réalisable), travailler avec un blindage en plomb, minimiser le temps de contact direct et maintenir une distance maximale à chaque étape de l’exposition aux rayonnements. Les procédures expérimentales doivent être surveillées à l’aide d’appareils de détection de la radioactivité.
    1. Éluez le générateur 68Ge/68Ga, manuellement ou automatiquement, dans 10 mL de HCL 0,6 M (1,2 GBq/10 mL). Piégez le 68Ga sur une cartouche PS-H+ (taille M - 0,8 ml) en faisant passer l’éluat à travers la cartouche. Éluez la cartouche SPE PS-H+ avec un total de 1 mL de 4 M de NaCl par étapes et lentement dans un tube de microcentrifugation.
    2. Jetez les premiers 0,3 ml de l’éluat et récupérez les 0,7 ml restants dans un autre tube de microcentrifugation.
    3. Prenez un nouveau tube de microcentrifugation et procédez au radiomarquage de NM-02-DOTA-GA comme indiqué dans le protocole du fabricant.
      REMARQUE : Le conjugué nanocorps-chélateur (NM-02-DOTA-GA) a été préalablement préparé selon le protocole du fournisseur. Le conjugué peut être stocké dans des aliquotes à -80 °C pendant plusieurs mois.
    4. Ajustez le pH du produit à environ 7 en utilisant jusqu’à 5 μL de 3 M NH4OAc.
  2. Contrôle qualité
    1. Mesurer l’activité de l’échantillon concentré dans le tube de la microcentrifugeuse à l’aide d’un indicateur d’activité au bon réglage (68Ga comme isotope ; 1 mL seringue, 0,1 mL pour la géométrie). Le rendement radiochimique (corrigé de la désintégration) doit être d’au moins 40 %.
    2. Déterminez le pH à l’aide d’une bandelette de test de pH (0-14) en repérant une quantité suffisante sur la bandelette de test de pH (10-15 μL).
    3. Chromatographie sur couche mince (CCM)
      1. Spot 1 μL du mélange réactionnel de radiomarquage sur une bandelette TLC imprégnée de silice. Laisser sécher l’aliquote pendant environ 1 min. Exécutez la CCM en utilisant de l’acide citrique comme phase mobile, préremplie sur environ 2 à 3 mm, dans une chambre CCM fermée. Retirez la bande TLC de la chambre lorsque le liquide a atteint le haut de la bandelette.
      2. Placez la bande TLC sur un scanner radio-TLC et mesurez-la selon le protocole du fabricant. Le produit doit apparaître à l’origine (Rf < 0,2), tandis que les cations libres 68G vont s’éluer avec le front du solvant (Rf > 0,9).
      3. Calculez le rendement de radiomarquage de la réaction à l’aide du radiochromatogramme, en divisant l’aire intégrée sous la courbe (AUC) de Rf 0,0-0,2 par l’AUC totale (Rf 0,0-1,0) et en multipliant par 100.
    4. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
      1. Assurez-vous que la HPLC a fonctionné pendant au moins 10 minutes en utilisant le bon solvant afin que toutes les lignes soient inondées et ajustez le réglage pour la mesure. Utiliser le flux isocratique d’un mélange 50:50 d’acétonitrile (solvant A) et d’un mélange de solution de NaCl à 0,9 % (980 ml) combiné à de l’acide trifluoracétique (1 ml) et d’une solution de citrate (20 ml) comme solvant B. Mesurer l’absorbance UV à 280 nm.
      2. Prélever 5 μL de produit et les diluer avec 15 μL de NaCl à 0,9 %. Injecter 15 μL du mélange dans la radio-HPLC analytique (colonne 5 μm SEC-s2000 154 Å ; débit : 2 mL/min).
      3. Utiliser le flux isocratique d’un mélange 50:50 d’acétonitrile (solvant A) et d’un mélange de solution de NaCl à 0,9 % (980 ml) combiné à de l’acide trifluoracétique (1 ml) et d’une solution de citrate (20 ml) comme solvant B. Mesurer l’absorbance UV à 280 nm. Il y a un léger décalage dans les temps de rétention entre les canaux UV et gamma ; cela est dû à la conception de la HPLC (le signal gamma est installé en série après le détecteur UV).
      4. Déterminer la pureté radiochimique en intégrant les pics dans le canal gamma. Le produit doit se situer dans la plage d’intégration qui a été déterminée précédemment en mesurant le nanocorps non radiomarqué. De plus, intégrez tous les autres pics dans le canal gamma et évaluez-les comme des impuretés. La pureté doit être de >95 %.
    5. Endotoxine
      1. Préparez une dilution 1:20 du produit d’un volume total de 150 μL en utilisant de l’eau (certifiée) sans endotoxines pour diluer.
      2. Insérez une cartouche d’endotoxine jetable, qui est préremplie commercialement avec tous les réactifs nécessaires, dans le lecteur de test d’endotoxine et chargez 25 μL de produit dilué dans chaque chambre de cartouche.
      3. Appuyez sur Lecture. Le PTS dispose de contrôles internes positifs et négatifs et sera inclus dans le rapport final. Le test dure environ 15 min. Le produit est considéré comme exempt d’endotoxines si sa teneur en endotoxines est < 8,7 UE/ml à Vmax = 20 ml.
    6. Stérilité rétrospective
      1. Après l’injection et le prélèvement de l’échantillon de qualité, conserver le produit radiopharmaceutique dans un flacon stérile au réfrigérateur à 4 °C.
      2. Remettre l’échantillon à un institut certifié pour l’analyse de la stérilité (interne ou externe) si la limite d’exemption de 10,5 Bq ou 10 Bq/g n’est pas dépassée afin d’effectuer un test de stérilité conformément au12.
  3. Préparation de la seringue (une par animal)
    1. Mesurez l’activité du produit à l’aide d’un indicateur d’activité au bon réglage (68Ga comme isotope ; 1 mL seringue, 0,1 mL pour la géométrie).
    2. Prélever 15 MBq du produit (environ 25 μL) dans un tube de microcentrifugation et remplir le volume avec 0,9 % de NaCl à 75 μL.
    3. Ajoutez 50 μL dans la seringue et mesurez-le à l’aide d’un compteur d’activité au bon réglage (68Ga comme isotope ; seringue de 1 mL, 0,1 mL pour la géométrie). La seringue doit contenir 10 MBq du produit.
      REMARQUE : Dès que le nanocorps NM-02 marqué au 68Ga est formé, les pointes de pipette en plastique ne sont plus nécessaires lors de la manipulation du Ga 68. À partir de là, chaque fois que le protocole mentionne la manipulation d’un liquide, utilisez une seringue (1 ml) et une aiguille (27-30 g) appropriées.

2. Génération de modèles animaux

  1. Logement des animaux
    1. Utiliser des souris femelles immunodéficientes Rj : ATHYM-Foxn1nu/nu à l’âge de 6 à 8 semaines (auprès d’un fournisseur commercial) pour développer des tumeurs sous-cutanées. À l’arrivée, logez toutes les souris directement dans la salle des animaux et donnez-leur au moins 1 semaine après le transport pour l’acclimatation.
    2. Hébergez les animaux sous un cycle de 12 h de lumière / 12 h d’obscurité et fournissez un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Maintenez la température ambiante et l’humidité relative entre 20-25 °C et 45 %-65 %, respectivement.
  2. Préparation des cellules pour l’implantation
    1. Commencer la culture cellulaire avec 1 x 106 cellules SKOV-3 et ajouter 25 ml de milieu DMEM/F12 préchauffé enrichi de 10 % de FBS et de 1 % de pénicilline/streptomycine dans une fiole de culture cellulaire T175.
    2. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 et remplacez le milieu complet au moins 2 fois par semaine.
    3. À 1 semaine ou, au plus tard 1 jour avant l’implantation cellulaire, prélever 20 μL de milieu dans le flacon de culture cellulaire pour tester le mycoplasme13. N’utilisez que des cellules mycoplasmiques négatives pour l’injection de cellules.
    4. Le jour de l’injection de la cellule, aspirez le milieu complet et pipetez 5 mL de PBS dans le flacon. Faites tourner la bouteille d’avant en arrière plusieurs fois pour laver le milieu restant.
    5. Ajoutez 3 mL de trypsine dans le ballon et incubez-le pendant 4 min dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pour dissocier les cellules. Vérifiez au microscope avec un grossissement de 40x si les cellules se sont détachées de la fiole de culture cellulaire.
    6. Ajouter 7 mL de milieu pour neutraliser l’activité de la trypsine et transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 50 mL.
    7. Centrifugez les cellules à 150 x g pendant 5 min (à température ambiante) pour obtenir une pastille de cellule. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL de milieu pour remettre les cellules en suspension.
    8. Prenez 12 μL de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation et ajoutez une quantité égale de bleu de trypan. Chargez la chambre de l’hémocytomètre avec 10 μL de suspension cellulaire soigneusement mélangée.
    9. Comptez les cellules viables non colorées dans la zone définie et calculez le nombre de cellules. Ajustez la concentration cellulaire à 5 x 107 cellules/mL et mélangez soigneusement la suspension cellulaire avec 1 mL de matrice de membrane basale.
    10. Prendre 5 x 106 cellules dans 0,2 mL de milieu cellulaire avec une matrice de membrane basale à 50 % dans une seringue d’insuline de 1 mL pour chaque souris. Maintenir la seringue sur de la glace jusqu’à l’injection pour éviter la solidification de la matrice de la membrane basale.
      REMARQUE : Si une souris pèse moins de 20 g, injectez seulement 150 μL (pour 15-20 g) ou 100 μL (pour 10-15 g) du mélange. Pour les applications sous-cutanées, on veille à ce que le volume maximal de 10 mL/kg de poids corporel recommandé par le GV-SOLAS ne dépasse pas14.
  3. Inoculation et suivi
    1. Injectez la suspension cellulaire par voie sous-cutanée dans le flanc de l’animal éveillé en fixant le cou et la queue d’une main. Habituellement, on privilégie les injections dans le flanc gauche.
    2. Attendez 10 à 15 s pour que la matrice de la membrane basale durcisse, puis retirez l’aiguille.
    3. Surveillez la croissance tumorale quotidiennement après l’implantation à l’aide d’un pied à coulisse numérique pour mesurer deux axes tumoraux perpendiculaires.
    4. À l’aide de ces mesures, évaluez la croissance tumorale à l’aide du volume tumoral calculé par la formule :
      VT = L × B2 × π / 6
      où VT est le volume tumoral en mm3, L est la longueur de la tumeur en mm (c’est-à-dire le plus grand de deux axes perpendiculaires), et B est la largeur de la tumeur en mm (c’est-à-dire le plus petit de deux axes perpendiculaires15). Cette technique a tendance à surestimer le volume tumoral car elle inclut également la peau.
    5. La masse tumorale influence le poids de la souris lorsqu’elle est mesurée sur la balance électronique. Pour calculer le poids de l’animal corrigé de la masse tumorale, utilisez la formule suivante :
      msouris-T = msouris - 0,82 × VT
      où msouris-T est le poids de la souris à l’exclusion de la masse tumorale en g, msouris est le poids de la souris selon l’échelle électronique en g et VT est le volume tumoral calculé en mm3. Le nombre 0,82 g/mm3 résulte de la valeur moyenne d’une série de tumeurs isolées lors d’expériences animales antérieures, pesées et leur volume déterminé à l’aide de la formule donnée. Il représente une densité tumorale moyenne.
    6. De plus, déterminez la taille de la tumeur par rapport à la souris et surveillez la charge tumorale à l’aide de la formule suivante :
      Charge tumorale [ %] = (0,82 × VT)/ m souris × 100
      où la charge tumorale est exprimée en pourcentage, 0,82 × VT correspond à la masse tumorale en g (c’est-à-dire VT, le volume tumoral calculé en mm3, multiplié par la densité tumorale moyenne), et msouris est le poids de la souris selon l’échelle en g.
    7. Lorsque les animaux atteignent un volume tumoral supérieur à 200mm3, programmez-les pour une TEP/TDM non invasive ou une SPECT/TDM, selon l’expérience.

3. Imagerie

  1. Préparation de la seringue (système sur mesure)
    REMARQUE : La queue de la souris est petite ; par conséquent, l’utilisation d’une canule 27G ou plus petite est nécessaire (un nombre plus grand correspond à des aiguilles plus petites). Dans le cas des souris femelles, les seules veines accessibles pour les injections en bolus sont les trois veines de la queue. Anatomiquement, la veine dorsale de la queue est plus proche de la colonne vertébrale par rapport aux deux veines latérales ; Ne pas injecter dans cette veine pour éviter le grattage osseux iatrogène. D’après l’expérience, l’utilisation d’une canule 30G donne les meilleurs résultats car des veines plus petites peuvent également être accessibles. Étant donné que les cathéters 30G ne sont pas disponibles à l’achat, ce type doit être fabriqué avec soin par le chercheur.
    1. Préparez la seringue avec le traceur radioactif en fonction de la voie d’administration prévue. Pour les injections intraveineuses, s’assurer qu’un volume maximal de 5 mL/kg de poids corporel est administré à une souris de 25 g ; cela signifie un volume injecté maximal de 125 μL.
    2. Pour préparer un cathéter 30G, utilisez d’abord n’importe quelle aiguille 30G et retirez la tige de l’aiguille métallique, soit avec des ciseaux métalliques, soit en la pliant pour l’éloigner du plastique.
    3. Insérez manuellement un tube PE10 de 0,3 mm de diamètre dans la partie de l’arbre qui a été retirée du moyeu. Des précautions doivent être prises pour éviter de perforer le tube.
      REMARQUE : D’autres types de plastique peuvent également être utilisés ; cependant, le PE10 offre le meilleur équilibre entre rigidité et flexibilité des parois.
  2. Injection intraveineuse
    REMARQUE : Les injections intraveineuses peuvent également être effectuées chez les animaux éveillés ; Cependant, si cela n’est pas nécessaire, les animaux doivent être injectés sous sédation à l’isoflurane afin de réduire le fardeau de l’animal de recherche.
    1. Remplissez le cathéter 30G avec un tampon NaCl à 0,9 % ou tout autre tampon souhaité.
    2. Placez la souris dans une chambre d’induction et remplissez-la continuellement d’un mélange d’oxygène (ou d’air sous pression de qualité médicale) et d’isoflurane gazeux jusqu’à ce que l’animal perde le réflexe de redressement. Pour l’induction, utilisez de l’isoflurane à 3,5 % à 5 % avec un débit d’oxygène ou d’air de 0,8 L/min.
    3. Placez immédiatement la souris sous sédation en position ventrale initiale sur un tapis chauffant (37-38 °C) tout en maintenant la sédation à l’isoflurane à travers un cône nasal. Vérifiez fréquemment les souris pour détecter des signes de surchauffe (par ex. un étirement excessif, une respiration rapide, une rougeur de la peau). Pour l’entretien de l’anesthésie, utilisez de l’isoflurane à 1,8 % à 2,5 % avec un débit d’oxygène ou d’air de 0,8 L/min.
    4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement pendant la sédation. Inspectez les deux veines latérales de la queue et choisissez celle qui convient le mieux à l’injection. La visibilité et le diamètre de la veine doivent être pris en compte. Pour de meilleurs résultats, tournez légèrement la queue de manière à ce que la veine sélectionnée entre en contact avec le tapis chauffant et laissez la veine se dilater pendant 1 min.
    5. Tournez toute la souris sur la position latérale de sorte que la veine sélectionnée remonte vers le haut. Fixez la pointe et la base de la queue avec du ruban adhésif.
    6. Prenez le cathéter 30G avec la main dominante et placez doucement l’index de la main non dominante sur la veine sélectionnée pour créer une réserve de sang à l’intérieur. Au site de la sauvegarde, la veine va se dilater, formant une petite bosse.
    7. Avec la main dominante, placez le cathéter 30G parallèlement à la queue face à la bosse sur la veine. Déplacez la main dominante vers l’avant. La plupart du temps, cette technique assure une ponction veineuse directe.
    8. Une fois à l’intérieur de la veine, le reflux sanguin devient visible dans le tube en plastique. Fixez le tube en plastique pour vous assurer que l’aiguille ne se déplacera pas à l’intérieur de la veine pendant l’injection. À l’extrémité libre du tube, insérez la seringue traceur reliée à une aiguille 30G.
      REMARQUE : Lorsqu’une distribution dynamique du traceur doit être évaluée, les points suivants doivent être effectués après que l’animal est placé sur le lit du scanner TEP et que la TEP est initiée.
    9. Injectez lentement le contenu de la seringue traçante pendant au moins 10 s. Tout en gardant l’aiguille 30G toujours connectée au système de cathéter 30G, retirez uniquement la seringue traceur et connectez une seringue avec un tampon à 0,9 % de NaCl (ou tout autre tampon souhaité) pour rincer le cathéter. Surveillez la respiration en continu pendant la procédure d’injection et ajustez la concentration d’isoflurane pour maintenir environ 1 respiration par seconde.
    10. Retirez le cathéter 30G de la veine de la queue et utilisez une compresse de coton stérile pour arrêter le saignement.
    11. Pour mesurer l’activité restante, mesurez le cathéter 30G, la seringue tampon, la seringue de traceur vide et la compresse de coton, car ils contiennent tous de petites quantités de traceur qui n’ont pas atteint l’animal.
  3. Acquisition TEP/TDM
    REMARQUE : Pour les nanocorps NM-02 marqués au Ga 68, tous les animaux sont imagés avec un système TEP/TDM pour petits animaux.
    1. Acquisition de PET
      1. Placez la souris sous sédation en position ventrale sur le lit de l’animal et fixez-la au scanner TEP. Basculez le débit d’isoflurane vers le cône nasal du PET et maintenez-le à 1,5 % à 2,5 % d’isoflurane dans l’air médical à 0,8 L/min de sorte que le rythme respiratoire de l’animal pendant l’examen soit compris entre 75 et 50 respirations par minute.
      2. Fixez la souris derrière son cou au lit de l’animal avec du ruban adhésif médical. Si nécessaire, appliquez à nouveau une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant la sédation.
      3. Allumez le coussin chauffant dans le lit de l’animal à environ 80 % de puissance, ce qui équivaut à environ 30 °C.
      4. Réglez le temps d’acquisition sur 45 min et sélectionnez la région d’intérêt qui sera numérisée. Sélectionnez 68Ga comme isotope d’étude et lancez l’examen. Entrez la quantité d’activité injectée, le moment de l’injection et le temps de mesure de la seringue vide. La position d’un lit en PET est de 160 mm, ce qui est assez long pour un balayage complet de la souris par la souris.
      5. Lorsqu’une distribution dynamique du traceur doit être évaluée, il faut d’abord démarrer la TEP, attendre 30 s pour l’acquisition, puis passer aux étapes 3.2.9 et 3.2.10. Laissez le cathéter dans la souris avec la seringue tampon attachée pour éviter une perte de sang supplémentaire. Le cathéter peut être déconnecté à la fin de la TEP, avant l’acquisition de la TDM pour éviter les artefacts.
    2. Acquisition de la tomodensitométrie
      1. Déconnectez le lit d’animal du scanner TEP et connectez-le immédiatement au tomodensitomètre. Si nécessaire, détachez également la canule de la veine de la queue. Après au moins 30 minutes après la ponction veineuse, le site d’injection est déjà coagulé, de sorte qu’il n’y aura plus de saignement.
      2. Basculez le flux d’isoflurane vers le cône de nez dans le tomodensitomètre.
      3. Sélectionnez la même région d’intérêt à balayer pour l’imagerie TEP. Sélectionnez le protocole d’acquisition standard : 440 μA, 50 kVp, temps d’exposition de 32 ms et rotation de 1080° en mode spirale avec 960 expositions/360° ; la durée de la tomodensitométrie est d’environ 7 minutes pour un balayage corporel de la souris.
      4. Contrôlez le rythme respiratoire et allumez le coussin chauffant dans le lit de l’animal. Surveillez la respiration en continu pendant les scanners et ajustez la concentration d’isoflurane pour maintenir une fréquence respiratoire entre 75 et 50 respirations par minute.

4. Soins aux animaux après l’imagerie

  1. À la fin des scans, l’animal a besoin d’au moins 15 minutes pour se réveiller. Pour éviter l’agression des compagnons de portée, mettez l’animal seul en cage pendant environ 15 minutes ou jusqu’à ce qu’il soit capable de marcher seul jusqu’à ce qu’il soit remis dans sa cage d’hébergement d’origine. Pendant ce temps, utilisez la lumière infrarouge pour éviter l’hypothermie.
  2. Dans un premier temps, placez l’animal sur son côté gauche (position sécurisée) pour éviter un choc hémodynamique. Laissez la pommade ophtalmique rester, car elle sera retirée par l’animal lui-même une fois qu’il sera réveillé.

5. Reconstruction TEP/TDM

  1. Effectuez une reconstruction TEP à l’aide d’une maximisation d’attente de sous-ensemble ordonné en 3 dimensions (c’est-à-dire OSEM-3D avec 30 itérations) avec une fenêtre d’énergie de ± 15 % d’un pic de 511 keV à une taille de voxel isométrique de 0,4 mm dans une matrice de 192 × 192 × 384. Appliquez des corrections basées sur la tomodensitométrie (c’est-à-dire la correction de l’atténuation, la correction de la diffusion, le temps mort et les événements aléatoires) à la reconstruction TEP.
  2. Dans le cas où une distribution dynamique du traceur doit être évaluée, appliquez une reconstruction multi-images. À titre d’exemple, les images suivantes peuvent être utilisées pour un balayage de 45 min : 4 x 30 s, 3 x 1 min, 5 x 2 min, 2 x 5 min et 2 x 10 min.
  3. Reconstruire les protocoles d’acquisition standard de la tomodensitométrie à l’aide d’un algorithme de reconstruction itératif (c’est-à-dire ISRA) à une taille de voxel isométrique de 0,2 mm dans une matrice de 200 × 200 × 425. À l’aide d’un logiciel du fournisseur, convertissez les valeurs CT en unités Hounsfield (HU) à l’aide de la formule :
    figure-protocol-1
    où μW est le coefficient d’atténuation linéaire de l’eau, μa est le coefficient d’atténuation linéaire de l’air et μt est le coefficient d’atténuation linéaire du tissu.
  4. Les images TEP et TDM ont été automatiquement alignées après reconstruction à l’aide de la matrice générée par un balayage fantôme capillaire. Archivez toutes les données reconstruites et transférez-les vers un serveur de base de données à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, au besoin.

6. Traitement et analyse d’images

REMARQUE : Les images TEP/TDM co-enregistrées sont ensuite utilisées pour la quantification au sein du serveur de base de données d’un logiciel d’analyse d’images, où chaque balayage hybride est enregistré en tant que sujet.

  1. Identifiez la tumeur en fonction du scanner et sélectionnez-la comme région d’intérêt. Masquez manuellement la base tumorale sur la tomodensitométrie.
  2. Pour obtenir une segmentation indépendante de l’utilisateur, placez le masque tumoral nouvellement formé sur la TEP ou la SPECT. Pour le PET, utilisez un seuil minimal de 1,0 valeur d’absorption standardisée (SUV). Pour la SPECT, utilisez un seuil minimal supérieur à l’absorption moyenne du pool sanguin mesurée dans le cœur ou l’aorte abdominale terminale.
  3. Enregistrez la moyenne, le maximum, la moyenne des 10 voxels les plus chauds (c.-à-d. la moyenne chaude de 10) et l’absorption totale des volumes d’intérêt nouvellement générés.
  4. Utilisez ces valeurs pour générer des valeurs SUV et TBR (target-to-background (TBR), qui seront ensuite utilisées pour l’analyse statistique.

Résultats

L’un des aspects les plus importants du contrôle de la qualité d’un produit radiopharmaceutique est le moyen de la HPLC, car elle permet non seulement de montrer la pureté chimique et radiochimique (98,2 % dans ce cas), mais aussi de prouver l’identité du produit radiopharmaceutique en comparant le temps d’élution et la forme du pic à ceux d’un composé de référence non radioactif. Ce composé de référence est, dans ce cas, un nanocorps non marqué, dont il a été prouvé qu’il s’agissait du bon composé par des techniques classiques telles que la spectrométrie de masse ou la résonance magnétique nucléaire. Ces techniques ne peuvent pas être appliquées directement au composé radioactif (il n’y a pas assez de masse pour générer un signal), mais en comparant le composé radioactif avec sa référence, on recueille suffisamment de preuves que le composé correct a effectivement été marqué et n’a pas été modifié pendant la synthèse. Notez la petite différence de temps de rétention entre le produit radioactif et la référence de la figure 1, correspondant à la mesure en série du débit HPLC (l’UV est mesuré en premier ; le débit a ensuite besoin d’environ 0,2 min pour atteindre le détecteur de radioactivité dans une configuration typique).

figure-results-1
Figure 1 : Chromatogramme analytique HPLC typique pour le contrôle qualité de 68nanocorps NM-02 marqués au Ga (GLNM-02). L’absorbance UV du composé froid (c’est-à-dire le panneau supérieur) est mesurée à 280 nm et montre un pic à 4,18 min, avec un décalage de 0,22 min. Le pic du produit marqué au Ga 68est visible dans le détecteur gamma (c.-à-d. le panneau inférieur). Le rendement radiochimique est de 98,2 %. mAU = unités d’absorbance millimétriques, NM-02 = notre produit, UV = canal de lumière ultraviolette, nm = nanomètre, min = minute, CPS = nombre par seconde, GLMN-02 = 68nanocorps marqué au Ga NM-02, 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = canal gamma. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En l’absence de HPLC ou en plus de celle-ci, la TLC peut être utilisée pour déterminer le rendement de l’étiquetage et la pureté du produit final (mais pas l’identité, et pas aussi détaillée que la HPLC). En raison de sa faible complexité, la CCM est idéale lorsque la voie de radiosynthèse est encore en cours d’optimisation. La figure 2 montre le chromatogramme CCM de 68nanocorps NM-02 marqués au Ga (pureté radiochimique apparente de 99,9 %).

figure-results-2
Figure 2 : Chromatogramme analytique CCM typique pour le contrôle qualité de 68nanocorps NM-02 marqués au Ga (GLNM-02). Les comptages de surface sont tracés en fonction de la distance parcourue par le solvant (citrate) sur la plaque de CCM. Le Rf est de 0,2 et la pureté radiochimique est de 99,9 %. C = Comptage, mm = millimètre, GLNM-02 = 68Nanocorps marqué au Ga NM-02, CCM = chromatographie sur couche mince. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans le processus de préparation des données d’imagerie pour la publication, il est courant de montrer au moins une image CT et PET autonome. Cette approche permet une évaluation complète de la biodistribution des traceurs. L’échelle standard de la tomodensitométrie est comprise entre -1000 HU et 1000 HU, ce qui permet de visualiser tous les tissus mous dans une seule fenêtre. Comme le montre la figure 3A, cette méthode permet une démarcation claire des reins de souris tout en permettant une évaluation osseuse.

Pour le pont-bascule TEP, fixer le seuil inférieur à un VUS de 0,0 tout en maintenant un seuil supérieur minimal de 1,0 (figure 3B), de préférence en utilisant la normalisation du poids corporel lors du calcul du VUS (c.-à-d. VUSp.c.). De plus, pour la quantification, SUVmean est préféré à SUVmax ; si le SUVmax doit être utilisé, utilisez la moyenne des 10 voxels les plus chauds au lieu de la valeur du voxel unique le plus chaud dans le calcul du poidsnoir du SUV. Préparez des fusions de caractéristiques d’images TEP/TDM en fusionnant les coupes CT et TEP (Figure 3C).

Pour permettre aux lecteurs d’évaluer indépendamment la biodistribution du traceur du corps entier, la projection d’intensité maximale du même balayage TEP peut être présentée à l’aide de la même échelle que la tranche TEP (figure 3D).

figure-results-3
Figure 3 : Images TEP/TDM in vivo d’une souris porteuse d’une tumeur sous-cutanée SKOV-3. L’image a été acquise 3 h après l’injection intraveineuse de 5 nanocorps NM-02 marqués au Ga (GLNM-02) de 5 MBq 68. (A) L’image CT est mise à l’échelle entre -1000 HU et 1000 HU, tandis que (B) l’image TEP est comprise entre un SUV de 0,0 et 5,0. (C) La fusion TEP/TDM utilise la même échelle. (D) L’image TEP de projection d’intensité maximale (MIP) est également mise à l’échelle à l’aide d’un SUV de 0,0 et 5,0. Toutes les images TEP montrent une bonne absorption tumorale de GLNM-02, et la clairance rénale est clairement visible. CT = tomodensitométrie, TEP = tomographie par émission de positons, MIP = projection de l’intensité maximale, HU = unité de Hounsfield, SUV = valeur d’absorption standardisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans le cas spécifique du nanocorps NM-02 marqué au Ga 68, une absorption tumorale notable peut être observée dans le flanc gauche de la souris. De plus, la clairance rénale du traceur est également évidente. En présentant la projection d’intensité maximale du TEP, l’activité de la vessie devient également visible, renforçant la clairance rénale du traceur. Dans ce cas précis, il convient de mentionner que le rein, la tumeur et la vessie ne peuvent pas être représentés dans la même tranche 2D. En incluant la projection d’intensité maximale dans les publications, l’ensemble de la biodistribution du traceur est présentée dans la même image.

Discussion

Radiosynthèse
La radiosynthèse décrite ici est typique d’un nouveau composé marqué au Ga 68- un temps de synthèse court, en mettant l’accent sur un pH approprié et en évitant les métaux dans la mesure du possible. Pour cela, il est important de suivre strictement l’ordre dans lequel les composants sont ajoutés. Dans tous les cas, la valeur du pH de la solution 68Ga doit d’abord être ajustée à pH 4 avec 3 M NH4OAc ; sinon, le nanocorps peut se dégrader si le pH est trop acide. Les concepts généraux de la synthèse de 68Ga ont été décrits précédemment16, nous n’entrerons donc pas dans les détails ici. Le module de synthèse automatisé nécessite une optimisation supplémentaire en ce qui concerne la réduction de la dose de rayonnement. Cela nécessite un effort important qui dépasse le cadre de la recherche exploratoire dans une expérience préclinique typique, comme décrit ici. De plus, il est peu probable qu’une synthèse automatisée produise les petits volumes que nous pouvons produire avec la méthode actuelle (< 1 mL), ce qui permet des concentrations plus élevées de 68Ga et une activité spécifique plus élevée.

Le contrôle de la qualité doit toujours être effectué et enregistré dans les moindres détails. Une exception à ce détail est le pH : alors que les mesures de pH pour les synthèses cliniques sont souvent effectuées avec une grande précision à l’aide de pH-mètres, il suffit ici de mesurer le pH avec une simple bandelette de pH, car les exigences pour les injections intraveineuses le permettent (tout pH compris entre 6 et 8 est autorisé14). Cette technique simple réduit le coût et le risque de contamination de l’équipement par des matières radioactives.

Formulations pour modèles animaux
La formulation finale du traceur est un aspect crucial du traceur, un aspect qui n’est souvent que mal décrit dans la recherche préclinique. Bien qu’il existe une législation claire pour la formulation de produits pharmaceutiques destinés à des essais sur l’homme, y compris les produits radiopharmaceutiques, en préclinique, il n’existe que des lignes directrices17,18 qui ne traitent pas spécifiquement des solvants ou des formulations. Ces directives sont souvent utilisées lors de la rédaction ou de l’évaluation de protocoles légalement requis pour l’approbation par des comités d’éthique (animale) (en Allemagne : LANUV19), mais ces documents ne soulignent pas suffisamment l’importance de la formulation. Il est probable que de mauvaises formulations puissent conduire à de faux résultats (négatifs), mais une telle affirmation est difficile à vérifier compte tenu du biais de publication persistant qui existe toujours, également dans le domaine de l’oncologie20.

En plus des directives ARRIVE, nous avons choisi de suivre autant que possible la législation conçue pour les applications humaines, en supposant que les formulations adaptées aux humains conviennent généralement aussi aux rongeurs. La différence majeure est la taille du sujet et, par conséquent, la quantité de volume qui peut être injectée en toute sécurité. À cette fin, nous avons choisi de purifier le composé dans la mesure du possible à l’aide de filtres à coupure de poids moléculaire (MWCO), car ceux-ci se sont avérés efficaces pour purifier les composés de grande taille21. Ils permettent de dissoudre finalement un traceur typique marqué au 68Ga dans une solution de choix et dans un petit volume adapté aux souris (injection intraveineuse maximale typique 100 - 150 μL).

En Allemagne, la GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde, en français : Association pour les animaux de laboratoire) sert d’intermédiaire entre la protection des animaux et la recherche, au profit des humains et des animaux. Par conséquent, cette association a mis en place des recommandations pour de multiples aspects de la recherche animale, notamment dans les domaines de l’oncologie et de l’anesthésie, afin d’uniformiser les soins aux animaux au niveau national14. Désormais, la plupart des autorités compétentes et des comités nationaux d’éthique veillent à ce que les protocoles relatifs aux animaux soient respectés de ces recommandations. GV-SOLAS a des recommandations pour les volumes maximaux de la plupart des itinéraires d’application. Pour l’injection intraveineuse, un maximum de 5 mL/kg de poids corporel est recommandé ; pour une souris de 25 g, cela équivaut à 150 μL. Pour cette raison, toutes les productions de traceurs radioactifs sont réglées pour un volume d’injection maximal de 150 μL par animal. Le dépassement de ce seuil lors d’une injection intraveineuse augmente le risque d’insuffisance cardiaque aiguë causée par l’hypervolémie. Les injections intraveineuses répétées dépassant ce seuil entraînent un risque accru de fibrose pulmonaire, car chaque injection, en fonction de la vitesse d’écoulement, provoque un œdème pulmonaire mineur. Un équivalent humain de l’IV de souris présenté dans cet article serait d’injecter par voie intraveineuse en bolus (dans les 10 s) un volume total de 375 mL pour un humain de 75 kg. En soins cliniques standard, 500 mL de solution de NaCl à 0,9 % sont administrés pendant 1 h ; cela signifie que 375 mL seraient administrés sur 45 min afin d’éviter toute complication.

GV-SOLAS recommande que la charge tumorale n’atteigne pas plus de 5 % ; Si l’animal est sous traitement, la charge peut être prolongée jusqu’à 10 %22. Cette différence entre les groupes traités et non traités a le potentiel de créer un biais de recherche, en particulier dans le cas de la survie, car les souris tumorales traitées peuvent atteindre une charge tumorale plus élevée que le groupe témoin afférent. Pour éviter de tels cas, soit la charge tumorale de 5 % doit également être fixée pour les animaux de traitement ; Cependant, cela peut conduire à des dilemmes éthiques pour tuer des animaux de recherche avant d’atteindre un critère d’évaluation dit humain, ou (de préférence) faire valoir que l’augmentation à 10 % dans le cas des groupes témoins afférents est fondée sur l’éthique afin d’éviter les biais.

Comme la charge tumorale doit être calculée tous les jours de manière non invasive, nous appliquons un facteur de correction (c’est-à-dire 0,82) pour convertir le volume tumoral calculé quotidiennement en poids tumoral. Nous avons calculé ce facteur en mesurant le diamètre de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse numérique avant que les animaux ne soient tués selon le protocole, puis le poids réel de la tumeur à l’aide d’une balance. Ce facteur de correction est différent de la densité du tissu tumoral, car le volume tumoral mesuré inclut également la peau. Par conséquent, ce facteur est probablement < 1,0, car le volume tumoral mesuré est supérieur au volume tumoral réel. Comme les tumeurs que nous avons pesées étaient relativement grandes, car l’évaluation a été faite le dernier jour de l’expérience, ce facteur surestime en effet le poids des petites tumeurs. Il ne doit être utilisé que dans l’évaluation de la charge tumorale.

Un autre aspect des recommandations GV-SOLAS est que pour les souris, un diamètre tumoral fixe de 15 mm est fixé comme critère d’évaluation humain17. Fréquemment, la tumeur a tendance à se développer rapidement le long du canal de l’aiguille formé par l’injection sous-cutanée si aucun air ou bouchon n’est injecté après la solution contenant des cellules tumorales. Par conséquent, les 15 mm sont atteints plus rapidement sur certaines voies d’application. Étant donné que, du point de vue de l’expérience, certaines tumeurs se développent en forme elliptique, nous avons adapté et utilisé la formule de volume tumoral mentionnée ci-dessus pour effectuer des comparaisons impartiales entre les différentes voies d’application.

Les modèles d’animaux que nous utilisons sont conçus selon les directives ARRIVE17 et PREPARE18 , ce qui permet une reproduction expérimentale facile. Le modèle est sujet à un certain degré de variation car le taux de croissance tumorale varie entre différentes souris, ce qui rend la normalisation et l’interprétation plus difficiles à gérer. Cependant, ces variations reflètent l’hétérogénéité intra- et intertumorale présente chez les patients atteints de cancer23.

Ce protocole n’est pas sans limites. Les animaux doivent être sous sédation pendant l’injection, en particulier lors de la TEP/TDM. La sédation, en particulier avec l’isoflurane, affecte la circulation sanguine et les animaux peuvent devenir hypothermiques, nécessitant l’utilisation d’un tapis chauffant et la surveillance de la profondeur de la sédation. Ce problème peut être évité en scannant les animaux éveillés ; Cependant, cela nécessite des logiciels internes spécialisés et une expertise, qui ne sont souvent pas disponibles.

Une autre limitation est la dose de rayonnement. Bien que la dose reçue par les animaux soit négligeable pour un seul scan, la réalisation de plusieurs scans (c’est-à-dire surtout s’ils sont plus de 10) peut entraîner une dose cumulative significative, pouvant avoir un impact sur la croissance tumorale. Lorsque la croissance tumorale est un paramètre de lecture, il est essentiel que tous les animaux reçoivent le même nombre de scans et de doses pour garantir des groupes comparables, ce qui alourdit la charge de travail de l’ensemble du projet. L’utilisation d’un système TEP/IRM au lieu d’un système TEP/TDM pourrait réduire l’exposition aux rayonnements. Cependant, cette approche implique des temps de balayage plus longs, des coûts supplémentaires et une méthode différente pour obtenir des informations anatomiques.

En adhérant aux recommandations d’organisations de protection sociale telles que GV-SOLAS en Allemagne et en suivant les directives établies telles que ARRIVE et PREPARE, nous nous efforçons de normaliser les modèles animaux et de minimiser la variabilité des protocoles expérimentaux. Ces efforts sont cruciaux pour garantir la fiabilité et la reproductibilité des études précliniques, ce qui facilitera en fin de compte l’application de produits radiopharmaceutiques prometteurs du laboratoire au chevet du patient.

Déclarations de divulgation

FMM est conseiller médical pour NanoMab Technology Ltd. et Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH. Il a récemment reçu des subventions institutionnelles de NanoMab Technology Ltd., Siemens et GE Precision Healthcare LLC. De plus, il a un contrat de recherche interventionnelle avec CURIUM.

Remerciements

Les auteurs remercient Susanne Allekotte pour son soutien technique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
EquipmentCompteur d’activité
ISOMED 2010Nuviatech Healthcare  ;-
Centrifugeuse MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
Test d’endotoxines Endosafe nexgen-PTSCharlesRiver-Bloc
chauffant NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
Système HPLC, y compris détecteur radioKnauer & Logicield’analyse d’images Raytest-Pmod
4.4PMOD Technologies LLC-Système
PET/CT pour petits animaux &beta ;-CUBE et X-CUBEMolecubes NV-TLC
MiniGITA*Elysia-Raytest-
Materials
0.3 mm de diamètre PE10 tubefisher scientific22-204008
30G aiguilleB|Braun4656300
Filtre centrifuge ; 10 kDa MWCO, 0,5 mLBande
chromatographie iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
Cartouche d’endotoxine, sensibilité 0,05 EU/ml  ;Charles RiverPTS-2005
Colonne HPLC Biosep SEC-s2000Phenomenex-Tube
centrifuger (1,5 mL)Eppendorf0030125150
bandelette de pH 0,0 - 6,0Merck KGaA109531
bandelette de pH 0-14Merck KGaA109535
PS-H+ Cartouche SPEMacherey Nagel GmbH &; Co. KG731861
Flacon stérile 10 mLALK Life Science SolutionsSEV100
Reagents
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABS-Ammoniumacétate
Merck KGaA101116
Acide citriqueMerck KGaA
Acide chlorhydriqueMerck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
Nanobody NM-02Radiopharm Theranostics-P-SCN-Bz-DOTA-GA
CheMatechC115
Acide trifluoracétiqueMerck KGaAT6508
Eau ultrapureMerck KGaA
de papier pour UFC501008 à 100241101262

Références

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