Article de méthode

Génération et co-culture de microglie primaire murine et de neurones corticaux

DOI :

10.3791/67078

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26 juillet 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une co-culture microgliale-neuronale établie à partir de cellules neuronales primaires isolées d’embryons de souris aux jours embryonnaires 15-16 et de microglie primaire générée à partir du cerveau de souris néonatales aux jours postnatals 1er-2.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microglies sont des macrophages tissulaires du système nerveux central (SNC), remplissant de nombreuses fonctions qui soutiennent la santé neuronale et l’homéostasie du SNC. Il s’agit d’une population importante de cellules immunitaires associées à l’activité de la maladie du SNC, adoptant des phénotypes réactifs qui peuvent contribuer aux lésions neuronales lors de maladies neurodégénératives chroniques telles que la sclérose en plaques (SEP). Les mécanismes distincts par lesquels les microglies régulent la fonction neuronale et la survie au cours de la santé et de la maladie restent limités en raison des défis liés à la résolution des interactions complexes in vivo entre la microglie, les neurones et d’autres facteurs environnementaux du SNC. Ainsi, l’approche in vitro de la co-culture de la microglie et des neurones reste un outil précieux pour l’étude des interactions microglie-neurones. Ici, nous présentons un protocole pour générer et co-cultiver des microglies primaires et des neurones à partir de souris. Plus précisément, les microglies ont été isolées après 9 à 10 jours in vitro à partir d’une culture gliale mixte établie à partir d’homogénats cérébraux dérivés de souris néonatales entre les jours postnatals 0 et 2. Des cellules neuronales ont été isolées à partir de cortex cérébraux d’embryons de souris entre les jours embryonnaires 16 et 18. Après 4 à 5 jours in vitro, les cellules neuronales ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits, suivies de l’ajout de microglie pour former la co-culture. Un timing minutieux est essentiel pour ce protocole, car les deux types de cellules doivent atteindre la maturité expérimentale pour établir la co-culture. Dans l’ensemble, cette co-culture peut être utile pour étudier les interactions microglie-neurone et peut fournir plusieurs lectures, y compris la microscopie d’immunofluorescence, l’imagerie en direct, ainsi que des dosages d’ARN et de protéines.

Introduction

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Les microglies sont des macrophages résidants dans les tissus qui facilitent l’immunosurveillance et l’homéostasie dans le système nerveux central (SNC)1,2,3. Ils proviennent de cellules progénitrices érythromyéloïdes du sac vitellin qui colonisent le cerveau pendant le développement embryonnaire 4,5,6 et sont maintenues tout au long de la vie de l’organisme par l’auto-renouvellement, ce qui implique la prolifération et l’apoptose7. À l’état d’équilibre, les microglies au repos ont une morphologie ramifiée et s’engagent dans la surveillance tissulaire 8,9,10.

Les microglies expriment de nombreux récepteurs à la surface des cellules, ce qui leur permet de réagir rapidement aux modifications du SNC11,12 et de favoriser les réponses inflammatoires en cas d’infections ou de lésions tissulaires 12,13,14, ainsi que lors de maladies neurodégénératives 9,15, telles que la sclérose en plaques (SEP)16,17. Les microglies expriment également des récepteurs à divers neurotransmetteurs et neuropeptides 18,19,20, ce qui suggère qu’elles peuvent également répondre et réguler l’activité neuronale 21,22. En effet, la microglie et les neurones interagissent dans diverses formes de communication bidirectionnelle 8,23 telles que les interactions directes médiées par les protéines membranaires ou les interactions indirectes par le biais de facteurs solubles ou de cellules intermédiaires23,24.

Par exemple, divers neurotransmetteurs sécrétés par les neurones peuvent moduler l’activité neuroprotectrice ou inflammatoire de la microglie 25,26,27. De plus, les interactions directes entre les neurones et la microglie aident à maintenir la microglie dans un état homéostatique28. À l’inverse, les interactions directes de la microglie avec les neurones peuvent façonner les circuits neuronaux29 et influencer la signalisation neuronale 30,31,32. Comme les perturbations de ces interactions induisent une hyperexcitabilité des neurones30 et une réactivité microgliale 33,34, des interactions microgliales-neuronales dérégulées sont impliquées comme un facteur contributif aux maladies neurologiques33,35. En effet, les maladies psychotiques23,26 et neurodégénératives ont été décrites comme présentant des interactions microgliales-neuronales dysfonctionnelles33. Bien que ces observations soulignent l’importance de la communication microgliale-neuronale dans le SNC, les mécanismes spécifiques de la façon dont ces interactions régulent les fonctions microgliales et neuronales dans la santé et la maladie sont relativement inconnus.

Dans un milieu complexe tel que le SNC, de multiples facteurs environnementaux peuvent influencer les interactions microgliales-neuronales, ce qui limite la capacité d’étudier les interactions cellulaires transitoires in vivo. Ici, nous présentons un système de co-culture microglie-neuronale in vitro qui peut être utilisé pour étudier les interactions cellulaires directes entre la microglie et les neurones. Ce protocole décrit la génération de microglie primaire et de neurones à partir des cortex de souris néonatales entre les jours postnatals 0 à 2 et les jours 16 à 18 des souris embryonnaires, respectivement. Les neurones et les microglies sont ensuite co-cultivés dans des plaques de 96 puits pour des expériences à haut débit en aval. Nous avons précédemment utilisé cette approche pour démontrer que la phagocytose microgliale protège les neurones de la mort cellulaire médiée par la phosphatidylcholine oxydée37, suggérant que cette méthode peut aider à comprendre les rôles de la microglie dans le contexte de la neurodégénérescence et de la SEP. De même, les co-cultures microgliales-neuronales peuvent également être utiles pour étudier l’impact de la diaphonie microgliale-neuronale dans d’autres contextes tels que les infections virales38 ou les lésions et réparations neuronales39. Dans l’ensemble, les systèmes de co-culture microglie-neuronale in vitro permettent aux chercheurs d’étudier les interactions microglie-neuronale dans un environnement manipulable et contrôlé, qui complète les modèles in vivo.

Protocole

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Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été logés et manipulés avec l’approbation du Comité universitaire de protection des animaux (CCAC) de l’Université de la Saskatchewan et du Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Des souris mâles et femelles CD1 postnatales de jours 0 à 2 et des embryons embryonnaires de souris CD1 enceintes de jours 16 à 18 (E16-18) ont été utilisés pour cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Culture de microglie primaire

REMARQUE : Il est crucial de chronométrer les cultures mixtes de cellules gliales et neuronales afin que les microglies soient matures et prêtes à être récoltées dans les 2 jours suivant l’ensemencement des neurones dans une plaque de 96 puits.

  1. Préparation
    1. Milieu de culture gliale complet préchauffé, qui comprend le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose complété par 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, 50 U/mL de pénicilline/streptomycine avec 2,92 mg/mL de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 1 x acides aminés non essentiels et 20 mM de HEPES dans un bain-marie à 37 °C.
    2. Ajouter 5 mL de bromhydrate de poly-L-ornithine (PO) de 10 μg/mL dans chaque fiole T-75. Agitez doucement le ballon pour vous assurer que le PO recouvre complètement le fond du ballon. Incuber à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant au moins 1 h.
      REMARQUE : Cette étape de revêtement est nécessaire pour faciliter l’adhérence des cellules aux flacons T-75.
  2. Isolement du cerveau de souris nouveau-natales P0-P2
    REMARQUE : Stérilisez tous les outils de dissection et maintenez la stérilité des réactifs. Assurer le respect des techniques d’asepsie tout au long du processus.
    1. Avant de commencer la dissection, vaporisez le comptoir avec de l’éthanol à 70 % ou un spray désinfectant à l’endroit où la dissection aura lieu. Installez le microscope de dissection et placez la boîte de Pétri sous le microscope. Versez 20 ml de milieu L-15 de Leibovitz dans la boîte de Pétri. Gardez le couvercle de la boîte de Pétri allumé lorsque le microscope n’est pas utilisé pour réduire la contamination.
    2. Placez plusieurs couches d’essuie-tout et vaporisez soigneusement les essuie-tout avec de l’éthanol à 70 %. Préparez les outils de dissection (ciseaux de dissection, une paire de micro-pinces et une pince à tissus) en les vaporisant soigneusement avec de l’éthanol à 70 % et en posant les outils sur les serviettes en papier.
    3. Transférez la souris postnatale des jours 0 à 2 sur les serviettes en papier et vaporisez soigneusement la souris avec de l’éthanol à 70%. Décapitez la souris à l’aide de ciseaux de dissection (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
    4. Tout en tenant doucement la tête, créez une incision médiane dans le crâne en partant du cou vers le nez. Pelez le crâne avec une pince à tissu pour révéler le cerveau.
    5. À l’aide d’une pince à tissus, retirez doucement le cerveau en insérant la pince sous le cerveau et soulevez le cerveau de la tête. Placez immédiatement le cerveau dans la boîte de Pétri contenant 20 ml de L-15 de Leibovitz.
    6. À l’aide d’un microscope de dissection, retirez soigneusement le tronc cérébral et les méninges à l’aide d’une paire de micro-pinces. Prélever les cerveaux dans un tube conique de 50 ml contenant 5 ml de milieu L-15 de Leibovitz.
  3. Dissociation du cerveau, ensemencement et maintien de la culture gliale mixte
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes subséquentes dans une enceinte de biosécurité.
    1. Hachez les cerveaux en morceaux d’environ 1 mm2 avec une lame de scalpel stérile et jetable. Transférez soigneusement les cerveaux hachés dans un nouveau tube stérile de 50 ml.
    2. Aux cerveaux hachés, ajoutez une concentration finale de 0,25 % de trypsine et incubez le tissu dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min. Toutes les 2-3 minutes, mélangez la solution en inversant doucement le tube pour faciliter la dissociation des tissus.
    3. À partir de l’incubateur à 5 % de CO2 , transvaser les flacons T-75 contenant 5 mL d’OO dans l’enceinte de biosécurité. Jetez le PO et rincez les flacons 3 fois avec une solution tampon de phosphate stérile 1x (PBS). Assurez-vous de bien rincer les flacons, car l’excès de PO est toxique pour les cellules.
    4. Transférez le tissu digéré du bain-marie à 37 °C dans l’enceinte de biosécurité. Ajouter 5 mL de milieu de culture gliale complet pour neutraliser la trypsine. Mélangez délicatement la suspension tissulaire à l’aide d’une pipette de 10 ml.
    5. Placez une crépine stérile en nylon de 70 μm sur un tube conique stérile de 50 mL et mouillez le treillis en versant environ 5 mL de L-15. Décanter soigneusement la suspension cellulaire à travers la crépine de cellule. Retirez le piston d’une seringue stérile de 1 ml, broyez le tissu dans le filet à l’aide du piston pour éliminer les amas de tissus et générez une suspension cellulaire homogénéisée.
    6. De temps en temps, versez environ 5 ml de média L-15 de Leibovitz dans le treillis en nylon de 70 μm et continuez à broyer le tissu sur le treillis avec le piston de seringue de 1 mL. Lorsqu’il reste peu ou pas de tissu visible sur le treillis, jetez le treillis et mettez la suspension cellulaire de côté.
    7. Mélangez la suspension cellulaire en pipetant doucement de haut en bas. Dans chaque flacon, ajouter des volumes égaux de suspension cellulaire contenant 1 à 2 cerveaux avec un milieu de culture gliale jusqu’à un volume final de 15 ml.
    8. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant la nuit. Le lendemain, lavez les flacons deux fois avec du PBS stérile 1x pour éliminer les cellules détachées et les débris.
    9. Ajouter 15 mL de milieu de culture glique complet frais à la culture et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 . Après 3 jours, remplacer la moitié du milieu par 10 ml de milieu de culture glique frais complété par 40 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages (MCSF).
      REMARQUE : Par la suite, la moitié du milieu est remplacée par 10 mL de milieu de culture gliale frais complété par 40 ng/mL de MCSF tous les 3 jours. La culture est maintenue pendant 8 à 10 jours avant que les microglies ne soient récoltées.

2. Culture de neurones primaires

  1. Préparation
    1. Décongeler B-27 plus supplément de B-27 plus système de culture neuronale. Préchauffage du milieu neurobasal plus à partir du système de culture neuronale B-27, 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS) à 37 °C dans un bain-marie.
    2. Enduire les flacons T-25 de 5 mL de PO de 10 μg/mL et incuber les flacons pendant au moins 1 heure à 37 °C. Préparer les instruments et les fournitures pour la dissection.
      REMARQUE : Cette étape de revêtement facilite l’adhérence des cellules aux flacons T-25.
  2. Isolement cérébral à partir d’embryons de souris E16-E18
    REMARQUE : Stérilisez tous les outils de dissection et maintenez la stérilité des réactifs. Assurer le respect des techniques d’asepsie tout au long du processus.
    1. Avant de commencer la dissection, vaporisez le comptoir avec de l’éthanol à 70 % ou un spray désinfectant à l’endroit où la dissection aura lieu. Installez le microscope de dissection et placez la boîte de Pétri sous le microscope. Versez 20 ml de 1x HBSS dans la boîte de Pétri. Gardez le couvercle de la boîte de Pétri allumé lorsque le microscope n’est pas utilisé pour réduire la contamination.
    2. Placez plusieurs couches d’essuie-tout et vaporisez soigneusement les essuie-tout avec de l’éthanol à 70 %. Préparez les outils de dissection (ciseaux à ressort, une paire de micro-pinces et des pinces à tissus) en les vaporisant soigneusement avec de l’éthanol à 70 % et en posant les outils sur les serviettes en papier.
    3. Anesthésier une souris enceinte entre les jours 16 à 18 de gestation à l’aide d’isoflurane et euthanasier la souris par luxation cervicale (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
    4. Posez la souris sur le dos sur un morceau de papier absorbant imbibé d’éthanol à 70 %. Désinfectez la zone abdominale avec de l’éthanol à 70%. Soulevez la peau du bas-ventre avec des pinces à tissus et effectuez une incision en forme de V à partir de ce point vers la cage thoracique inférieure avec des ciseaux de dissection.
    5. Saisissez les cornes utérines contenant les embryons à l’aide d’une pince à tissus et retirez délicatement les embryons de la cavité abdominale. Désinfectez brièvement les cornes utérines contenant des embryons avec de l’éthanol à 70%.
    6. Disséquez un embryon de son sac individuel à la fois. À l’aide de ciseaux à ressort, créez une incision médiane en haut du crâne, en partant de l’arrière du cou jusqu’au nez. Ensuite, soulevez le crâne loin du site d’incision pour révéler le cerveau. Prélevez doucement le cerveau à l’aide d’une pince à tissus et transférez le cerveau dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant 15 ml de 1x HBSS.
    7. À l’aide d’un microscope à dissection, retirez soigneusement le tronc cérébral et les méninges des deux côtés du cortex cérébral à l’aide d’une paire de micro-pinces. Transférez les cortex cérébraux dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de 1x HBSS et placez-le sur de la glace.
  3. Dissociation cérébrale et ensemencement des neurones corticaux en culture cellulaire
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes subséquentes dans une enceinte de biosécurité.
    1. Hachez le cerveau en morceaux d’environ 1 mm2 dans le tube conique de 50 ml à l’aide d’une lame de scalpel stérile et jetable. Transférez les cerveaux hachés dans un nouveau tube conique stérile de 50 ml.
    2. Ajouter la trypsine dans le tube avec une concentration finale de 0,25%. Plongez le tube dans un bain d’eau chaude à 35-38 °C pendant 15 min et mélangez doucement le tube pour homogénéiser le tissu toutes les 2-3 min.
    3. Sortez le tube du bain d’eau chaude. Pipetez doucement la suspension tissulaire de haut en bas pour dissocier davantage les cellules, puis ajoutez 0,5 ml de FBS inactivé par la chaleur à la suspension homogénéisée pour neutraliser l’activité de la trypsine. Évitez les bulles d’air pour minimiser la toxicité pour les cellules neuronales.
    4. Placez une passoire stérile en nylon de 70 μm sur un tube conique stérile de 50 ml et mouillez le filet en ajoutant environ 5 ml de milieu neurobasal. Filtrez la suspension cellulaire à travers la crépine à mailles de nylon de 70 μm. À l’aide d’un piston de seringue de 1 ml, broyez doucement le tissu dans la crépine cellulaire. Versez périodiquement environ 5 ml de 1x HBSS tout en continuant à broyer pour laver la crépine de la cellule.
    5. Centrifuger le tube conique à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Pendant ce temps, diluez le supplément de B-27 plus dans les milieux neurobasaux plus à 1x la concentration finale pour l’utiliser comme milieu neurobasal complet.
    6. Jeter le PO dans les flacons T-25 et rincer les flacons trois fois avec 5 mL de 1x PBS.
    7. Décanter soigneusement pour éliminer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire en pipetant doucement de haut en bas sur 2 à 3 ml de milieu neurobasal complet. Déterminez la concentration cellulaire et le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu trypan. Attendez-vous à ce que jusqu’à 1,0 x 107 cellules par embryon.
    8. Plaquez les cellules dans les fioles T-25 enrobées de PO avec environ 2,0 x 107 cellules par fiole dans 5 ml de milieu neurobasal complet. Incuber la culture cellulaire à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .
    9. Effectuez un demi-changement de milieu tous les 2-3 jours en remplaçant 2,5 ml de milieu du flacon de culture par un milieu neurobasal complet fraîchement préparé.

3. Co-culture de neurones primaires et de microglie

REMARQUE : Toutes les étapes subséquentes doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile.

  1. Ensemencement de neurones dans des plaques à 96 puits
    1. Ajouter 100 μL de 10 μg/mL d’OO par puits et incuber les flacons pendant au moins 1 h à 37 °C pour enrober les puits d’O. Lavez la plaque avec 1x PBS 3 fois avant d’ensemencer les cellules et aspirez tout liquide restant après le dernier lavage.
    2. Les neurones cultivés dans des flacons T-25 sont récoltés pour la co-culture après 2 à 5 jours de culture. Remplacer le milieu par 5 mL de solution 1x Versene avec 0,25 % de trypsine et 1 mg/mL de DNase I pour détacher les neurones du ballon. Placez les flacons à l’intérieur de l’incubateur pendant 5 à 6 minutes pour la digestion et remuez doucement le ballon toutes les 2 à 3 minutes pour faciliter le détachement des cellules.
    3. Sortez la fiole de l’incubateur et vérifiez si les cellules sont détachées au microscope. Ajouter 0,5 mL de FBS inactivé par la chaleur pour neutraliser la trypsine et la DNase I. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL. Lavez une fois le flacon avec 5 ml de milieu neurobasal complet pour maximiser les neurones collectés. Rassemblez toutes les cellules dans le même tube conique de 15 ml.
    4. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre doucement la pastille cellulaire en suspension dans 2 à 3 mL de milieu neurobasal complet.
    5. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajoutez un milieu neurobasal complet pour obtenir une concentration finale de 7,5 x 105 neurones/mL. Semez 100 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits recouverte d’un PO pour obtenir 7,5 x 104 neurones/puits. Un rendement de 5 à 6 millions de neurones par flacon est attendu.
    6. Incuber les neurones dans une plaque à 96 puits pendant la nuit. Ajouter 100 μL de milieu neurobasal complet dans chaque puits le lendemain.
      REMARQUE : Une fois que les neurones présentent une croissance appropriée du processus de neurites (environ 3-4 jours après l’ensemencement dans des plaques de 96 puits), ils sont prêts pour la co-culture avec la microglie.
  2. Isolement et co-culture microgliale-neuronale
    1. Entre 8 et 10 jours de culture mixte de cellules gliales, prélever les cellules microgliales en lavant délicatement les flacons T-75 avec des milieux de culture gliale dans chaque flacon avec une pipette de 10 ml, et transférer les cellules et les milieux dans un tube conique stérile de 50 ml. Lavez de nouveau les flacons avec 10 mL de milieu de culture glique frais pour détacher les microglies supplémentaires des flacons et recueillir les milieux. Un rendement de 7,5 x 105 microglies par flacon est attendu.
    2. Ajouter 20 mL de milieu de culture glique frais complété par 20 ng/mL de MCSF dans chaque flacon. La microglie peut être récoltée une ou deux fois de plus si la culture de cellules gliales mixtes est maintenue.
    3. Centrifuger la collection de cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans 2 mL de milieu neurobasal complet.
    4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu trypan. Ajouter un milieu neurobasal complet à une concentration finale de 2,5 x 105 cellules/mL.
    5. De la plaque de culture neuronale à 96 puits, prélever 100 μL de milieu neurobasal et ajouter 100 μL de suspension cellulaire 2,5 x 105 cellules/mL à l’ensemencement de 2,5 x 104 microglies par puits de 7,5 x 104 neurones. Incuber la culture pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pour permettre à la microglie de se déposer. La co-culture peut maintenant être utilisée pour des expériences en aval.

Résultats

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La figure 1A montre un organigramme montrant les étapes clés de la culture mixte de cellules gliales pour les microglies. Dans l’ensemble, on s’attend à ce que des cellules clairsemées et un excès de débris cellulaires soient attendus au jour 1 (figure 1B). Au jour 4, une augmentation du nombre de cellules devrait être observée, en particulier avec la génération d’astrocytes adhérents, comme l’indique leur morphologie allongée (Figure 1C). Quelques microglies peuvent être observées au-dessus des astrocytes ou sous forme de petites cellules rondes flottant dans les milieux. Au 8e jour, une couche confluente d’astrocytes formera les couches adhérentes des cellules, tandis que la microglie apparaîtra comme des cellules rondes et brillantes semi-attachées aux astrocytes ou flottant dans le milieu (Figure 1D). Si la densité microgliale est faible au jour 8, la culture peut être incubée pendant des jours supplémentaires avant la récolte.

Un organigramme montrant les étapes clés de la culture neuronale est illustré à la figure 2A. Dans une culture saine, les neurones se fixent et forment des processus de neurites après 1 à 3 jours in vitro (Figure 2B). De même, lors de l’ensemencement des neurones dans une plaque de 96 puits, ils apparaîtront initialement ronds, mais au troisième jour, les neurones devraient devenir adhérents et former des processus neurites qui se connectent aux neurones voisins (Figure 2C). À l’inverse, les cultures de neurones malsaines contiendront des amas de cellules et des débris cellulaires, qui peuvent résulter d’une dissociation cellulaire déficiente ou d’une mauvaise manipulation des neurones (Figure 2D).

La figure 3A présente un organigramme montrant les étapes clés du protocole de co-culture microgliale-neuronale. Après avoir ajouté 2,5 x 104 microglies à 7,5 x 104 neurones, des microglies rondes et grandes doivent apparaître au-dessus ou entre les neurones et les processus neuritiques (Figure 3B). Pour mieux visualiser la co-culture microgliale-neuronale, la microglie et les neurones seuls ou en co-culture ont été marqués avec la molécule adaptatrice de liaison au calcium ionisée 1 (IBA-1, rouge) et les anticorps de tubuline βIII (TUJ1, vert)37 pour la microscopie d’immunofluorescence (Figure 3C-F).

Procédé de culture cellulaire : suspension de cellules uniques à partir de cortex de souris ; étapes indiquées dans le diagramme ; images au microscope.
Figure 1 : Vue d’ensemble de la culture microgliale primaire. (A) Organigramme des étapes clés de la génération d’une culture gliale mixte. (B-D) Images représentatives au microscope à fond clair 10x de la culture mixte de cellules gliales le jour 1 (B), le jour 4 (C) et le jour 8 (J). Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Diagramme du processus de culture neuronale ; préparation et imagerie de cellules embryonnaires de souris dans des plaques T25 à 96 puits.
Figure 2 : Vue d’ensemble de la culture des neurones primaires. (A) Organigramme des étapes clés de la génération des neurones. (B) Images représentatives au microscope à champ clair 10x montrant des neurones cultivés dans des flacons T-25. (C) Microscope représentatif à champ clair 10x de neurones cultivés dans une plaque de 96 puits. (D) Microscope représentatif à champ clair 10x d’un amas neuronal malsain dans une plaque de 96 puits. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Flux de travail d’isolement de la microglie et analyse microscopique ; Les images d’immunofluorescence montrent des marqueurs cellulaires.
Figure 3 : Vue d’ensemble de la co-culture microglie-neurone. (A) Organigramme des étapes clés de la co-culture microglie-neuronale. (B) Images représentatives au microscope à fond clair 10x de la co-culture microgliale-neuronale dans des plaques à 96 puits. Barres d’échelle : 100 μm. (C,D) Images représentatives par microscopie d’immunofluorescence de neurones seuls (C), de microglies seules (D), de co-cultures de neurones et de microglies au jour 2 (E), ou de co-cultures de neurones et de microglies (F) de 12 jours dans une plaque de 96 puits. La microglie et les neurones sont marqués avec IBA-1 (rouge) et tubuline βIII (vert), respectivement. Les noyaux sont colorés au DAPI (bleu). Les images d’immunofluorescence ont été acquises à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau 25x, 0,8 NA, avec un microscope à fluorescence à grand champ. Barres d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Cet article décrit un protocole permettant d’isoler et de cultiver des neurones primaires et des microglies primaires de souris, qui sont ensuite utilisés pour établir une co-culture microglie-neuronale qui peut être utilisée pour étudier comment les interactions microgliales et neuronales régulent leur santé et leur fonction cellulaires. Cette approche relativement simple et accessible peut fournir des informations essentielles sur les mécanismes et les résultats fonctionnels des interactions des neurones microgliaux dans le SNC.

Pour obtenir une co-culture optimale, plusieurs aspects critiques de ce protocole nécessitent une attention particulière. Au cours de l’isolement cérébral (étapes 1.2.6 et 2.2.7), les méninges attachées à la surface du cerveau embryonnaire et du cerveau postnatal doivent être complètement enlevées avant de prélever les tissus. Comme d’autres protocoles de neuroglie, l’ablation incomplète des méninges peut entraîner la contamination de la culture cellulaire par des cellules endothéliales ou des cellules dérivées du sang 40,41,42. De plus, lors de la culture de neurones primaires (étapes 2.3.7 et 3.1.4), il est crucial de générer une suspension unicellulaire et d’éviter les amas de cellules avant d’ensemencer les neurones dans des flacons ou des plaques à 96 puits. Les agrégats neuronaux n’adhèrent pas correctement à la culture et entraînent un stress neuronal excessif et la mort cellulaire. De plus, un traitement prolongé des neurones avec de la trypsine lorsqu’on tente de les dissocier des flacons T-25 peut provoquer une mort cellulaire indésirable (étape 3.1.2). Pour atténuer ce phénomène, les neurones peuvent être directement ensemencés dans des plaques de 96 puits à la densité cellulaire souhaitée après dissociation du cerveau embryonnaire (étape 2.3.7). De plus, dans ce protocole, un rapport neurone :microglie de 3:1 a été sélectionné pour représenter partiellement une quantité élevée de microglie qui peut être présente dans le microenvironnement du SNC pendant la neuroinflammation. Alternativement, le rapport de cellules dans la co-culture peut être ajusté en fonction des besoins expérimentaux. De plus, le point temporel choisi pour la co-culture de neurones peut être prolongé si l’on vise à évaluer des états neuronaux plus matures.

Notamment, lors de la dissociation des neurones des flacons T-25 vers des plaques à 96 puits, l’utilisation de la trypsine seule peut entraîner une dissociation incomplète et la formation d’amas cellulaires au lieu d’une culture monocouche dans des plaques à 96 puits (Figure 2D). Pour résoudre ce problème, les neurones peuvent être dissociés de la fiole T-25 à l’aide d’une solution de versène 1x contenant 1 mg/mL de DNase I. D’autres facteurs contribuant à l’agrégation neuronale et à la viabilité réduite comprennent la trituration incomplète de la suspension cellulaire, la neutralisation inadéquate de la trypsine avec le FBS inactivé par la chaleur, une centrifugation excessive ou la formation prolongée de pastilles cellulaires. Par conséquent, il est essentiel d’assurer une bonne dissociation des tissus et la génération d’une suspension unicellulaire pour établir une co-culture saine de microglie et de neurones.

Ce protocole vise à récapituler les interactions microglie-neuronale in vitro afin de mieux comprendre l’importance fonctionnelle de leurs interactions dans le SNC. Alors que d’autres types de systèmes de co-culture ont été développés, tels que la culture de populations cellulaires individuelles sur différentes surfaces pour permettre un traitement indépendant de deux populations cellulaires43,44, ce système de culture mixte permet un contact direct et étroit de la microglie et des neurones. De plus, lorsqu’il est correctement maintenu par des demi-changements de milieu tous les 3 jours, ce système de culture mixte peut rester sain de 12 jours (figure 3F) à potentiellement 3 semaines, ce qui permet d’étudier à long terme les interactions neurones-microglies45.

Bien que la simplicité relative du système de co-culture soit avantageuse pour l’accessibilité, l’une des principales limites de cette approche est que la culture cellulaire bidimensionnelle ne représente pas entièrement l’environnement tissulaire du SNC. En effet, il a été démontré qu’une tri-culture de microglies, de neurones et d’astrocytes imite la réponse neuroinflammatoire in vivo de manière plus fiable que la microglie ou la co-culture astrocytes-neurones46,47. De plus, les développements récents dans les systèmes organoïdes cérébraux avec des cellules microgliales et d’autres cellules gliales, y compris les astrocytes et les oligodendrocytes, sont plus appropriés pour l’étude de l’architecture tissulaire tridimensionnelle (3D) et des interactions du SNC48. De même, un système de triculture 3D humain comprenant des neurones, des microglies et des astrocytes s’est avéré efficace dans la modélisation de l’état de la maladie d’Alzheimer49. D’autres co-cultures microgliales-neurones humaines peuvent être plus pertinentes sur le plan physiologique pour les études sur les maladies neurodégénératives. Par exemple, la co-culture de microglie et de motoneurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines50 peut être utile pour étudier des maladies telles que la sclérose latérale amyotrophique51. Néanmoins, compte tenu de l’abondance relative et du faible coût de génération de neurones primaires et de microglie à partir de souris, l’évaluation de la co-culture microglie-neuronale dans des plaques de 96 puits peut être une approche à haut débit pour étudier les mécanismes et les implications fonctionnelles des interactions microglie-neuronale. Les tests en aval peuvent inclure l’utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour déterminer les changements fonctionnels cellulaires en temps réel, le séquençage de l’ARN pour déterminer les changements transcriptionnels cellulaires, la microscopie d’immunofluorescence pour déterminer les changements phénotypiques cellulaires, la spectrométrie de masse pour déterminer les changements cellulaires et protéomiques, ou le test immuno-enzymatique et le transfert Western pour mesurer les protéines sécrétées dans le surnageant de co-culture.

Comme les microglies sont des médiateurs importants de la santé et des maladies du SNC, cette co-culture peut également être utilisée pour étudier l’effet des molécules et des composés liés à la maladie sur la communication bidirectionnelle microglie-neuronale. Dans le contexte de la SEP, la microglie activée peut jouer un rôle destructeur, contribuant à l’aggravation de la pathologie52,53. Par exemple, ils peuvent sécréter des cytokines pro-inflammatoires et des espèces réactives de l’oxygène, ainsi que favoriser l’activation des astrocytes45. Ce protocole pourrait aider à mieux cerner le rôle néfaste de la microglie en traitant la microglie en co-culture avec des cytokines inflammatoires élevées dans la SP et en évaluant les résultats de la santé des neurones. Alternativement, cette co-culture microgliale-neuronale a été utilisée pour montrer l’effet protecteur de la microglie sur les neurones en réponse à la phosphatidylcholine oxydée, un produit oxydatif découvert dans MS54. De plus, l’apoptose neuronale remodèle l’expression des gènes de la microglie au cours du développement en favorisant la survie de la microglie et la phagocytose55. Par conséquent, ce protocole peut également aider à déterminer l’impact de la mort neuronale sur le phénotype et la fonction de la microglie.

En résumé, ce protocole décrit la génération et la co-culture de neurones primaires dérivés de souris et de microglies in vitro. La co-culture microgliale-neuronale mise en place dans des plaques de 96 puits peut être une approche à haut débit pour interroger les mécanismes et la fonction des interactions microgliales avec les neurones dans le contexte de la santé et de la maladie du SNC, y compris la SP.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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JP remercie le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et le Collège de médecine de l’Université de la Saskatchewan pour leur soutien financier. YD remercie le Fonds de démarrage du Collège de médecine de l’Université de la Saskatchewan, la Subvention à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN-2023-03659), la Subvention catalyseur de MS Canada (1019973), la Subvention d’établissement de la Fondation de la recherche en santé de la Saskatchewan (6368) et la Subvention pour les futurs leaders en recherche sur le cerveau au Canada de la Fondation Brain Grain. Les figures 1A, 2A et 3A ont été créées avec BioRender.com.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de Pétri de 10 cm  ;Fisher  ;07-202-011stérile
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Système de culture neuronale  ;Gibco  ;
microscope de dissectionVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Sérum de veau fœtal  ;ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HémacytomètreHausser Scientific1475
HEPES  ;ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz' s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific  ;
Facteur de stimulation des colonies de macrophagesPeprotech315-02
Micro-PinceRWDF11020-11Autoclave/Stérile
Acides aminés non essentielsCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Pénicilline Streptomycine Glutamine (100x)Gibco103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromure  ;SigmaP3655-100MG
Pyruvate de sodium (100 mM)Gibco11360-070
Ciseaux à ressortRWDS11008-42Autoclave/
Stérile Lame chirurgicaleFeather08-916-5DFioles stériles
T-25Fisher10-126-9
Fioles T-75 flacons  ;Fisher13-680-65
Pince à tissusCodman30-4218Autoclave/Stérile
Ciseaux à tissusRWDS12052-10Autoclave/
Stérile Trypan Blue  ;Thermofisher Sci  ;15250-061
Trypsine (2,5 %)ThermoFisher Sci15090046
à grand champZeiss
A365340121083027Microscope d’immunofluorescence

Références

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