Article de méthode

Modèle in vitro pour l’étude de la différenciation et des modifications de la multi-omique sur des cellules épithéliales des voies respiratoires murines stimulées par un extrait de fumée de cigarette

DOI :

10.3791/67057

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12 juillet 2024

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1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons un modèle in vitro pour isoler et différencier les cellules épithéliales des voies respiratoires murines, en nous concentrant sur leur acclimatation à l’extrait chronique de fumée de cigarette (ECS). Le modèle pourrait être utilisé pour caractériser de manière exhaustive l’impact multi-omique de l’ECS, ce qui pourrait donner un aperçu des réponses cellulaires en cas d’exposition chronique à la fumée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC) est largement attribuée à l’exposition à la fumée de tabac. L’étude de la façon dont les cellules épithéliales des voies respiratoires s’adaptent fonctionnellement à la fumée de tabac est cruciale pour comprendre la pathogenèse de la BPCO. La présente étude visait à mettre en place un modèle in vitro utilisant des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines pour imiter l’impact réel de la fumée de tabac. Contrairement aux lignées cellulaires établies, les cellules primaires conservent davantage de propriétés in vivo, notamment les modèles de croissance, le vieillissement et la différenciation. Ces cellules présentent une réponse inflammatoire sensible et une différenciation efficace, représentant ainsi étroitement les conditions physiologiques. Dans ce modèle, des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines ont été cultivées pendant 28 jours sous une interface air-liquide avec une concentration optimale d’extrait de fumée de cigarette (CSE), ce qui a conduit à la transformation d’une monocouche de cellules indifférenciées en un épithélium cylindrique pseudostratifié, indiquant une acclimatation au CSE. Des analyses multi-omiques complètes ont ensuite été appliquées pour élucider les mécanismes par lesquels la CSE influence la différenciation des cellules basales des voies respiratoires. Ces informations permettent de mieux comprendre les processus cellulaires qui sous-tendent la progression de la BPCO en réponse à l’exposition à la fumée de tabac.

Introduction

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La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une affection pulmonaire hétérogène aux caractéristiques complexes, tandis que les patients atteints de BPCO ont progressivement tendance à être plus jeunes1. Le tabagisme, principal facteur de risque de la BPCO2, a un impact profond sur les cellules épithéliales des voies respiratoires, qui servent de barrière initiale contre la fumée de tabac. Malgré cette association connue, les mécanismes détaillés par lesquels la fumée de tabac induit des changements dans les cellules épithéliales des voies respiratoires restent insuffisamment explorés. Une compréhension approfondie de ces altérations moléculaires est essentielle pour identifier des marqueurs diagnostiques précoces et des cibles thérapeutiques de la BPCO.

Pour combler cette lacune, nous avons développé un nouveau modèle in vitro utilisant des cellules épithéliales murines des voies respiratoires. Ces cellules ont été soumises à une stimulation à long terme avec de l’extrait de fumée de cigarette (CSE), ce qui nous a permis de surveiller les changements cellulaires dynamiques et d’explorer les changements dans les cellules épithéliales des voies respiratoires sous stimulation à long terme du tabac et le mécanisme sous-jacent. Dans ce modèle, transwell a été utilisé pour fournir l’interface air-liquide des cellules épithéliales des voies respiratoires, et l’extrait de fumée de cigarette a été stimulé au stade précoce de la différenciation des cellules épithéliales jusqu’à la fin de la différenciation à 28 jours. Des études antérieures n’ont porté que sur la différenciation et la stimulation à court terme des cellules épithéliales des voies respiratoires (dominance de la lignée cellulaire). Ils étaient limités à une seule voie réglementaire 3,4,5,6. Cependant, le protocole présenté ici utilise des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires de souris et optimise le processus d’extraction cellulaire pour une meilleure activité cellulaire que les méthodes précédentes de culture de cellules épithéliales des voies respiratoires. Ce modèle se concentre sur les altérations de la différenciation cellulaire ainsi que sur des analyses transcriptomiques, protéomiques, métabolomiques et épigénomiques complètes. En utilisant l’immunofluorescence et des techniques multi-omiques avancées, nous avons cherché à élucider les réponses cellulaires des cellules épithéliales des voies respiratoires à l’exposition chronique à la fumée de tabac, contribuant ainsi à une compréhension plus approfondie de la pathogenèse de la BPCO. Ce modèle peut être utilisé pour explorer les changements dans le modèle de différenciation des cellules épithéliales des voies respiratoires et son mécanisme causé par la stimulation à long terme de divers polluants.

Protocole

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Le protocole global nécessite 44 jours, dont 1 jour pour la préparation des cellules épithéliales des voies respiratoires isolées des trachées murines, 15 jours pour la prolifération cellulaire et 28 jours pour la stimulation CSE à l’interface air-liquide. Tous les animaux de laboratoire sont hébergés dans la salle des animaux de barrière SPF du Centre d’expérimentation animale de l’Université médicale de la capitale et ont été examinés et approuvés par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale et des animaux de laboratoire de l’Université médicale de la capitale (AEEI-2020-100) pour répondre aux exigences des directives ARRIVE7.

1. Isolement des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines à partir des trachées murines

  1. Préparation
    1. Préparez un milieu d’expansion complet en combinant 1 mL de supplément 50x et 0,05 mL de stock d’hydrocortisone avec 48,95 mL de milieu basal d’expansion. Conserver à 4 °C et utiliser dans les 4 semaines.
    2. Dissoudre 7,5 mg de protéinase et 5 mg de désoxyribonucléase I dans 5 mL de F-12 de Ham pour préparer une solution de protéinase. Filtrez-le pour le stériliser et conservez-le à 4 °C et utilisez-le dans les 4 semaines.
    3. Préparez des solutions antibiotiques en ajoutant 0,05 mL de pénicilline/streptomycine 100x et 0,01 mL de gentamicine/amphotéricine 500x à 5 mL de milieu d’expansion complète, de PBS et de solution de protéinase (100 U/mL de pénicilline, 100 U/mL de streptomycine, 10 μg/mL de gentamicine et 0,25 μg/mL d’amphotéricine B). Conserver à 4 °C et utiliser dans les 4 semaines.
    4. Stérilisez les instruments chirurgicaux et préparez l’enceinte de sécurité biologique pour l’isolement des cellules. En même temps, assurez-vous que l’équipement de culture cellulaire standard est prêt à l’emploi.
    5. Préparez des plats enrobés de collagène pour la queue de rat en ajoutant du collagène de queue de rat (100 μg/mL dans de l’acide acétique 0,02 N) dans des boîtes de culture de 100 mm et des transwells de 24 mm (0,05 mL/cm2). Laisser ouvert toute la nuit sous la lumière UV pour la stérilisation.
  2. Isolement des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines
    1. Utilisez des souris C57BL/6 (âgées de 6 à 8 semaines, mâles, avec un FPS élevé) pour l’isolement des cellules épithéliales trachéales. Euthanasier avec une solution de pentobarbital sodique à 1 % (environ 200 mg/kg). Utilisez cinq souris pour un rendement cellulaire suffisant.
    2. Stérilisez la souris par immersion dans une solution d’éthanol à 75 %, sans immerger le nez et la bouche dans l’alcool pour éviter que l’alcool ne coule dans la trachée.
    3. Disséquez la souris.
      1. Utilisez des lames chirurgicales et des pinces, un ensemble de dispositifs pour couper et ouvrir l’épiderme de la mâchoire inférieure à la cavité abdominale de la souris.
      2. Utilisez un autre ensemble d’instruments chirurgicaux pour déchirer les glandes thyroïdes des deux côtés et enlever les connexions entre la trachée, le tissu musculaire environnant et l’œsophage.
      3. Après cela, coupez soigneusement dans la poitrine, utilisez des pinces pour plonger plus profondément dans la cavité thoracique, retirez tout le poumon et trouvez l’extrémité de la trachée.
    4. Traitez la trachée.
      1. Coupez la trachée du cartilage thyroïdien à la branche trachéo-bronchique et mettez-la dans un milieu d’expansion pré-froid contenant quatre antibiotiques.
      2. Secouez le tube pour rincer autant de sang que possible de la surface de la trachée, maintenez-le sur de la glace, puis commencez l’opération pour la souris suivante.
    5. Transférez toutes les trachées prélevées dans un tampon PBS pré-froid contenant quatre antibiotiques (200 μ/ml de pénicilline, 200 μg/ml de streptomycine, 20 μg/ml de gentamicine et 0,5 μg/ml d’amphotéricine B) pour le prétraitement avant la digestion.
    6. Utilisez un ensemble d’instruments chirurgicaux pour retirer les caillots et autres tissus des surfaces de la trachée, puis coupez-les en 1 cm2 .
    7. Incuber le tissu trachéal dans une solution de protéinase à 37 °C pendant 40 min.
    8. Après 40 min, secouez le tube plusieurs fois et utilisez une passoire à cellules de 40 μm pour retirer les tissus restants. Rincer les trachées hachées sur une passoire avec 5 mL de milieu d’expansion, centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    9. Remettre en suspension les cellules obtenues dans 8 mL de milieu d’expansion.
    10. Comptez les cellules viables à l’aide de bleu trypan et d’un hémocytomètre.
    11. Suspension cellulaire P0 sur des boîtes de 100 mm (1 x 104 cellules vivantes/cm2) pré-enrobées de collagène de queue de rat, et culture des cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2.

2. Culture d’expansion et passage des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines

  1. Remplacez le milieu pour la culture cellulaire P0 tous les 3 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 70 % à 80 % de confluence, généralement dans les 6 jours. À ce stade, les cellules épithéliales trachéales murines peuvent former une monocouche intacte avec un aspect de pavé (Figure 1A-D).
  2. Préchauffez des volumes suffisants de PBS, de milieu d’expansion complet et de kit de dissociation cellulaire sans composants animaux (ACF) à 37 °C.
  3. Rincez doucement les cellules avec 3 ml de PBS.
  4. Effectuer une dissociation enzymatique.
    1. Ajouter 3 mL de solution de dissociation enzymatique d’ACF dans la boîte et incuber à 37 °C pendant 5 min. Après le pipetage, délogez doucement les cellules et transférez la suspension cellulaire dans 3 mL de solution d’inhibition de l’enzyme ACF.
    2. Répétez l’ajout de 3 mL de solution de dissociation enzymatique ACF et incubez à nouveau pendant 5 min pour assurer un détachement cellulaire maximal.
  5. Faites tourner la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  6. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu d’expansion.
  7. Comptez les cellules viables à l’aide de bleu trypan et d’un hémocytomètre.
  8. Suspension cellulaire P1 sur plusieurs boîtes de 100 mm (5 x 10 4cellules vivantes /cm2) pré-enrobées de collagène de queue de rat, et culture des cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2.

3. Différenciation et stimulation CSE des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines à l’interface air-liquide

  1. Confirmez le type de cellule.
    1. Vérifiez l’origine épithéliale de cellules isolées à l’aide d’un test d’immunofluorescence (IFA) avec des anticorps contre les cytokératines. Ensemencez les cellules sur des lames de verre recouvertes de collagène de queue de rat et utilisez du paraformaldéhyde pour les fixer pendant au moins 12 heures après que les cellules ont atteint 80% de confluence.
    2. Lavez les lames 3 fois avec une solution PBS pendant 5 min et incubez-les avec 3% de BSA et 0,1% de triton X-100 dans une solution PBS à température ambiante (RT) pendant 1 h.
    3. Incuber les lames pendant la nuit à 4 °C avec un anticorps anti-cytokératine pan-dentaire commercial à une dilution de 1:500.
    4. Le lendemain, laver les lames 3 fois avec une solution de PBS pendant 5 minutes et les incuber avec un tampon d’anticorps secondaire à une dilution de 1:1000 à RT pendant 2 h dans l’obscurité.
    5. Après l’incubation, laver les lames 3 fois avec du PBS (5 min par lavage) et y ajouter du DAPI à une dilution de 1:1000. Après l’incubation à RT pendant 15 min, laver les lames une fois avec du PBS pendant 5 min.
    6. Observez les lames au microscope à fluorescence et comparez les profils d’expression à ceux d’un témoin positif (lignée cellulaire A549) et d’un témoin négatif (lignée cellulaire Raw264.7) (Figure 2).
  2. Ensemencez les cellules pour la différenciation.
    1. Détachez et centrifugez les cellules P2 comme décrit précédemment, et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié de milieu d’expansion pour faciliter le placage de 1 x 104 cellules vivantes/cm2.
    2. Pipeter 1 mL de suspension cellulaire sur la chambre apicale de l’insert de membrane en polycarbonate transwell. Dans le compartiment basal du transpuits, ajouter 1,5 mL de milieu de prolifération.
  3. Incuber les cellules à 37 °C et changer complètement tout le milieu dans les chambres basale et apicale tous les 3 jours à l’aide d’un milieu d’expansion jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Cela prend généralement de 3 à 6 jours.
  4. Préparez 50 ml de milieu de différenciation complet en ajoutant 5 ml de supplément ALI 10x, 500 μL de supplément d’entretien ALI, 100 μL de solution d’héparine et 250 μL de solution mère d’hydrocortisone à 44,15 ml de milieu basal ALI.
  5. Préparer l’ECS.
    1. Faites buliser une cigarette dans 12,5 mL de milieu de différenciation, puis filtrez-la à travers un filtre à pores de 0,22 μm pour préparer le CSE. Pour assurer la standardisation entre les expériences et les lots de CSE, mesurez l’absorbance à 320 nm sur un spectrophotomètre et définissez la densité optique (DO) de 1 comme 100 %8.
  6. Utilisez le milieu de différenciation contenant une concentration appropriée de CSE pour stimuler les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines afin de détecter les effets sur la différenciation des cellules.
  7. Laissez les cellules se différencier pendant 28 jours, au cours desquels le milieu de la chambre basale est changé et la face apicale est lavée deux fois par semaine en retirant le milieu de la chambre apicale et en remplaçant le milieu de la chambre basale par le milieu de différenciation contenant la concentration appropriée de CSE.
  8. Analysez les cellules après l’exposition.
    1. Après l’exposition à un milieu de différenciation contenant de l’ECS, prélever les cellules et les surnageants de culture à n’importe quel moment (c.-à-d. de 0 à 28 jours) pour détecter les changements morphologiques (c.-à-d. test d’immunofluorescence (IFA) ou coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) ou pour les procédures analytiques bio-informatiques (c’est-à-dire transcriptomique, protéomique, métabolomique, etc.).

Résultats

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Différenciation
Les cellules épithéliales des voies respiratoires murines se sont différenciées avec succès après culture à une interface air-liquide avec un milieu de différenciation pendant 28 jours. La présence de cellules ciliées et caliciformes a été démontrée par un dosage par immunofluorescence d’un marqueur de cils acétylé α-tubuline (vert ; Graphique 3A) et le marqueur de cellules caliciformes Mucin5AC, respectivement6 (rouge ; Figure 3B).

Détermination de la concentration de CSE pour la différenciation cellulaire
Stimuler les cellules épithéliales isolées avec différentes concentrations de CSE pendant 24 h. Les résultats ont montré que la viabilité cellulaire des cellules épithéliales diminuait lorsque la concentration de CSE était supérieure à 6 % (p <0,05, Figure 4A). Afin de maintenir l’activité cellulaire sous stimulation à long terme, des milieux de culture contenant 2 %, 4 % et 6 % de CSE ont été utilisés pour stimuler la différenciation des cellules épithéliales pendant 28 jours. De plus, les résultats ont montré qu’avec l’augmentation de la concentration de CSE, il n’y avait pas de mort cellulaire significative dans les cellules épithéliales (Figure 4B), mais il y avait un changement progressif du nombre de cellules de résistance transmembranaire intercellulaire (TEER) (Figure 4C) et de cellules exfoliées (Figure 4D). De plus, une réduction globale des cellules différenciées et des cellules ciliées a été observée lorsque des cultures de cellules épithéliales des voies respiratoires murines ont été exposées de manière chronique à l’ECS (figure 4E-H). Par conséquent, le milieu de différenciation contenant 6 % de CSE a été choisi pour déréguler la fonction de barrière épithéliale et réduire le nombre de cellules ciliées sans diminution de la viabilité cellulaire tout en différenciant les cellules épithéliales pendant 28 jours.

Analyse multi-omique
Deux groupes de cellules stimulées avec un milieu différentiel contenant 0 % ou 6 % de CSE pendant 28 jours ont été prélevés. L’ARNm total a été extrait pour l’analyse transcriptomique. Après la préparation de la banque, le séquençage, le contrôle de la qualité, la cartographie des lectures vers le génome de référence et la quantification de l’expression génique, l’expression différentielle des gènes entre les deux groupes a été analysée. Le progiciel clusterProfiler R a été utilisé pour effectuer une analyse d’enrichissement de l’ontologie génétique (GO) pour les gènes présentant une expression différentielle, avec des ajustements effectués pour tenir compte des écarts de longueur des gènes (Figure 5A). L’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) sert de base de données complète qui facilite la compréhension des fonctionnalités et des rôles complexes des systèmes biologiques à divers niveaux, y compris cellulaire, organisationnel et écologique, en intégrant des données au niveau moléculaire dérivées de vastes ensembles de données tels que ceux produits par le séquençage génomique et les méthodologies expérimentales à haut débit (Figure 5B). Pour la protéomique, les protéines totales ont été extraites de deux groupes de cellules 28 jours après des cultures avec des milieux différentiels contenant 0 % ou 6 % de CSE. Après le test de qualité des protéines, l’élimination du sel, l’hydrolyse enzymatique des protéines, le marquage des peptides par des marqueurs de masse en tandem (TMT), la séparation des fractions, l’analyse LC-MS, l’identification des protéines et la quantification des protéines, les protéines exprimées de manière différentielle entre deux groupes peuvent être définies. L’analyse GO a été effectuée à l’aide du programme interproscan par rapport à la base de données de protéines non redondantes (figure 6A), et KEGG a été utilisée pour analyser la voie (figure 6B). Pour la métabolomique, les surnageants de culture ont été prélevés dans deux groupes de cellules épithéliales des voies respiratoires 28 jours après des cultures avec un milieu de différenciation contenant 0 % ou 6 % de CSE. Après l’analyse HPLC-MS/MS, l’identification et la quantification des métabolites, les métabolites différentiels entre les deux groupes peuvent être définis. La base de données KEGG (figure 7A), la base de données sur le métabolome humain (figure 7B) et la base de données Lipidmaps (figure 7C) ont été utilisées pour annoter tous les métabolites. La base de données KEGG a été utilisée pour analyser les fonctions de ces métabolites différentiels et des voies métaboliques (Figure 7D). Pour l’épigénomique, l’ATAC-seq a été effectué comme indiqué précédemment9. Les noyaux ont été extraits de deux groupes de cellules 28 jours après la culture avec un milieu différentiel contenant 0 % ou 6 % de CSE, et les noyaux en pastille ont été remis en suspension dans le mélange réactionnel de la transposase Tn5. La réaction de transposition a été incubée à 37 °C pendant 30 min. Après l’ajout d’un adaptateur, la préparation de la banque, l’évaluation de la qualité, le clustering et le séquençage, l’épigénomique différentielle entre deux groupes peut être définie. L’analyse de l’enrichissement en GO des gènes différentiellement liés au pic reflète directement la distribution du nombre de gènes différentiellement liés au pic dans les items GO enrichis en processus biologiques, en composants cellulaires et en fonction moléculaire (Figure 8A). La base de données KEGG a été utilisée pour analyser les fonctions de ces gènes et voies différentiels (Figure 8B).

Gènes codant pour des protéines de jonction serrée
Les données transcriptomiques ont montré qu’après une stimulation à long terme de l’ECS, il y avait une diminution de l’expression de nombreux gènes codant pour les protéines de jonction serrée, notamment Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 et Ocln (Figure 9A), dans laquelle l’expression réduite de Cldn3 et d’Ocln a été confirmée par Western-Blot et l’immunohistochimie (IHC) (Figures 9B-E). Ces données suggèrent que l’exposition à l’ECS réduit considérablement l’expression des protéines de jonction serrée des cellules épithéliales des voies respiratoires.

Expression des cytokines et des chimiokines
En plus de la rupture des connexions étroites, la transcriptomique a également montré qu’après une stimulation à long terme de la CSE, l’expression de certaines cytokines et chimiokines, notamment Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 et Il33 a augmenté, mais l’expression de Ccl5 a diminué (Figure 10A). Le test Luminex a en outre confirmé qu’il y avait une augmentation des concentrations de CXCL-5, de CSF-3 et d’IL-1α (figure 10B-D), mais une diminution de CCL-5 (figure 10E) dans le surnageant des cellules épithéliales des voies respiratoires murines. Ces résultats suggèrent que l’exposition au CSE agit sélectivement sur l’expression des cytokines et des chimiokines.

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Figure 1 : Croissance des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines. (A) Les cellules nouvellement isolées apparaissent rondes et transparentes. (B) Au deuxième jour après l’isolement, les cellules expansées se sont formées en petits îlots cellulaires. (C) Au jour 4, la formation d’îlots cellulaires plus grands. (D) Au jour 6, plus de 90% de fusion avec la morphologie des pavés. (grossissement 4x ; barres d’échelle : 250 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Test d’immunofluorescence de marqueurs de cellules épithéliales. Expression de la cytokératine dans les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines, A549 (contrôle positif) et Raw264.7 (contrôle négatif). Noyaux colorés au DAPI (grossissement 63x ; barres d’échelle : 40 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Dosage par immunofluorescence des marqueurs des cellules ciliées et caliciformes. Les marqueurs utilisés étaient acétylés (A) α-tubuline et (B) Mucine 5AC pour confirmer les cellules cilières et les cellules caliciformes, respectivement (grossissement 100 ; barres d’échelle : 10 μm dans le panneau A et 50 μm dans le panneau B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Impact des concentrations de CSE sur les cellules épithéliales. (A) Viabilité cellulaire à 24 h à différentes concentrations de CSE. (B) Viabilité cellulaire à 28 jours. (C) Mesure FEER. (D) Nombre de cellules exfoliées. (E-H) Immunofluorescence pour les cellules ciliées (vertes) et caliciformes (violettes) à des concentrations de CSE de 0 %, 2 %, 4 % et 6 % (grossissement de 20x ; barres d’échelle : 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Analyses d’enrichissement GO et KEGG pour l’expression génique. (A) Signification du terme GO dans le processus biologique enrichi, la composante cellulaire et la fonction moléculaire. (B) Proportion de gènes exprimés de manière différentielle dans les voies KEGG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Analyse de l’expression des protéines. (A) Graphique à barres d’enrichissement GO montrant l’expression différentielle des protéines. (B) Analyse de la voie KEGG basée sur des protéines exprimées de manière différentielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Analyse de la voie KEGG des métabolites. (A) Annotation de tous les métabolites à l’aide de la base de données KEGG. (B) Annoter tous les métabolites à l’aide de la base de données du métabolome humain. (C) Annoter tous les métabolites à l’aide de la base de données Lipidmaps. (D) La distribution des métabolites exprimés différemment dans diverses voies KEGG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 8 : Analyse de l’expression génique liée au pic différentiel. (A) Graphique à barres d’enrichissement GO montrant l’expression différentielle des protéines. (B) Analyse de la voie KEGG basée sur des protéines exprimées de manière différentielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 9 : Expression de la protéine de jonction serrée dans les cellules épithéliales des voies respiratoires murines avec ou sans stimulation CSE. (A) Carte thermique de l’expression de la protéine de jonction serrée dans le transcriptome. (B-E) Les niveaux d’expression de (B,C) Cldn3 et (D,E) Ocln dans les cellules épithéliales des voies respiratoires murines ont été détectés par Western Blot et par immunohistochimie pour Cldn3 et Ocln (grossissement de 80 ; barres d’échelle : 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 10 : Analyse de l’expression des cytokines. (A) Carte thermique du transcriptome de l’expression des cytokines. (B-E) Test Luminex pour les niveaux de CXCL-5, CSF-3, IL-1α et CCL-5 dans des cellules avec/sans stimulation CSE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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La BPCO est une maladie inflammatoire chronique courante des voies respiratoires. L’exposition à la fumée de tabac entraîne une inflammation chronique des voies respiratoires, un remodelage des voies respiratoires et une destruction structurelle des poumons, qui est le résultat de l’interaction de diverses cellules structurelles et cellules immunitaires10. En tant que première ligne du système immunitaire inné dans les poumons, les cellules épithéliales des voies respiratoires jouent un rôle très important dans le développement de la maladie11. De ce point de vue, clarifier comment les cellules épithéliales modifient et régulent les cellules en aval sous l’effet de la stimulation de substances nocives est un problème scientifique qui doit être résolu de toute urgence.

Récemment, plusieurs modèles animaux de BPCO qui ont surmonté certaines limites ont été signalés12. Des niveaux modérés d’inflammation des voies respiratoires neutrophiles, une signature inflammatoire Th1/Th17, une hyperproduction marquée de mucus, une augmentation du remodelage des voies respiratoires, une diminution de la fonction pulmonaire et des espaces aériens élargis peuvent être observés dans ces modèles. Bien que ces modèles ne nécessitent qu’un mois pour établir des changements semblables à ceux de la BPCO, ce qui s’est passé chez les souris exposées à la fumée de cigarette dans un délai d’un mois n’est toujours pas clair. L’utilisation de la stimulation CSE à long terme a l’avantage d’être plus facile à calibrer, ce qui signifie que les cellules épithéliales des voies respiratoires peuvent être exposées à des stimuli de cigarette aussi sévères que possible sans mourir, tout comme les cellules épithéliales des voies respiratoires chez les fumeurs. Dans ce cas, la surveillance des changements pathologiques dynamiques menant à l’inflammation des voies respiratoires et à la formation d’emphysème est essentielle pour mieux comprendre la pathogenèse de la BPCO liée au tabagisme. Par conséquent, nous avons établi un modèle in vitro pour imiter l’état de la fumée et essayé de surveiller les changements dynamiques lors de l’exposition du CSE aux cellules épithéliales des voies respiratoires. De plus, les cellules épithéliales des voies respiratoires relativement purifiées rendent l’étude multi-omique plus facile que celle des tissus entiers, ce qui peut nous aider à trouver les réponses moléculaires et cellulaires dans les cellules épithéliales des voies respiratoires exposées à la CSE et à identifier les voies clés et les cibles thérapeutiques de la BPCO à haut débit.

Ici, le protocole décrivant l’isolement des cellules épithéliales trachéales murines est adapté des protocoles de Hilaire et al.13, et You et al.14 avec quelques modifications. Dans le protocole utilisé dans cette étude, les cellules épithéliales des voies respiratoires murines ont été propagées et différenciées en une structure pseudostratifiée contenant des cellules ciliées et caliciformes à l’aide d’une interface air-liquide et d’un milieu contenant des CSE, établissant ainsi un modèle d’acclimatation chronique aux CSE. Les événements suivants sont les points clés du modèle actuel.

Étant donné que la luxation cervicale pouvait forcer mécaniquement le cou et endommager physiquement les cellules épithéliales, et que l’anesthésie à l’hydrate de chloral pouvait également avoir un impact sur les voies respiratoires, le pentobarbital sodique a été utilisé pour l’euthanasie15. Lors d’interventions chirurgicales sur des souris, immerger uniquement le cou et les zones inférieures pour empêcher l’alcool de pénétrer dans le nez pourrait augmenter la viabilité des cellules épithéliales des voies respiratoires16. Les données préliminaires de la présente étude ont démontré que les cellules épithéliales des voies respiratoires soumises à une intubation trachéale ou à une immersion alcoolique avaient une faible viabilité et ne se développaient pas. De plus, pour obtenir des cellules épithéliales des voies respiratoires sans érythrocytes, il faut être prudent lors des interventions chirurgicales pour éviter la contamination sanguine lors de l’isolement des voies respiratoires principales.

Même chez les souris exemptes d’agents pathogènes spécifiques, les voies respiratoires ont colonisé des microbes importants. L’ajout d’antibiotiques appropriés dans le milieu d’expansion des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires murines P0 est essentiel pour éviter la contamination par des agents pathogènes bactériens ou fongiques. Une solution cocktail de pénicilline, de streptomycine, d’amphotéricine B et de gentamicine17 assure efficacement l’expansion des cellules épithéliales des voies respiratoires murines P0 dans un environnement stérile in vitro . Des expériences préliminaires ont démontré que s’il n’y a pas d’inhibition efficace de la contamination bactérienne, les cellules épithéliales des voies respiratoires murines P0 mourront avant le premier passage.

Dans les méthodes de digestion, 4 °C et 37 °C ont été testés. Les résultats d’expériences préliminaires ont indiqué que la digestion à 37 °C surpassait 4 °C en termes d’efficacité temporelle, de viabilité cellulaire et de rendement cellulaire.

Avant l’ensemencement des cellules épithéliales, le collagène de la queue de rat était dissous dans de l’acide acétique et utilisé pour l’enrobage de la boîte de culture afin d’améliorer l’adhésion des cellules épithéliales18. Cependant, la densité de l’enrobage de collagène ne doit être ni trop élevée ni trop faible ; Une densité insuffisante ne permet pas de fournir des conditions d’adhérence adéquates, tandis qu’une densité excessive entraîne la formation de résidus cristallins à la surface de la culture.

Une étape critique consiste à maintenir plus de cellules épithéliales en vie et à éviter la contamination par les fibroblastes. Pour y parvenir, nous recommandons que 1) l’utilisation du kit de dissociation cellulaire sans composants animaux puisse isoler en douceur les cellules épithéliales et réduire les dommages cellulaires inutiles et 2) l’utilisation d’un milieu différentiel contenant de l’hydrocortisone puisse inhiber la croissance des fibroblastes et favoriser la prolifération des cellules épithéliales.

Les cultures monocouches submergées traditionnelles de cellules épithéliales des voies respiratoires ont été un élément de base de la recherche respiratoire et des études toxicologiques. Cependant, ces méthodes ne parviennent pas à reproduire avec précision les caractéristiques différenciées des tissus épithéliales des voies respiratoires telles qu’elles sont observées in vivo. Pour remédier à cette limitation, nous avons opté pour un modèle épithélial alternatif des voies respiratoires. Ce modèle est basé sur la culture de cellules primaires des voies respiratoires sur des échafaudages à membrane microporeuse, tels que ceux fournis par les systèmes transwell, à une interface air-liquide19. L’exposition de la surface apicale à l’air ambiant dans cette configuration de culture ALI est essentielle pour favoriser la différenciation cellulaire, imitant ainsi plus étroitement les conditions in vivo 20.

Si la différenciation n’est pas efficace, il est crucial d’évaluer les raisons potentielles. Cela inclut la possibilité que les cellules épithéliales des voies respiratoires aient subi un passage excessif, ce qui peut compromettre leur capacité de différenciation. De plus, il est impératif de s’assurer que l’accumulation de mucus et de liquide dans la chambre apicale est complètement éliminée pendant le processus d’échange de milieu toutes les deux semaines, car le contenu résiduel peut entraver le processus de différenciation.

Bien que ce modèle présente certaines limites, il demeure un outil précieux pour la recherche. L’une des limites est que l’utilisation d’un milieu contenant du CSE pour stimuler les cellules épithéliales des voies respiratoires peut ne pas reproduire complètement les conditions in vivo rencontrées par les cellules épithéliales des voies respiratoires chez les fumeurs. De plus, la viabilité des cellules épithéliales ciliées différenciées in vitro est généralement limitée à un mois. Malgré ces contraintes, le modèle intègre efficacement plusieurs aspects clés : il facilite l’étude de la différenciation des cellules épithéliales des voies respiratoires à l’interface air-liquide, l’acclimatation à long terme à la CSE et l’application d’une analyse multi-omique sur une certaine période de temps. Cette approche globale offre un cadre sophistiqué et holistique pour les recherches futures sur les mécanismes physiologiques et pathologiques des cellules épithéliales des voies respiratoires. De plus, il aide à l’identification de biomarqueurs potentiels et de cibles thérapeutiques pour les maladies des voies respiratoires. Nous espérons que notre expérience fournira des informations utiles à ceux qui souhaiteraient utiliser ce modèle pour des études pertinentes.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82090013).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100x pénicilline/streptomycine solutionGibco15140122
24 mm Transwell avec 0,4 µ ; m Insert de membrane en polyester poreux, stérileBIOFILTCS016012
40 & micro ; m Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotéricine SolutionGibcoR01510
acétylé &alpha ;-tubulineCST#5335
Acétyl-&alpha ;-tubuline (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb  ;cellsignal#5335
Composant animal Kit de dissociation des cellules libresStemcell05426
Anticorps anti-cytokératinepanique abcamab7753
CigaretteMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Désoxyribonuclase I du pancréas bovinSigma-AldrichDN25
Désoxyribonuclase I du pancréas bovinSigmaDN25
Ham' s F-12Sigma-AldrichN6658
Solution d’héparine  ;Stemcell07980
Solution mère d’hydrocortisoneStemcell07925
Mucine 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Pénicilline-Streptomycine SolutionGibco15140122
PneumaCult-ALI
Cellule		souche05002  ;
PneumaCult-ALI 10x SupplémentStemcell05003  ;
PneumaCult-ALI Supplément d’entretienStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SupplémentStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus BasalMedium Stemcell05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Collagène de queue de ratCorning354236
Trypan BlueCellule souche07050²nbsp ;
basale

Références

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