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Études sur l’effet anti-inflammatoire des pilules Xiaoyao dans le traitement de l’ostéoporose post-ménopausique chez la souris

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DOI :

10.3791/67051

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23 août 2024

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1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

Dans cet article

Résumé

L’ostéoporose postménopausique est devenue un problème de santé publique mondial. Le but de cette étude est d’explorer les effets thérapeutiques et les mécanismes associés des pilules de médecine traditionnelle chinoise Xiaoyao sur cette maladie.

Résumé

L’ostéoporose est une maladie métabolique courante chez les femmes âgées et ménopausées, sans symptômes évidents à ses débuts. Dans les derniers stades de cette maladie, les patients sont sujets aux fractures, ce qui peut gravement affecter leur santé et leur qualité de vie. L’augmentation mondiale de l’espérance de vie a fait de l’ostéoporose une préoccupation mondiale. Les pilules Xiaoyao étaient auparavant
Utilisé dans le traitement de la dépression. De plus, le médicament semblait avoir une activité semblable à celle des œstrogènes, ce qui a affecté l’expression de l’ALP, un marqueur précoce spécifique des ostéoblastes, et du COL-1, un composant majeur de la matrice extracellulaire osseuse. Les pilules Xiaoyao ont été évaluées pour leurs effets sur l’ostéoporose post-ménopausique (PMOM) chez la souris. Les informations cibles de chaque composant à base de plantes des pilules Xiaoyao ont été consultées à partir de la base de données de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP). Les informations provenant de GeneCards, d’OMIM, de PharmGkb, de TTD, de DrugBank et d’autres sites Web ont été utilisées pour construire le réseau de régulation du complexe à base de plantes par le biais de Cytoscape et du réseau String afin d’évaluer les interactions protéiques. Des souris ont été ovariectomisées et traitées avec des doses élevées et faibles de pilules Xiaoyao, et celles-ci ont été comparées à des témoins. Leurs symptômes ont été évalués par immunocytochimie des tissus osseux. Les résultats ont suggéré que les pilules Xiaoyao avaient la capacité de soulager les symptômes de la PMOM chez les souris ovariectomisées par la voie de signalisation IL-17. Ce médicament a le potentiel de devenir un nouvel agent thérapeutique pour le traitement de l’ostéoporose.

Introduction

L’Organisation mondiale de la santé (OMS) définit l’ostéoporose (OP) comme une maladie caractérisée par une diminution de la masse osseuse et une détérioration de la microarchitecture du tissu osseux, entraînant une augmentation de la fragilité osseuse et, par conséquent, un risque accru de fracture1. L’importance clinique de l’ostéoporose est qu’elle peut entraîner des fractures, qui sont associées à une mortalité, une morbidité et des coûts économiques élevés2. L’ostéoporose postménopausique (PMOP) est causée par une diminution des niveaux d’œstrogènes chez les femmes après la ménopause, ce qui entraîne une augmentation de l’activité des ostéoclastes, entraînant une perte osseuse et une destruction de la microstructure osseuse. Cela provoque souvent l’ostéoporose avec un impact sérieux sur la santé3. Les traitements actuels pour la PMOP comprennent l’œstrogénothérapie substitutive, les bisphosphonates et l’hormone parathyroïdienne, mais ils peuvent avoir des effets indésirables à des degrés divers, une observance insuffisante à long terme et des coûts élevés4. Par conséquent, la phytothérapie abordable est une alternative viable pour une grande partie de la population.

Les pilules Xiaoyao sont incluses dans la pharmacopée chinoise5, et celles-ci contiennent huit composants à base de plantes, dont le Chai Hu, l’Angelica sinensis, le Paeonia lactiflora blanc, l’Atractylodes macrocephala, le Poria cocos, le Menthae Herba, la réglisse et le gingembre frais. Toutes ces herbes sont connues pour être efficaces pour détoxifier le foie et renforcer la rate, nourrir le sang et réguler le cycle menstruel, et le mélange a également été utilisé pour traiter la dépression6. Cependant, le rôle des pilules Xiaoyao dans l’ostéoporose n’est pas clair.

Les premières études ont suggéré que l’inflammation peut entraîner une perte osseuse7 et que le déclin de la densité osseuse associé à ce processus peut être accéléré par la ménopause. De plus, il existe une forte relation entre le développement de l’ostéoporose et de l’inflammation. Le facteur inflammatoire, l’interleukine-17 (IL-17), est un facteur pro-inflammatoire sécrété par les cellules Th17, un sous-ensemble des lymphocytes T CD4+. Ces cellules sont associées à plusieurs maladies inflammatoires chroniques et jouent un rôle important dans le développement de la destruction osseuse dans la polyarthrite rhumatoïde8. De plus, l’IL-17 stimule l’activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire-κ B (RANKL), qui régule l’ostéoclastogenèse, conduisant à une plus grande résorption osseuse que la formation osseuse9. L’IL-17 stimule l’expression d’autres cytokines ostéoclastogènes telles que le TNFα, l’IL-1, l’IL-6 et l’IL-8. Il a la capacité d’entrer en synergie avec d’autres facteurs inflammatoires, ce qui en fait un effecteur inflammatoire important10.

Des études ont également montré un lien entre les pilules Xiaoyao et l’inflammation. Shi et al.11 et Fang et al.12 ont récemment confirmé que les pilules Xiaoyao peuvent réduire les niveaux d’IL-6 et de TNF-α, respectivement. Dans une autre étude sur la stéatohépatite associée au métabolisme, il a été rapporté que les pilules Xiaoyao pouvaient réguler à la hausse l’expression de l’acide propionique, qui à son tour inhibe l’expression du TNF-α et exerce un effet anti-inflammatoire13. Cependant, à l’heure actuelle, on ne sait pas si les pilules Xiaoyao peuvent réguler le développement du PMOM en médiant une réponse inflammatoire par l’IL-17, ce qui était le but de cette étude.

Cette étude a prédit l’intersection des cibles des pilules Xiaoyao et des gènes liés à l’ostéoporose grâce à la pharmacologie du réseau et à l’analyse bio-informatique et a analysé les gènes qui se croisent pour les interactions protéiques, GO et KEGG. Sur la base des résultats prédits, l’expression d’Act1 et d’IL-6, qui sont des protéines clés dans la voie de signalisation de l’IL-17, peut être observée14,15, ainsi que les marqueurs de renouvellement osseux de la phosphatase alcaline (ALP) et du collagène de type I (COL-1), pour observer l’efficacité thérapeutique des pilules Xiaoyao dans le modèle de souris PMOM.

Protocole

Le Comité d’éthique des animaux de laboratoire de l’Université de médecine de Youjiang pour les nationalités a approuvé le protocole d’étude (numéro d’approbation : 2022101502). Des souris femelles C57BL/6, âgées de 10 à 12 semaines, de classe SPF et de poids corporel (22 ± 2) g, ont été hébergées au Centre d’expérimentation animale de classe SPF de l’Université médicale de Youjiang pour les nationalités. Les animaux de laboratoire ont été maintenus à une température de 24-26 °C et à une humidité relative de 55 % à 60 %.

1. Base de données et plateforme d’analyse pharmacologique des systèmes de médecine traditionnelle chinoise

REMARQUE : La base de données et la plateforme d’analyse de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP ; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) sont des plateformes de pharmacologie de médecine chinoise qui contiennent des informations sur les ingrédients de la MTC, les propriétés liées à l’ADME, les cibles et les maladies16,17.

  1. Accédez à l’interface Web TCMSP. Recherchez le nom de Herb, entrez le nom de la médecine chinoise et cliquez sur Rechercher. Cliquez sur Nom latin dans les résultats de la recherche. Effectuer un dépistage sur les résultats des ingrédients avec les paramètres OB ≥ 30% et DL ≥ 0,18.
  2. Copiez tous les résultats et enregistrez-les au format TXT, nommé Chinese Medicine Name_ingredients.txt.
  3. Sous Informations sur les cibles dans l’onglet Cibles associées, filtrez l’ID Mol (c’est-à-dire le résultat à l’étape 1.2).
  4. Copiez les résultats filtrés et enregistrez-les au format TXT nommé Chinese Medicine Name_targets.txt.
    REMARQUE : Grâce aux étapes ci-dessus, tous les ingrédients actifs éligibles et les informations cibles correspondantes de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) ont été obtenus.
  5. Placez tous les fichiers ingredients.txt et fichiers targets.txt ci-dessus dans le même dossier et placez les scripts Perl (Supplementary Coding File 1) dans ce dossier.
  6. Ouvrez CMD, tapez le chemin du dossier cd, entrez-le et exécutez le script Perl. Récupérez un nouveau fichier texte (allTargets.txt). Ce nouveau fichier texte (allTargets.txt) contient le nom de la plante médicinale, le nom de l’ingrédient et l’ID de l’ingrédient cible.

2. Base de données UniProt

REMARQUE : La base de données UniProt (https://www.uniprot.org/) contient des séquences de protéines humaines annotées avec des informations fonctionnelles, et elle est utilisée pour normaliser les noms des cibles à leurs noms officiels18.

  1. Accédez à l’interface Web d’UniProt. Cliquez sur l’onglet Rechercher , sélectionnez UniProtKB, puis cliquez sur Rechercher.
  2. Filtrez dans la barre latérale gauche, sélectionnez Examiné (Swiss-Prot) pour Status et Human pour Popular organisms. Cliquez sur Télécharger, sélectionnez Tout télécharger, sélectionnez TSV pour Format, puis cliquez sur Télécharger pour télécharger le fichier d’annotation.
  3. Décompressez le fichier téléchargé dans le dossier actuel, ouvrez le fichier décompressé, puis copiez-le et collez-le dans un fichier texte nommé ann.txt.

3. Conversion de l’ID de la cible du médicament

  1. Mettez tous les fichiers cibles de médicaments allTargets.txt obtenus dans la section 1 et le fichier d’annotation UniProt ann.txt obtenu dans la section 2 dans un dossier et mettez-y les scripts Perl (Supplementary Coding File 2).
  2. Ouvrez CMD, tapez cd + espace + chemin d’accès au dossier, entrez-le et exécutez le script Perl pour obtenir un nouveau fichier texte (allTargets.symbol.txt). Ce nouveau fichier texte (allTargets.symbol.txt) contient le nom de la plante médicinale, l’ID de l’ingrédient, le nom de l’ingrédient et l’ID du gène.

4. Recherche dans la base de données

  1. GeneCards : base de données de gènes humains (GeneCards)
    REMARQUE : La base de données GeneCards (https://www.genecards.org/) fournit des informations de prédiction et d’annotation pour les gènes humains. Il est utilisé pour accéder aux cibles de la maladie19,20.
    1. Rendez-vous sur l’interface web de GeneCards. Tapez ostéoporose dans la boîte de recherche et cliquez sur Rechercher.
    2. Cliquez sur Exporter et sélectionnez Exporter vers Excel.
    3. Ouvrez le fichier téléchargé, copiez les gènes avec un score de pertinence ≥ 1, collez-les et enregistrez-les dans un fichier nommé GeneCards.txt.
  2. Base de données OMIM
    REMARQUE : La base de données OMIM (https://omim.org) contient des gènes, des maladies génétiques et des traitshumains 21.
    1. Rendez-vous sur l’interface web d’OMIM. Cliquez sur GENE Map, tapez osteoporose dans le champ de recherche, puis cliquez sur Rechercher.
    2. Cliquez sur Télécharger en tant que et sélectionnez Fichier Excel.
    3. Ouvrez le fichier téléchargé, copiez le nom du gène dans la colonne Symbole approuvé, collez-le et enregistrez-le dans un fichier nommé OMIM.txt.
  3. Base de données PharmGkb
    REMARQUE : PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), la base de connaissances en pharmacogénomique, contient des annotations sur les étiquettes des médicaments, des voies centrées sur les médicaments, des résumés pharmacogénétiques et des relations entre les gènes, les médicaments et les maladies22.
    1. Rendez-vous sur l’interface du site PharmGkb. Entrez ostéoporose dans le champ de recherche, cliquez sur Rechercher, puis cochez Gène dans la barre latérale gauche.
    2. Entrez tous les résultats manuellement et enregistrez-les dans un fichier appelé PharmGkb.txt.
  4. TTD : Base de données de cibles thérapeutiques (TTD)
    REMARQUE : La base de données TTD (https://idrblab.org/ttd/) fournit des informations sur les cibles de protéines et d’acides nucléiques, les maladies ciblées, les voies et les médicaments correspondants pour chaque cible23.
    1. Rendez-vous sur l’interface web de TTD. Tapez ostéoporose dans la boîte de recherche et cliquez sur Rechercher.
    2. Cliquez sur Informations sur la cible sous ID de la cible dans le résultat, copiez le nom de la cible, collez-le et enregistrez-le dans un fichier nommé TTD.txt. Au total, 33 résultats ont été obtenus. Enregistrez chaque résultat de la même manière.
  5. Base de données DrugBank Online (DrugBank)
    REMARQUE : La base de données DrugBank (https://go.drugbank.com) contient des informations sur les médicaments et les cibles médicamenteuses, les interactions médicamenteuses, les mécanismes médicamenteux et le métabolisme des médicaments24.
    1. Rendez-vous sur l’interface du site DrugBank. Sélectionnez Indications dans l’onglet de recherche, tapez ostéoporose dans la zone de recherche, puis cliquez sur Rechercher.
    2. Cliquez sur l’entrée Ostéoporose dans les résultats pour plus d’informations, cliquez sur l’onglet MÉDICAMENTS ET CIBLES , et cliquez sur le lien approprié dans la colonne CIBLE du tableau.
    3. Cliquez sur Détails dans Protéine, copiez le nom du gène, collez-le et enregistrez-le dans un fichier nommé DrugBank.txt. Enregistrez chaque résultat de la même manière.

5. Diagramme de Venn

  1. Fusion de gènes associés à la maladie et cartographie de Venn
    1. Mettez les fichiers txt enregistrés ainsi que le script dans le même dossier.
    2. Ouvrez le code R (Fusionner les gènes liés à la maladie), copiez et collez le chemin où le fichier txt ci-dessus est stocké dans la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
    3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code R modifié et enregistrez. Définissez le gène, nommez le fichier Disease.txt.
    4. Ouvrez le site Web Draw Venn Diagram ; dans la section de saisie, copiez et collez un par un le contenu textuel enregistré dans les sections 4 à 8 dans la liste, en le nommant avec la base de données correspondante et en cliquant sur Soumettre.
    5. Cliquez sur Enregistrer l’image au format PNG sous l’image et enregistrez le résultat du texte dans le même dossier.
  2. Intersection de cibles médicamenteuses et de gènes associés à la maladie
    1. Placez le fichier allTargets.symbol.txt obtenu au chapitre 3 et le fichier Disease.txt obtenu à l’étape 5.1.3 dans le même dossier.
    2. Ouvrez le code R (cible du médicament et intersection de la prise de gène liée à la maladie), copiez et collez le chemin où le fichier txt ci-dessus est stocké sur la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
    3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code R modifié et enregistrez. Définissez le gène, nommez le fichier Drug_Disease.txt.
    4. Ouvrez le site Web Draw Venn Diagram. Dans la section de saisie, copiez et collez allTargets.symbol.txt et Disease.txt dans la liste et nommez-les d’après leurs fichiers respectifs.
    5. Cliquez sur Enregistrer l’image au format PNG sous l’image et enregistrez les résultats du texte dans le même dossier.

6. Construction du réseau réglementaire du compoundage TCM

  1. Placez le fichier allTargets.symbol.txt obtenu au chapitre 3 dans le même dossier que le fichier Disease.txt et le script Perl correspondant (Supplementary Coding File 3).
  2. Ouvrez CMD, tapez le chemin du fichier cd, appuyez sur Entrée et exécutez le script Perl. Obtenez quatre nouveaux fichiers txt : net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt et net.type.txt. Le fichier network.txt contient l’ID de l’ingrédient TCM, le gène cible, la relation cible et le nom de l’ingrédient. net.type.txt contient le nom du nœud, les attributs et l’affiliation. net.geneLists.txt est la liste des gènes, et net.molLists.txt est la liste des ingrédients.
  3. Copiez les fichiers texte nouvellement obtenus dans le même nouveau dossier.
  4. Ouvrez le logiciel Cytoscape 3.9.1, cliquez sur Fichier, cliquez sur Importer, puis sélectionnez Fichier de formulaire réseau. Sélectionnez net.network.txt, placez la première colonne de l’ID du composant en tant que nœud source, la deuxième colonne des gènes en tant que nœud cible et la troisième colonne de la relation de ciblage en tant que type d’interaction, puis cliquez sur OK.
  5. Importez net.type.txt à partir de la fenêtre Table des nœuds. Cliquez sur l’onglet Sélectionner, sélectionnez Noeuds, À partir du fichier de liste d’ID, sélectionnez net.geneLists.txt, puis cliquez sur Ouvrir.
  6. Cliquez sur l’onglet Disposition, sélectionnez Disposition de cercle trié par degrés, puis sélectionnez Nœuds sélectionnés uniquement. Ajustez la hauteur et la largeur des nœuds à 70.
  7. Cliquez sur la deuxième zone dans Hauteur, sélectionnez degree.layout dans Colonne, sélectionnez Mappage continu dans Type de mappage, puis double-cliquez sur la fenêtre de réglage de la hauteur sur le côté droit de Mappage actuel pour ajuster les limites supérieure et inférieure de la hauteur à une plage appropriée.
  8. Répétez l’opération avec l’option Largeur.
  9. Cliquez à nouveau sur l’onglet Disposition , puis sur Outils de mise en page > Ajuster l’échelle afin que les nœuds ne se chevauchent pas.
  10. Cliquez sur la fenêtre supérieure droite du logiciel pour désactiver le réseau de nœuds, cliquez sur l’onglet Sélectionner , sélectionnez Nœuds, sélectionnez À partir du fichier de liste d’ID, sélectionnez net.molLists.txt, puis cliquez sur Ouvrir.
  11. Cliquez sur l’onglet Disposition, sélectionnez Disposition des attributs de groupe, sélectionnez Nœuds sélectionnés uniquement, puis cliquez sur Type.
  12. Cliquez sur Taille de police de l’étiquette dans la colonne de gauche et définissez Valeur par défaut sur 12. Cliquez sur Valeur par défaut dans l’image/le graphique 1 dans la colonne de gauche.
  13. Sélectionnez Graphiques dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Graphique à secteurs, puis sélectionnez les éléments dans la colonne Colonnes disponibles, à l’exception du degré. Layout dans la colonne des colonnes sélectionnées et cliquez sur Appliquer.
  14. Cliquez sur Border Paint dans la colonne de gauche et définissez la valeur par défaut sur #003EF8. Cliquez sur l’onglet Bord en bas de la barre latérale gauche et définissez Largeur sur 0,8.
  15. Cliquez sur Fichier dans la barre d’outils supérieure, sélectionnez Exporter, puis Réseau vers image.
  16. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le format PNG pour Format, sélectionnez le répertoire de sauvegarde et nommez le réseau d’images, ajustez le zoom avant sur la taille de l’image à 500 % maximum, sélectionnez Arrière-plan transparent et cliquez sur OK pour terminer l’enregistrement de l’image.

7. Constructions des réseaux d’interaction protéine-protéine (IPP)

  1. Ouvrez le site Web STRING (https://string-db.org/), cliquez sur Protéines multiples, cliquez sur Parcourir dans Télécharger un fichier, sélectionnez le fichier Drug_Disease.txt obtenu à l’étape 5.2.3 et sélectionnez Homo sapiens dans Organismes. Cliquez sur Rechercher , puis sur Continuer.
  2. Cliquez sur Paramètres, définissez le score d’interaction minimum requis sur le niveau de confiance le plus élevé (0,900) et cochez Masquer les nœuds déconnectés dans le réseau dans les options d’affichage du réseau. Cliquez sur Mettre à jour.
  3. Ajustez les nœuds dans le diagramme de réseau afin qu’il n’y ait pas de chevauchement ou d’occlusion.
  4. Cliquez sur Exportations (Exports), puis sur Download (Télécharger) en tant que bitmap haute résolution pour obtenir la carte du réseau d’interfonctionnement des protéines au format PNG. Téléchargez également le fichier TSV sous forme de court texte tabulaire. Enregistrez les deux fichiers dans un dossier unifié. Le fichier TSV contient le nom du gène, l’ID interne STRING et les scores de différents attributs.

8. Construction du cœur du réseau PPI

  1. Placez le fichier TSV obtenu dans la section 7 et les scripts Perl requis dans un nouveau dossier.
  2. Ouvrez le logiciel Cytoscape 3.9.1, cliquez sur Fichier, sélectionnez Importer, cliquez sur Réseau à partir du fichier, sélectionnez le fichier TSV ci-dessus, placez le premier nœud de colonne1 comme Nœud source et le deuxième nœud de colonne 2 comme Nœud cible, puis cliquez sur OK.
  3. Cliquez sur Style dans la barre latérale gauche, cliquez sur Valeur par défaut en largeur et définissez-la sur 60. Faites glisser et déposez les nœuds afin qu’il n’y ait pas de chevauchement ni d’occlusion dans le réseau.
  4. Cliquez sur APP dans la barre d’outils supérieure, sur CytoNCA, puis sur Ouvrir.
  5. Dans la colonne de gauche, sélectionnez Sans pondération sous Intermédiarité, Proximité, Degré, Vecteur propre, Méthode basée sur la connectivité moyenne locale et Réseau, puis cliquez sur Analyser.
  6. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur Table des nœuds dans la fenêtre en bas à droite, cliquez sur Exporter, enregistrez-la dans le dossier et nommez-la score 1.
    REMARQUE : Le plug-in CytoNCA doit être installé dans le logiciel Cytoscape. Pour ce faire, cliquez sur Applications dans la barre d’outils supérieure, cliquez sur APP Manager, entrez CytoNCA dans la zone de recherche, cochez CytoNCA dans la colonne du milieu des résultats renvoyés, puis cliquez sur Installer.
  7. Ouvrez score1, ajustez la colonne du nom à la première colonne, copiez les informations dans le tableau, collez-les dans un nouveau fichier texte, nommez-le score1.txt et enregistrez-le.
  8. Ouvrez le code R et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier score1.txt sur la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
  9. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code modifié pour obtenir deux nouveaux fichiers, score2.txt et score2.gene.txt. Le fichier score2.txt contient les gènes pour lesquels tous les scores du programme étaient supérieurs à la médiane et les scores spécifiques pour chaque programme. score2.gene.txt contient les gènes qui ont obtenu un score supérieur à la médiane pour tous les éléments.
  10. Pour continuer dans Cytoscape, cliquez sur AnalysisPanel 1 dans la fenêtre inférieure droite, cliquez sur Télécharger à partir d’un fichier sur le côté gauche de la fenêtre, sélectionnez le score2.gene.txt, cliquez sur Ouvrir et appuyez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
  11. Cliquez sur Sélectionner des nœuds en bas et cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
  12. Cliquez sur Fichier dans la barre d’outils supérieure, sélectionnez Exporter, cliquez sur Réseau vers l’image, ajustez le zoom (%) de la taille de l’image au maximum 500 %, cochez Arrière-plan transparent et enregistrez le fichier dans le même dossier, nommez-le network1.
  13. Cliquez sur Créer un sous-réseau dans la barre latérale droite de la fenêtre inférieure pour créer un sous-réseau, analyser le sous-réseau, cliquer sur APP dans la barre d’outils en haut, cliquer sur CytoNCA et cliquer sur Ouvrir.
  14. Dans la barre latérale gauche, sélectionnez Sans poids sous Intermédiarité, Proximité, Degré, Vecteur propre, Méthode basée sur la connectivité moyenne locale et Réseau, puis cliquez sur Analyser.
  15. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur Table de nœuds dans la fenêtre inférieure droite, cliquez sur Exporter et enregistrez-la dans un nouveau dossier nommé score2.
  16. Ouvrez score2, ajustez la colonne de nom à la première colonne, copiez les informations dans le tableau, collez-les dans un nouveau fichier texte, nommez-le score2.txt et enregistrez-le.
  17. Ouvrez le code R et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier score2.txt sur la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
  18. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code modifié pour obtenir deux nouveaux fichiers : score3.txt et score3.gene.txt. Le fichier score3.txt contient les gènes qui ont obtenu un score supérieur à la médiane pour tous les éléments et les scores spécifiques pour chaque élément. score3.gene.txt contient les gènes qui ont obtenu un score supérieur à la médiane pour tous les éléments.
  19. Pour continuer dans Cytoscape, cliquez sur AnalysisPanel 1 dans la fenêtre inférieure droite, cliquez sur Télécharger à partir d’un fichier sur le côté gauche de la fenêtre, sélectionnez le score3.gene.txt, cliquez sur Ouvrir et appuyez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
  20. Cliquez sur Sélectionner des nœuds en bas et cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
  21. Cliquez sur Fichier dans la barre d’outils supérieure, sélectionnez Exporter, cliquez sur Réseau vers l’image, ajustez le zoom (%) de la taille de l’image à 500 %, cochez Arrière-plan transparent et enregistrez le fichier dans le même dossier que celui utilisé dans cette étape, en le nommant network2.
  22. Cliquez sur Créer un sous-réseau dans la barre latérale droite de la fenêtre ci-dessous pour créer un sous-réseau.
  23. Cliquez sur Fichier dans la barre d’outils en haut, sélectionnez Exporter, cliquez sur Réseau vers l’image, ajustez le zoom (%) de la taille de l’image au maximum de 500 %, cochez Arrière-plan transparent et enregistrez le fichier dans le même dossier que celui utilisé dans cette étape et nommez-le network3.

9. Conversion de l’ID génétique

  1. Placez le fichier Drug_Disease.txt dans le même nouveau dossier que le fichier de code requis.
  2. Ouvrez le code R (Supplementary Coding File 4) et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier Drug_Disease.txt sur la ligne où se trouve le setwd dans le code R.
  3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code modifié à l’aide de l’organisation. Hs.eg.db paquet pour convertir l’ID du gène et l’exécuter après la fin d’un nouveau fichier id.txt. Le id.txt contient le symbole du gène et l’ID correspondant.

10. Analyse de l’enrichissement GO

  1. Placez le fichier id.txt de l’étape précédente dans le même dossier que le code d’analyse d’enrichissement GO.
  2. Ouvrez le code R (Supplementary Coding File 5) et définissez le répertoire de travail sur id.txt et le chemin d’accès où le code GO est stocké.
  3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code modifié et utilisez clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichissez le graphique, le graphique ggplot2, les histogrammes d’analyse d’enrichissement GO et les graphiques à bulles. Une fois l’exécution terminée, obtenez trois nouveaux fichiers, GO.txt, barplot.pdf et bubble.pdf.
    REMARQUE : Le GO.txt est le fichier de résultats d’enrichissement contenant la classification d’enrichissement (BP, CC, MF), L’ID GO, le nom GO, la proportion de gènes, la proportion de fond, la valeur p significative de l’enrichissement, la valeur p corrigée (p.adjust, value), l’ID du gène (nom) et le nombre de gènes enrichis sur chaque GO. barplot.pdf est l’histogramme, bulle. PDF est un graphique à bulles.

11. Analyse de l’enrichissement de KEGG

  1. Placez le fichier id.txt dans le même dossier que le code d’analyse d’enrichissement KEGG.
  2. Ouvrez le code R (Supplementary Coding File 6) et définissez le répertoire de travail sur le chemin d’accès où id.txt et le code KEGG sont stockés.
  3. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code modifié et utilisez clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, ggplot2 pour tracer des histogrammes d’analyse d’enrichissement GO, des diagrammes à bulles et des tracés de chemin. La série se termine par la production de trois nouveaux fichiers, KEGG.txt, barplot.pdf et bubble.pdf.
    REMARQUE : Le fichier KEGG.txt est un fichier de résultats d’enrichissement contenant l’ID de la voie, la description de la voie, la proportion de gènes, la proportion de gènes, la proportion de fond, la valeur p de signification de l’enrichissement, la valeur p corrigée (p.adjust, qvalue), l’ID de gène (nom) et le nombre de gènes enrichis dans chaque voie. barplot.pdf est un graphique à barres et bubble.pdf est un graphique à bulles.
  4. Rechercher IL-17 dans le dossier KEGG.txt ; Le résultat montre qu’il n’y a qu’une seule voie ; copiez l’ID du chemin.
  5. Ouvrez le code R, collez l’ID de chemin IL-17 sur KEGGID et utilisez le package pathview pour étiqueter la carte du chemin. Exécutez le code R modifié et obtenez deux nouveaux fichiers, hsa04657.pathview.png et hsa04657.png.
    REMARQUE : Le fichier hsa04657.png est la carte du chemin, hsa04657.pathview.png est la carte du chemin étiqueté, et ceux étiquetés en rouge sont les gènes présents dans le réseau d’interactions.

12. Préparation des pilules Xiaoyao

REMARQUE : Pour la méthode de préparation utilisée, reportez-vous à la Pharmacopée Chinoise5.

  1. Prenez 100 g de Chai Hu, 100 g d’Angelica sinensis, 100 g de Paeonia lactiflora blanc, 100 g d’Atractylodes macrocephala sauté, 100 g de Poria cocos, 80 g de Radix glycyrrhizae preparate et 20 g de Menthae herba.
  2. À l’aide d’un moulin à pierre ou d’une machine à poudrer, écrasez les herbes en une poudre fine ; Plusieurs herbes sont combinées dans les proportions ci-dessus et pulvérisées en une poudre fine pour se mélanger naturellement. Utilisez un tamis à drogue de 80 mailles d’un diamètre intérieur de 180 μm ± 7,6 μm et tamisez la poudre pulvérisée. Mélanger.
  3. Prenez 100 g de gingembre, ajoutez de l’eau et faites-le bouillir 2 fois pendant 20 minutes à chaque fois. Filtrer et réserver.
  4. Prenez une plaque médicinale, trempez un petit balai dans de l’eau de gingembre, badigeonnez-le sur la plaque, prenez la poudre ci-dessus, saupoudrez-la sur l’eau de gingembre et retournez la plaque de sorte que toute la poudre soit humide et qu’elle puisse être moulée en forme de boule.
    REMARQUE : La formation de la plaque médicinale est une étape essentielle lors de la préparation des pilules de MTC. La plupart du bambou moso sera divisé en bandes et tissé en un squelette. La peau de bambou, ou tengpi, est tissée dans la surface et s’arrondit. La surface de la plaque doit être recouverte d’huile d’abrasin mince, puis brossée d’une couche de vernis. Celui-ci est séché pour devenir étanche. Les pilules fabriquées de cette manière seront rondes et lisses.
  5. Badigeonnez à nouveau l’eau de gingembre, saupoudrez la poudre et tournez la plaque de sorte que le médicament s’arrondisse et s’agrandit progressivement. Placer dans un endroit frais pour le séchage.

13. Etablissement du modèle animal

  1. Après 7 jours d’acclimatation, divisez au hasard les souris expérimentales en 4 groupes, à savoir, le groupe d’opération simulée (Sham, où seule la graisse autour des ovaires a été retirée) et trois groupes de souris ovariectomisées composées d’un groupe modèle (OVX) ainsi que des groupes d’administration de pilules Xiaoyao à faible et haute concentration.
  2. Anesthésier les souris avec du pentobarbital sodique à 3 % (40 mg/kg) injecté par voie intrapéritonéale. Vérifiez que les souris entrent dans l’état d’anesthésie en observant une relaxation musculaire généralisée, une respiration profonde et lente et un mouvement ralenti. Appliquez une pommade oculaire sur les yeux des souris avant la chirurgie.
  3. Placez les animaux en position couchée et rasez la région rénale du dos avec un rasoir pour animaux. Effectuer une désinfection locale avec de l’éthanol à 75 %.
  4. Faites une incision longitudinale d’environ 1 cm bilatéralement, près de la région dorsale du rein, et incisez le fascia pour séparer les muscles et le péritoine.
  5. Localisez la partie supérieure de la corne utérine et les trompes de Fallope pour la ligature. Insérez une pince dans l’incision pour l’exploration et localisez l’ovaire, enveloppé de tissu adipeux dans un motif de chou-fleur rouge vif, avec des trompes de Fallope disposées en spirale sous l’ovaire, reliant l’ovaire à la corne utérine25. Retirez les ovaires avec des ciseaux chirurgicaux et des sutures.
  6. Prélever une petite quantité de tissu adipeux près de l’ovaire comme témoin dans le groupe d’opération simulée. Observez les animaux jusqu’à ce qu’ils reprennent conscience. Placez les animaux postopératoires dans des cages séparées jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement.
  7. Pour prévenir l’infection, fournissez de la gentamicine aux souris pendant 3 jours postopératoires. Après l’opération, assurez-vous d’une alimentation normale et d’un bon environnement de croissance en fonction de l’état réel des souris. S’il y a des anomalies, telles qu’une infection de la plaie ou une perte d’appétit, consultez immédiatement l’instructeur du Centre des animaux de laboratoire.

14. Administration des médicaments

REMARQUE : Selon la méthodologie expérimentale de pharmacologie26, la conversion des doses humaines et animales utilisées était de 9 g de pilules Xiaoyao pour un adulte de 70 kg, ce qui équivaut à une dose (dose pour une seule administration).

  1. Pour les groupes à faible dose et à dose élevée, utiliser 0,683 g/kg et 2,73 g/kg, respectivement, pour un groupe de 8 animaux. Utilisez la main gauche pour immobiliser la souris de sorte que la bouche de la souris soit en ligne droite avec l’œsophage. En tenant l’aiguille de gavage dans la main droite, insérez-la doucement dans l’œsophage le long de la paroi postérieure du pharynx à partir du coin de la bouche de la souris.
  2. À ce stade, la direction de l’aiguille du gavage peut être légèrement modifiée pour stimuler une action de déglutition induite. Injectez le médicament. Effectuez cette opération une fois par jour pendant 12 semaines.
  3. Pour les groupes simulés et modèles, administrer une solution saline une fois par jour pendant 12 semaines en une quantité déterminée par le poids de l’animal.
  4. Euthanasier les souris par luxation cervicale et couper leurs membres postérieurs. Écorchez les membres pour séparer le muscle du fémur. Traitez les fémurs de souris avec une solution de décalcification EDTA pendant 1 mois et remplacez-les quotidiennement par une solution fraîche.

15. Coloration à l’hématoxyline-éosine (HE)

  1. Décirer les tissus fémoraux pendant 8 min, puis les placer dans de l’éthanol dégradé pendant 3 min ; Rincer à l’eau courante pendant 1 min.
  2. Ajouter la solution de coloration à l’hématoxyline goutte à goutte sur les sections pour couvrir complètement le tissu, colorer pendant 5 min et laver à l’eau du robinet
  3. Ajoutez la solution de différenciation de l’acide chlorhydrique au tissu sur la lame, en vous assurant qu’elle recouvre complètement le tissu. Arrêt lorsque la décoloration du tissu est observée. Rincer à l’eau du robinet.
  4. Ajouter la solution de colorant Eosin goutte à goutte et laisser couvrir complètement le tissu, en agissant pendant 30 s à 2 min. Rincez l’excédent de colorant à l’eau courante.
  5. Effectuez une déshydratation à l’éthanol en gradient avec de l’éthanol anhydre à 75 % pendant 5 min, suivie d’un éthanol anhydre pendant 5 min, et éclaircissez à l’aide d’une solution de déparaffinage pendant 3 min.
  6. Déposez une quantité appropriée de gomme neutre sur la lame en fonction de la taille du tissu, et abaissez soigneusement la lamelle, en évitant les bulles d’air.

16. Analyse micro-CT et immunohistochimie

  1. Retirez les muscles et les ligaments en excès autour du fémur de différents groupes de souris et fixez les tissus de l’échantillon dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h.
  2. Séchez les tissus osseux à l’air libre et effectuez une micro-TDM par balayage des tissus osseux afin d’obtenir des données micro-CT tridimensionnelles.
  3. À partir des blocs de cire de souris conservés, coupez-les en sections continues de 6 μm d’épaisseur et faites cuire les tranches à 70 °C -72 °C pendant 30 à 60 min.
  4. Déparaffinage pendant 8 min, suivi d’un traitement à l’éthanol anhydre à 75 % pendant 5 min, à l’éthanol anhydre pendant 5 min et au rinçage PBS pendant 5 min pendant 3 fois.
  5. Effectuez une réparation à haute pression EDTA pendant 15 minutes, suivie d’un lavage PBS pendant 5 minutes pendant 3 fois.
  6. Ajoutez 3 % de peroxyde d’hydrogène goutte à goutte sur le tissu, incubez à température ambiante pendant 10 minutes et lavez avec du PBS pendant 5 minutes pendant 3 fois.
  7. Utilisez un stylo d’immunohistochimie pour dessiner un cercle. Laver avec PBS wash pendant 3 min pour 3x.
  8. Colorer l’anticorps primaire (anticorps anti-ALP chez le lapin (1:200), anticorps anti-COL-1 chez le lapin (1:200), anticorps anti-IL-17 chez le lapin (1:275), anti-Act1 (1:500), anticorps anti-IL-6 chez le lapin (1:500)) pendant la nuit, suivi d’un rinçage du tampon PBS pendant 5 minutes pendant 3 fois.
  9. Ajouter l’anticorps secondaire (Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L ; 1:2000) conjugué à HRP et incuber à température ambiante pendant 60 min. Laver avec un tampon PBS pendant 3 min pour 3x.
  10. Incuber dans du DAB prêt à l’emploi pendant 3 à 5 min, puis rincer au PBS.
  11. Effectuez une nouvelle coloration à l’hématoxyline pendant 3 min, suivie d’un rinçage PBS.
  12. Utilisez la solution de différenciation pendant environ 10 secondes, suivie d’un rinçage PBS.
  13. Ajouter la solution bleue de retour pendant 10 s, suivie d’un rinçage PBS.
  14. Effectuer un traitement à l’éthanol anhydre à 75 % pendant 5 min, à l’éthanol anhydre pendant 5 min et à l’éthanol clair pendant 3 min. Utilisez de la résine neutre pour sceller les diapositives.

Résultats

Principes actifs et cibles d’action des pilules Xiaoyao
En effectuant une recherche dans la base de données TCMSP et en effectuant un dépistage selon les critères de biodisponibilité orale (OB) ≥ 30 % et de propriétés similaires au médicament (DL) ≥ 0,18, 125 ingrédients actifs ont été trouvés dans les pilules Xiaoyao. Parmi eux, les ingrédients 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 et 2 provenaient respectivement de Paeonia lactiflora blanc, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, réglisse et gingembre. Certaines des matières actives sont présentées dans le tableau 1. De plus, un total de 879 cibles de matières actives efficaces ont été obtenues à partir de la base de données TCMSP, et 232 cibles sont restées après la conversion de l’ID et la suppression des valeurs en double.

Analyse en réseau de la MTC - Ingrédient actif - Cible croisée - Maladie
Plusieurs bases de données ont été consultées à l’aide du mot-clé ostéoporose pour les gènes associés à la maladie. Dans la base de données GeneCards, 1692 gènes ont été obtenus après filtrage selon le score de pertinence ≥1. Au total, 35 gènes ont été obtenus dans la base de données OMIM. Il y avait respectivement 3, 33 et 386 gènes dans les bases de données PharmGkb, TTD et DrugBank. Par la suite, l’intersection des résultats de ces cinq bases de données a été utilisée pour une analyse plus approfondie (figure 1A). L’un des gènes représentés dans quatre bases de données était CALCR. Au total, 102 gènes qui se croisent ont été obtenus après avoir combiné les gènes liés à la maladie et pris l’intersection avec la cible médicamenteuse (Figure 1B). Sur la base des interactions entre les cibles de la maladie et les ingrédients actifs du médicament, un réseau de maladies cibles intersection entre les ingrédients actifs de la MTC et les ingrédients actifs a été construit à l’aide du logiciel Cytoscape. En conséquence, des relations entre les composants du médicament et la régulation polymorphe des scintigraphies de gènes liés à la maladie ont été obtenues (Figure 2A).

Dans la base de données String, les interactions protéiques ont été analysées à l’intersection des gènes de la maladie et des cibles médicamenteuses pour obtenir leurs diagrammes de réseau d’interaction (Figure 2B), puis celles-ci ont été criblées pour les protéines les plus centrales (Figure 2C-D). Les résultats ont montré les interactions les plus fortes entre FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1 et STAT3 parmi les gènes de la maladie et les cibles médicamenteuses (Figure 2E).

Analyse de la fonction GO et de l’enrichissement de la voie KEGG
L’analyse d’enrichissement du GO a montré un total de 2177 entrées, y compris 1990 entrées de processus biologique (BP), 58 entrées de composants cellulaires (CC) et 129 entrées de fonctions moléculaires (MF). Dans la BP, les gènes étaient principalement axés sur la réponse aux niveaux de nutriments, la réponse au stress oxydatif et la réponse cellulaire au stress oxydatif. La MF s’est concentrée sur la liaison du facteur de transcription de liaison à l’ADN, la liaison du facteur de transcription de liaison à l’ADN spécifique de l’ARN polymérase II, l’activité des récepteurs nucléaires, l’activité du facteur de transcription activé par le ligand et l’activité des cytokines (Figure 3A-B).

Dans l’analyse d’enrichissement de la voie KEGG, un total de 168 voies de signalisation connexes ont été obtenues, et les plus significatives étaient la voie de signalisation AGE-RAGE, la voie de signalisation IL-17, la voie de signalisation TNF, la voie de signalisation HIF-1 et la différenciation des cellules Th17 (Figure 3C-D). Il est suggéré que les pilules Xiaoyao peuvent exercer des effets thérapeutiques sur le PMOM de plusieurs façons. L’inflammation est fortement associée à l’ostéoporose et peut être accélérée par la ménopause, et l’IL-17 estun facteur inflammatoire 7 important. Par conséquent, le prochain plan est d’explorer si les pilules Xiaoyao pourraient traiter l’ostéoporose d’un point de vue inflammatoire en ce qui concerne l’IL-17.

Changements structurels dans le tissu osseux avant et après l’ablation du tissu ovarien
La coloration HE a montré que chez les fémurs des souris Sham, les trabécules étaient étroitement disposées, avec une bonne continuité, de petits espaces entre les trabécules, des fractures rares et une taille normale de la cavité de la moelle osseuse. Par rapport au groupe Sham, les fémurs du groupe OVX étaient peu disposés, avec de graves fractures des trabécules, une continuité perturbée et une cavité de la moelle osseuse nettement élargie, montrant des changements ostéoporotiques typiques (Figure 4A).

Comparaison micro-CT entre les groupes
Les fémurs des souris du groupe OVX présentaient un réseau trabéculaire incomplet, une cavité médullaire partiellement vide et un amincissement du cortex osseux par rapport à ceux des souris du groupe Sham. Le groupe de souris Sham a montré une abondance de trabécules, une bonne continuité et un rétrécissement de la cavité médullaire dans leurs fémurs (Figure 4B).

Effets comportementaux des pilules Xiaoyao sur les souris
Au cours de la période d’étude, à l’exception du groupe OVX, toutes les souris des autres groupes avaient de meilleures habitudes de vie, une couleur de cheveux normale, une grande mobilité et une bonne santé. L’urine et les excréments de chaque souris sont revenus à la normale dans la semaine suivant le traitement avec les pilules Xiaoyao. Il n’y a pas eu de morsures, d’infections de plaies, d’obstruction gastro-intestinale, de détachement de suture, de nécrose cutanée de l’incision ou de mort chez les souris. Les souris du groupe OVX étaient sujettes à la perte de cheveux, à l’assombrissement de la couleur des cheveux, à une mobilité réduite, à des réflexes plus longs, à une excrétion accrue et à une diminution de l’alimentation et de la boisson.

Coloration HE de sections pathologiques de souris après intervention médicamenteuse
Dans le groupe Sham, le tissu fémoral était dense, réticulaire et régulièrement disposé. La taille et la continuité de la cavité médullaire étaient normales et l’espacement entre les trabécules osseuses adjacentes était relativement faible. Par rapport au groupe Sham, le cortex fémoral et l’os spongieux dans le groupe OVX ont montré des défauts évidents, une diminution des trabécules, une augmentation des lacunes, une continuité interrompue, un amincissement de la structure, un élargissement de la cavité médullaire et un amincissement du cortex osseux. Par rapport au groupe OVX, les trabécules fémorales des souris des groupes traités par le médicament (doses faibles et élevées) semblaient structurellement intactes, avec un espacement réduit, une connectivité accrue, des cavités de moelle osseuse rétrécies et des structures plus denses (Figure 5A).

Détection d’indices d’imagerie chez la souris après une intervention médicamenteuse
Par rapport au groupe Sham, les fémurs des souris du groupe OVX avaient des trabécules osseuses clairsemées et cassées et un cortex osseux aminci. Par rapport au groupe OVX, les souris du groupe des pilules Xiaoyao à forte dose présentaient moins de trabécules osseuses fracturées, une réticulation restaurée et un degré significatif de réduction partielle de la cavité de la moelle osseuse. Cependant, les souris traitées avec des pilules Xiaoyao à faible dose avaient toujours des trabécules osseuses fracturées, bien qu’il y ait eu une augmentation des trabécules osseuses et une réduction de la cavité de la moelle osseuse. La structure trabéculaire des trabécules osseuses du groupe opéré a montré plus de continuité et d’exhaustivité (Figure 5B).

Résultats immunohistochimiques des tissus dans les groupes après intervention médicamenteuse
Act1 et IL-6 sont des protéines clés de la voie de signalisation IL-17, et ALP et COL-1 sont des gènes ostéogéniques. L’expression des protéines ALP, COL-1, IL-6, IL-17 et Act1 conduit à la formation de granules bruns ou jaunes sur le tissu osseux. Les résultats de l’immunohistochimie ont montré que les valeurs moyennes de densité optique de l’ALP et de la COL-1 dans le groupe médicament étaient plus élevées que celles du groupe OVX après traitement avec les pilules Xiaoyao, et la différence était statistiquement significative (p < 0,05). Les valeurs moyennes de densité optique de l’IL-17, de l’Act1 et de l’IL-6 dans le groupe médicament étaient inférieures à celles du groupe OVX, et la différence était statistiquement significative (p < 0,05 ; Figure 6). Les pilules Xiaoyao ont inversé le déclin de l’ALP et du COL-1 causé par l’ovariectomie tout en diminuant l’expression de plusieurs protéines clés IL-17, IL-6 et Act1 dans la voie de signalisation IL-17, ce qui suggère que le médicament peut exercer ses effets thérapeutiques par cette voie.

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Figure 1 : Analyse en réseau de l’intersection des ingrédients actifs de la phytothérapie chinoise et des gènes liés à la maladie. (A) L’intersection de gènes liés à la maladie, obtenus à partir des bases de données GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD et DrugBank. Ceux-ci sont représentés par des couleurs bleues, rouges, vertes, jaunes et brunes avec 1692, 35, 3, 33 et 386 gènes, respectivement. L’intersection est les gènes associés à la maladie dans les cinq bases de données, et la partie qui se chevauche indique le nombre de gènes qui se croisent dans chaque base de données. (B) L’intersection des cibles médicamenteuses (la couleur bleue indiquant cet ensemble de données, c’est-à-dire l’ensemble des gènes cibles agissant sur les médicaments collectés dans la base de données TCMSP après la transformation de l’ID et l’élimination des doublons) et les gènes liés à la maladie (la couleur rouge indiquant cet ensemble de données, qui contient tous les gènes des cinq bases de données mentionnées ci-dessus) sont représentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Interaction des ingrédients actifs de la MTC avec les réseaux de régulation des gènes liés à la maladie et les protéines centrales. (A) Le réseau régulateur des ingrédients actifs et des gènes liés à la maladie dans la MTC montre les relations de régulation des gènes correspondant à chaque ingrédient actif des pilules Xiaoyao, chaque ingrédient étant lié au gène qu’il régule. (B) Les résultats de l’analyse de l’interaction protéine-protéine des gènes qui se croisent dans STRING (les nœuds du réseau représentent les protéines, les bords représentent les associations protéine-protéine, et les liaisons multiples indiquent des interactions multiples entre deux protéines). (C-E) Les interactions protéiques obtenues par String ont été criblées à plusieurs reprises. (C) Le réseau d’interaction protéique a été obtenu après le premier criblage, et la partie mise en évidence est sa partie centrale. (D) Le résultat du deuxième criblage et de la partie mise en évidence est la partie centrale. (E) Le réseau d’interaction protéique le plus central dans le réseau d’interaction protéique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Analyse de l’enrichissement de GO et KEGG. (A-B) Les résultats de l’analyse de l’enrichissement GO des gènes qui se croisent sont divisés en 3 entrées, Processus biologique (BP), Composante cellulaire (CC) et Fonction moléculaire (MF), et chaque entrée ne montre que les 10 gènes les plus significativement enrichis. (C-D) Les résultats de l’analyse d’enrichissement KEGG des gènes qui se croisent (montrant les 30 premiers gènes les plus significativement enrichis). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Etablissement et évaluation du modèle de souris ovariectomisées. (A) Comparaison de la morphologie osseuse métaphysaire entre les groupes opérés par placebo et les groupes ovariectomisés (10x). Dans le groupe OVX, les fractures trabéculaires étaient graves, la continuité était perturbée et la cavité de la moelle osseuse était considérablement élargie, tandis que dans le groupe placebo, les fractures trabéculaires étaient rares et la cavité de la moelle osseuse était de taille normale. (B) Micro-tomodensitométrie du fémur dans les groupes opérés et ovariectomisés. Dans le groupe OVX, le réseau trabéculaire était incomplet et la cavité de la moelle osseuse était partiellement vide. Dans le groupe Sham, les trabécules étaient abondantes et continues, et la cavité de la moelle osseuse était étroite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Dosage de l’HE et de la micro-TDM après traitement avec les pilules Xiaoyao. (A) Coloration HE (10x) des sections de fémur des souris dans chaque groupe après le traitement des pilules Xiaoyao. Dans le groupe OVX, les trabécules osseuses ont été réduites, la continuité a été interrompue, la structure était clairsemée et la cavité médullaire a été élargie. Dans le groupe Sham, les trabécules osseuses avaient une bonne continuité, le tissu fémoral était structurellement dense et la cavité médullaire était normale. Par rapport au groupe OVX, les trabécules osseuses du groupe médicament semblaient structurellement intactes, avec une connectivité accrue, une cavité médullaire réduite et une structure plus dense que dans le groupe modèle. (B) Comparaison de la micro-TDM des fémurs de souris dans chaque groupe après le traitement par pilules Xiaoyao. Les trabécules osseuses des fémurs des souris du groupe ovariectomisé étaient clairsemées et brisées, tandis que le groupe Sham avait des trabécules plus continues et intactes. Par rapport au groupe ovariectomisé, les souris du groupe traité par médicament à forte dose avaient moins de trabécules osseuses cassées, restauré la structure réticulaire et une cavité de la moelle osseuse partiellement réduite, tandis que les animaux du groupe de médicament à faible dose avaient plus de trabécules osseuses et une cavité de moelle osseuse réduite, mais les trabécules osseuses cassées sont restées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Immunohistochimie pour détecter l’effet des pilules Xiaoyao sur la voie de signalisation de l’IL-17 et l’expression de la protéine du gène marqueur ostéogénique chez la souris ostéoporotique (40x). Des réactions positives à la présence des protéines ALP, COL-1, IL-6 ainsi que IL-17 et Act1 se sont manifestées par l’apparition de granules beige ou jaunes sur le tissu osseux. L’expression d’ALP et de COL-1 dans le groupe médicament était plus élevée que celle dans le groupe OVX (p < 0,05). L’expression de l’IL-17, de l’Act1 et de l’IL-6 dans le groupe médicament était plus faible que celle du groupe OVX (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom de la médecine traditionnelle chinoiseIdentification moléculaireNom de la molécule
Paeonia lactiflora blancMOL001918Paeoniflorgenone
Paeonia lactiflora blancMOL000211Mairin
Atractylodes macrocephalaMOL00002214-acétyl-12-sènecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-acétoxyatractylone
Menthae HerbaMOL000471aloès-émodine
Menthae HerbaMOL005190ériodictyol
Chai HuMOL000354isorhamnétine
Chai HuMOL013187Cubèbe
Angelica sinensisMOL000449Stigmastérol
Angelica sinensisMOL000358Bêta-sitostérol
Poria cocosMOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-ol
Poria cocosMOL000283Peroxyde d’ergostérol
RéglisseMOL002311Glycyrol
RéglisseMOL0049907,2',4'-trihydroxy-5-méthoxy-3-arylcoumarine
Gingembre fraisMOL0061296-méthylgingediacétate2
Gingembre fraisMOL001771poriferast-5-fr-3beta-ol

Tableau 1 : Ingrédients actifs dans certains médicaments chinois. La première colonne énumère les noms des médecines traditionnelles chinoises, la deuxième colonne est l’ID de l’ingrédient actif de la médecine chinoise et la troisième colonne est le nom de l’ingrédient actif de la médecine chinoise.

Fichier de codage supplémentaire 1 : Nom de l’herbe, ingrédient et code de fusion de l’ID cible. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 2 : Conversion de l’identifiant de la cible du médicament. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 3 : Fichiers pour l’analyse du réseau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 4 : Conversion du symbole en ID de gène. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 5 : Analyse de l’enrichissement GO. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 6 : Analyse de l’enrichissement de KEGG. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Selon les statistiques, l’ostéoporose est à l’origine de 1,5 million de fractures chaque année aux États-Unis, et la grande majorité d’entre elles surviennent chez les femmes ménopausées. Avec l’augmentation du vieillissement de la population, on prévoit que la majorité des fractures de la hanche dans le monde se produiront en Asie et que d’ici 2050, le nombre total de fractures de la hanche dans le monde atteindra 8,2 millions28. Le coût de la prévention des fractures est presque égal à celui de leur traitement, et l’utilisation de médicaments aura inévitablement des effets secondaires29. Par conséquent, il est urgent de trouver un moyen plus rentable de résoudre ce problème dans une société responsable.

Les pilules Xiaoyao se composent de huit ingrédients. Des études sur les effets de ses ingrédients sur l’ostéoporose sont en cours. Poria cocos inhibe l’ostéoclastogenèse et l’activité ostéolytique dans un modèle murin induit par l’ostéoporose ovariectomisé30. La combinaison de deux composants, la réglisse et le Shu-di-huang, peut exercer un effet antioxydant en inhibant la voie de signalisation NF-κB31. Le tonique traditionnel chinois, Danggui buxue tang, peut être utile dans le traitement de l’ostéoporose par sa capacité à inhiber le renouvellement osseux et à moduler la régulation de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) et ainsi prévenir la perte osseuse chez les rats ovariectomisés32. Tous ces résultats suggèrent que les pilules Xiaoyao peuvent avoir un effet thérapeutique sur l’ostéoporose. Les résultats de cette étude suggèrent également que les pilules Xiaoyao peuvent exercer un effet anti-ostéoporose en modulant l’activité de la voie de signalisation IL-17 de manière anti-inflammatoire.

Au total, 168 voies de signalisation pertinentes ont été obtenues à partir du réseau régulateur de cibles médicamenteuses et de gènes liés à l’ostéoporose construits dans cette étude, et cette étude a exploré davantage la voie de signalisation de l’IL-17. La famille IL-17 se compose de six membres, dont l’IL-17A-F, dont l’IL-17A a été le premier et le plus important à être découvert33. Dans les premières études, on pensait que l’IL-17 était associée à des maladies inflammatoires et auto-immunes chez l’homme. Plus tard, des études ont suggéré qu’il avait un rôle dans le maintien de l’intégrité de la barrière, et il s’est également avéré qu’il était associé au cancer15. Cependant, bien qu’il ne joue pas de rôle physiologique dans le remodelage osseux, il se comporte différemment lors d’affections osseuses anormales. De plus, l’IL-17 peut agir comme un activateur faible, et elle entre en synergie avec d’autres cytokines pour augmenter la production d’énergie. Ceci est démontré par sa co-activation avec TNFα15,34.

Des expériencesin vitro ont démontré que l’IL-17 peut induire la prolifération et la différenciation des CSM ostéoblastiques35, et qu’elle peut également inhiber la différenciation induite par BMP-2 des ostéoblastes primaires de rat36. L’IL-17 peut stimuler les ostéoblastes à exprimer RANKL, ce qui, à son tour, favorise l’ostéoclastogenèse, mais cet effet semble dépendre de la présence d’ostéoblastes37,38. Dans cette étude, les différentes concentrations des pilules Xiaoyao ont produit des effets thérapeutiques sur des souris modèles PMOM, en particulier lorsqu’elles étaient utilisées à des concentrations plus élevées. L’IL-17, l’Act1 et l’IL-6, qui sont corrélées avec la voie de signalisation de l’IL-17, ont été significativement diminuées chez ces souris par rapport aux témoins. Lorsque les résultats de l’analyse d’enrichissement ont été évalués, ceux-ci ont suggéré l’implication de la voie IL-17 lorsque les animaux ont été traités avec des pilules Xiaoyao.

Cette étude a également testé certains des marqueurs de conversion osseuse. L’ALP est une enzyme membranaire tétramérique qui peut être sécrétée par les ostéoblastes et joue un rôle important dans la formation et la minéralisation des os en dégradant l’inhibiteur de minéralisation, le pyrophosphate39. Environ 90% de la fraction organique de la matrice extracellulaire des tissus osseux est composée de COL-1, et lors de la minéralisation osseuse, le collagène joue un rôle clé dans ce processus40. Dans les résultats de cette étude, les niveaux d’expression des protéines ALP et COL-1, tels qu’observés par immunohistochimie des souris du groupe médicament, étaient plus élevés que ceux du groupe modèle, suggérant que l’effet des pilules Xiaoyao dans l’amélioration de l’ostéoporose pourrait être obtenu en augmentant les indicateurs des gènes ostéogéniques. Certains chercheurs ont démontré que l’expression et l’activité transcriptionnelle du récepteur des œstrogènes hépatocytaires (ERα) peuvent être régulées à la hausse par Xiaoyao san41. Il a été démontré que les extraits d’Angelica sinensis, de Paeonia lactiflora blanche et de réglisse dans le Xiaoyao san ont une activité semblable à celle des œstrogènes. Les mêmes ingrédients sont également présents dans les pilules Xiaoyao utilisées dans cette étude, qui sont fabriquées à partir de la prescription de Xiaoyao san par des méthodes modernes de préparation. Par conséquent, on peut supposer que les pilules Xiaoyao peuvent également augmenter l’expression des gènes ostéogéniques tels que ALP et COL-1 en exerçant des effets similaires à ceux des œstrogènes sur les ostéoblastes pour augmenter leur activité et améliorer la qualité des os.

Cette étude a réussi à établir un modèle de PMOM chez la souris en enlevant les deux ovaires par ovariectomie dorsale. Le modèle animal est à la base de toutes les expériences ultérieures de cette étude. Lors de l’ablation chirurgicale des ovaires des souris, il était important de s’assurer que les ovaires des souris des groupes OVX et médicament étaient complètement éliminés, tandis que dans le groupe fictif, seule la graisse près des ovaires était enlevée, et il était également important d’éviter les infections des plaies.

Le nombre de trabécules osseuses et la densité de connexion des souris ont été améliorés après le traitement de l’ovariectomisé avec des pilules Xiaoyao, ce qui suggère que ce médicament avait un effet thérapeutique sur l’ostéoporose. L’immunohistochimie et l’immunocytochimie ont été utilisées pour évaluer l’efficacité du traitement dans cette étude ; Le temps d’action des différents réactifs n’est pas absolu, en particulier dans le processus de développement de la couleur, qui nécessite une observation en temps réel et une réaction rapide pour garantir les meilleurs résultats. Lors de l’incubation des anticorps, le gradient de concentration d’anticorps est d’abord défini et, après observation et comparaison, choisissez la concentration la plus appropriée pour les expériences suivantes.

Cependant, cette étude comportait certaines limites. Les données de pharmacologie en ligne ne disposaient que d’une seule source de données, et l’analyse de la composition du médicament ne provenait que d’une seule base de données. De plus, l’efficacité des pilules Xiaoyao n’a pas été comparée à celle des médicaments positifs dans cette étude, et il n’a pas été possible d’évaluer les différences spécifiques entre les pilules Xiaoyao et les modalités de traitement actuelles.

Pour le PMOM, l’option de traitement de première intention disponible est les bisphosphonates. Cependant, l’utilisation de ces médicaments peut entraîner des contre-indications gastro-intestinales et des fractures atypiques du fémur et une ostéonécrose des mâchoires encore plus graves42,43. Les options de traitement de deuxième intention comprennent l’utilisation du denosumab et de l’hormonothérapie. Il a été démontré que le dénosumab réduit les fractures de la hanche, vertébrales et non vertébrales. Cependant, un rebond peut se produire une fois que le médicament est arrêté, et plus la durée de l’arrêt est longue, plus la perte de densité osseuse est importante 42,44,45. L’hormonothérapie de la ménopause réduit le risque de fractures ostéoporotiques de la colonne vertébrale, mais ses effets sont limités à l’âge et ses risques à long terme semblent l’emporter sur les avantages46. La thérapie séquentielle est une option de traitement à long terme pour la PMOM, dans laquelle l’utilisation de médicaments formant les os suivis de médicaments anti-résorptifs peut obtenir la plus grande augmentation de la masse osseuse. Les médicaments spécifiques sont généralement déterminés au cas parcas42.

À cet égard, on peut supposer que les herbes traditionnelles chinoises peuvent avoir un potentiel avantageux dans le traitement de l’ostéoporose. Le mode d’action de la phytothérapie est multi-voies et multi-cibles plutôt que d’agir via un seul mécanisme47. Certains chercheurs ont évalué l’efficacité et l’innocuité de certains médicaments à base de plantes chinoises, et ils ont montré que le nombre de fractures lors de l’utilisation d’une combinaison de médicaments chinois et occidentaux par rapport à l’administration uniquement de médecine chinoise était inférieur à celui de la médecine occidentale seule du groupe48. Comparés aux médicaments chimiques, les remèdes à base de plantes chinoises ont moins d’effets secondaires, sont relativement peu coûteux et conviennent à une utilisation à long terme. Les remèdes à base de plantes chinoises non seulement réparent la microstructure osseuse et augmentent le volume osseux, mais ils peuvent également réduire ou éliminer les symptômes de la faiblesse de la colonne lombaire etdes maux de dos. L’étude actuelle pourrait aider à fournir une approche possible pour découvrir de nouveaux médicaments et traitements.

L’application des pilules Xiaoyao pour traiter le PMOM semble prometteuse. Dans la présente étude, les pilules peuvent améliorer la masse osseuse et la qualité osseuse dans un modèle murin de PMOM en supprimant l’inflammation. Certains chercheurs ont même suggéré qu’une combinaison de médecine chinoise et d’acupuncture peut être efficace dans le traitement de la PMOM50. Dans le même temps, une combinaison de médecine chinoise et occidentale s’est avérée efficace51. Ces deux remèdes possibles sont valides, bien que tout traitement recommandé utilisant les pilules Xiaoyao en conjonction avec l’acupuncture et la médecine occidentale devrait être validé par des essais cliniques. L’importance clinique de l’ostéoporose réside dans les fractures osseuses, et les recherches futures devraient également se concentrer sur leur prévention.

En résumé, cette étude a démontré par la pharmacologie du réseau et des expériences sur des animaux que les souris PMOM ont montré une amélioration significative du métabolisme osseux et une augmentation de la masse osseuse après un traitement avec des pilules Xiaoyao. Le mécanisme d’action de ce phénomène peut être lié à l’inhibition de la voie de signalisation IL-17 et à l’augmentation des facteurs ostéogéniques, de l’ALP et de l’activité de COL-1. Cette étude établit une base théorique et une base expérimentale pour l’application clinique des pilules Xiaoyao dans le traitement des maladies associées à l’ostéoporose.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Le programme de recherche scientifique et de développement technologique (20224128) de la ville de Baise a soutenu ce travail. Les auteurs remercient le Dr Dev Sooranna de l’Imperial College de Londres et YMUN pour l’édition du manuscrit. YYX et ZYW ont contribué à parts égales à cette étude.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Échantillonneur de 1 mlGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001Pour l’anesthésie chez la souris
4 % de polyformaldéhydeBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.P1110Pour la fixation tissulaire
Suture résorbable 6-0 (aiguille coudée)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06Pour la suture postopératoire
Boule de coton absorbanteWinnerMIANQIU-500gPour la stérilisation et l’hémostase
Lames adhésivesJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105Pour la coupe de tissus
AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLPour l’anesthésie chez la souris Bluing
SolutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G1866Coloration bleue des noyaux des cellules après l’action de la solution de différenciation de l’hématoxyline
C57BL/6 sourisBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)Pour utilisation dans l’expérimentation animale
Lames chirurgicales en acier au carbonePremier Medical Equipment Co.SP239Pour la chirurgie
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAbBIOSS ANTIBODIESbs-6202RSe lie à Act1 dans les tissus
d’hématoxyline de Cole (pour coloration conventionnelle)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G1140Pour la coloration des coupes de paraffine
Collagène de type I Anticorps polyclonalproteintech14695-1-APSe lie à COL-1 dans les tissus
DAB Substrate kit,20xBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.DA1010Pour le développement de la couleur des tissus
Feuille chirurgicale jetable 50 * 60CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777Pour la chirurgie de la souris
Solution de décalcification EDTA (pH 7,2)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.E1171-500mlPour la décalcification des tissus
Tampon de blocage de la peroxydase endogène amélioréeBeyotime BiotechnologyP0100BSéquestration des peroxydases endogènes tissulaires ou cellulaires
Déparaffinage clair liquide respectueux de l’environnementServicebioG1128-1LPour le déparaffinage des sections de paraffine
Alcool éthyliqueCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)Pour la déshydratation de sections de paraffine
Diluant d’anticorps à usage généralEpizyme BiotechPS119LPour la dilution des anticorps
différenciation de l’hématoxylineServicebioG1039-500MLPour la différenciation après coloration à l’hématoxyline et l’élimination du colorant excessivement lié et non spécifiquement adsorbé des tissus Kit
de coloration à l’hématoxyline Éosine (HE) BeijingSolarbio Science & Technology Co., Ltd.G1120-3 * 100mlPour la coloration des tissus Poignée de
couteau chirurgical en acier inoxydable de haute qualitéPremier Medical Equipment Co.SP0088Pour la chirurgie de la souris
Affinipure Goat Conjugué HRP Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintechSA00001-2Se lie à l’anticorps primaire et amplifie le signal
IL-17A Anticorps polyclonalproteintech13082-1-APSe lie à IL-17 dans les tissus
IL-6 Anticorps polyclonalproteintech21865-1-APSe lie à IL-6 dans les tissus
Immunohistochemistry penPékin Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)Pour dessiner des cercles en immunohistochimie
Suture chirurgicale médicale Non absorbante (bille) 5-0 3.5mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2Pour la suture postopératoire
Aiguilles de suture médicale Aiguilles d’angle 4 * 10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4Pour la suture postopératoire
Baume NeutreBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G8590En tant que scelleuse de tranches
PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015Tampon pour le lavage des lames et la dilution partielle de la solution
Tampon de blocage rapide sans protéines (1X)Epizyme BiotechPS108PÉviter la liaison non spécifique des protéines
Anticorps anti-os de phosphatase alcaline de lapinANTICORPS BIOSSBS-6292RSe lie à la phosphatase alcaline dans les tissus
Hôpital affilié à la salinitéUniversité de médecine de Youjiang Pour les nationalitésLHN500Pour les animaux par gavage
Rasoirs/Tondeuses électriquesHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002Pour raser les souris
Porte-aiguille médicale en acier inoxydable 14cm Aiguille grossièrePremier Medical Equipment Co.SP784Pour la chirurgie
la souris Pince ophtalmique en acier inoxydable 10,5 cm courbée (sans crochet)ZhuoyouyueYKNWW-10.5Pour la chirurgie
Ciseaux ophtalmiques en acier inoxydable / Ciseaux chirurgicaux 10CM Pointe droitePremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJPour la chirurgie
Aiguille gastrique à pointe en acier inoxydable 12 Gauge 55mm CoudeGWJ-12-55WPour une utilisation chez les souris par gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)proteintechPR30002Pour la réparation antigénique des sections de paraffine
Planche de dissection en bois 25 * 16cmJP16 * 24Pour la chirurgie
de la souris Pilules XiaoyaoJiuzhitang Co., Ltd.YPG-041Pour l’administration de médicaments pour animaux
Others
R 4.3.1Traitement des données
Cytoscape3.9.1Ressource nationale pour la biologieConstruction d’un réseau de régulation pour la médecine traditionnelle chinoise
ImageJ 1.54fNational Institutes of HealthTraitement d’images pour Résultats d’immunohistochimie
Adobe Photoshop 24.0.0AdobePour la combinaison d’images
GraphpadPrism 9.5LogicielAnalyse statistique de données
cellsens DimensionOLYMPUSPour le tranchage et la photographie OLYMPUS
BX53OLYMPUSPour la coloration HE et la photographie de coupe immunohistochimique
de la souris Solution Solution de de de la souris de la souris des réseaux GraphPad

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