Modèle in vitro intégrant la rigidité et l’écoulement du substrat pour étudier les réponses des cellules endothéliales

Résumé

Nous avons synthétisé et caractérisé un substrat à base de gélatine accordable pour la culture de cellules endothéliales vasculaires (CE) dans des conditions de flux vasculaire pertinentes. Cette surface biomimétique reproduit à la fois des conditions physiologiques et pathologiques, permettant d’étudier les forces mécaniques sur le comportement des CE et de faire progresser notre compréhension de la santé vasculaire et des mécanismes de la maladie.

Résumé

Nous présentons un modèle in vitro innovant visant à étudier les effets combinés de la rigidité tissulaire et du stress de cisaillement sur la fonction des cellules endothéliales (CE), qui sont cruciales pour comprendre la santé vasculaire et l’apparition de maladies telles que l’athérosclérose. Traditionnellement, les études ont exploré les impacts de la contrainte de cisaillement et de la rigidité du substrat sur les CE, indépendamment. Cependant, ce système intégré combine ces facteurs pour fournir une simulation plus précise de l’environnement mécanique du système vasculaire. L’objectif est d’examiner la mécanotransduction des EC à travers divers niveaux de rigidité tissulaire et conditions d’écoulement à l’aide de CE humaines. Nous détaillons le protocole de synthèse d’hydrogels de méthacrylate de gélatine (GelMA) à rigidité réglable et leur ensemencement avec des EC pour obtenir une confluence. De plus, nous décrivons la conception et l’assemblage d’une chambre d’écoulement rentable, complétée par des simulations numériques de dynamique des fluides, pour générer des conditions d’écoulement physiologiques caractérisées par un écoulement laminaire et des niveaux de contrainte de cisaillement appropriés. Le protocole intègre également le marquage par fluorescence pour la microscopie confocale, ce qui permet d’évaluer les réponses EC à la fois à la compliance tissulaire et aux conditions d’écoulement. En soumettant des CE cultivées à de multiples stimuli mécaniques intégrés, ce modèle permet des études complètes sur la façon dont des facteurs tels que l’hypertension et le vieillissement peuvent affecter la fonction des CE et les maladies vasculaires médiées par les CE. Les connaissances acquises grâce à ces recherches seront déterminantes pour élucider les mécanismes sous-jacents aux maladies vasculaires et pour développer des stratégies de traitement efficaces.

Introduction

L’endothélium, qui tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins, joue un rôle central dans le maintien de la santé vasculaire. Les cellules endothéliales (CE) sont essentielles à la régulation de diverses fonctions cardiovasculaires, notamment le contrôle du tonus des vaisseaux, la perméabilité sélective, l’hémostase et la mécanotransduction ^1,2. La recherche a fermement lié le dysfonctionnement de la CE à un rôle primordial dans le développement de l’athérosclérose. Notamment, les CE rencontrent diverses forces mécaniques aux interfaces où elles interagissent avec le flux sanguin et les tissus vasculaires sous-jacents ^3,4. Plusieurs études ont associé le dysfonctionnement de la CE à des changements anormaux dans les facteurs mécaniques de l’environnement vasculaire, tels que le stress de cisaillement des fluides dû au flux sanguin et la rigidité des tissus ^5,6,7.

Cependant, les recherches antérieures ont reçu peu d’attention pour comprendre les effets combinés de la rigidité des tissus et du stress de cisaillement sur la fonction EC. Pour améliorer la capacité de traduire les résultats de la recherche en traitements efficaces pour l’athérosclérose et d’autres maladies cardiovasculaires, il est essentiel d’améliorer les modèles cellulaires utilisés dans le domaine. Des progrès significatifs ont été réalisés dans l’humanisation des modèles cellulaires en utilisant des CE humains et en les soumettant soit à des contraintes de cisaillement, soit à des substrats avec des niveaux de rigidité variables ^8,9,10. Cependant, l’adoption et le perfectionnement de modèles cellulaires qui intègrent des environnements d’écoulement dynamiques avec des substrats EC possédant des propriétés de rigidité réglables ont progressé lentement. Le défi consiste à concevoir des substrats EC non gonflants pour empêcher les altérations des paramètres d’écoulement dans le canal d’écoulement tout en facilitant la culture de monocouches EC intactes et bien adhérentes. Un modèle in vitro capable de surmonter ces obstacles pourrait faciliter des investigations plus efficaces sur la façon dont l’hypertension, le vieillissement et les conditions de flux influencent en collaboration la mécanotransduction de la CE, la santé vasculaire et, en fin de compte, le développement de l’athérosclérose. Diverses méthodes ont été développées pour appliquer une contrainte de cisaillement sur les cellules tout en contrôlant la rigidité du substrat, y compris des plaques rotatives et des dispositifs microfluidiques. Dans la méthode des plaques rotatives, les cellules sont placées entre deux plaques et une contrainte de cisaillement est appliquée par le mouvement de rotation des plaques. Cette méthode est moins compliquée et fournit un modèle rapide ; Cependant, il souffre d’une variation spatiale des contraintes de cisaillement, avec une contrainte de cisaillement nulle au centre et une contrainte de cisaillement maximale à la périphérie¹¹.

D’autre part, les dispositifs microfluidiques représentent la nouvelle génération d’outils capables de contrôler la rigidité du substrat et les conditions d’écoulement. Ces systèmes sont adaptés pour imiter les microvascularisations dans des conditions d’écoulement laminaire. Cependant, il n’est pas pratique d’étudier l’athérosclérose avec de tels appareils, car l’athérosclérose se produit dans de gros vaisseaux dont le flux est perturbé¹¹. Cet article vise à contribuer au domaine de recherche critique des études EC en présentant un système rentable capable d’examiner les effets de différents niveaux de rigidité dans des substrats EC dans différentes conditions d’écoulement. Le système intègre des substrats de différentes rigidités pour émuler les vaisseaux sanguins pathologiques et physiologiques. Ce protocole décrit la méthode de création d’hydrogels à base de gélatine sans gonflement et avec des niveaux de rigidité de 5 kPa et 10 kPa, représentant respectivement une rigidité physiologique et pathologique. De plus, la construction d’une chambre d’écoulement à plaques parallèles capable d’intégrer ces substrats est détaillée. La dynamique des fluides numérique (CFD) a été utilisée pour évaluer les contraintes de cisaillement et les conditions d’écoulement. La préparation d’hydrogels pour la culture EC et l’exécution d’une expérience d’écoulement de 6 h sont décrites, suivies d’une discussion sur l’immunocoloration post-expérience.

Protocole

1. Synthèse de GelMA

1. Préparez une solution 0,2 M de carbonate de sodium anhydre et une solution 0,2 M de bicarbonate de sodium.
2. Mélanger 46 mL de solution de bicarbonate de sodium avec 15 mL de solution de carbonate de sodium et ajouter 139 mL d’eau désionisée (DI). Ajustez le pH à 9,5 en utilisant 0,1 M de NaOH et de HCl si nécessaire.
3. Ajouter 10 g de gélatine de type A, à 300 blooms de peau de porc à 100 mL de tampon carbonate-bicarbonate à une concentration de 10 % p/v.
4. Dissoudre la gélatine à l’aide d’un bain-marie à 55 °C en agitant la solution à 700 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique. Une fois complètement dissoute, ajustez le pH de la solution de gélatine à 9,5 en utilisant 0,1 M de NaOH.
5. Pour amorcer la méthacrylation, ajoutez 938 μL d’anhydride méthacrylique (MAH) goutte à goutte à la solution. Améliorez la distribution initiale de la MAH dans la solution de gélatine en l’injectant à divers endroits, y compris à différentes profondeurs et distances radiales du centre.
6. Enveloppez le récipient de réaction dans du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Maintenir la température à 55 °C et agiter la solution à 500 tr/min pendant 1 h pour terminer la réaction (Figure 1A)¹².
   REMARQUE : La réaction s’arrête à un pH inférieur à 7,4.
7. Préparez un bécher de 2 L contenant 1,8 L d’acétone et un bécher de 0,6 L contenant 0,3 L d’acétone.
8. Ajouter la solution GelMA obtenue goutte à goutte dans le bécher de 2 L tout en agitant à 200 tr/min pour induire la précipitation¹³. Pour maximiser la collecte du produit précipité, placez une tige ou une spatule en acier inoxydable comme site de nucléation pour faciliter le transfert.
9. Transférez le produit du plus grand bécher au plus petit et laissez-le reposer pendant 10 minutes avant de passer à l’étape de séchage. Le GelMA précipité doit apparaître sous forme de fibres blanches.
10. Récupérez le produit sur du papier absorbant, séchez-le dans un four sous vide à température ambiante (RT) et conservez-le à -20 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
    REMARQUE : Des détails supplémentaires sur la caractérisation chimique du produit par résonance magnétique nucléaire des protons (RMN ¹H) peuvent être trouvés dans un travail publié antérieurement⁸.

2. Salinisation du verre

REMARQUE : La fixation d’hydrogels sur des lames de verre fournit une surface plane et uniforme, facilitant la manipulation et assurant la stabilité sous contrainte de cisaillement dérivée de l’écoulement. La fonctionnalisation du verre avec du méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl)propyle est nécessaire pour améliorer les propriétés de surface et permettre la fixation covalente des hydrogels pendant le processus de polymérisation.

1. Découpez avec précision des lames de microscope simples (1 mm d’épaisseur) en morceaux similaires aux dimensions finales de l’hydrogel à l’aide d’un coupe-verre. Lavez les lames coupées avec du savon pour éliminer les contaminants de surface et les débris qui pourraient obstruer le traitement de la surface du verre.
   REMARQUE : Si nécessaire, sonicez les lames de verre pendant 5 min dans de l’éthanol, puis séchez-les à l’air.
2. Préparez une solution à 0,5 % de méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl)propyle dans de l’éthanol absolu. Préparez une solution glaciaire d’acide acétique à 10 % dans de l’eau DI. Mélangez les solutions pour obtenir une concentration finale de 3 % d’acide acétique glacial.
   REMARQUE : La solution glaciale d’acide acétique peut être préparée en grande quantité et stockée.
3. Organisez les lames de verre dans un récipient en verre pour vous assurer que les surfaces en verre ne sont pas obstruées. Versez la solution obtenue sur les lames de verre et conservez-les pendant environ 5 minutes sur une bascule à 80 tr/min pour que la réaction soit complète. Assurez-vous que les deux côtés des lames de verre sont modifiés en éliminant les bulles d’air emprisonnées.
4. Une fois la réaction terminée, aspirez la solution et lavez les lames de verre avec de l’éthanol 2x. Faites sécher les lames à l’air libre et rangez-les dans l’obscurité à RT.
   REMARQUE : Les lames de verre conservent leur modification pendant 1 mois dans ces conditions.

3. Préparation de l’hydrogel

1. Fabriquer des hydrogels à l’aide d’une méthode de polymérisation radicalaire induite par l’oxydoréduction.
   1. Assemblez des moules en polytétrafluoroéthylène (PTFE) en deux parties avec une profondeur appropriée et des fenêtres ouvrantes de 10^mm2 pour façonner le substrat final. Tenir compte d’un retrait de 25 % de la hauteur de l’hydrogel après polymérisation pendant le processus de conception. Assurez-vous que les moules sont plats et solidement fixés aux plaques inférieure et supérieure pour éviter les fuites.
      REMARQUE : Les dimensions du moule conçues sont intentionnellement 10% plus grandes que la taille d’hydrogel prévue. Cette conception a plusieurs objectifs : elle empêche d’endommager les côtés lors de la séparation du moule, améliore la régularité de la surface de l’hydrogel en poussant les impuretés ou les bulles sur les côtés, et compense le retrait prévu de 25 % après l’équilibrage en raison de l’effet de synérèse, où les hydrogels hautement réticulés repoussent l’eau après l’équilibre, provoquant un retrait. La quantité de retrait est spécifiée dans le protocole⁸.
   2. Pour garantir que les hydrogels ont une surface uniforme et une hauteur constante, suspendez les lames de verre modifiées à la plaque supérieure du moule, permettant une ouverture étroite pour l’injection de la solution polymère. À l’aide d’une vitre de protection, suspendez les lames de verre modifiées (Figure 1B).
   3. Pour créer le verre de couverture, coupez du verre microscopique ordinaire 20% plus grand que le moule. Fixez deux entretoises sur les côtés les plus courts. Calculez l’épaisseur de l’entretoise comme suit :
      Épaisseur de l’entretoise = 1,33 x épaisseur finale du gel + 1 (épaisseur du verre modifié) - profondeur du moule
   4. Appliquez une fine couche de graisse d’étanchéité compatible avec les cellules sur les côtés les plus longs du verre de protection, sur la même face où les entretoises sont fixées.
   5. Fixez la glissière de verre modifiée au verre de protection entre les deux entretoises.
   6. Placez le verre de couverture sur le moule de sorte que les entretoises reposent sur le moule et que le verre modifié s’étende dans le moule. Cette configuration offre un dégagement de 1,33 de la hauteur finale de l’hydrogel entre le verre modifié et le fond du moule.
   7. Dissoudre GelMA dans de l’eau DI à 4 % et 10 % p/v pour des hydrogels de 5 kPa et 10 kPa, respectivement, et le placer dans un bain-marie à 45 °C.
      REMARQUE : GelMA est un polymère thermosensible et le maintien de la température de la solution à 45 °C empêche la solidification avant la polymérisation et réduit la viscosité de la solution, ce qui est crucial pour la fabrication d’hydrogels plats.
   8. Ajouter TEMED (24 mM pour un hydrogel de 5 kPA, 6,25 mM pour un hydrogel de 10 kPa) à la solution de polymère et bien mélanger.
      REMARQUE : TEMED seul n’initie pas la polymérisation, alors assurez-vous que les moules, les pipettes et les solutions sont préparés avant de procéder.
   9. Ajoutez de l’APS (24 mM pour un hydrogel de 5 kPA, 24,5 mM pour un hydrogel de 10 kPa) à la solution de GelMA et mélangez soigneusement.
      REMARQUE : L’ajout d’APS initie la polymérisation, et les hydrogels peuvent se former rapidement, nécessitant une action rapide pour éviter les hydrogels défectueux. De plus amples détails sur les mesures de rigidité peuvent être trouvés dans un travail précédemment publié⁸.
   10. Pipetez soigneusement la solution obtenue jusqu’à l’ouverture entre la lame de verre suspendue et le moule à RT et laissez-la se réticuler. La force capillaire entraîne la solution polymère dans le moule. Évitez d’ajouter des bulles aux gels et arrêtez le pipetage lorsqu’il reste une petite quantité de solution dans la pointe de la pipette.
       REMARQUE : Pendant la polymérisation, les groupes méthacrylate de GelMA réagissent avec les résidus de méthacrylate sur les lames de verre modifiées, ce qui entraîne la fixation chimique de l’hydrogel au verre.
   11. Au bout de 15 min, la réaction est complète. Détachez le substrat du moule à l’aide d’un objet pointu, tel qu’une aiguille, et faites glisser le substrat loin du verre de protection pour le séparer.
   12. Transférez les hydrogels dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de Pétri de 100 mm scellée avec un film plastique et équilibrez à 37 °C pour éliminer les réactifs et sous-produits restants.
   13. Comme l’hydrogel est légèrement plus grand que les dimensions finales, coupez tout excès de gel sur les côtés pour correspondre aux dimensions requises pour la fenêtre de la chambre d’écoulement.
   14. Utilisez la chambre d’écoulement pour vérifier les dimensions de l’hydrogel. Assurez-vous que l’hydrogel s’insère correctement dans la chambre d’écoulement, sans espace entre l’hydrogel et le moule ni aucun défaut qui pourrait affecter les modèles d’écoulement. S’il y a des irrégularités de forme qui peuvent affecter le modèle d’écoulement dans la chambre d’écoulement, entraînant un comportement cellulaire défavorable, conservez l’hydrogel pour les conditions statiques.
   15. Transférez quatre hydrogels dans une boîte de Pétri contenant 1x PBS pour la stérilisation.
2. Stérilisez l’hydrogel comme décrit ci-dessous avec de l’éthanol à 70 %.
   1. Préparez des solutions d’alcool à 25 %, 50 % et 70 % pour une déshydratation progressive de l’hydrogel.
      REMARQUE : Si une déshydratation progressive n’est pas effectuée, les hydrogels plus rigides peuvent rétrécir et se briser, tandis que des rides peuvent se former à la surface des hydrogels plus mous.
   2. Aspirez la solution 1x PBS de la boîte de Pétri contenant des hydrogels. Ajoutez une solution d’éthanol à 25 % dans chaque boîte de Pétri pour immerger les hydrogels de 5 kPa et 10 kPa pendant 15 min.
   3. Aspirez la solution d’alcool à 25 %. Ajoutez une solution d’alcool à 50 % dans chaque boîte de Pétri pour immerger les hydrogels de 5 kPa et 10 kPa pendant 15 min.
   4. Aspirez la solution d’alcool à 50 %. Ajoutez une solution d’alcool à 70 % dans chaque boîte de Pétri, en immergeant les hydrogels de 5 kPa et 10 kPa pendant 5 min. Placez la boîte de Pétri sur un shaker à 100 tr/min.
   5. Laissez les hydrogels de 5 kPa immergés pendant 40 min et les hydrogels de 10 kPa pendant 20 min.
      REMARQUE : On a observé que les hydrogels de 5 kPa étaient plus sujets à la contamination que les hydrogels de 10 kPa.
   6. Transférez les échantillons dans une plaque à 6 puits dans une enceinte de biosécurité et lavez les hydrogels 2x-3x avec du PBS stérile.

4. Revêtement des hydrogels

1. Préparez une solution de gélatine de 60 μg/mL en dissolvant 3 mg de gélatine dans 50 mL de PBS stérile (1x avec du sel de magnésium et de calcium). Faites chauffer la solution au bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que toute la gélatine soit complètement dissoute.
2. Filtrez stérilement la solution d’enrobage à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Aspirez la solution 1x PBS de chaque plaque de puits et ajoutez la solution de gélatine dans chaque puits, assurant une couverture complète de chaque hydrogel. Pour minimiser le risque de contamination, ajouter 40 unités/ml de pénicilline et 10 μg/mL de streptomycine à la solution d’enrobage.
3. Incuber chaque plaque de puits dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant 45 min. Lavez les hydrogels avec 1x solution PBS.
4. Aspirez le PBS et ajoutez des milieux de culture cellulaire.
5. Pendant deux jours au maximum, conservez les hydrogels dans un milieu de culture cellulaire et incubez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’à l’ensemencement cellulaire.
   REMARQUE : Malgré les excellentes propriétés d’attachement cellulaire de la fibronectine, son utilisation est préoccupante en raison du dépôt de fibronectine endogène dans les conditions athérosclérotiques, ce qui peut entraîner une réponse pro-inflammatoire. Pour éviter les réponses cellulaires stimulées chimiquement, nous renonçons à utiliser la fibronectine. De plus, Orr et al. ont démontré que l’enrobage de fibronectine, par rapport à l’enrobage de collagène I, régulait à la hausse les gènes athérogènes. Plus précisément, ils ont observé une augmentation des niveaux d’expression de la molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1), de la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire 1 (VCAM-1) et du facteur nucléaire-κB (NF-κB)¹⁴.

5. Ensemencement des cellules sur les substrats

1. Préparez la suspension cellulaire en suivant les protocoles de détachement disponibles et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre⁸.
2. Aspirez soigneusement le média des hydrogels. Ajouter 50 000 cellules/cm2 à chaque échantillon. Ajoutez un volume approprié de suspension cellulaire à chaque échantillon pour éviter le débordement de la cellule.
   REMARQUE : Les substrats plus rigides sont plus hydrophobes ; Par conséquent, minimisez le temps entre les étapes pour améliorer la mouillabilité et la dispersion de la suspension cellulaire à la surface du substrat.
3. Incuber des hydrogels ensemencés en cellules dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 2 h. Ajoutez des milieux de culture cellulaire aux échantillons une fois que les cellules sont fixées aux gels.

6. Fabrication de la chambre d’écoulement

REMARQUE : L’approche de conception de la chambre d’écoulement est rentable et nécessite une expertise minimale pour la fabrication et l’utilisation.

1. Utilisez du poly(méthacrylate de méthyle) pour la fabrication en chambre afin d’évaluer visuellement la qualité de l’écoulement, l’intégrité de l’hydrogel sous contrainte de cisaillement et les études potentielles de biomarqueurs en temps réel pendant les expériences d’écoulement. La conception de la chambre a été créée à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). La chambre d’écoulement a fait l’objet d’un dépôt de brevet, et les détails de ce dispositif ne peuvent pas être divulgués dans le protocole actuel.
2. Évaluation informatique des conditions d’écoulement dans la chambre d’écoulement
   1. Assemblez les différents composants de la chambre d’écoulement conçue (. SLDPRT) pour créer la configuration finale de la chambre.
   2. Tracez une ligne le long de la ligne médiane de l’écoulement tangentielle à la surface de l’hydrogel pour analyser la contrainte de cisaillement. Fermez les ouvertures d’entrée et de sortie pour définir un volume de commande fermé.
   3. Ouvrez Flow Simulation à partir de l’onglet Compléments du logiciel de CAO. Dans l’onglet Simulation d’écoulement, ouvrez la fonction Assistant pour saisir les propriétés. Spécifiez le système d’unités et ajustez la pression et les unités de contrainte sur dyne/cm².
   4. Vérifiez l’écoulement du fluide et la gravité dans les caractéristiques physiques. Réglez la gravité à -9,8 dans la composante Z ; Les composantes X et Y doivent être égales à zéro.
   5. Choisissez Interne pour le type d’analyse dans Gestion de la géométrie. Sélectionnez Eau comme fluide par défaut.
      REMARQUE : Supposez que le milieu se comporte comme de l’eau.
   6. Choisissez Laminaire et Turbulent pour le type d’écoulement. Définissez le mur comme un mur adiabatique et entrez la rugosité de surface dans l’état du mur.
   7. Réglez la température à 37.5 °C (310.65 K) dans les conditions initiales. Définissez le domaine de calcul dans les projets de simulation d’écoulement, en vous assurant qu’il couvre l’ensemble du volume de contrôle.
   8. Sélectionnez toutes les parois qui s’interfacent avec le fluide pour définir le sous-domaine du fluide. Dans Condition aux limites, désignez la surface intérieure du couvercle d’entrée comme Débit volumique d’entrée et spécifiez le débit (Q) et l’écoulement uniforme. Ensuite, attribuez la surface intérieure de l’étanchéité du couvercle de sortie à la pression statique.
   9. Déterminez la taille de maillage globale en fonction des ressources de calcul disponibles. Appuyez sur Exécuter pour lancer la simulation.
   10. Une fois l’opération terminée, examinez les résultats souhaités, y compris les tracés des contraintes de cisaillement et les simulations d’écoulement.
   11. Répétez les étapes 6.2.8 à 6.2.10 avec différents débits pour calculer la contrainte de cisaillement appliquée à différentes vitesses. Utilisez l’analyse de régression pour établir la relation entre le débit et la contrainte de cisaillement.
   12. Évaluez la tolérance du système aux variations des dimensions de l’hydrogel afin d’améliorer le réalisme de la simulation.

7. Exécutez un flux laminaire uniforme

1. Après la culture des cellules sur les hydrogels de 5 kPa et 10 kPa, assurez-vous de la confluence de la monocouche cellulaire dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ . Une monocouche de cellules sur chaque hydrogel doit être obtenue.
2. Stérilisez les composants autoclavables du système de chambre d’écoulement à plaques parallèles (vis en acier inoxydable, spatule, pinces, joint et réservoir de média) avec un cycle d’autoclave par gravité de 30 minutes. Stérilisez les autres pièces (composants acryliques et scelleur/amortisseurs de réservoir) avec une exposition à la lumière UV.
3. Assemblez le dispositif de chambre d’écoulement dans une enceinte de biosécurité. Fixez les échantillons d’hydrogel dans l’appareil, en assurant l’uniformité. Utiliser une charge de taille égale à celle des hydrogels si le nombre d’échantillons disponibles pour l’écoulement est insuffisant.
4. Pré-mouillez la surface intérieure de la chambre et les surfaces de l’hydrogel pour minimiser la formation de bulles et empêcher le dessèchement des cellules pendant l’assemblage.
5. Ajoutez suffisamment de fluide dans le réservoir d’entrée, permettant à 20 à 30 % du fluide de s’écouler vers le réservoir de sortie lors de l’assemblage. Scellez hermétiquement le réservoir d’entrée à l’aide d’un registre/scelleur.
   REMARQUE : L’accumulation de pression dans le réservoir d’entrée entraîne le débit et toute fuite d’air modifie les débits. Vérifiez s’il y a des défauts d’étanchéité si des bulles se forment dans le tube extérieur.
6. Réglez le registre de sortie sur la pression atmosphérique pour établir la différence de pression. Placez l’appareil et les réservoirs dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ . Connectez la tubulure de l’appareil à une pompe péristaltique placée à l’extérieur de l’incubateur (Figure 1C).
7. Allumez la pompe pour commencer à appliquer 3,6 dyne/cm². Augmentez graduellement le débit par incréments de 2 ml/min (par exemple, atteindre 85 ml/min à partir de 65 ml/min après 10 min) jusqu’à appliquer environ 8 dyne/cm².
8. Augmentez encore le débit par incréments de 2,5 ml/min jusqu’à atteindre 12 dyne/cm² de contrainte de cisaillement.
   REMARQUE : Laissez le temps aux cellules de s’adapter à la condition dynamique, car des augmentations rapides du débit peuvent détacher les cellules et endommager la monocouche.
9. Après 6 h, arrêtez l’écoulement, retirez l’appareil de l’incubateur et démontez la chambre d’écoulement. Ensuite, transférez des échantillons d’hydrogel sur une plaque à six puits.
10. Lavez les échantillons avec du PBS glacé et fixez les cellules pour l’immunocoloration ou lysez-les pour l’isolement des protéines.

8. Configuration d’immunomarquage pour la microscopie confocale à fort grossissement

REMARQUE : Pour augmenter l’efficacité de l’étude, une méthode a été mise au point pour l’immunomarquage de petites portions d’hydrogels, ce qui permet d’examiner plusieurs cibles biologiques dans un seul échantillon.

1. Préparez des poinçons de biopsie ou des outils de coupe préférés d’un diamètre de 3 ou 4 mm.
2. Utilisez une boîte à pointes de pipette comme chambre de coloration. Humidifiez la chambre pour contrôler l’évaporation de la solution de coloration pendant une incubation prolongée en plaçant une serviette en papier humide au fond de la boîte de pointe de la pipette.
3. Réduisez la consommation d’anticorps en créant de petits pools de solutions pour des échantillons individuels. Couvrez la grille de la boîte à pointes avec un film transparent, en appuyant doucement le film contre les trous de la grille du bout du doigt pour faire des fossettes. Remplissez les alvéoles avec 70 μL de PBS.
4. Transférez un hydrogel individuel dans une boîte de Pétri vide et coupez-le à l’aide d’un poinçon de biopsie ou de l’outil de coupe de votre choix. Utilisez un microscope pour découper une zone d’échantillon représentative. Coupez un cylindre de gel plein pour éviter les problèmes de microscopie confocale.
5. Placez les échantillons d’hydrogel coupés dans les fossettes créées à l’étape 8.3. Effectuer la coloration selon le protocole standard¹⁵. Après le dernier lavage de coloration, obtenez une feuille de caoutchouc de silicone qui correspond à l’épaisseur de l’hydrogel.
   REMARQUE : De préférence, utilisez une feuille avec un côté collant pour une meilleure étanchéité. Dans cette étude, les fibres d’actine ont été colorées à l’aide d’un anticorps secondaire fluorescent conjugué à la phalloïdine à une dilution de 1:20.
6. Coupez la feuille de caoutchouc en carrés de 15 mm x 15 mm. Percez un trou de 6 mm à l’aide d’un poinçon à biopsie ou de l’outil de coupe de votre choix.
7. Créez un récipient d’échantillon en fixant le caoutchouc à une lamelle de microscopie (n° 1.5). Ajoutez 10 μL de support de montage humide dans les fossettes pendant que l’échantillon est encore présent et incubez-le dans l’obscurité pendant 10 à 15 min.
   REMARQUE : Pour cette étude, le milieu de montage contenait 0,9 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) afin de raccourcir le protocole de coloration.
8. Retirez l’échantillon de la chambre de coloration et placez-le dans le récipient créé à l’étape 8.7. Appliquez 1 à 2 μL de média de montage sur l’échantillon.
   REMARQUE : la quantité de supports de montage a un impact sur la qualité de l’image à des grossissements élevés. Un support de montage excessif ou insuffisant peut compromettre la clarté de l’image.
9. Placez une autre lamelle sur le dessus et appuyez doucement pour vous assurer que l’échantillon entre en contact avec le verre. Conservez les échantillons à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie microscopique.

Résultats

La figure 1 représente le dispositif expérimental, décrivant le processus de synthèse de GelMA par une réaction de méthacrylation. Le produit résultant a ensuite été utilisé pour fabriquer le substrat d’hydrogel, sur lequel les CE ont été ensemencés. Par la suite, les cellules ont été introduites dans la chambre d’écoulement pour une expérience d’écoulement de 6 h à 12 dyne/cm².

¹La spectroscopie RMN H a été utilisée pour évaluer le succès de la réaction de méthacrylation (Figure 2A). La présence d’un groupe méthyle à 1,9 ppm et d’un pic vinylique entre 5,4 et 5,6 ppm dans GelMA a confirmé la réussite de la méthacrylation. De plus, la diminution du pic de lysine à 3 ppm dans GelMA indique la consommation de résidus de lysine, qui sont remplacés par des résidus de méthacrylate 12,13,16. La rigidité des hydrogels GelMA a été évaluée à l’aide d’un test de compression, qui a montré que les modules de compression augmentaient avec les concentrations de GelMA (Figure 2B). Des hydrogels composés de 4% et 8% (p/v) de GelMA ont été utilisés pour imiter les rigidités matricielles physiologiques (5 kPa) et pathologiques (10 kPa), respectivement⁸.

La chambre d’écoulement a été conçue pour être rentable et pour une stérilisation facile, en utilisant un polymère acrylique résistant aux UV. Sa transparence facilite le suivi en temps réel des hydrogels et des conditions d’écoulement pendant les expériences. Conçue avec trois couches distinctes, la chambre minimise le risque d’endommagement de l’hydrogel lors du chargement ou du déchargement : la plaque inférieure fournit une base solide, la couche intermédiaire offre un support latéral pour les hydrogels, et la plaque supérieure, le long du joint, crée le dégagement nécessaire à l’écoulement du fluide (Figure 3A). Des simulations informatiques ont été effectuées à l’aide de la CFD pour évaluer les conditions d’écoulement et les contraintes de cisaillement à l’intérieur de la chambre. L’équation suivante - contrainte de cisaillement = 0,0558 x débit - a permis de calculer la contrainte de cisaillement appliquée aux cellules en fonction du débit en entrée (figure 3B). Notamment, les changements dans les propriétés des matériaux, tels que la rigidité, n’ont pas modifié la contrainte de cisaillement dans les simulations. Pour tenir compte des différences de taille d’hydrogel dans le dispositif expérimental final, les hydrogels ont été intentionnellement légèrement plus petits dans le modèle informatique. Un espace de 0,5 mm a été créé entre un côté des hydrogels et les parois de la plaque centrale de la chambre, perpendiculairement à la direction de l’écoulement. Cette configuration a permis d’analyser les effets des contraintes de cisaillement dans ces espaces. Bien que des irrégularités dans la contrainte de cisaillement aient été observées aux emplacements des espaces (figure 3B), leur impact a été confiné à une petite zone adjacente aux espaces, la surface restante de l’hydrogel subissant une contrainte de cisaillement uniforme (figure 3C). Ces informations suggèrent de jeter les cellules des bords des hydrogels pour minimiser l’impact potentiel des régions turbulentes. Il convient de mentionner qu’une contrainte de cisaillement plus élevée, jusqu’à 15 dyne/cm², a été appliquée expérimentalement à des CE ensemencés sur des hydrogels de 5 kPa et 10 kPa sans fuite dans le dispositif (données non incluses). Cependant, l’augmentation supplémentaire de la contrainte de cisaillement pourrait potentiellement entraîner le détachement de la cellule et la défaillance de l’hydrogel, ce qui souligne la nécessité d’une optimisation minutieuse des conditions expérimentales.

Pour que les cellules d’ensemencement forment une monocouche, il est crucial d’utiliser une densité cellulaire plus élevée que dans les cultures traditionnelles. Il a été démontré qu’une faible densité de semis entrave la formation de monocouches sur les hydrogels plus mous⁸. De plus, le pré-enrobage des hydrogels avec de la gélatine avant l’ensemencement cellulaire améliore l’attachement initial des cellules et l’étalement sur des hydrogels plus mous. Cependant, il est important de noter que l’effet bénéfique de ce revêtement est temporaire, car il facilite principalement l’interaction initiale entre les cellules et le substrat.

La figure 4 montre comment la rigidité et la contrainte de cisaillement influencent la formation des fibres d’actine. Sous contrainte de cisaillement, des fibres de contrainte plus épaisses se sont formées, suggérant une fixation plus forte à la surface. Dans les échantillons plus mous, il y avait plus de fibres d’actine périphériques, qui sont des indicateurs de conditions physiologiques. Cependant, dans les CE sur des substrats plus rigides, la présence de fibres de contrainte plus fortes et de moins de fibres périphériques pourrait potentiellement entraîner un dysfonctionnement des CE¹⁷. Ces données confirment l’efficacité du système présenté dans la modulation du comportement EC.

Figure 1 : Vue d’ensemble de l’étude en cours. (A) Synthèse de GelMA. La gélatine a été chimiquement modifiée en méthacrylate de gélatine (GelMA) par une réaction entre la gélatine et l’anhydride méthacrylique (MAH) à 55 °C. Le produit a ensuite été précipité dans de l’acétone et séché sous vide. (B) Fabrication d’hydrogel. Le verre de couverture a été préparé en fixant des entretoises. Ensuite, le verre modifié a été fixé au verre de protection. Le verre de couverture a été placé sur le moule, les entretoises fournissant le dégagement souhaité entre le verre modifié et le fond du moule. La solution GelMA contenant des initiateurs a été ajoutée à l’ouverture entre le verre modifié et le moule, polymérisant pour former un hydrogel lié de manière covalente au verre modifié. (C) Expérience d’écoulement. L’hydrogel résultant a été utilisé pour ensemencer les CE. Après avoir formé une monocouche, les cellules ont subi une expérience d’écoulement de 6 h à une contrainte de cisaillement de 12 dyne/cm². Cette figure a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : ¹spectres H-RMN pour la prépolymérisation de la gélatine et du GelMA. (A) Reportez-vous aux cases pointillées pour les pics pertinents. Les pics de méthacryloyle (c’est-à-dire les groupes vinyle et méthyle) sont apparus après la modification chimique de la gélatine, tandis que le groupe lysine a été utilisé pour quantifier le degré de substitution après la réaction chimique¹⁸. (B) Le module de Young des hydrogels a été mesuré par un essai de compression, et 4 % (p/v) des hydrogels GelMA ont été considérés comme des substrats physiologiques, et 10 % (p/v) ont été considérés comme des substrats pathologiques (n = 4, moyenne ± MEB). Cette figure a été modifiée au lieu de⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Conception de la chambre d’écoulement à plaques parallèles et simulation informatique. (A) Trois plaques distinctes ont été utilisées pour réduire le risque d’endommager les hydrogels pendant le chargement ou le déchargement ; Là où la plaque inférieure fournissait une surface d’appui, la surface médiane offrait un support latéral pour les hydrogels, et la plaque supérieure et le joint d’étanchéité formaient l’espace pour que le fluide puisse s’écouler. (B) La chambre d’écoulement a fait l’objet de simulations informatiques¹¹. Lorsque le débit est de 215 mL/min, la contrainte de cisaillement le long de la ligne tracée est d’environ 12 dyne/cm^2, représentant la contrainte de cisaillement physiologique. (C) L’influence de l’écart de 0,5 mm est limitée à une petite zone adjacente à l’espace. La surface restante de l’hydrogel subit une contrainte de cisaillement uniforme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : La contrainte de cisaillement et l’hydrogel rigide augmentent la formation de fibres. D’autres fibres d’actine périphériques se forment dans les CE sur des échantillons de 5 kPa sous écoulement. Des fibres de contrainte plus fortes se sont formées lorsque les cellules ont été exposées à une contrainte de cisaillement sur des hydrogels de 10 kPa, mettant en évidence l’efficacité du modèle sur le comportement de la CE. Les flèches indiquent l’actine périphérique et les astérisques indiquent les fibres stressées. Barre d’échelle = 10 μm (Bleu : DAPI, Rouge : Fibres d’Actine). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le système vasculaire est un environnement dynamique où diverses forces influencent considérablement le comportement cellulaire. Il serait inexact d’étudier les événements biologiques dans les maladies cardiovasculaires sans tenir compte de ces forces. Ainsi, les modèles cellulaires capables d’émuler l’environnement mécanique vasculaire sont cruciaux. Les chercheurs ont déjà fait des progrès significatifs dans la mise en évidence de l’effet de ces forces sur le comportement cellulaire¹¹. Cependant, pour comprendre le comportement cellulaire dans des conditions pathologiques et physiologiques dans le corps humain, il est essentiel de développer des modèles plus précis qui ressemblent davantage à l’environnement du vaisseau sanguin. Par conséquent, nous avons cherché à développer un système qui reproduit plus précisément l’environnement des vaisseaux sanguins tout en maintenant la facilité d’accès et la convivialité.

Le modèle peut appliquer une contrainte de cisaillement dérivée de l’écoulement contrôlé aux cellules humaines sur des substrats avec des niveaux de rigidité variables, produisant des conditions plus proches des réalités physiologiques par rapport aux modèles existants. GelMA a été synthétisé et utilisé dans ce modèle pour répondre aux critères suivants : 1) propriétés mécaniques réglables, 2) comportement non gonflant, 3) compatibilité et adhésion cellulaires, et 4) capacité d’intégration des cellules vasculaires pour modéliser les vaisseaux sanguins avec plus de précision. L’ajustement des propriétés mécaniques a été obtenu en faisant varier la concentration de biopolymère⁸ pour imiter les conditions physiologiques et pathologiques. Le deuxième critère était le comportement non gonflant. Il est crucial d’avoir un substrat non gonflant pour maintenir des dimensions constantes de la chambre d’écoulement, les conditions d’écoulement associées et la contrainte de cisaillement sur les cellules. GelMA avec un degré élevé de méthacrylation a démontré des propriétés anti-gonflement, préservant la forme et la douceur de la surface de l’hydrogel tout au long de l’expérience⁸. Il est important de noter que la concentration et la rigidité n’ont pas affecté le comportement de gonflement, ce qui a simplifié le modèle en éliminant le besoin d’ajustements distincts pour chaque groupe expérimental. Le troisième critère était l’adhérence des cellules, car une bonne fixation est nécessaire pour empêcher le détachement des cellules et préserver l’intégrité de la monocouche. GelMA a fourni une adhérence cellulaire, réduisant ainsi le besoin d’étapes supplémentaires pour conjuguer les molécules adhésives cellulaires au substrat, ce qui est essentiel pour de nombreux biopolymères. De plus, la capacité d’encapsulation cellulaire de GelMA a été prise en compte, bien qu’elle n’ait pas été directement testée dans cette étude. Le potentiel d’encapsulation cellulaire a des indications pour soutenir la culture cellulaire 3D et intégrer des couches de cellules, telles que les cellules musculaires lisses vasculaires ou les péricytes, afin d’améliorer la précision du modèle¹⁹. De plus, la synthèse de GelMA est rentable et nécessite un équipement minimal, ce qui en fait un excellent candidat en tant que biomatériau pour la fabrication de substrats 20,21,22.

La chambre d’écoulement à plaques parallèles est couramment utilisée pour appliquer une contrainte de cisaillement aux cellules, mais elle n’a traditionnellement été utilisée qu’avec des lamelles en verre ou des matériaux rigides. Cependant, ces matériaux manquent de pertinence physiologique²³. En revanche, les dispositifs microfluidiques ont introduit une plus grande complexité géométrique et des substrats plus souples en utilisant des matériaux à base de polymères. Cependant, ces dispositifs ne peuvent souvent pas contrôler le régime d’écoulement avec précision, et leurs petites dimensions limitent leur capacité à n’étudier qu’un petit nombre de cellules, limitant ainsi les résultats expérimentaux¹¹. Le dispositif proposé combine les avantages des deux systèmes en intégrant des hydrogels monocouches de cellules endothéliales ensemencées avec une chambre d’écoulement appliquant une contrainte de cisaillement contrôlée avec précision.

Le dispositif a démontré sa capacité à intégrer à la fois les forces mécaniques dérivées de l’écoulement et des forces dérivées du solide. Lorsqu’une contrainte de cisaillement de 12 dyne/cm² a été appliquée pendant 6 h, une formation de fibres de stress cytosolique a été observée, contrastant avec la prédominance de l’actine périphérique dans le groupe de substrats plus mous. Ceci est conforme à de nombreux rapports montrant moins de fibres de stress formées lorsque les CE sont cultivés sur des surfaces plus molles ^24,25,26,27. D’autre part, l’écoulement laminaire pourrait entraîner la formation de fibres de stress importantes. Il a été démontré que la réponse cytosquelettique aux conditions d’écoulement commence dans l’heure qui suit l’exposition au flux, mais nécessite un temps remarquablement plus long pour terminer la réorganisation 28,29,30. Le réseau d’actine périphérique est essentiel pour diverses fonctions EC, y compris l’adhésion cellule-cellule et la fonctionnalité de barrière¹⁷. La régulation positive de ce réseau dans un groupe expérimental sain par rapport au groupe pathologique avec des fibres de stress étendues approuve la modélisation réussie du dispositif des conditions saines et malades.

L’un des inconvénients de ce dispositif est le risque d’endommager les hydrogels, ce qui pourrait perturber l’écoulement et diminuer le taux de réussite des expériences. Ce problème provient principalement de défauts initiaux dans les hydrogels, qui, sous l’effet d’une contrainte de cisaillement, peuvent s’aggraver, entraînant le détachement de l’échantillon et une obstruction partielle de l’écoulement. Par conséquent, les étapes de préparation des échantillons, y compris la polymérisation, l’équilibrage et la découpe, doivent être effectuées avec soin afin d’éviter tout dommage supplémentaire aux échantillons. Un autre défi de ce système est d’atteindre et de maintenir l’intégrité de la monocouche. Bien que l’enrobage des hydrogels avec de la gélatine puisse améliorer l’attachement initial des cellules, nos travaux précédents ont montré que ce revêtement n’affecte pas la prolifération cellulaire⁸. Par conséquent, pour améliorer la formation de monocouches, surtout si l’on considère que la prolifération cellulaire est plus lente sur les hydrogels plus mous³¹, l’augmentation de la densité d’ensemencement est bénéfique. De plus, les cellules peuvent se détacher en raison de la contrainte de cisaillement induite par l’écoulement du fluide. Par conséquent, il est crucial d’augmenter progressivement le débit, ce qui laisse aux cellules suffisamment de temps pour s’adapter aux nouvelles conditions environnementales.

En conclusion, le dispositif représente une avancée significative dans la simulation plus précise de l’environnement vasculaire en raison de sa capacité à simuler simultanément les forces mécaniques dérivées des fluides et des solides. Il offre une plate-forme complète pour étudier le comportement de la CE dans diverses conditions physiologiques et pathologiques. Cette polyvalence en fait un outil précieux pour faire progresser notre compréhension de la biologie vasculaire et de la progression de la maladie. Ce modèle peut contribuer à une variété d’études de recherche, notamment la mécanobiologie, l’athérosclérose, le développement de métastases cancéreuses, l’ingénierie tissulaire vasculaire et l’angiogenèse, ainsi que l’administration et le dépistage de médicaments.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(triméthoxysilyl)méthacrylate de propyle, tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	Invitrogen	15524-010	Fabrication d’hydrogel
3-(triméthoxysilyl)Méthacrylate de propyle	Sigma-Aldrich	440159	Salinisation du verre
Milieu de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Immunocoloration
Acétone	Thermo Fisher Scientifics	A18-4	GelMA Synthèse
Alexa Fluor 555 Phalloïdine  ;	Technologie de signalisation cellulaire	8953S	Immunocoloration Persulfate d’ammonium
(APS)	Bio-Rad	1610700	Fabrication d’hydrogel
Feuille acrylique coulée transparente résistante aux rayures et aux UV (45/64'')	McMaster-CARR	8560K165	Fabrication de chambre d’écoulement
Microscope confocal	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 800	Immunocoloration
Covidien Monoject Rigid Pack Seringues de 60 mL sans aiguilles	Fisher  ;   ;	22-031-375	Flow Experiment
Kit de croissance EC  ;	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-041	Culture cellulaire
Éthanol 200 Proof	Decon Labs	2701	Salinisation du verre
Gélatine de type A (300 bloom) à partir de peau porcine	Sigma-Aldrich	G1890	GelMA Synthesis
Acide acétique glacial	Thermo Fisher Scientifics	9526-33	Salinisation
du verre Silicone haute pureté haute température Feuille de caoutchouc	McMaster-Carr	87315K74	chambre d’écoulement
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)	Collection de culture de type américain (ATCC)	PSC-100-010	Culture cellulaire
M3x30mm Vis mécaniques à six pans hexagonaux Vis à tête ronde 304 Boulons de fixation en acier inoxydable 20pcs	Uxcell	B07Q5RM2TP	Fabrication
de la chambre d’écoulementVariateur numérique Masterflex L/S avec Easy-Load® ; 3 tête de pompe pour tube de précision ; Expérience	VWR	#MFLX77921-65	VAC²
Tube de pompe de précision Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25 ; 25 ft	VWR	#MFLX96419-25	Flow Experiment  ;
Anhydride méthacrylique (MAH)	Sigma-Aldrich	276685	GelMA Synthesis
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientifics	043368.9M	Culture cellulaire
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	14080-055	Bicarbonate de
sodium	Fisher Chemical	S233-3	GelMA Synthesis
Carbonate de sodium	Fisher Chemical	S263-500	GelMA Synthesis
SOLIDWORKS version
SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023	SolidWorks	N/A	Flow Chamber Design
Vasculaire Basal Medium	American Type Culture Collection (ATCC)	PCS-100-030	Culture cellulaire