Ici, nous décrivons les méthodes pour tatouer le Xenopus laevis adulte (grenouille à griffes africaines) avec une machine à tatouer rotative. Un tatouage approprié permet d’obtenir des chiffres sombres et facilement lisibles qui durent plusieurs mois et permettent de distinguer facilement les animaux à des fins de recherche et de tenue de registres.
Article de méthode
Méthodes de tatouage de Xenopus laevis avec une machine à tatouer rotative
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les modèles animaux élargissent la portée de la recherche biomédicale, approfondissent notre compréhension de la biologie développementale, moléculaire et cellulaire et permettent aux chercheurs de modéliser les maladies humaines. L’enregistrement et le suivi des animaux individuels permettent aux chercheurs de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude et d’affiner les pratiques pour améliorer le bien-être des animaux. Il existe plusieurs méthodes bien documentées pour marquer et suivre les mammifères, notamment le poinçonnage des oreilles et les étiquettes d’oreille. Cependant, les méthodes de marquage des espèces d’amphibiens aquatiques sont limitées, les ressources existantes étant désuètes, inefficaces ou d’un coût prohibitif. Dans ce manuscrit, nous décrivons les méthodes et les meilleures pratiques pour marquer Xenopus laevis avec une machine à tatouer rotative. Un tatouage approprié permet d’obtenir des tatouages de haute qualité, ce qui rend les individus facilement distinguables par les chercheurs et présente un risque minimal pour la santé des animaux. Nous soulignons également les causes des tatouages de mauvaise qualité, qui peuvent entraîner des tatouages qui s’estompent rapidement et causent des dommages inutiles aux animaux. Cette approche permet aux chercheurs et aux vétérinaires de marquer les amphibiens, ce qui leur permet de suivre les réplicats biologiques et les lignées transgéniques et de tenir des registres précis de la santé animale.
Introduction
Les modèles animaux sont des outils utiles pour étudier des questions relatives à la santé humaine. En pratique, la recherche biomédicale utilisant des modèles animaux nécessite une organisation minutieuse et le maintien d’une colonie animale saine. Les meilleures pratiques en matière de manipulation et d’élevage éthiques des animaux visent à réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation et à affiner les pratiques pour assurer le bien-être des animaux1. Le genre de grenouille à griffes, y compris Xenopus laevis (X. laevis ; grenouille à griffes africaines) et Xenopus tropicalis (X. tropicalis ; Grenouille à griffes occidentales), sont utilisés dans la recherche biomédicale depuis les années 1930, lorsque X. laevis a été utilisé par les médecins sud-africains pour effectuer les premiers tests de grossesse2. Bien que les tests de grossesse modernes ne nécessitent plus de grenouilles, le rôle de la recherche sur le xénope persiste. Les avantages de l’utilisation du xénope pour la recherche biomédicale comprennent ses génomes bien annotés3, l’ovulation inductible toute l’année de grandes couvées d’œufs4 et les œufs pondus à l’extérieur qui se prêtent à la fécondation in vitro. Ces caractéristiques en font un atout utile pour l’embryologie et le développement des vertébrés 5,6,7, la biologie moléculaire et cellulaire de base 7,8,9,10 et pour la modélisation des maladies humaines 7,11,12,13.
Des méthodes fiables pour suivre les animaux Xénope sont essentielles pour enregistrer les réplicats biologiques et améliorer la rigueur et la reproductibilité de la recherche. Comme les xénopes sont souvent logés en groupes, le marquage des animaux permet aux chercheurs de suivre facilement les animaux individuels4. La tenue d’un registre précis des animaux peut permettre d’économiser du temps et des ressources et d’améliorer la capacité de suivre la santé des animaux. Par exemple, l’identification individuelle des animaux peut améliorer les flux de travail d’organisation pour générer des lignées transgéniques de Xénope, car cela nécessite plusieurs générations de grenouilles avec des génotypes spécifiques vérifiés par le séquençage14, ce qui nécessite l’organisation et l’identification individuelle des animaux. Cela est particulièrement vrai lorsque ces mutations n’ont pas de phénotypes adultes facilement discernables. De même, l’utilisation d’ovocytes et d’embryons de xénope pour étudier la biologie cellulaire et développementale de base bénéficie du suivi d’animaux individuels. Après avoir induit l’ovulation, les animaux doivent se reposer pendant au moins 3 mois pour prévenir les complications de santé telles que le syndrome d’hyper-ovulation15. Les méthodes d’identification individuelles permettent de ne pas inciter les animaux à ovuler trop fréquemment.
Le marquage et le suivi des animaux permettent également au personnel de laboratoire de suivre les problèmes de santé des animaux. Le fait que des animaux du même génotype tombent malades peut indiquer une consanguinité excessive ou des problèmes de santé imprévus associés au transgène. De même, les animaux qui tombent malades après une ovulation récente peuvent indiquer des problèmes avec les réactifs, les matériaux ou les techniques. Le suivi des animaux et de leur santé permet au personnel de laboratoire et aux vétérinaires de faire un suivi lorsque des problèmes refont surface et de prendre des mesures préventives pour prévenir de futures maladies. Chez les mammifères, il existe de nombreuses méthodes d’identification. Les méthodes permanentes pour les souris comprennent les coups de poing dans les oreilles, les étiquettes d’oreille, le tatouage et les micropuces sous-cutanées16. Ceux-ci peuvent différencier clairement et de manière fiable les animaux au sein d’une colonie ou d’une cage et peuvent être facilement administrés par le personnel de laboratoire. Les méthodes telles que les coups de poing dans les oreilles sont peu invasives, ne nécessitent qu’une seule pièce d’équipement spécialisé et fonctionnent pour les animaux de tous âges. Bien que ces systèmes soient simples et utiles pour les souris, leur utilisation chez les grenouilles présente un ensemble unique de défis. Les grenouilles et autres amphibiens n’ont pas de pavillon (structure de l’oreille externe). Certains chercheurs ont attaché des étiquettes à la mâchoire, à l’orteil ou au membre postérieur de l’animal17,18. Cette approche a entraîné divers problèmes : les étiquettes de la mâchoire provoquaient une irritation et les grenouilles agitées tentaient d’enlever les étiquettes avec leurs membres antérieurs17. Les étiquettes d’orteil perçaient la sangle entre les orteils, ce qui nuisait aux mouvements et comportait le risque de se perdre. En tant que tels, les amphibiens ont besoin de leurs propres méthodes d’identification. Historiquement, la coupe des orteils a également été utilisée pour marquer les amphibiens17,19. L’orteil est coupé à l’aide d’une paire de ciseaux pointus, et l’animal peut être identifié par la longueur des orteils sur les pattes avant et arrière ou par l’angle auquel l’orteil a repoussé (chez les salamandres). Cependant, cette méthode pose le problème éthique que la coupe des orteils peut entraver le mouvement de l’animal17. De plus, cela peut provoquer des saignements et introduire un risque d’infection. Un autre système de marquage établi est l’autogreffe de peau, dans laquelle la peau est prélevée sur une partie de la grenouille et attachée chirurgicalement à une autre partie. Par exemple, une méthode est décrite pour marquer le dos ou l’épaule d’une grenouille à l’aide d’une greffe de peau de couleur claire de sa poitrine20. Les greffes de peau comportent également des limites et des risques : la procédure est invasive et introduit un risque d’infection à Aeromonas hydrophila, ou jambe rouge, une affection potentiellement mortelle ; la cicatrisation complète de l’autogreffe prend jusqu’à 6 semaines ; Et avec les méthodes décrites, seules 6 grenouilles peuvent être logées ensemble en raison du nombre limité d’endroits pour mettre une autogreffe20.
Les approches de marquage moins invasives comprennent les billes de verre et les puces de transpondeur17,19. Dans la méthode des perles de verre, les perles de verre sont enfilées sur une petite suture et cousues dans la peau de la grenouille. Cela offre une plus grande variabilité que les autogreffes de peau, avec au moins 60 combinaisons de couleurs distinctives. Il existe cependant un risque que la suture se détache et entraîne la perte des billes. Alternativement, un transpondeur de micropuce peut être implanté sous la peau dans le sac lymphatique dorsal de la grenouille. Cette méthode est considérée comme la plus permanente et permet d’identifier et de cataloguer individuellement un nombre potentiellement infini d’animaux. Cependant, c’est aussi la méthode la plus coûteuse, car les micropuces individuelles sont chères et une grande colonie serait coûteuse à marquer. Les micropuces nécessitent également un scanner spécial pour lire19. Une approche courante pour l’identification du xénope consiste à se référer à la coloration et aux motifs naturels des animaux. Cela fonctionne particulièrement bien pour les grenouilles telles que X. laevis, qui ont des motifs distincts qui persistent tout au long de l’âge adulte. Cependant, ces motifs peuvent changer avec le temps avec le stress, et la coloration peut apparaître différente lorsque les grenouilles sont déplacées entre des récipients transparents et teintés15. De plus, cette méthode d’identification est moins utile pour X. tropicalis, qui a des motifs de marquage moins distincts que X. laevis, ou pour les animaux albinos, qui n’ont pas de marques de couleur21. Même pour les espèces avec des marques distinctes, le personnel de laboratoire peut interpréter différemment l’emplacement et la taille des marques, ce qui peut entraîner des erreurs d’identification. Pour cette raison, la photographie des animaux est plus fiable en conjonction avec une méthode d’identification supplémentaire. Par conséquent, nous cherchons à marquer et à identifier les animaux Xenopus à l’aide d’une technique facilement discernable, permanente et peu invasive.
Il existe peu de ressources publiées décrivant les méthodes de tatouage des amphibiens. Le tatouage a été décrit aux côtés d’autres techniques de marquage, notamment les marques de chaleur, les marques de nitrate d’argent et les marques de congélation17. Dans la même ressource, le tatouage a été fait en dessinant des chiffres avec une aiguille hypodermique 27G, et le processus a été noté comme ne provoquant pas d’infection, contrairement aux autres techniques de marquage, qui utilisaient un fil en forme de chiffre ou d’une autre marque. Dans une autre source, une machine à tatouer électrique (décrite comme une aiguille vibrante) a été utilisée pour marquer les grenouilles, mais peu de détails ont été fournis sur la technique17,19. Les auteurs avertissent qu’en perturbant la couche de boue protectrice de la grenouille, cette procédure augmente le risque de patte rouge. Bien qu’il n’existe pas de méthode de marquage ou d’identification à la fois totalement non invasive (comme les photographies) et permanente (comme les micropuces), le tatouage constitue un compromis efficace. Le tatouage est relativement simple par rapport à d’autres techniques, telles que les autogreffes de peau. Parmi les autres avantages, citons une courbe d’apprentissage plus courte et un équipement relativement peu coûteux. Le tatouage d’amphibiens aquatiques s’accompagne de certains défis, qui peuvent intimider les chercheurs et nuire au marquage réussi des animaux. Cet article vise à fournir aux chercheurs des méthodes bien documentées pour tatouer le xénope adulte avec une machine à tatouer rotative.
Protocole
Toutes les procédures décrites sur les animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux du Dartmouth College.
1. Configuration de l’équipement
REMARQUE : un flux de travail pour la procédure et un exemple de configuration de banc sont inclus (Figure 1).
- Connectez le pistolet de tatouage et la pédale à l’alimentation électrique. Placez la pédale sous la surface de travail.
- Assemblage du pistolet de tatouage
- À l’aide d’une clé Allen ou d’un tournevis hexagonal, desserrez les vis de la poignée (Figure 2A, encerclée en rouge).
- Insérez l’embout en plastique à fond dans la poignée. Serrez la vis pour la maintenir en place.
- Insérez le tube métallique à l’arrière de la poignée (Figure 2A). Celui-ci sera ajusté, alors insérez-le à la moitié de sa longueur. Serrez la vis pour la maintenir en place.
- Insérez une aiguille de tatouage à l’arrière de la poignée de manière à ce qu’elle repose confortablement dans la pointe en plastique à l’avant de la poignée (Figure 2B).
- Faites glisser l’arrière de l’aiguille et du tube métallique à travers le collier de serrage. Ajustez le tube métallique de manière à ce que l’aiguille s’insère confortablement dans la pointe en plastique (Figure 2B). Serrez à la main le collier de serrage jusqu’à ce qu’il ne puisse plus bouger (Figure 2C).
- Retirez le joint torique noir et accrochez l’aiguille sur le bras du rotor ; replacez le joint torique pour fixer l’aiguille en place (Figure 2C).
- Réglez la tension sur l’alimentation de manière à ce qu’il y ait suffisamment de puissance pour percer la peau, mais pas trop puissante pour qu’elle soit difficile à contrôler. Une fois l’alimentation branchée et connectée, appuyez sur la pédale pour vous assurer que la machine fonctionne. Veillez à ne pas pointer l’aiguille sur vous-même ou sur d’autres membres du personnel.
REMARQUE : La machine à tatouer utilisée dans ce protocole fonctionne mieux entre 6,0 et 9,0 V, mais cela peut varier entre les machines à tatouer et les alimentations en tension et doit être déterminé empiriquement. - Remplissez le capuchon d’un tube de microcentrifugation de 1,5 ml ou d’un encrier en plastique fourni avec de l’encre de tatouage noire jusqu’à ce qu’il soit rempli aux trois quarts.
2. Anesthésie
- Préparez l’anesthésie dans un réservoir suffisamment grand pour immerger une grenouille X . laevis femelle adulte.
- À l’aide d’eau sans danger pour les grenouilles (sans chlore), ajoutez de la tricaïne à la concentration finale de 1,5 g/L et du bicarbonate de sodium à la concentration finale de 3,5 g/L. Mélangez pour dissoudre. Le pH de cette solution est de 7,15.
ATTENTION : La tricaïne est un irritant.
- À l’aide d’eau sans danger pour les grenouilles (sans chlore), ajoutez de la tricaïne à la concentration finale de 1,5 g/L et du bicarbonate de sodium à la concentration finale de 3,5 g/L. Mélangez pour dissoudre. Le pH de cette solution est de 7,15.
- Immergez une grenouille dans le réservoir d’anesthésie. Assurez-vous que la grenouille reste immergée dans la solution de tricaïne jusqu’à ce qu’elle soit anesthésiée (7-8 min).
- Pour vérifier si la grenouille est complètement anesthésiée, prenez-la, tenez-la à l’envers et pressez-la fermement sur un pied. Si la grenouille ne bronche pas ou ne répond pas, elle peut être tatouée.
- Si les grenouilles mettent constamment plus de 10 minutes pour être anesthésiées, préparez une solution de tricaïne fraîche tamponnée avec du bicarbonate de sodium.
REMARQUE : Les grenouilles ne doivent pas passer plus de 30 minutes dans la solution de tricaïne15.
3. Le tatouage
REMARQUE : Avant de tatouer un animal vivant, il peut être utile de s’entraîner sur un morceau de fruit à peau ferme (comme un citron ou une banane).
- Préparez une cuve de récupération pour les grenouilles avant le tatouage. Remplissez un réservoir de 10 à 15 L d’eau fraîche sans danger pour les grenouilles et ajoutez un îlot en polystyrène. Cela fournira une surface pour que la grenouille puisse se réveiller sans se noyer.
REMARQUE : Un îlot en polystyrène peut être fabriqué à l’aide du couvercle d’un conteneur d’expédition frigorifique en polystyrène placé à l’intérieur d’un sac à fermeture éclair. - Placez la grenouille anesthésiée sur son dos sur une serviette en papier sèche ou du papier de banc (figure 3A). Utilisez des essuie-tout non blanchis (bruns) pour tous les travaux impliquant des grenouilles.
- À l’aide d’une lingette sèche non pelucheuse, essuyez l’eau et le mucus de la poitrine de la grenouille.
- Trouvez le sternum au centre de la poitrine de la grenouille avec les doigts et, à l’aide de la main non dominante, maintenez la peau tendue.
- Marquage de la grenouille
- Tenez le pistolet de tatouage assemblé verticalement par rapport à la surface de travail et trempez l’aiguille dans l’encre (Figure 3B).
- En gardant le pistolet de tatouage assemblé vertical, appuyez la pointe de l’aiguille sur la peau de la grenouille avant d’appuyer sur la pédale. Tracez des lignes sur la peau de la grenouille tout en appliquant une pression uniforme.
REMARQUE : Certains saignements ou rougeurs mineurs sont normaux, tout comme une desquamation cutanée mineure. - Si l’aiguille se coince sur la peau de la grenouille, enlevez l’excès d’encre ou de peau de l’aiguille avec une lingette. L’excès d’encre est normal lors du tatouage.
- Si la poitrine de la grenouille est recouverte d’une trop grande quantité d’encre pour voir clairement la zone marquée (figure 3C), éliminez l’excès d’encre avec de l’eau sans danger pour la grenouille et une lingette (figure 3C). Ensuite, évacuez l’humidité avec une lingette sèche et continuez l’encrage.
REMARQUE : Une bouteille compressible d’eau sans danger pour les grenouilles peut être préparée avant le tatouage. - Continuez à encrer la même zone jusqu’à ce que les chiffres soient foncés et lisibles après avoir essuyé l’excès d’encre (Figure 3D). Au lieu de dessiner l’ensemble du marquage ou du numéro en un seul trait, faites à plusieurs reprises des traits plus petits, en particulier pour les courbes.
4. Récupération
- Mouillez une serviette en papier avec de l’eau sans danger pour les grenouilles et placez-la à plat sur l’îlot en polystyrène (figure 4A).
- Remise des grenouilles dans les bassins sur pied
- Posez la grenouille sur le ventre sur la serviette face à l’eau (Figure 4B). Pliez la moitié de l’essuie-tout sur la moitié arrière de la grenouille et, à l’aide des mains en coupe, mouillez le haut de la grenouille. Une fois qu’une grenouille sort de l’anesthésie (environ 1 h après le tatouage), elle entrera dans l’eau de manière indépendante et nagera normalement.
- Remettez les grenouilles dans un logement à long terme après 24 heures, une fois que le tatouage est complètement cicatrisé.
5. Nettoyage et entretien de l’équipement
- Réutilisation et autoclave des aiguilles de tatouage
- Rincez les aiguilles dans de l’isopropanol à 100 % et de l’eau déminéralisée pour détacher l’encre et frotter l’encre restante qui n’est pas dissoute.
- Après avoir frotté, placez les aiguilles dans un boîtier d’autoclave en métal ou enveloppez-les de papier d’aluminium et d’autoclave pendant 30 minutes sur un cycle de séchage.
- S’il y a de l’encre sur des morceaux de la machine à tatouer ou d’un autre équipement, essuyez-le avec de l’éthanol à 100% et une serviette en papier.
- La solution anesthésique a une concentration finale de tricaïne d’environ 0,5 %. Éliminez-les conformément aux lignes directrices de l’établissement en matière de gestion des déchets dangereux.
- Stockage et entretien de l’équipement
- Si possible, rangez la machine à tatouer dans une pièce sèche. L’excès d’humidité endommagera les composants électriques et réduira la longévité de la machine.
- Pour maintenir la machine à tatouer en bon état de fonctionnement, vérifiez le roulement du rotor (Figure 2C) pour vous assurer qu’il ne s’est pas détaché des vibrations22. Celui-ci peut être serré à l’aide d’une clé Allen ou d’un tournevis hexagonal.
- Environ une fois par mois, lubrifiez le roulement sur le bras du rotor à l’aide d’une graisse lubrifiante épaisse22.
- Sur certaines machines à tatouer, le bras du rotor peut se coincer et ne vibrera pas. Pour corriger ce problème, tournez le bras du rotor ou comprimez le ressort de sorte que l’aiguille soit en position abaissée (Figure 2C).
Résultats
Les tatouages de haute qualité auront des traits sombres et lisibles sur la poitrine de la grenouille et peuvent être clairement différenciés à plusieurs pieds de distance (Figure 5A). En général, les grands nombres et les marques sont meilleurs pour la lisibilité, mais les noms et les numéros plus longs peuvent être réduits pour s’adapter confortablement à la poitrine de la grenouille. La longévité des tatouages est plus difficile à juger, mais les tatouages de grenouilles de haute qualité doivent rester foncés et lisibles pendant au moins 3 à 6 mois (Figure 5D-D'). Une fois qu’un tatouage s’est estompé, il peut être retouché en utilisant la même technique.
Une mauvaise technique ne causera pas de tort aux animaux, mais peut entraîner des tatouages qui s’estompent rapidement (Figure 5B), entraînant des retouches plus fréquentes. Un tatouage trop zélé peut provoquer des saignements et des rougeurs, et placer une grenouille dans une position de récupération incorrecte peut provoquer une noyade involontaire.
La qualité des tatouages et l’efficacité de la technique peuvent être évaluées dans les mois qui suivent le tatouage (Figure 5E). Tant qu’il y a de l’encre sur la grenouille après la période de récupération, un tatouage est considéré comme réussi.
Figure 1 : Flux de travail du protocole et configuration du banc. (A) Flux de travail et synchronisation. (1) Les grenouilles passent 7 à 8 minutes à être anesthésiées dans une solution de 1,5 g/L de tricaïne et de 3,5 g/L de bicarbonate de sodium, pH 7,15, dissoute dans de l’eau sans danger pour les grenouilles. Pendant qu’une grenouille est tatouée, une deuxième grenouille peut être placée sur le pont dans la bouteille d’anesthésie. Une seule grenouille peut être dans une solution de tricaïne à la fois. (2) Les grenouilles passent environ 10 minutes hors de l’eau à se faire tatouer. Le temps variera en fonction de la taille du tatouage et de l’expérience du personnel de laboratoire. (3) Les grenouilles inconscientes sont placées sur du polystyrène pendant 30 à 45 minutes pour éviter la noyade et recouvertes d’une serviette en papier humide pour les empêcher de se dessécher. (4) Après le tatouage, les grenouilles passent 24 heures à se rétablir dans de l’eau stagnante fraîche sans danger pour les grenouilles. Une fois qu’elles se sont rétablies, les grenouilles peuvent être renvoyées dans leur colonie. (B) Configuration d’un banc pour un exemple d’espace de travail. L’espace de travail de tatouage, une serviette en papier non blanchie, est centré sur le banc. La machine à tatouer et l’alimentation électrique se trouvent à gauche de l’essuie-tout. Ceux-ci sont placés du côté dominant du personnel (le personnel est gaucher). Un encrier et de l’encre de tatouage sont placés près de l’alimentation électrique et à l’écart de l’espace de travail de tatouage. La pédale se trouve du même côté que l’alimentation en tension. En appuyant sur cette pédale, le mouvement de rotation est effectué. Des lingettes non pelucheuses et une bouteille compressible avec de l’eau sans danger pour les grenouilles se trouvent à droite de l’essuie-tout. Ceux-ci sont utilisés pour nettoyer l’excès d’encre de la peau de la grenouille pendant le tatouage. Une clé Allen est utilisée pour serrer et desserrer les vis dans la machine à tatouer. Celui-ci est utilisé pour monter et démonter la machine à tatouer. La cuve d’anesthésie et les serviettes en papier supplémentaires sont également conservées sur le banc pendant le tatouage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Assemblage de la machine à tatouer. (A) Image de l’aiguille de tatouage, de la poignée et des composants associés démontés. Les vis de la poignée métallique sont entourées de rouge. (B) Image de l’aiguille de tatouage correctement assemblée dans la poignée. (C) Image de l’aiguille de tatouage et de la poignée assemblées dans le pistolet de tatouage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Positionnement et images de référence pour le tatouage de grenouille. (A) Image d’une grenouille allongée face vers le haut sur une serviette en papier. La flèche pointe vers le sternum de la grenouille. (B) Image du personnel de laboratoire en train d’encrer la grenouille. (C) Images de chiffres pendant l’encrage, avant (C) et après que (C') l’excès d’encre a été lavé. (D) Image du tatouage de la grenouille immédiatement après l’encrage, avant la récupération. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Récupération post-tatouage. (A) Îlot en polystyrène. Le couvercle de la glacière en polystyrène est placé à l’intérieur d’un sac à fermeture éclair. (B) Grenouilles en position de récupération après le tatouage. Les îlots en polystyrène peuvent généralement accueillir 1 ou 2 grenouilles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Exemples de résultats représentatifs. (A) Un tatouage frais 24 h après avoir été tatoué. (B) Techniques de mauvaise qualité. Dans (B), la machine à tatouer n’était pas correctement assemblée, mais elle était toujours capable de mouvement rotatif. Cette photo a été prise 4 mois après le tatouage. Dans (B'), la machine à tatouer n’a pas été assemblée correctement et n’était pas capable de mouvement rotatif. Cette photo a été prise 6 mois après le tatouage. (C) Machine à tatouer mal assemblée. Le tube métallique et l’embout en plastique ne sont pas présents, et la poignée métallique n’est pas correctement fixée au reste de la machine à tatouer. L’élastique altère le mouvement rotatif (D) Avant (D) et après (D') d’une grenouille tatouée avec une bonne technique et une bonne configuration de l’équipement. (D) a été pris immédiatement après le tatouage, et (D') a été pris 4 mois après le tatouage. (E) Données quantitatives des résultats du tatouage de grenouille. Parmi les grenouilles tatouées, 100% avaient des tatouages visibles immédiatement après le tatouage, 100% les avaient 24 heures après le tatouage et 91% les avaient 4 mois après le tatouage. n = 58 grenouilles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Tatouer des humains est une forme d’art qui remonte à des milliers d’années, et depuis que les humains se tatouent eux-mêmes, ils ont également tatoué ou marqué des animaux23. L’équipement et les techniques de marquage des animaux, en particulier des mammifères, sont bien établis, bien documentés et largement accessibles. Alors que le marquage des animaux servait à l’origine à distinguer le bétail et les moyens de dissuasion contre le vol23, son rôle dans la recherche biomédicale est devenu tout aussi important.
Un avantage du tatouage des amphibiens est que les tatouages cicatrisent en 24 heures et que les bons tatouages dureront plusieurs mois (Figure 5D'). Le tatouage offre de multiples avantages pour l’hébergement et l’élevage des amphibiens. Les tatouages permettent aux chercheurs et au personnel vétérinaire de distinguer facilement les animaux individuels à l’aide de chiffres faciles à voir et à interpréter, même dans les aquariums aux teintes plus foncées19. Cette procédure peut également être pratiquée sur n’importe quelle grenouille adulte, par rapport aux autogreffes de peau, qui ne sont pas recommandées pour les grenouilles de plus de 2 ans15. Plus important encore, le tatouage permet d’identifier un grand nombre d’animaux, avec au moins trois doigts s’adaptant confortablement à la poitrine de X. laevis (Figure 5A).
Par rapport à l’attache de perles ou d’étiquettes, le tatouage ne laisse rien qui pourrait tomber et provoque une irritation limitée17. De plus, le tatouage permet une plus grande polyvalence que les autres techniques de marquage, qui nécessitent de façonner un fil dans la marque. La procédure elle-même est beaucoup moins perturbante que les autogreffes de peau car aucun tissu n’est enlevé. Cependant, comme les autogreffes, le tatouage est également partiellement invasif et introduit un faible risque de blessure ou d’infection. Il s’agit d’une partie nécessaire du marquage de tout animal, mais il est important que les chercheurs se méfient des saignements excessifs pendant le tatouage et surveillent les animaux pour détecter l’infection à A. hydrophilia . Cela peut être évité en maintenant un espace de travail propre avant, pendant et après le tatouage et en s’assurant que les tatouages ont complètement cicatrisé avant que les animaux ne retournent dans leur colonie. Lors de la rédaction et du développement de cet article, aucune des grenouilles n’a été blessée de façon permanente ou n’est morte d’un tatouage. Une limite de cette procédure est qu’elle n’a été testée que sur des grenouilles adultes de plus de 1 an. À ce jour, aucune grenouille n’a été tatouée avec ce protocole. De plus, cette procédure n’est pas optimisée pour X. tropicalis, qui ont une coloration foncée sur la poitrine et rendront les tatouages moins discernables21. À l’avenir, ce protocole de tatouage pourrait être mis à jour pour inclure des considérations pour X. tropicalis.
Comme l’habitat du xénope est aquatique4, il est normal que ces tatouages s’estompent avec le temps. La nécessité de remplacer fréquemment les tatouages est documentée dans les tatouages des lèvres humaines à l’intérieur de la bouche, qui s’estompent plus rapidement que les tatouages épidermiques en raison du contact continuavec la salive et les boissons. Cependant, la longévité d’un tatouage dépend en grande partie de la technique de tatouage. Une mauvaise technique peut provenir d’une machine à tatouer mal assemblée (Figure 4C) ou de paramètres d’alimentation sous-optimaux. Une tension trop basse empêchera l’aiguille de pénétrer dans la peau, ce qui entraînera de légères marques ou lignes. Un réglage trop élevé de la tension causera des dommages inutiles à l’animal. Une autre source courante de mauvais tatouage provient d’un mauvais positionnement de l’aiguille ou d’une pression lorsque le personnel tient le pistolet de tatouage. Un tatouage avec une pression trop faible a le même effet qu’un réglage de tension trop bas et entraînera un tatouage faible qui s’estompe rapidement (Figure 5B'). Pendant le tatouage, on peut avoir l’impression que l’aiguille effleure la peau de la grenouille au lieu de la percer. Un tatouage avec trop de pression entraînera des saignements visibles ou incontrôlables. Le meilleur tatouage est effectué patiemment et méthodiquement en encrant par sections courtes et en retraçant les lignes avec une pression forte et constante.
Dans l’ensemble, les avantages du marquage des animaux par tatouage chez les amphibiens l’emportent sur les inconvénients. Le suivi individuel du xénope dans la recherche biomédicale permet une rigueur scientifique dans le suivi des répliques biologiques, permet aux chercheurs et au personnel vétérinaire d’évaluer le bien-être de chaque animal et garantit une fréquence d’ovulation appropriée pour maintenir la santé à long terme de l’animal. En ce qui concerne les 3R de la recherche animale - raffinement, réduction et élimination - ce protocole est le plus pertinent pour le raffinement et la réduction1. Le marquage des grenouilles permet aux chercheurs et aux vétérinaires de suivre plus facilement les problèmes de santé, ainsi que de s’assurer que les grenouilles bénéficient d’un temps de repos suffisant entre les expériences. Cela permet d’affiner le processus de recherche en assurant une meilleure qualité des données et des échantillons recueillis sur les animaux, ainsi qu’en affinant les pratiques d’élevage et de soins des animaux. Cela permet également d’améliorer la reproductibilité des expériences. De plus, le marquage des animaux permet de les réutiliser, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Les grenouilles qui pondent des œufs de qualité particulièrement élevée ou qui sont les plus utiles dans d’autres expériences peuvent être marquées et identifiées comme mieux adaptées à la recherche. Si les grenouilles ne sont toujours pas utiles pour les expériences, elles peuvent être identifiées et retirées de la colonie, ce qui permet d’économiser des ressources et de l’espace. L’objectif de cet article est de documenter les meilleures pratiques en matière de tatouage d’amphibiens et de fournir aux laboratoires de Xenopus un protocole de tatouage détaillé et facilement accessible. Cette pratique n’est pas encore courante dans le domaine du xénope , en partie parce que les ressources publiées existantes sont limitées. Cette ressource permettra aux chercheurs de marquer les animaux de manière sûre et efficace, d’améliorer la tenue de registres pour les grandes colonies et de perfectionner l’utilisation des amphibiens dans la recherche biomédicale.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Nous remercions le Centre de médecine et de recherche comparatives du Dartmouth College d’avoir fourni un élevage quotidien aux animaux utilisés dans ce protocole. Nous remercions également Leah Jacob et Adwaita Bose pour leur aide dans la mise à l’essai du protocole et la photographie d’animaux. Enfin, nous remercions le laboratoire d’Ann Miller pour sa formation à la pratique du tatouage. Ce travail a été soutenu par la subvention R00 du NIH GM147826 à J.L.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 3 aiguilles rondes | Worldwide Tattoo Supply | 1203RLB | Emballé stérile |
| 5 aiguilles rondes jetables ULTRA | Worldwide Tattoo Supply | HTIPRS5-U | Stérile emballé |
| 5 aiguilles rondes Worldwide | Tattoo Supply | 1205RLB | Emballé stérile |
| 7 aiguilles rondes | Worldwide Tattoo Supply | 1207RLB | Emballé stérile |
| Cordon de clip | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Pédale Worldwide | Tattoo Supply | N/A | |
| Inkpots | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Kimwipes, lingettes pour tâches délicates | Fisher Scientific | 06-666A | |
| RCA Connection | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Scream Ink Pitch Black, 1oz | Worldwide Tattoo Supply | SI101 | |
| Bicarbonate de sodium (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Poignées en acier inoxydable Worldwide | Tattoo Supply | N/A | |
| Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine | en tatouage N | /A | |
| Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH2-SET | |
| Île en polystyrène | N/A | N/A | Il s’agit du couvercle d’un conteneur d’expédition froid en polystyrène |
| Tricaïne (éthyl 3-aminobenzonate méthane) | Sigma-Aldrich | E10521 | ATTENTION : IRRITANT |
| Essuie-tout non blanchi | Grainger | 2U229 | essuie-tout DOIVENT être non blanchis, l’eau de Javel est toxique pour les amphibiens |
| Voltage Supply Worldwide | Tattoo Supply | N/A | |
| Flacon toilette (avec de l’eau sans danger pour les grenouilles) | Fisher Scientific | FB0340923T | L’eau sans danger pour les grenouilles est déchlorée, pH 7,0-8,5, conductivité 1200-1800 uS |
| X. laevis femelle adulte | Xenopus1 | N/A | |
| Sac en plastique à fermeture éclair | N/A | N/A | Ce sac doit être assez grand pour contenir l’îlot en polystyrène |
Références
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- Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
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- Catlett, T. All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. Healthline. , (2019).
Réimpressions et autorisations
