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Article de méthode

L’ablation cellulaire au laser chez des larves de drosophile intactes révèle une compétition synaptique

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DOI :

10.3791/67053

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26 juillet 2024

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole démontre l’ablation cellulaire au laser de neurones individuels chez des larves de drosophile intactes. La méthode permet d’étudier l’effet de la réduction de la compétition entre les neurones du système nerveux en développement.

Résumé

Le protocole décrit l’ablation d’un seul neurone avec un système laser à 2 photons dans le système nerveux central (SNC) de larves intactes de Drosophila melanogaster . En utilisant cette méthode non invasive, le système nerveux en développement peut être manipulé d’une manière spécifique à la cellule. Perturber le développement de neurones individuels dans un réseau peut être utilisé pour étudier comment le système nerveux peut compenser la perte d’entrée synaptique. Les neurones individuels ont été spécifiquement ablatés dans le système de fibres géantes de la drosophile, en mettant l’accent sur deux neurones : la fibre géante présynaptique (GF) et le motoneurone tergotrochantéral postsynaptique (TTMn). Le GF fait synapse avec le TTMn ipsilatéral, ce qui est crucial pour la réponse de fuite. L’ablation de l’un des GF dans le cerveau du 3estade, juste après le début de la croissance axonale, élimine définitivement la cellule pendant le développement du SNC. Le GF restant réagit au voisin absent et forme une terminaison synaptique ectopique au TTMn controlatéral. Cette terminaison atypique, à symétrie bilatérale, innerve les deux TTMn, comme le démontre le couplage des colorants, et entraîne les deux motoneurones, comme le démontrent les tests électrophysiologiques. En résumé, l’ablation d’un seul interneurone démontre une compétition synaptique entre une paire bilatérale de neurones qui peut compenser la perte d’un neurone et restaurer des réponses normales au circuit d’échappement.

Introduction

L’ablation au laser est un outil privilégié pour disséquer les circuits neuronaux dans une grande variété d’organismes. Développé dans des systèmes génétiques modèles comme les vers et les mouches, il a été appliqué dans tout le règne animal pour étudier la structure, la fonction et le développement du système nerveux 1,2,3. Ici, l’ablation d’un seul neurone a été utilisée pour étudier comment les neurones interagissent lors de l’assemblage des circuits chez la drosophile. Le système d’échappement de la mouche est un circuit de prédilection pour l’analyse car il contient les plus grands neurones et les plus grandes synapses de la mouche adulte, et le circuit a été bien caractérisé au cours des dernières décennies4. Le rôle que jouent les interactions neurones-neurones dans l’assemblage du circuit de la fibre géante est au cœur de cette recherche.

Un type d’interaction qui a été un point central en neurosciences depuis les travaux de Hubel et Wiesel dans les années 1960 est la « compétition synaptique »5,6. Dans ce protocole, l’ablation laser a été utilisée pour revisiter le rôle de la compétition par ablation unicellulaire dans le système de fibres géantes (GFS) de la drosophile, où les fondements moléculaires du phénomène pourraient être découverts.

L’ablation des neurones chez la mouche en développement a été difficile pour diverses raisons, notamment la visualisation des neurones cibles, la précision de la méthode d’ablation et la survie de l’échantillon. Pour surmonter ces problèmes dans le GFS, le système UAS/Gal47 a été utilisé pour marquer les neurones d’intérêt, et un microscope à deux photons a été utilisé pour retirer la fibre géante présynaptique ou le motoneurone de saut postsynaptique (TTMn).

Dans cette étude, pour déterminer le rôle que jouent les neurones bilatéraux voisins dans l’ajustement de la connectivité synaptique et de la force synaptique dans le GFS, l’une des paires bilatérales de neurones (GF présynaptique ou motoneurone postsynaptique) a été supprimée juste avant le développement de la nymphe. À ce stade de développement, l’axonogenèse de GF n’est pas terminée8. La structure GF et la fonction du circuit synaptique chez l’adulte ont ensuite été examinées, avec une attention particulière accordée à la sortie du GF restant.

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Protocole

Tous les animaux utilisés pour le protocole étaient de l’espèce Drosophila melanogaster. Il n’y a aucun problème éthique entourant l’utilisation de cette espèce. Une autorisation éthique n’était pas nécessaire pour effectuer ce travail. Les détails de l’espèce, des réactifs et de l’équipement de la drosophile utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Élevage de la drosophile et sélection du bon stade larvaire

  1. Choisissez une ligne pilote Gal4 qui pilote l’expression dans les cellules à ablater et recombinez-la avec une ligne rapporteuse UAS-GFP ou croisez-la vers une ligne rapporteuse UAS-GFP. Élevez les mouches avec de la nourriture anti-mouches standard à 25 °C.
    REMARQUE : Pour l’ablation par fibre géante (GF), R91H05-Gal4 ou A307-Gal4 a été recombiné avec UAS-GFP. ShakB(lethal)-GAL4 recombiné avec UAS-GFP a été utilisé pour les ablations TTMn (voir Tableau des matériaux).
  2. Sélectionnez les larves qui ont commencé à émerger de la nourriture et rampez sur le côté de la fiole de nourriture. Ces larves sont au stade errant, qui est le stade préféré pour effectuer l’ablation des cellules GF.
    REMARQUE : L’ablation peut être effectuée à n’importe quel stade larvaire. Le dernier stade larvaire était important pour la manipulation du développement du GFS car les corps des cellules GF peuvent être facilement identifiés dans le cerveau, mais les axones GF n’ont pas établi de connexions avec leurs cibles à ce stade.

2. Préparation de la larve du 3e stade

REMARQUE : Les larves ont été anesthésiées à l’aide d’une méthode semblable à celle de Burra et al.9. Pour que les temps de procédure soient courts, ne préparez qu’une seule larve à la fois. Une courte exposition à un anesthésique améliorera la survie des animaux de laboratoire10.

  1. Préparez un plat en verre avec un couvercle hermétique. Placez une boule de coton dans le plat et, sous une hotte, ajoutez environ 3 à 5 ml d’éther éthylique (liquide dangereux et inflammable, blouse de laboratoire, gants, lunettes de protection). Couvrez le plat avec le couvercle.
  2. Prélever les larves individuelles du 3e stade dans les flacons de mouches. Au 3estade larvaire, les larves quittent le milieu alimentaire et rampent le long du côté du flaconalimentaire 11.
    1. Assurez-vous que les larves sont toujours en mouvement et n’ont pas commencé à former du puparium. Les larves qui sont stationnaires et qui présentent un raccourcissement du corps commencent la nymphose et ne conviennent pas à l’ablation. Ramassez les larves avec un petit pinceau.
      REMARQUE : Le 3èmestade larvaire commence après la deuxième mue à 72 h de développement (après la ponte), et dure jusqu’à la formation du puparium à 120 h pour les mouches élevées à 25 °C.
  3. Transférez une larve dans un petit récipient ouvert. Placez le récipient dans le plat en verre avec de l’éther éthylique et fermez bien le plat. Lorsque vous ouvrez le plat en verre, placez-le sous un tuba ou dans une hotte pour éviter que les fumées ne s’échappent.
    1. À intervalles de 30 s, retirez le couvercle avec la larve de la boîte et vérifiez la mobilité de la larve à l’aide d’un microscope de dissection. La larve sera généralement immobilisée en 1 min. Une fois que les crochets buccaux cessent de se contracter, la larve est prête à monter. Jetez toutes les larves qui ne sont pas complètement immobilisées après 3 min.
      REMARQUE : Le haut d’un couvercle renversé d’un tube de microcentrifugation (couvercle retiré du tube) peut être utilisé comme récipient.

3. Montage des larves sur des lames pour l’ablation

  1. Placez la larve anesthésiée sur une lame de microscope en verre. Immergez la larve dans une goutte de sérum physiologique pour insectes ; Cela emportera une partie des débris alimentaires qui pourraient coller à la larve.
  2. Sous le microscope de dissection, retirez la majeure partie de la solution saline à l’aide d’un mouchoir en papier. Positionnez la face dorsale de la larve vers le haut pour l’ablation GF ou la face ventrale vers le haut pour l’ablation TTMn. Abaissez lentement une lamelle en verre sur la larve. Ajoutez une solution saline sur le côté de la lamelle pour remplir l’espace entre la lame de verre et la lamelle.
  3. Pour l’ablation GF, vérifiez le positionnement du cerveau sous un fort grossissement sur le microscope de dissection. Assurez-vous que le cerveau est au niveau et qu’il est visible à travers la cuticule. Souvent, le cerveau est recouvert de tissu adipeux, ce qui rend la visualisation et l’ablation cellulaire impossibles.
    1. Pour déplacer tout tissu adipeux recouvrant le cerveau, appliquez une légère pression sur la lamelle à l’aide d’une pince et déplacez la lamelle d’un côté à l’autre. Si le tissu adipeux ne peut pas être éloigné du cerveau de cette façon, utilisez une autre larve à la place.

4. Localisation des cellules cibles

REMARQUE : Le système multiphotonique utilisé pour cette étude a été monté sur un microscope vertical. Un logiciel spécifique au système a été utilisé pour contrôler les paramètres d’acquisition et de stimulation laser. Le système était équipé d’une source lumineuse à épifluorescence pour localiser les échantillons. L’objectif était un objectif à immersion dans l’eau avec un grossissement de 25x, une longue distance de travail de 2 mm et une NA de 1,10.

  1. Placez l’échantillon sur la platine du microscope multiphotonique et utilisez le filtre GFP pour localiser l’échantillon en mode épifluorescence. Pour l’ablation GF, les corps cellulaires peuvent être identifiés dans le cerveau, comme le montrent les figures 1A, C et D. Pour l’ablation TTMn, un groupe de quatre cellules peut être identifié du côté ventral dans le cordon nerveux ventral (VNC), comme le montre la figure 1A,B. Une fois la mise au point terminée, centrez les cellules dans le champ de vision et passez en mode 2 photons.

5. Configuration des paramètres d’ablation

  1. Ajustez les paramètres laser et le gain du détecteur pour visualiser les cellules exprimant la GFP avec le scanner Galvano. Une longueur d’onde de 870 nm fonctionne mieux pour visualiser le signal GFP. Centrez la cellule dans le champ de vision.
  2. Utilisez une zone d’intérêt circulaire pour définir la zone d’ablation. Assurez-vous que le retour d’intérêt couvre la majeure partie de la surface de la cellule (Figure 1E,G).
  3. Configurez le protocole d’ablation dans le logiciel. Définissez une image d’acquisition, puis une stimulation, suivie d’une autre image d’acquisition.
  4. Démarrez le réglage de la puissance du laser de stimulation à une valeur inférieure (10 %-20 %) et exécutez le protocole de stimulation. Une ablation réussie peut être reconnue par un cercle clair au centre du soma cellulaire à l’emplacement du ROI et une augmentation de la fluorescence autour du ROI (Figure 1F).
    1. Si l’ablation n’a pas réussi et n’a fait que blanchir la cellule (Figure 1H), augmentez la puissance du laser par incréments de 5 % ou le nombre de boucles une à la fois et exécutez à nouveau le protocole. La puissance laser appliquée était comprise entre 10 % et 40 % pour le système utilisé dans le protocole.
      REMARQUE : Les paramètres de puissance du laser pour l’ablation dépendent grandement de la profondeur à laquelle les cellules sont situées dans le tissu et d’autres facteurs tels que le pliage de la cuticule. Si les cellules sont brillantes et clairement visibles, la puissance laser se situera à l’extrémité inférieure de la plage. La puissance laser sera différente pour chaque système en fonction du modèle de laser et de l’âge du laser.

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Figure 1 : Identification des neurones pour l’ablation laser chez les larves intactes de Drosophila L3. (A) Schéma de l’emplacement du soma en fibre géante (GF) dans le cerveau et de l’amas de motoneurones contenant le motoneurone tergotrochantéral (TTMn) dans le cordon nerveux ventral (VNC). (B) Projection d’intensité maximale de l’expression motrice de la GFP par shakB(lethal)-Gal4 dans la VNC larvaire. La ligne médiane est indiquée par la ligne pointillée. Le cercle indique le groupe de neurones contenant le TTMn qui sont ciblés pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 50 μm. (C) Vue de projection partielle du cerveau larvaire exprimant la GFP sous le contrôle de A307-Gal4. Le cercle indique le soma GF ciblé pour l’ablation au laser. Barre d’échelle : 50 μm. (D) Projection d’intensité maximale du cerveau avec R91H05-Gal4 pilotant UAS-GFP. Les deux GF (cercles) sont identifiables par leur emplacement, leur forme et leur taille. Barre d’échelle : 50 μm. (E) Vue agrandie de GF soma avant ablation laser. Le cercle magenta indique la région cible pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 10 μm. (F) Vue agrandie de GF soma après administration de la puissance laser localisée et ablation réussie. Barre d’échelle : 10 μm. (G) Vue agrandie de la taille avant l’ablation laser. Le cercle magenta indique la région cible pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 10 μm. (H) Vue agrandie du soma GF après administration de la puissance laser localisée et ablation infructueuse (blanchiment). Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Récupération des larves

  1. Après avoir réussi à ablater la cellule, retirez la lamelle et ramassez doucement les larves de la lame avec un pinceau. Placez les larves dans un flacon alimentaire. Les larves recommenceront à ramper dans les 30 minutes.
    REMARQUE : La réduction de la durée de la procédure améliore les taux de survie des animaux. Avec de l’expérience, l’expérience peut être réalisée en un peu moins de 10 minutes.
  2. Continuez à élever les larves dans des conditions normales jusqu’à ce qu’elles se ferment de l’enveloppe nymphale.

7. Test de la fonctionnalité du GFS chez les mouches adultes

REMARQUE : Les étapes suivantes sont expliquées en détail dans Allan et Godenschwege12, et Augustin et al.13.

  1. Testez les mouches adultes à l’âge de 2 à 5 jours après l’éclosion. Anesthésisez les mouches avec du CO2 et montez-les sur de la cire dentaire en poussant les pattes dans la cire. Déployez les ailes à un angle de 90° et fixez-les en place avec la cire. Fixez la tête en enfonçant la trompe dans la cire.
  2. Placez des fils de stimulation dans les deux yeux, un fil de terre dans l’abdomen et des électrodes d’enregistrement en verre dans les muscles de saut (TTM) de chaque côté.
  3. Stimulez le circuit GF avec des stimuli uniques pour mesurer la latence de réponse des deux muscles. Stimulez le circuit avec des trains de stimuli de 100 Hz et 200 Hz, respectivement, pour mesurer la fréquence suivante pour les deux muscles.

8. Dissection et marquage du système de fibres géantes pour l’imagerie confocale

REMARQUE : La dissection du SNC des mouches et l’injection de colorant sont détaillées dans Boerner et Godenschwege14.

  1. Retirez délicatement la mouche de la cire dentaire à l’aide d’une pince et transférez-la dans une boîte de Pétri doublée d’élastomère de silicone sous un endoscope de dissection.
  2. Retirez les pattes, les ailes et la trompe avec des ciseaux et utilisez des épingles à insectes pour fixer la face dorsale de la mouche vers le haut dans le revêtement en élastomère.
  3. Faites une incision latérale le long de la ligne médiane à partir du milieu de l’abdomen, à travers tout le thorax et le long du cou, en reliant le thorax à la tête. Ouvrez la mouche avec des épingles à insectes. Retirez les organes et les glandes de la mouche sans endommager le système nerveux.
    REMARQUE : À ce stade, les axones GF peuvent être injectés avec des colorants pour marquer les GF et les neurones couplés électriquement13.
  4. Retirez la capsule cérébrale de la tête pour exposer le cerveau.

9. Immunohistochimie du système nerveux

  1. Après dissection du SNC, fixer la mouche dans 4% de PFA dans du PBS pendant 45 min à température ambiante (RT). Laver pendant 20 min dans PBS à RT (3 fois).
  2. Bloquer l’échantillon pendant 1 h à RT dans 3% BSA dans PBS avec une solution détergente à 0,5%.
  3. Incuber pendant 2-3 nuits à 4 °C dans 3% BSA dans du PBS avec une solution détergente à 0,3% et anti-GFP pour lapin (1:500). Laver pendant 20 min en PBS à RT (6 fois).
  4. Incuber une nuit à 4 °C dans du PBS avec l’anti-lapin Alexa 488. Laver pendant 20 min en PBS à RT (6 fois).
  5. Déshydrater les échantillons avec une série ascendante d’éthanol (50 %, 70 %, 90 %, 100 % d’éthanol) pendant 10 min à chaque étape. Retirez les broches et coupez l’abdomen et les muscles de vol. Transférez le reste du thorax contenant le système nerveux sur une lame et couvrez-le d’un milieu de montage comme le salicylate de méthyle. Placez une lamelle sur l’échantillon et scellez-la avec du vernis à ongles.
  6. Imager le système nerveux au microscope confocal pour analyser l’anatomie de la terminaison GF.

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Résultats

Cette méthode peut être utilisée pour manipuler le développement de réseaux neuronaux spécifiques dans le système nerveux de la drosophile. La principale question de recherche ici était la formation de connexions synaptiques. L’élimination de la GF présynaptique ou de la TTMn postsynaptique a permis d’étudier la synaptogenèse réactive au niveau de cette synapse centrale et les mécanismes moléculaires cruciaux pour la fonction et le développement synaptiques. Comme décrit dans le protocole, l’ablation cellulaire ...

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Discussion

L’ablation cellulaire à l’aide d’un microscope à 2 photons s’est avérée être une méthode très efficace pour manipuler le développement des circuits neuronaux chez la drosophile. Comme cette méthode est non invasive, elle cause des dommages minimes à l’animal. Les données soutiennent l’utilité de cette manipulation spécifique aux cellules de circuits connus.

Le choix du pilote Gal4 le plus approprié était crucial pour le succès de l’ablation. Comme le GFS est bien étudié, de nombreuses...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Des expériences sur le microscope à 2 photons ont été réalisées dans le FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. Nous tenons à remercier la Jupiter Life Science Initiative pour son soutien financier.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 488 AffiniPure Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Protéine fluorescente anti-verte, lapinFisher ScientificA11122Concentration 1:500
Apo LWD 25x/1.10W ObjectifNikonMRD77220immersion dans l’eau longue distance de travail
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti :Sapphire Vision II LaserCoherent
Cotton BallGenesee Scientific51-101
Dextra, tétraméthylrhodamine, 10 000 MW, lysine fixable (fluoro-rubis)Fisher ScientificD1817
Recette salinede drosophile de Gu et O’Dowd, 2006
Éther éthyliqueFisher ScientificE134-1Danger, Liquide inflammable
Nourriture pour mouches B (recette de Bloomington)LabExpress7001-NV
Salicylate de méthyleFisher ScientificO3695-500
Tube de microcentrifugation 1,5 mLEppendorf22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5Fisher Scientific12-541A
Vecteur traceur de neurobiotine LaboratoiresSP-1120
multiphotonique Nikon A1Rsur un support de microsope FN1 vertical
NIS Elements Advanced ResearchNikonLogiciel d’acquisition et d’analyse
de données Paraformaldéhyde (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)Fisher BioReagentsBP2944-100Comprimés
R91H05-GAL4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(lethal)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Superfrost microscope lame de verreFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000solution détergente
UAS-10xGFPBloomington Centre de stock de drosophile32185
Microscope

Références

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
  3. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
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  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

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Réimpressions et autorisations

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