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Article de méthode

Isolement mitochondrial robuste à partir de tissu cardiaque de rongeur

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DOI :

10.3791/67093

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23 août 2024

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1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

Dans cet article

Résumé

Des études bioénergétiques et métabolomiques sur les mitochondries ont révélé leur rôle multiforme dans de nombreuses maladies, mais les méthodes d’isolement de ces organites varient. La méthode détaillée ici est capable de purifier des mitochondries de haute qualité à partir de plusieurs sources tissulaires. La qualité est déterminée par les rapports de contrôle respiratoire et d’autres paramètres évalués à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Résumé

L’isolement mitochondrial est pratiqué depuis des décennies, suivant des procédures établies par des pionniers dans les domaines de la biologie moléculaire et de la biochimie pour étudier les déficiences métaboliques et les maladies. Une qualité mitochondriale constante est nécessaire pour étudier correctement la physiologie mitochondriale et la bioénergétique ; Cependant, de nombreuses méthodes d’isolement publiées sont disponibles pour les chercheurs. Bien que différentes stratégies expérimentales nécessitent des méthodes d’isolement différentes, les principes et procédures de base sont similaires. Ce protocole détaille une méthode capable d’extraire des mitochondries bien couplées à partir de diverses sources tissulaires, y compris de petits animaux et des cellules. Les étapes décrites comprennent la dissection d’organes, la purification mitochondriale, la quantification des protéines et divers contrôles de qualité. La principale mesure de contrôle de la qualité utilisée pour identifier les mitochondries de haute qualité est le rapport de contrôle respiratoire (RCR). Le RCR est le rapport entre la fréquence respiratoire lors de la phosphorylation oxydative et la fréquence en l’absence d’ADP. D’autres indicateurs sont abordés. Bien que des valeurs RCR élevées par rapport à leur source tissulaire soient obtenues à l’aide de ce protocole, plusieurs étapes peuvent être optimisées pour répondre aux besoins individuels des chercheurs. Cette procédure est robuste et a toujours abouti à des mitochondries isolées avec des valeurs RCR supérieures à la moyenne dans les modèles animaux et les sources tissulaires.

Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires qui établissent des conditions énergétiques cytoplasmiques optimisées pour des fonctions cellulaires spécifiques. Alors que les études cellulaires, tissulaires et organisationnelles peuvent fournir des informations sur la fonction mitochondriale, l’isolement des organites offre un niveau de contrôle expérimental qui n’est pas possible autrement. Des isolements mitochondriaux sont effectués depuis les années 1940, ce qui permet d’étudier mécaniquement le métabolisme et la respiration dans une variété de cellules et de tissus 1,2. La pertinence historique des mitochondries est également bien documentée3. En tant que principaux producteurs d’ATP, les mitochondries jouent de nombreux rôles clés qui sont essentiels au fonctionnement optimal des cellules et des organes4. Dans la matrice mitochondriale, les substrats sont oxydés par le cycle TCA, produisant des équivalents réducteurs et des porteurs d’électrons mobiles tels que le NADH et l’UQH2 5,6. Le cytochrome C est le troisième principal porteur d’électrons mobiles dans le réseau de réactions biochimiques mitochondriales7. Ces molécules sont ensuite oxydées par les complexes transmembranaires du système de transport d’électrons (ETS) intégrés dans la membrane mitochondriale interne8. Les réactions d’oxydoréduction de l’ETS sont couplées à la translocation de protons de la matrice à l’espace intermembranaire. Ces processus établissent un gradient électrochimique de protons qui est utilisé pour phosphoryler l’ADP avec Pi par F1F0 ATP synthase pour produire ATP 9,10. Les processus individuels qui se produisent dans chaque complexe peuvent être explorés à l’aide d’une respirométrie à haute résolution à l’aide d’électrodes de type Clark ou de tests de consommation d’oxygène sur microplaques11,12. De plus, les modèles de maladies et les traitements utilisant des mitochondries isolées peuvent déterminer l’impact ou l’importance de la fonction mitochondriale dans la progression de certaines pathologies. Cela s’est avéré fructueux dans le domaine de la cardiologie, où les altérations de l’administration de carburant et de substrat ont été utilisées pour élucider comment le dysfonctionnement mitochondrial influence l’insuffisance cardiaque 13,14,15,16. Les mitochondries sont également connues pour avoir un impact sur le développement d’autres états pathologiques tels que le diabète, le cancer, l’obésité, les troubles neurologiques et les myopathies17,18. Par conséquent, l’utilisation de mitochondries isolées ou purifiées permet des investigations mécanistes du métabolisme oxydatif et de la production d’ATP dans le tissu source.

Les protocoles d’isolement mitochondrial ne manquent pas en raison de leur importance dans la recherche bioénergétique. De plus, on peut trouver des méthodes très spécifiques adaptées aux sous-populations de mitochondries dans les tissus et les cellules19,20. Les étapes procédurales de base sont similaires entre les méthodes d’isolement, mais des variations peuvent être apportées à la composition du tampon, aux étapes d’homogénéisation et aux spins de centrifugation pour améliorer la quantité et la qualité des mitochondries. Les modifications de ces aspects sont basées sur la demande métabolique du tissu, la fonction globale des organes, la densité mitochondriale et d’autres facteurs. Dans des tissus tels que le foie et les muscles squelettiques, les homogénéisateurs portatifs sont utilisés pour préserver l’intégrité mitochondriale et limiter les dommages aux membranes mitochondriales21. Cependant, lors de l’isolement des reins, certains protocoles suggèrent d’utiliser une homogénéisation manuelle ou des kits commerciaux pour obtenir de meilleurs résultats22. Bien que les deux méthodes produisent des mitochondries fonctionnelles, la qualité des organites peut être compromise par le temps supplémentaire nécessaire pour effectuer les isolements à l’aide de ces protocoles. La centrifugation est également essentielle à l’extraction des protéines mitochondriales, car elle sépare les composants cellulaires tels que les noyaux et autres organites des mitochondries23. Au cours du processus d’isolement, on se demande si la centrifugation différentielle ou basée sur la densité doit être mise en œuvre pour obtenir des isolats plus purs24. Bien que la centrifugation par densité puisse séparer les mitochondries des organites de gravité spécifique similaire, tels que les peroxysomes, il n’est pas bien établi si les mitochondries de ces méthodes représentent mieux la fonction des organites in situ par rapport aux mitochondries isolées à l’aide de la centrifugation différentielle. Dans le domaine de la physiologie mitochondriale, la centrifugation basée sur la densité est préférée et peut être facilement modifiée pour augmenter la pureté de l’isolat. La question de savoir si les modifications des forces g, de la durée de la centrifugation et du nombre de spins de centrifugation sont incorporées doit être prise en compte avant l’expérimentation en raison de leur influence sur la purification mitochondriale. De plus, la remise en suspension mitochondriale, sans doute l’étape la plus cruciale de l’isolement, diffère considérablement d’une étude à l’autre, avec l’utilisation du grattage, du mélange basé sur les vortex ou de l’homogénéisation 23,25,26. La remise en suspension mécanique de ces types peut être trop abrasive et nuire à l’intégrité de la membrane des mitochondries. Pour cette raison, un lavage doux doit être effectué pour corriger cela. Malgré la pléthore de modulations et de méthodologies suggérées, il existe moins de protocoles complets avec une reproductibilité et une adaptabilité élevées pour les modèles de rongeurs.

Les méthodes décrites dans le présent document décrivent un protocole détaillé, robuste et hautement reproductible qui permet d’obtenir des mitochondries purifiées et bien couplées à partir de tissus cardiaques de petits animaux. Comme nous l’avons démontré, cette méthode peut être facilement adaptée pour répondre aux besoins spécifiques de chaque expérience et/ou environnement de laboratoire pour isoler les mitochondries des reins, du foie et des cellules cultivées. D’autres modifications peuvent être apportées pour isoler les mitochondries des tissus et d’autres animaux non énumérés ici. Les recettes de tampon utilisées pour toutes les isolations sont fournies et peuvent être modifiées si nécessaire. À l’instar d’autres protocoles publiés, l’homogénéisation motorisée et la centrifugation différentielle sont mises en œuvre ; Cependant, des ajustements sont apportés à la fois au temps de cisaillement et à la force à laquelle les échantillons sont centrifugés pour fournir constamment des isolats mitochondriaux de haute qualité, en fonction de la source d’isolement. Notamment, ce protocole diffère des autres par l’utilisation d’un lavage doux par pipetage pour remettre en suspension les mitochondries granulées, ce qui aide à préserver l’intégrité de la membrane mitochondriale et à maintenir la fonctionnalité globale des organites. La protéine mitochondriale est quantifiée soit par la détermination de la protéine totale, soit par la mesure de l’activité de la citrate synthase. L’utilité et la large applicabilité de cette méthode d’isolement sont également étayées par les valeurs des rapports de contrôle respiratoire (RCR) obtenues dans divers organismes et sources tissulaires.

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Protocole

L’utilisation et le traitement de tous les animaux vertébrés ont été effectués conformément aux protocoles approuvés examinés et acceptés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État du Michigan. Ce protocole a été conçu à l’aide de cobayes Hartley albinos mâles et femelles et de rats Sprague Dawley (SD). Pour l’isolement des mitochondries cardiaques de cobayes, des animaux ont été sacrifiés à des âges compris entre 4 et 6 semaines (300 à 450 g). Des mitochondries cardiaques de rats SD des deux sexes ont été obtenues entre l’âge de 10 et 13 semaines (250 à 400 g). Les recettes de tampons sont décrites dans le tableau 1 et doivent être préparées à l’avance. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation expérimentale

  1. Avant de commencer l’isolement, étiquetez deux tubes de centrifugation de 50 mL comme « Spins 1 et 2 » et « Spin 3 ».
  2. Placez des tubes, un tampon d’isolement (IB) fraîchement décongelé, des ciseaux de hachage tranchants, une sonde d’homogénéisation assemblée et un bécher de 5 ml ou un récipient de taille équivalente sur de la glace.
  3. Placez le tampon respiratoire (RB) fraîchement décongelé dans un incubateur pour le réchauffer en vue des tests respiratoires ultérieurs.
  4. Pré-refroidissez une centrifugeuse réfrigérée à 4 °C.
  5. Assurez-vous que tout l’équipement est disposé et que 20 μL de protéase 7-15 U/mg de Bacillus licheniformis ont été ajoutés au tube étiqueté « Spins 1 et 2 ».
  6. Mettre en place un système de pression dépendant de la gravité pour la perfusion par canulation à l’aide d’un tampon de cardioplégie (CB, tableau 1), d’une canule en verre et d’un tube en plastique avec une valve d’arrêt attachée.
  7. Disposez des outils chirurgicaux et prévoyez des ciseaux et des pinces appropriés pour la dissection et la canulation du cœur.
    REMARQUE : Toute l’eau doit être de qualité pure (18,2 MΩ·cm)

2. Dissection tissulaire

  1. Injecter aux animaux du sulfate d’héparine stérile par voie intrapéritonéale à une dose de 500 U/kg.
  2. Laissez l’animal reposer dans la chambre d’induction pendant 15 minutes après l’administration d’héparine. Pendant ce temps, fournissez 2 L/min de gaz O2 pur pour oxygéner complètement les animaux, les calmer et minimiser tout stress pouvant avoir des conséquences néfastes sur les tissus d’intérêt.
  3. Commencer l’induction de l’anesthésie par un flux continu d’isoflurane à 0,5%. Après 1 min, augmentez à 1%. Continuez à augmenter de 1 % toutes les minutes jusqu’à ce que 5 % soient atteints. Une fois à 5 %, attendez 1 minute et surveillez le rythme respiratoire de l’animal.
  4. Une fois que la respiration a ralenti et devient laborieuse (environ au bout de 6,5 minutes), coupez le flux d’isoflurane et d’oxygène.
  5. Retirez rapidement l’animal de la chambre d’induction et vérifiez la profondeur de l’anesthésique en serrant une patte et en vérifiant le réflexe cornéen. Si l’animal répond à l’un ou l’autre stimulus, remettez-le dans la chambre d’induction, administrez à nouveau l’anesthésie et répétez la vérification de la profondeur de l’anesthésique.
  6. Une fois que la profondeur appropriée de l’anesthésie est atteinte, décapitez rapidement avec une guillotine pour sévèrer la colonne cervicale et placez le corps couché sur de la glace.
  7. Faites deux incisions verticales parallèles à partir des clavicules en longeant la cage thoracique latérale sur toute la longueur du thorax. Assurez-vous que les incisions sont suffisamment profondes pour couper les côtes du thorax latéral, mais évitez d’endommager les structures intrathoraciques telles que le cœur ou les gros vaisseaux.
    REMARQUE : La taille des incisions verticales dépend de l’animal utilisé. Si vous utilisez des cobayes et des rats, coupez jusqu’au diaphragme (environ 6,35 cm pour les rats et 11 cm pour les cochons d’Inde). Si vous utilisez des souris, effectuez une thoracotomie standard27.
  8. Exposez le cœur à l’aide d’un hémostatique pour déplacer le thorax antérieur et remplissez la cavité thoracique exposée avec de la glace. Cette étape minimise le temps d’ischémie chaude et améliore la viabilité des organites isolés.
  9. À l’aide d’une pince à épiler, disséquez brutalement le thymus et le péricarde et exposez complètement le cœur.
  10. À l’aide d’une pince, appliquez une légère traction inférieure sur le cœur pour exposer et identifier l’aorte. L’aorte est le gros vaisseau le plus épais qui se ramifie à partir de la base du cœur. D’autres gros vaisseaux, tels que la veine pulmonaire, sont nettement plus translucides que l’aorte.
  11. Coupez l’aorte à environ 4 à 6 mm au-dessus de la racine aortique mais en dessous des points de ramification carotidiens.
  12. Canuler l’aorte et perfuser le cœur28,29 avec une solution glacée de cardioplégie (CB) à l’aide d’une tête de pression dépendante de la gravité jusqu’à ce que les artères coronaires soient débarrassées du sang et que l’organe semble blanchi.
    REMARQUE : Pour les gros rongeurs, un diamètre de canule de 1,8 à 2,2 mm fonctionne bien, tandis que pour les petits rongeurs, une plage de diamètre de 1,4 à 1,8 mm est recommandée. La rétro-perfusion ne devrait pas prendre plus de 15 à 30 s pour que les vaisseaux coronaires se débarrassent du sang.
  13. Isolez le myocarde ventriculaire en disséquant les oreillettes, le tissu valvulaire cartilagineux et les tissus adipeux.
  14. Placer les ventricules dans un bécher pré-refroidi de 10 ml contenant 0,1 à 0,2 ml d’IB glacé.
  15. Hacher le tissu avec des ciseaux chirurgicaux tranchants jusqu’à ce que les morceaux mesurent environ 1 mm3.

3. Purification mitochondriale et quantification des protéines

  1. Transférez le tissu haché dans le tube à centrifuger pré-refroidi étiqueté « Spins 1 et 2 » contenant la solution de protéase.
  2. Ajouter de l’IB glacé à un volume final de 25 ml.
  3. À l’aide d’un homogénéisateur rotor-stator portatif motorisé, disperser le tissu à 18 000 tr/min sur de la glace pendant 20 à 25 s.
  4. Centrifugeuse homogénéiser le tissu dans un tube étiqueté « Spins 1 and 2 » à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  5. Jetez le surnageant (qui contient de la protéase) en le versant dans la tourie à déchets et rincez doucement la pastille avec 5 ml d’IB pour éliminer la protéase résiduelle.
  6. Après avoir jeté le rinçage, remettre la pastille en suspension avec de l’IB frais et glacé jusqu’à un volume final de 25 ml par un léger vortex.
  7. Centrifugeuse à 800 x g pendant 10 min à 4 °C.
  8. Retirez le surnageant (contient des mitochondries) en le versant doucement dans un tube pré-refroidi de 50 ml étiqueté « Spin 3 ». Pendant le versement, veillez à ne pas déloger la partie supérieure lâche de la pastille. Comme alternative, une pipette de transfert ou une stripette peut être utilisée pour recueillir le surnageant.
  9. Centrifuger le surnageant à 8000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  10. Jetez le surnageant résultant et conservez la pastille contenant des mitochondries.
  11. Utilisez une lingette non pelucheuse pour absorber l’excès de surnageant de la paroi intérieure du tube, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Conservez le granulé à 4 °C sur de la glace autant que possible.
  12. Pour remettre les mitochondries en suspension, ajoutez 80 μL d’IB glacé au fond du tube. Remettez doucement le granulé en suspension en lavant à plusieurs reprises IB sur le granulé.
  13. Pour éviter de créer des bulles, réglez une micropipette pour aspirer et délivrer entre 40 et 60 μL de volume.
  14. Au fur et à mesure que la pastille mitochondriale se disperse, augmentez le volume de la micropipette pour remettre efficacement en suspension les mitochondries granulées. Évitez de toucher la pastille avec la pointe de la pipette et évitez de faire des bulles.
  15. Une fois remises en suspension, transférez les mitochondries dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi et étiquetez-les comme mitochondries mères. Notez le volume total de remise en suspension.
  16. Pour déterminer la concentration en protéines mitochondriales dans l’échantillon, effectuez un dosage des protéines totales à l’aide des dosages bien connus des protéines BCA ou Bradford, tels que définis dans les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Une stratégie alternative ou complémentaire pour évaluer le rendement consiste à déterminer l’activité de la citrate synthase. À titre de référence, le contenu mitochondrial peut être quantifié en suivant le protocole décrit dans Vinnakota et al.30.

4. Contrôles de qualité

  1. Dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi, diluez le stock mitochondrial à la concentration de travail souhaitée avec IB.
    REMARQUE : Les stocks mitochondriaux sont dilués à 40 mg/mL pour fonctionner à une concentration finale de 0,1 mg/mL pour les tests de respirométrie lors de l’utilisation d’isolats de tissu cardiaque.
  2. Rincez dix fois les chambres d’oxygraphe, les bouchons et les seringues d’un microlitre avec de l’eau distillée pour les nettoyer avant de les utiliser dans les tests de respirométrie.
  3. Pour tester la viabilité et la qualité des isolats mitochondriaux, chargez 2,3 mL de tampon respiratoire (RB) dans les chambres d’oxygraphie et laissez le signal de consommation d’oxygène s’équilibrer à 37 °C pendant environ 10 minutes ou lorsque le taux est proche de 0.
  4. Une fois le signal équilibré, enfoncez les bouchons et aspirez l’excès de tampon qui sort du capillaire du bouchon.
  5. Ajouter 1 mM d’EGTA à l’aide d’une seringue d’un microlitre pour chélater tout calcium résiduel dans les tampons ou l’échantillon mitochondrial.
  6. Pour alimenter la respiration, ajoutez 5 mM de pyruvate de sodium et 1 mM de L-malate.
  7. Après l’ajout de substrats, ajoutez un bolus de mitochondries diluées pour obtenir une concentration de travail et permettre à la respiration de se produire pendant 5 min. Cette période est appelée FUITE ou respiration de l’état 2.
  8. Au bout de 5 minutes, ajoutez un bolus de 500 μM ADP pour initier la respiration de l’état 3, également appelé OXHPOS, et laissez les mitochondries respirer jusqu’à l’anoxie.
  9. Calculez le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant le taux maximal de consommation d’oxygène pendant l’état 3 par le taux de consommation d’oxygène juste avant l’ajout de l’ADP dans l’état 2 (voir Figure 1).
    REMARQUE : Une autre expression RCR de 1 - 1/RCR peut également être utilisée comme mesure de la qualité, qui est bornée entre 0 et 1 ; cependant, il est difficile de différencier la qualité à l’aide de cette mesure lorsque le RCR > 10 (voir la figure 2).
  10. Rincer les chambres et les bouchons 10 fois à l’eau pure pour nettoyer l’oxygraphe en vue des tests ultérieurs. Si la respirométrie est terminée, remplissez les chambres avec de l’éthanol à 70 % et placez les bouchons dans les chambres jusqu’à la prochaine utilisation.

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Résultats

Une fois l’isolement mitochondrial terminé, la qualité et la fonctionnalité des isolats doivent être testées en quantifiant les taux de consommation d’oxygène (JO2) à l’aide d’une respirométrie à haute résolution. Pour ce faire, les stocks mitochondriaux ont été dilués à 40 mg/mL pour permettre des concentrations de travail de 0,1 mg/mL dans 2 mL de RB pour tous les tests de respirométrie utilisant des mitochondries cardiaques isolées. La respiration a été alimentée par 5 mM de pyruvate de sodium et 1...

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Discussion

Le respect des méthodes décrites de manière concise dans ce protocole garantira l’isolement des mitochondries bien couplées du tissu cardiaque de petits rongeurs, en plus d’autres types et sources de tissus. Dans l’ensemble, le processus devrait durer de 3 à 3,5 heures, au cours desquelles tous les tissus animaux, les échantillons et les isolats devraient rester sur la glace à 4 °C autant que possible pour limiter la dégradation. Cette procédure est robuste et peut être modifiée de plusi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Daniel A. Beard et Kalyan C. Vinnakota pour leurs contributions fondamentales à ce protocole. Ce travail a été financé par la subvention NSF CAREER MCB-2237117.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
de microcentrifugation de 1,7 mL
BécherPour la dsection et le hachage d’organes Tubes
centrifugation Centrifugation
Adénosine 5'-diphosphate sel monopotassique dihydratéSigma  ;A5285Dosages de respirométrie
BSA Kit de dosage des protéines ThermoScentificPI23225Quantification des protéines mitochondriales
DextroseSigma  ;DX0145Pour tampon (CB)
Éthylène glycol-bis(2-amino-éthylétre)-N,N,N',N'-acide tétraacétique  ;Sigma  ;E4378Pour les tampons (CB et IB) et les tests de respirométrie
Canule en verreRadnotiPerfusion cardiaque de cobaye et de rat
Héparine sodique muqueuse porcineSigma  ;SRE0027-250KUInjection IP animale
RespiromètreÉlectrode de type Clark ; oxygraphe avec chambres de 2 mL
Chambre d’induction
IsofluraneSigma  ;792632Anesthésique  ;
Acide L-maliqueSigma  ;02288-50GDosages de respirométrie
Chlorure de magnésium hexahydratéSigma  ;M9272Pour tampon (RB)
MannitolSigma  ;MX0214Pour tampon (IB)
Seringuesd’un microlitre Tailles allant de 5&ndash ; 50 et micro ; L
LecteurDoit pouvoir incuber à 37 ° ; C  ;
MOPSSigma  ;475898Pour tous les tampons
O2 réservoir
OMNI THQ HomogénéisateurOMNI International  ;12-500Des homogénéisateurs à rotor et stator similaires peuvent faire fonctionner
des pipettesVolumes de  ; 2&ndash ; 20 et micro ; L; 20&ndash ; 200 et micro ; L; 200&ndash ; 1000 et micro ; L
Chlorure de potassiumSigma  ;P3911Pour tampons (RB et CB)
Phosphate de potassium dibasiqueSigma  ;795496Pour tampons (IB et RB)
Protéase de Bacillus licheniformisSigma  ;P5459
Chlorure de sodiumSigma  ;S9888Pour tampon (CB)
Pyruvate de sodiumFisher bioréactifsBP356-100Dosages
SaccharoseSigma  ;8510-OPPour tampon (IB)
dissection chirurgicaleDépend de la source animale et tissulaire
CentrifugeuseDoit refroidir à 4 ° ; C  ;
Tubes en verre de 10 mL de haute résolution de microplaques respiratoires Kit de de table

Références

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