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Identification de cellules quiescentes dans un modèle de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T de poisson-zèbre à l’aide de la coloration de la prolifération cellulaire

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DOI :

10.3791/67059

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19 juillet 2024

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1Pharmacology and Nutritional Sciences, The University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, The University of Kentucky, 3Department of Molecular and Cellular Biochemistry, The University of Kentucky

Dans cet article

Résumé

Nous avons utilisé la coloration de prolifération cellulaire pour identifier les cellules quiescentes dans le modèle de leucémie lymphoblastique aiguë T-poisson zèbre. La coloration est conservée dans les cellules non divisées et réduite pendant la prolifération cellulaire, ce qui permet de sélectionner les cellules dormantes pour une interrogation plus approfondie. Ce protocole fournit un outil fonctionnel pour étudier l’auto-renouvellement dans le contexte de la quiescence cellulaire.

Résumé

La quiescence cellulaire est un état d’arrêt de la croissance ou de prolifération ralentie qui est décrit dans les cellules souches normales et cancéreuses (CSC). La quiescence peut protéger les CSC contre les agents chimiothérapeutiques antiprolifératifs. Dans les modèles murins de xénogreffe dérivée de patients (PDX) de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T (T-LLA), les cellules quiescentes sont associées à la résistance au traitement et à la souche. Les colorants de prolifération cellulaire sont des outils populaires pour le suivi de la division cellulaire. Le colorant fluorescent est ancré de manière covalente dans des groupes d’amines sur la membrane et des macromolécules à l’intérieur de la cellule. Cela permet de suivre les cellules marquées jusqu’à 10 divisions, qui peuvent être résolues par cytométrie en flux.

En fin de compte, les cellules ayant les taux de prolifération les plus élevés auront une faible rétention de colorant, car il sera dilué à chaque division cellulaire, tandis que les cellules dormantes à division plus lente auront la rétention la plus élevée. L’utilisation de colorants de prolifération cellulaire pour isoler les cellules dormantes a été optimisée et décrite dans des modèles murins T-LAL. En complément des modèles murins existants, le modèle T-ALL dérivé du poisson-zèbre rag2 :Myc offre un excellent moyen d’interroger l’auto-renouvellement dans la T-ALL en raison de la fréquence élevée des cellules souches leucémiques (LSC) et de la commodité du poisson-zèbre pour les expériences de transplantation à grande échelle.

Ici, nous décrivons le flux de travail pour la coloration des cellules T-ALL du poisson-zèbre avec un colorant de prolifération cellulaire, l’optimisation de la concentration du colorant pour les cellules de poisson-zèbre, le passage des cellules colorées avec succès in vivo et la collecte de cellules avec différents niveaux de rétention de colorant par tri de cellules vivantes d’animaux transplantés. Étant donné l’absence de fabricants de surface cellulaire bien établis pour les LSC dans la T-ALL, cette approche fournit un moyen fonctionnel d’interroger les cellules quiescentes in vivo. Pour des résultats représentatifs, nous décrivons l’efficacité de la greffe et la fréquence LSC des cellules à haute et basse rétention de colorant. Cette méthode peut aider à étudier d’autres propriétés des cellules quiescentes, notamment la réponse aux médicaments, les profils transcriptionnels et la morphologie.

Introduction

Les cellules souches adultes sont responsables de la régénération des types de cellules différenciées dans un organe donné et sont principalement présentes dansun état dormant et non divisé1,2. Par exemple, les cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui maintiennent le sang, restent en grande partie quiescentes, et seule une petite fraction entre dans le cycle cellulaire pour s’auto-renouveler ou se différencier afin de générer des composants sanguins matures3. De même, dans les cancers, une sous-population rare de cellules appelées cellules souches cancéreuses (CSC) possède la capacité de s’auto-renouveler et est responsable du maintien à long terme de la malignité4. Les cellules souches cancéreuses existent in vivo dans un état de quiescence ou de croissance lente, ce qui peut leur permettre d’échapper aux traitements anti-prolifératifs contre le cancer5, d’échapper à l’élimination par le système immunitaire6, de réduire le stress oxydatif et d’améliorer leurs voies de réparation de l’ADN7. Même un petit nombre de CSC laissés après le traitement peut potentiellement repeupler la tumeur, entraînant une rechute du patient8. Par conséquent, la compréhension de la quiescence cellulaire est très prometteuse pour l’identification des vulnérabilités potentielles des CSC et le développement de nouvelles façons de les cibler.

Les colorants de prolifération cellulaire, tels que la coloration à l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) et ses dérivés, sont couramment utilisés pour suivre la fréquence des divisions cellulaires9. Le colorant s’infiltre à travers la membrane cellulaire et, une fois à l’intérieur de la cellule, subit une activation par des estérases intracellulaires en un produit fluorescent. Le composé fluorescent résultant est retenu à l’intérieur de la cellule par les liaisons amide covalentes formées entre la fraction succinimidyle et les groupes fonctionnels amines des protéines intracellulaires10. À chaque division cellulaire, le composé fluorescent est divisé également entre les deux cellules résultantes, provoquant une double dilution du signal. Ce colorant permet de détecter jusqu’à 10 divisions cellulaires grâce à l’analyse par cytométrie en flux11.

Cette approche a déjà été utilisée pour enrichir les populations de CSC in vitro en identifiant les populations de cellules à cycle lent avec une rétention élevée du colorant11,12. Dans la LAL-T, le CFSE a été utilisé pour suivre la croissance tumorale in vivo dans des xénogreffes dérivées de patients chez la souris. Après le marquage cellulaire et trois semaines après la greffe, l’analyse par cytométrie en flux a montré une population rare de cellules qui conservaient encore la fluorescence CFSE. Cette population était associée à la souche, à la résistance au traitement et à une grande similitude avec les cellules responsables de la rechute chez les patients13. En conséquence, ce colorant fournit un outil utile pour l’étude des phénotypes des cellules souches leucémiques (LSC) dans la LAL-T.

L’objectif du travail est d’étendre l’application du colorant de prolifération cellulaire à l’étude de la quiescence in vivo à l’aide d’un modèle T-ALL de poisson-zèbre. En particulier, le modèleT-ALL 14 du poisson-zèbre piloté par rag2 :Myc offre un excellent lieu pour l’étude de l’auto-renouvellement en raison de la fréquence élevée des LSC par rapport aux modèles murins et aux maladies humaines15. De plus, l’utilisation du poisson-zèbre permet des études de transplantation à grande échelle, qui peuvent être effectuées à un coût de soins et d’entretien beaucoup plus faible que leurs homologues souris16. Les poissons-zèbres sont également excellents pour les applications d’imagerie en direct, car les cellules tumorales marquées par fluorescence peuvent être facilement visualisées à l’aide d’un simple microscope à fluorescence pour estimer le taux de développement tumoral16.

Dans ce protocole, nous décrivons le flux de travail pour la coloration des cellules T-ALL du poisson-zèbre avec un colorant de prolifération cellulaire, suivie de la propagation in vivo des cellules colorées chez le poisson-zèbre syngénique CG1. Lors de l’apparition d’une leucémie, nous décrivons le tri des cellules qui ont conservé le colorant et leur utilisation pour une expérience ultérieure de transplantation à dilution limite afin de quantifier les taux d’auto-renouvellement des LSC. Ce protocole peut être étendu à d’autres applications, y compris le criblage in vivo de composés potentiels pour le ciblage des LSC quiescents. De plus, les cellules collectées peuvent être utilisées pour différentes analyses en aval, telles que le profilage transcriptomique, la protéomique et la métabolomique, offrant des informations uniques sur le comportement des LSC quiescentes dans la T-ALL.

Protocole

Dans ce protocole, nous utilisons des cellules T-ALL de poisson-zèbre marquées à la GFP qui ont été générées précédemment dans la souche CG1 et peuvent donc être directement injectées dans le poisson-zèbre syngénique CG115 du receveur. En bref, la leucémie a été générée par micro-injection d’ADN de rag2 :Myc et rag2 :GFP dans des embryons de poisson-zèbre CG1 unicellulaires. Les animaux ont été surveillés pour le développement d’une leucémie à partir de 3 semaines après l’injection, à l’aide de la microscopie à fluorescence. Des cellules leucémiques positives à la GFP ont été isolées par FACS et transplantées en série chez des poissons-zèbres CG1 receveurs pour générer des clones avec une fréquence élevée de LSC. Les détails de l’ensemble du protocole sont décrits par Blackburn et al.15.

Alternativement, la T-ALL primaire dérivée de rag2 :Myc peut être générée par micro-injection d’ADN d’embryons de poisson-zèbre17. La micro-injection d’ADN de rag2 :Myc avec un rapporteur fluorescent piloté par rag2 tel que la GFP peut entraîner le développement de cellules B, de cellules T et de ALL18 mixtes. Il a été précédemment vérifié que les clones de leucémie utilisés dans ce protocole étaient des T-ALL15. Toutes les procédures expérimentales impliquant le poisson-zèbre ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Kentucky, protocole 2019-3399.

1. Propagation des cellules T-ALL de poisson-zèbre in vivo

  1. Décongeler un flacon contenant 1 mL de cellules T-ALL de poisson-zèbre marquées à la GFP congelées dans un bain-marie à 37 °C en agitant doucement, jusqu’à ce qu’il soit décongelé. Une fois décongelé, transférez-le dans de la glace.
  2. Pipetez lentement le contenu du tube dans un tube conique de 15 ml avec 4 ml de milieu de poisson (0,9x PBS + 5% FBS) pour diluer le milieu de congélation.
  3. Faites tourner pendant 5 min à 2 500 × g à 4 °C. Retirez le support de la pastille. Remettre en suspension dans 0,5 mL de milieu de poisson et garder les cellules sur de la glace.
  4. Comptez les cellules et diluez-les si nécessaire à 100 000 cellules/5 μL.
  5. Anesthésie le poisson-zèbre CG1 adulte en ajoutant 200 μL d’un anesthésique à 4 mg/mL (MS-222) à 25 mL d’eau du système piscicole dans une boîte de Pétri. Tenez le poisson CG1, côté ventral vers le haut et injectez 5 à 6 μL dans l’espace intrapéritonéal (IP) à l’aide d’une seringue d’un microlitre Hamilton. Ramenez les animaux dans leurs bassins et surveillez le retour à la nage normale avant de les remettre dans le système.
    REMARQUE : Des poissons-zèbres adultes, âgés de 60 jours ou plus, ont été utilisés pour les études de transplantation décrites dans ce protocole.
  6. Surveiller la croissance de la leucémie une fois par semaine à l’aide d’un microscope à fluorescence. Voir la section 2 ci-dessous pour plus de détails sur la procédure de dépistage.

2. Prélèvement de cellules leucémiques marquées par fluorescence

  1. Environ 21 à 28 jours après la transplantation, anesthésier le poisson-zèbre CG1 adulte en ajoutant 200 μL (4 à 5 gouttes) d’anesthésique à 4 mg/mL à 25 mL d’eau du système piscicole dans une boîte de Pétri.
  2. Examinez le poisson-zèbre CG1 pour détecter la charge leucémique en évaluant le pourcentage de cellules leucémiques marquées à la GFP chez l’animal à l’aide d’un microscope épifluorescent, en utilisant le filtre approprié pour détecter la fluorescence de la GFP. La leucémie positive à la GFP est prête à être récoltée si elle s’est propagée à >70 % de l’animal.
  3. Euthanasier l’animal en ajoutant 1 mL d’anesthésique à 4 mg/mL dans une boîte de Pétri contenant 9 mL d’eau du système du poisson. Permettez à tous les signes de vie de cesser ; Par exemple, observez le poisson pour l’arrêt du mouvement operculaire (~5 min).
  4. Placez le poisson-zèbre dans une nouvelle boîte de Pétri et ajoutez 1 ml de milieu de poisson pour servir de tampon pour les cellules. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir, décapitez d’abord le poisson-zèbre, puis faites macérer le tissu à l’aide de la même lame de rasoir. Pipette de haut en bas pour déloger de gros amas de cellules.
  5. Passez les cellules à travers une crépine de 40 μm dans un tube conique de 50 mL pour les dissocier en une suspension unicellulaire. Gardez les cellules sur de la glace.

3. Optimisation de la concentration en colorant de prolifération cellulaire (CellTrace Far Red) pour la coloration et la viabilité cellulaire du poisson-zèbre

REMARQUE : Pour ce protocole, et puisque les cellules tumorales sont marquées à la GFP, nous avons utilisé un colorant de prolifération des cellules rouges lointaines (CellTrace Far Red) pour éviter le chevauchement spectral, qui sera appelé CT-FR.

  1. Préparez une solution de 1 mM de colorant fluorescent immédiatement avant l’utilisation en ajoutant le volume approprié de DMSO selon les recommandations du fabricant. Avoir des solutions de travail de 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM et 0,01 mM ; Diluer au besoin dans un milieu de poisson pour tester la viabilité cellulaire après la coloration.
  2. Comptez les cellules et prélevez 1 × 106 cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml.
  3. Centrifugeuse à 2 500 × g à 4 °C pendant 5 min. Retirez le liquide et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de PBS 0,9x.
  4. Répartissez la suspension cellulaire entre quatre tubes de 250 μL chacun pour le traitement par CT-FR.
  5. Ajoutez 250 μL de PBS 0,9x pour porter le volume à 500 μL chacun avec environ 250 000 cellules/tube.
  6. Ajouter les quantités requises des solutions de travail décrites ci-dessus dans chacun des quatre tubes pour obtenir les concentrations finales suivantes : 1 μM, 0,5 μM, 0,1 μM et 0,05 μM. Incuber pendant 20 min à 37 °C, à l’abri de la lumière.
  7. Granulez les cellules en les faisant tourner à 2 500 × g pendant 5 min à température ambiante. Retirez le liquide et lavez les cellules avec 500 μL de milieu de poisson pour éliminer l’excès de colorant.
  8. Granulez à nouveau, retirez le liquide et mettez-le en suspension dans 25 μL de milieu de poisson. Utilisez 1 μL pour compter les cellules dans une dilution de 1:10 dans du bleu de trypan à 50 %.
  9. Examiner les cellules au microscope pour déterminer leur viabilité ; Les cellules vivantes ne conserveront pas le bleu trypan et apparaîtront brillantes au microscope, tandis que les cellules mortes absorberont le colorant et apparaîtront sombres. Examinez d’abord les cellules sous le canal de fluorescence approprié pour identifier les cellules tumorales, puis utilisez le canal en fond clair pour évaluer la viabilité cellulaire.
  10. Sélectionnez la concentration qui permet une coloration réussie tout en maintenant la viabilité cellulaire (>90 % de cellules négatives au bleu trypan).
    REMARQUE : Pour les cellules T-ALL du poisson-zèbre testées dans cette expérience, une concentration de 1 μM a été utilisée pour une coloration réussie et >90 % de la viabilité cellulaire.

4. Propagation in vivo de cellules de poisson-zèbre T-ALL colorées CT-FR

  1. À l’aide de la concentration CT-FR optimisée de la section 3, colorez les cellules de poisson-zèbre. Laissez certaines cellules tumorales non colorées pour la génération de la tumeur T-ALL marquée à la GFP, en tant que contrôle positif à la GFP lors du tri FACS. Diluez les cellules colorées et non colorées à 50 000 cellules/5 μL pour la transplantation.
  2. Anesthésie le poisson-zèbre CG1 adulte en ajoutant 200 μL d’anesthésique à 4 mg/mL à 25 mL d’eau du système piscicole dans une boîte de Pétri.
  3. Injecter 5 μL de suspension cellulaire dans la cavité IP du poisson-zèbre comme décrit à la section 1 pour les cellules colorées et non colorées. Injectez 5 à 6 poissons-zèbres par groupe pour tenir compte de la mortalité potentielle après l’injection.
  4. Examinez les animaux par microscopie fluorescente sous sédation 2 fois par semaine pour le développement de la leucémie.
    REMARQUE : Après ~10-14 jours, la leucémie devrait occuper environ 30-40% de ce corps. Planifiez la récolte de la leucémie et le tri ultérieur dans ce laps de temps. Attendre que la tumeur s’étende à une grande taille pourrait entraîner une plus grande dilution du colorant cellulaire fluorescent et une difficulté à détecter son signal. Envisager l’optimisation du moment de la récolte de la tumeur pour le modèle tumoral choisi. De plus, une surveillance tumorale plus fréquente est recommandée ici pour assurer la capture de la taille tumorale souhaitée.

5. Préparation au tri des cellules T-ALL de poisson-zèbre colorées au CT-FR

  1. Préparez les contrôles suivants pour le tri des cellules : Aucun contrôle de couleur (non coloré, non transgénique, suspension unicellulaire, provenant d’un poisson zèbre de type sauvage), cellules T-ALL marquées à la GFP et cellules de poisson-zèbre CT-FR WT nouvellement colorées (pour définir un seuil maximal de signal Far-Red).
  2. Préparation des contrôles non colorés et CT-FR
    1. Récoltez des cellules de poisson sauvage (WT) en euthanasiant un poisson-zèbre CG1 non transplanté en ajoutant 1 mL d’anesthésique à 4 mg/mL dans une boîte de Pétri contenant 9 mL d’eau du système piscicole.
    2. Placez le poisson-zèbre dans une nouvelle boîte de Pétri et ajoutez 1 ml de milieu de poisson pour servir de tampon pour les cellules. Utilisez une nouvelle lame de rasoir pour décapiter puis faire macérer le poisson-zèbre à l’aide de la même lame de rasoir ; Pipette de haut en bas pour déloger les gros amas de cellules.
    3. Passez les cellules à travers une crépine de 40 μm dans un tube conique de 50 mL pour les dissocier en une suspension unicellulaire. Gardez les cellules sur de la glace.
    4. Pour le contrôle CT-FR, transférez 250 000 cellules WT dans un tube de microcentrifugation et granulez les cellules par centrifugation à 2 500 × g pendant 5 min à température ambiante. Retirez le milieu de poisson et ajoutez 500 μL de FBS 0,9x PBS+ 1%.
    5. Ajouter 0,5 μL de la solution mère de colorant CT-FR de 1 mM pour une concentration finale de 1 μM. Pipeter doucement avec une pipette de 1 000 μL pour mélanger. Incuber à 37 °C pendant 20 min, à l’abri de la lumière.
    6. Retirez le liquide et lavez les cellules avec 500 μL de milieu de poisson pour éliminer l’excès de colorant.
    7. Granulez à nouveau les cellules par centrifugation, retirez le liquide et remettez les cellules en suspension dans 500 μL de 0,9x PBS+ 1% FBS et passez à travers un capuchon filtrant de 35 μm dans un tube FACS. Restez sur la glace.
  3. Préparation de la plaque donneuse
    REMARQUE : La plaque donneuse est une plaque à fond en V de 96 puits dans laquelle les cellules T-ALL colorées CT-FR de poisson-zèbre transplanté seront triées. Chaque puits de la plaque contient 5 000 cellules WT CG1 non colorées dans 50 μL de milieu de poisson pour servir de support pour aider à granuler les cellules triées dans les étapes suivantes.
    1. Comptez 500 000 cellules CG1 WT et transférez-les dans un tube conique de 15 ml.
    2. Diluez ce stock cellulaire à 100 cellules/μL en ajoutant 5 mL de milieu de poisson.
    3. Versez 50 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Mélangez le tube de suspension cellulaire après chaque rangée pour maintenir l’homogénéité de la suspension cellulaire. Maintenir l’assiette à 4 °C jusqu’au tri.
  4. Préparation des échantillons de poissons transplantés
    1. Sélectionnez des poissons transplantés à 30-40 % de charge T-LAL. Collectez des poissons transplantés avec les cellules colorées CT-FR et les cellules tumorales GFP non colorées.
    2. Récoltez les cellules comme décrit à la section 2.
      REMARQUE : Étant donné que l’on s’attend à ce que les cellules retenant le colorant soient présentes en faible abondance, préparez-vous à trier un grand nombre de cellules de l’échantillon CT-FR GFP.
    3. Diluer à la concentration appropriée pour le tri ~3-5 × 106 cellules/mL dans 0,9x PBS + 1% FBS et passer à travers un capuchon filtrant de 35 μm dans un tube FACS. Ajouter du DAPI (1 mg/mL) à une dilution de 1:1 000 comme colorant vital pour exclure les cellules mortes. Restez sur la glace.
    4. Pour les cellules tumorales GFP non colorées, transférez 250 000 cellules dans un tube de microcentrifugation et granulez à 2 500 × g pendant 5 min à température ambiante. Retirez le média pour poissons, ajoutez 500 μL de PBS et passez-le à travers un capuchon filtrant de 35 μm dans un tube FACS. Restez sur la glace.

6. Tri

REMARQUE : Gardez tous les tubes et la plaque donneuse sur de la glace tout le temps, sauf lorsqu’ils sont utilisés pour le tri.

  1. Pour trier les paramètres et les portes, commencez par appliquer le contrôle de diffusion avant et latéral pour identifier les cellules d’intérêt en fonction de leur taille et éliminer les débris cellulaires. Ensuite, utilisez la hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant pour exclure les cellules en double et ne conserver que les singlets. Enfin, utilisez les commandes sans couleur et unicolore pour dessiner les quadrants afin d’identifier les populations cellulaires positives à la GFP et à la CT-FR.
    REMARQUE : On s’attend à ce que le témoin CT-FR soit beaucoup plus brillant que les échantillons pour le tri, car la coloration du témoin a été effectuée à l’état frais, sans divisions cellulaires ; les cellules des échantillons CT-FR GFP devraient apparaître à l’extrémité inférieure de la porte positive CT-FR.
  2. Triez le nombre de cellules à transplanter dans chaque poisson dans un puits de la plaque donneuse.
    REMARQUE : Pour cette expérience, nous avons utilisé un test de dilution limite pour estimer la fréquence des cellules souches de leucémie dans CT-FR High et CT-FR Low. Ce test a utilisé une dose de 25 cellules, transplantées chez 3 animaux, et une dose de 10 cellules, transplantées chez 10 animaux. Un test de dilution limite typique utilisant la T-ALL dérivée du poisson-zèbre rag2 :Myc impliquerait un groupe avec un nombre plus élevé de cellules (500 ou 1 000) puisque la fréquence des LSC dans ce modèle est estimée à 1 LSC dans des centaines de cellules. Cependant, dans cet essai, nous utilisons l’un des clones T-ALL précédemment décrits par Blackburn et al.15. La fréquence LSC dans l’échantillon utilisé ici est de ~1 LSC dans des dizaines de cellules ; Nous prévoyons que la leucémie sera détectée chez les animaux transplantés dans le groupe de 25 cellules. Lors de l’optimisation de ce test pour votre modèle de maladie, des précautions doivent être prises lors de la sélection du groupe de nombre de cellules le plus élevé pour assurer la greffe de la tumeur.
  3. Après le tri, gardez la plaque sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête pour la transplantation.
    REMARQUE : Les procédures de tri peuvent être stressantes et affecter la viabilité cellulaire. Avant d’exécuter l’expérience de dilution limite, une expérience pilote de tri a été réalisée. Les cellules triées ont été transplantées et le développement de la leucémie a été surveillé pour déterminer si le tri nuisait à la viabilité cellulaire. Alternativement, la viabilité cellulaire peut être évaluée en colorant les cellules triées avec du bleu de trypan et en les examinant au microscope avant la transplantation.

7. Transplantation de cellules triées à la limitation de la dilution et suivi de l’apparition de la tumeur

  1. Faites tourner la plaque à l’aide d’une grande centrifugeuse de paillasse à 2 500 × g à 4 °C.
  2. Retirez soigneusement 45 μL de surnageant de chaque puits, en laissant 5 μL de liquide derrière vous et en vous assurant d’éviter de toucher la pastille de cellule au fond du puits.
  3. Remettez les cellules en suspension à l’aide d’une pipette de 20 μL. Remettez en suspension 2-3 puits avec la pipette, puis à l’aide de la seringue d’un microlitre Hamilton, injectez les suspensions cellulaires de chaque puits dans le nombre souhaité de poissons-zèbres CG1 via une greffe IP. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans le groupe de puits suivant pour éviter que les cellules ne se déstabilisent.
  4. Examinez le poisson-zèbre par microscopie à fluorescence sous sédation une fois par semaine pour le développement de la LAL-T pendant au moins 6 semaines.

8. Détermination de la fréquence des cellules souches de la leucémie

  1. Enregistrer le nombre d’animaux positifs par dose cellulaire et par groupe de traitement 6 semaines après la greffe, en considérant que les animaux présentant n’importe quelle quantité de signal GFP sont positifs. Considérez que les animaux ont une charge leucémique importante lorsque le signal GFP occupe >50 % du corps.
  2. Utilisez le logiciel statistique ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)19 pour calculer la fréquence des CSL au sein de chaque population cellulaire.
    REMARQUE : Une illustration schématique du flux de travail est fournie à la figure 1.

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Figure 1 : Flux de travail pour l’utilisation de la coloration de suivi cellulaire pour isoler les cellules quiescentes dans le modèle T-ALL du poisson-zèbre. Illustration schématique de la coloration des cellules T-ALL du poisson-zèbre avec la coloration de prolifération cellulaire, de la propagation dans un poisson-zèbre CG1 (panneau du haut) et du tri des cellules en fonction de la rétention de la coloration de prolifération cellulaire (panneau du milieu). Les cellules collectées ont été utilisées pour un test de dilution limite afin de déterminer la fréquence des LSC (panneau inférieur). Abréviations : LAL-T = leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T ; LSC = cellules souches leucémiques ; CT-FR = CellTrace Far Red ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine ; PE = phycoérythrine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Nous avons suivi le protocole décrit ci-dessus pour trier les cellules qui ont conservé le colorant de prolifération cellulaire, CT-FR, et nous les avons utilisées pour un test de dilution limite (LDA) afin d’estimer la fréquence des LSC dans les populations CT-FR High et CT-FR Low. Pour définir le point de déclenchement de l’expérience de cytométrie en flux, nous avons utilisé un contrôle sans fluorophore (sans couleur) en plus des contrôles unicolores (Figure 2A). Ces quadrants ont été utilisés pour identifier les populations positives et négatives au FITC et au PE pour la mise en place des portes de tri. Le contrôle positif unicolore CT-FR a été préparé le même jour que le tri en colorant les cellules WT d’un poisson-zèbre non transplanté, et donc, l’intensité du signal devrait être beaucoup plus élevée que le signal des cellules propagées dans l’échantillon.

Dans les cellules GPF T-LAL colorées CT-FR (Figure 2B), les cellules apparaissant dans le quadrant supérieur droit à une faible fréquence de 0,13 % ont été considérées comme CT-FR élevées, et une porte de tri étiquetée « CT-FR élevée » a été placée dans ce quadrant. Une autre porte a été créée dans le quadrant inférieur droit pour recueillir les cellules leucémiques CT-FR Low. Étant donné que les cellules CT-FR High existaient en faible abondance dans l’échantillon tumoral, un grand nombre de cellules (~2,5 × 106) ont été triées pour collecter le nombre nécessaire de cellules pour l’expérience de dilution limitante.

Après avoir transplanté le poisson-zèbre CG1 avec les cellules triées pour le LDA, le poisson-zèbre a été suivi pendant 6 semaines. Les cellules de la CT-FR High avaient une fréquence de LSC quatre fois plus élevée que celles de la population cellulaire CT-FR Low (p = 0,0134) (figure 3A). Des images représentatives d’animaux 28 jours après la transplantation sont présentées (figure 3B). Dans le groupe CT-FR élevé, dose de 10 cellules, 8 animaux sur 9 (89 %) ont développé une leucémie, contre 2 sur 10 (20 %) dans le groupe CT-FR faible (figure 3A). Les animaux du groupe CT-FR High avaient une latence significativement plus courte jusqu’à la leucémie (p = 0,0014) (Figure 3C). Enfin, les animaux de l’école CT-FR High avaient une survie globale significativement plus faible (p = 0,0408) (figure 3D) ; à la semaine 6, 70 % des animaux CT-FR Low étaient en vie, contre seulement 10 % des animaux CT-FR High. Ces résultats démontrent l’enrichissement des LSC auto-renouvelées au sein de la population cellulaire quiescente à division lente dans le modèle T-ALL de poisson-zèbre piloté par rag2 :Myc et l’utilisation de la coloration de prolifération cellulaire pour isoler cette population.

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Figure 2 : Tri cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux. (A) Des tracés FACS à partir de cellules WT fraîchement colorées par CT-FR et de cellules T-ALL marquées à la GFP ont été utilisés pour créer les portes de tri des cellules colorées CT-FR. Cellules GFP+ T-LAL. (B) Exemple représentatif des cellules GFP+ T-ALL colorées CT-FR propagées. Les cellules du quadrant supérieur droit ont été considérées comme CT-FR élevée et les cellules du quadrant inférieur droit ont été considérées comme CT-FR faible. Abréviations : LAL-T = leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T ; CT-FR = CellTrace Far Red ; GFP = protéine fluorescente verte ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine ; PE = phycoérythrine ; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence ; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Fréquence significativement plus élevée de LSC dans les cellules à forte rétention de la coloration de prolifération cellulaire. (A) Données de l’essai de dilution limite indiquant le nombre d’animaux positifs à la leucémie après la transplantation avec deux doses croissantes de cellules (10 et 25 cellules). La fréquence LSC calculée et l’intervalle de confiance à 95 % sont indiqués (p = 0,0134). (B) Images représentatives d’animaux après 28 jours de transplantation ; barre d’échelle = 10 mm. (C) La latence jusqu’à une leucémie significative est considérée comme le temps nécessaire pour que >50 % de l’animal devienne positif à la GFP, ce qui représente un fardeau leucémique important. (D) Courbe de survie d’un animal transplanté avec 10 cellules. Abréviations : LSC = cellules souches leucémiques ; CT-FR = CellTrace Far Red. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les CSL sont connues pour être résistantes aux traitements de chimiothérapie anti-prolifératifs conventionnels, et la découverte de thérapies ciblées contre ces cellules est très prometteuse pour réduire l’occurrence des rechutes et améliorer le pronostic des patients20. Des recherches antérieures ont décrit l’utilisation de colorants fluorescents de prolifération cellulaire pour identifier une petite population de cellules quiescentes associées à la résistance aux médicaments et à la souche dans les modèles T-ALL PDX13. Dans ce travail, nous décrivons l’utilisation d’une coloration similaire de prolifération cellulaire pour résoudre les cellules à division lente ou quiescentes dans un modèle de poisson-zèbre de T-ALL. Nous avons utilisé cet outil pour décrire l’enrichissement des LSC dans les cellules avec la plus forte rétention de la coloration de prolifération cellulaire. L’extension de ces investigations au poisson-zèbre offre de nombreux avantages. Les poissons-zèbres sont très féconds ; Chaque couple d’accouplement peut générer des centaines de progénitures chaque semaine, ce qui alimente la transplantation et limite les études de dilution qui nécessitent un grand nombre d’animaux 15,17,21. De plus, les poissons-zèbres sont très pratiques pour l’imagerie in vivo, permettant le dépistage rapide des animaux positifs par simple microscopie à fluorescence16. En conséquence, ce protocole peut servir de base à une étude supplémentaire des cellules quiescentes dans le modèle T-ALL du poisson-zèbre.

Ici, nous décrivons l’utilisation de clones T-ALL avec une fréquence élevée de LSC qui étaient précédemment générés chez le poisson-zèbreCG1 15, ainsi, les cellules congelées ont simplement été décongelées et propagées pour être utilisées. Alternativement, la T-LAL induite par rag2 :Myc peut être générée par micro-injection d’ADN d’embryons de poisson-zèbre, le dépistage des animaux qui développent une T-LLA et la récolte de la leucémie à partir de poissons-zèbres positifs comme décrit précédemment17. L’utilisation du poisson-zèbre syngénique offre également de nombreux avantages pour ce type de recherche. Étant donné que les animaux sont génétiquement identiques, les cellules transplantées peuvent se greffer de manière robuste dans l’hôte sans avoir besoin de s’adapter à un nouveau micro-environnement, ce qui permet une estimation précise de la fréquence des LSC 15,17,22.

Comme alternative à l’utilisation d’animaux syngéniques, ce protocole peut être suivi en utilisant une souche de poisson-zèbre de type sauvage qui a subi une ablation immunitaire chimique ou radiologique. Si l’on utilise des animaux immuno-ablatés, il faut veiller à optimiser le test de dilution limitative, car davantage de cellules peuvent être nécessaires pour une greffe réussie dans une transplantation allogénique. De plus, en raison de la récupération du système immunitaire après 21 jours, une durée d’observation plus courte sera probablement nécessaire17. Ce protocole peut également être étendu à la xénotransplantation de cellules humaines. Les poissons-zèbres sont apparus comme un modèle efficace et rentable pour les xénogreffes de cancer, complémentaires à leurs homologuesmurins16. Les poissons-zèbres adultes immunodéficients prkdc−/−, il2rga−/− ont été utilisés pour greffer avec succès des cellules humaines à 37 °C pendant jusqu’à 60 jours23. Avec ce modèle, au lieu de se propager et de diviser les cellules colorées in vivo comme décrit ici, les cellules humaines peuvent être colorées et autorisées à se diviser in vitro , puis triées et transplantées dans un poisson zèbre prkdc−/−, il2rga−/− pour des études in vivo . Plusieurs limites doivent être prises en compte lors de l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle de xénogreffe. Par exemple, le poisson-zèbre doit être adapté pour survivre à 37 °C. De plus, les greffes orthotopiques pourraient ne pas être possibles pour certains cancers en raison de l’absence de certains organes chez le poisson zèbre, tels que le poumon et le sein16.

En conclusion, l’utilisation des colorants de prolifération cellulaire dans le modèle T-ALL du poisson-zèbre offre une voie prometteuse pour l’étude des CSL quiescentes et de leurs rôles dans le développement de la maladie et la résistance au traitement. En tirant parti des avantages du poisson-zèbre CG1, notamment sa rentabilité et son homogénéité génétique, ce protocole offre une plate-forme solide pour la compréhension de la biologie du LSC dans T-ALL. L’utilisation du modèle du poisson-zèbre peut compléter les modèles de souris et de PDX pour permettre le développement de thérapies optimisées et ciblées qui amélioreront à terme le pronostic des patients atteints de LAL-T.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le financement de cette recherche a été fourni par le National Cancer Institute (R37CA227656 à JSB). Cette recherche a également été financée par les ressources partagées en cytométrie en flux et en surveillance immunitaire du Markey Cancer Center (P30CA177558) de l’Université du Kentucky.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Micro-seringue 26 G/2"Hamilton87930NA
35 & micro ; m capuchon filtrant tubes FACSFalcon352235NA
40 & micro ; Filtre à cellulesm CELLTREAT229482NA
Plaque PCR à jupe 96 puitsThermo Fisher ScientificAB0800NA
Trieur de cellulesSony BiotechnologySY3200
NA CellTrace Far RedThermo Fisher ScientificC34564NA
Tubes coniquesVWR10026-078NA
DAPIThermo Fisher Scientific62248
NA DMSOSigma-AldrichD4818NA
Dulbecco’sSaline tamponnée au phosphate (PBS)Caisson Labs22110001NA
Stéréomicroscope à épifluorescenceNikonSMZ25NA
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma-Aldrich12306CNA
Système piscicole eauN/AN/ASalinité de 0,03 à 0,05 %, pH 6,5-8, tamponné avec du bicarbonate de sodium
Tubes à microcentrifugerThermo Fisher ScientificC2171NA
MS-222PentaireTRS-1mésylate de tricaïne, un anesthésique
Boîtes de PétriCorning07-202-011
NA Lames de rasoirAmerican Line66-0089NA
Trypan BlueThermo Fisher ScientifiqueT10282NA

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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Identification de cellules quiescentes dans un modèle de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T de poisson-zèbre à l’aide de la coloration de la prolifération cellulaire
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