Isolement mitochondrial robuste à partir de tissu cardiaque de rongeur

Résumé

Des études bioénergétiques et métabolomiques sur les mitochondries ont révélé leur rôle multiforme dans de nombreuses maladies, mais les méthodes d’isolement de ces organites varient. La méthode détaillée ici est capable de purifier des mitochondries de haute qualité à partir de plusieurs sources tissulaires. La qualité est déterminée par les rapports de contrôle respiratoire et d’autres paramètres évalués à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Résumé

L’isolement mitochondrial est pratiqué depuis des décennies, suivant des procédures établies par des pionniers dans les domaines de la biologie moléculaire et de la biochimie pour étudier les déficiences métaboliques et les maladies. Une qualité mitochondriale constante est nécessaire pour étudier correctement la physiologie mitochondriale et la bioénergétique ; Cependant, de nombreuses méthodes d’isolement publiées sont disponibles pour les chercheurs. Bien que différentes stratégies expérimentales nécessitent des méthodes d’isolement différentes, les principes et procédures de base sont similaires. Ce protocole détaille une méthode capable d’extraire des mitochondries bien couplées à partir de diverses sources tissulaires, y compris de petits animaux et des cellules. Les étapes décrites comprennent la dissection d’organes, la purification mitochondriale, la quantification des protéines et divers contrôles de qualité. La principale mesure de contrôle de la qualité utilisée pour identifier les mitochondries de haute qualité est le rapport de contrôle respiratoire (RCR). Le RCR est le rapport entre la fréquence respiratoire lors de la phosphorylation oxydative et la fréquence en l’absence d’ADP. D’autres indicateurs sont abordés. Bien que des valeurs RCR élevées par rapport à leur source tissulaire soient obtenues à l’aide de ce protocole, plusieurs étapes peuvent être optimisées pour répondre aux besoins individuels des chercheurs. Cette procédure est robuste et a toujours abouti à des mitochondries isolées avec des valeurs RCR supérieures à la moyenne dans les modèles animaux et les sources tissulaires.

Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires qui établissent des conditions énergétiques cytoplasmiques optimisées pour des fonctions cellulaires spécifiques. Alors que les études cellulaires, tissulaires et organisationnelles peuvent fournir des informations sur la fonction mitochondriale, l’isolement des organites offre un niveau de contrôle expérimental qui n’est pas possible autrement. Des isolements mitochondriaux sont effectués depuis les années 1940, ce qui permet d’étudier mécaniquement le métabolisme et la respiration dans une variété de cellules et de tissus ^1,2. La pertinence historique des mitochondries est également bien documentée³. En tant que principaux producteurs d’ATP, les mitochondries jouent de nombreux rôles clés qui sont essentiels au fonctionnement optimal des cellules et des organes⁴. Dans la matrice mitochondriale, les substrats sont oxydés par le cycle TCA, produisant des équivalents réducteurs et des porteurs d’électrons mobiles tels que le NADH et l’UQH₂ ^5,6. Le cytochrome C est le troisième principal porteur d’électrons mobiles dans le réseau de réactions biochimiques mitochondriales⁷. Ces molécules sont ensuite oxydées par les complexes transmembranaires du système de transport d’électrons (ETS) intégrés dans la membrane mitochondriale interne⁸. Les réactions d’oxydoréduction de l’ETS sont couplées à la translocation de protons de la matrice à l’espace intermembranaire. Ces processus établissent un gradient électrochimique de protons qui est utilisé pour phosphoryler l’ADP avec Pi par F₁F₀ ATP synthase pour produire ATP ^9,10. Les processus individuels qui se produisent dans chaque complexe peuvent être explorés à l’aide d’une respirométrie à haute résolution à l’aide d’électrodes de type Clark ou de tests de consommation d’oxygène sur microplaques^11,12. De plus, les modèles de maladies et les traitements utilisant des mitochondries isolées peuvent déterminer l’impact ou l’importance de la fonction mitochondriale dans la progression de certaines pathologies. Cela s’est avéré fructueux dans le domaine de la cardiologie, où les altérations de l’administration de carburant et de substrat ont été utilisées pour élucider comment le dysfonctionnement mitochondrial influence l’insuffisance cardiaque 13,14,15,16. Les mitochondries sont également connues pour avoir un impact sur le développement d’autres états pathologiques tels que le diabète, le cancer, l’obésité, les troubles neurologiques et les myopathies^17,18. Par conséquent, l’utilisation de mitochondries isolées ou purifiées permet des investigations mécanistes du métabolisme oxydatif et de la production d’ATP dans le tissu source.

Les protocoles d’isolement mitochondrial ne manquent pas en raison de leur importance dans la recherche bioénergétique. De plus, on peut trouver des méthodes très spécifiques adaptées aux sous-populations de mitochondries dans les tissus et les cellules^19,20. Les étapes procédurales de base sont similaires entre les méthodes d’isolement, mais des variations peuvent être apportées à la composition du tampon, aux étapes d’homogénéisation et aux spins de centrifugation pour améliorer la quantité et la qualité des mitochondries. Les modifications de ces aspects sont basées sur la demande métabolique du tissu, la fonction globale des organes, la densité mitochondriale et d’autres facteurs. Dans des tissus tels que le foie et les muscles squelettiques, les homogénéisateurs portatifs sont utilisés pour préserver l’intégrité mitochondriale et limiter les dommages aux membranes mitochondriales²¹. Cependant, lors de l’isolement des reins, certains protocoles suggèrent d’utiliser une homogénéisation manuelle ou des kits commerciaux pour obtenir de meilleurs résultats²². Bien que les deux méthodes produisent des mitochondries fonctionnelles, la qualité des organites peut être compromise par le temps supplémentaire nécessaire pour effectuer les isolements à l’aide de ces protocoles. La centrifugation est également essentielle à l’extraction des protéines mitochondriales, car elle sépare les composants cellulaires tels que les noyaux et autres organites des mitochondries²³. Au cours du processus d’isolement, on se demande si la centrifugation différentielle ou basée sur la densité doit être mise en œuvre pour obtenir des isolats plus purs²⁴. Bien que la centrifugation par densité puisse séparer les mitochondries des organites de gravité spécifique similaire, tels que les peroxysomes, il n’est pas bien établi si les mitochondries de ces méthodes représentent mieux la fonction des organites in situ par rapport aux mitochondries isolées à l’aide de la centrifugation différentielle. Dans le domaine de la physiologie mitochondriale, la centrifugation basée sur la densité est préférée et peut être facilement modifiée pour augmenter la pureté de l’isolat. La question de savoir si les modifications des forces g, de la durée de la centrifugation et du nombre de spins de centrifugation sont incorporées doit être prise en compte avant l’expérimentation en raison de leur influence sur la purification mitochondriale. De plus, la remise en suspension mitochondriale, sans doute l’étape la plus cruciale de l’isolement, diffère considérablement d’une étude à l’autre, avec l’utilisation du grattage, du mélange basé sur les vortex ou de l’homogénéisation 23,25,26. La remise en suspension mécanique de ces types peut être trop abrasive et nuire à l’intégrité de la membrane des mitochondries. Pour cette raison, un lavage doux doit être effectué pour corriger cela. Malgré la pléthore de modulations et de méthodologies suggérées, il existe moins de protocoles complets avec une reproductibilité et une adaptabilité élevées pour les modèles de rongeurs.

Les méthodes décrites dans le présent document décrivent un protocole détaillé, robuste et hautement reproductible qui permet d’obtenir des mitochondries purifiées et bien couplées à partir de tissus cardiaques de petits animaux. Comme nous l’avons démontré, cette méthode peut être facilement adaptée pour répondre aux besoins spécifiques de chaque expérience et/ou environnement de laboratoire pour isoler les mitochondries des reins, du foie et des cellules cultivées. D’autres modifications peuvent être apportées pour isoler les mitochondries des tissus et d’autres animaux non énumérés ici. Les recettes de tampon utilisées pour toutes les isolations sont fournies et peuvent être modifiées si nécessaire. À l’instar d’autres protocoles publiés, l’homogénéisation motorisée et la centrifugation différentielle sont mises en œuvre ; Cependant, des ajustements sont apportés à la fois au temps de cisaillement et à la force à laquelle les échantillons sont centrifugés pour fournir constamment des isolats mitochondriaux de haute qualité, en fonction de la source d’isolement. Notamment, ce protocole diffère des autres par l’utilisation d’un lavage doux par pipetage pour remettre en suspension les mitochondries granulées, ce qui aide à préserver l’intégrité de la membrane mitochondriale et à maintenir la fonctionnalité globale des organites. La protéine mitochondriale est quantifiée soit par la détermination de la protéine totale, soit par la mesure de l’activité de la citrate synthase. L’utilité et la large applicabilité de cette méthode d’isolement sont également étayées par les valeurs des rapports de contrôle respiratoire (RCR) obtenues dans divers organismes et sources tissulaires.

Protocole

L’utilisation et le traitement de tous les animaux vertébrés ont été effectués conformément aux protocoles approuvés examinés et acceptés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État du Michigan. Ce protocole a été conçu à l’aide de cobayes Hartley albinos mâles et femelles et de rats Sprague Dawley (SD). Pour l’isolement des mitochondries cardiaques de cobayes, des animaux ont été sacrifiés à des âges compris entre 4 et 6 semaines (300 à 450 g). Des mitochondries cardiaques de rats SD des deux sexes ont été obtenues entre l’âge de 10 et 13 semaines (250 à 400 g). Les recettes de tampons sont décrites dans le tableau 1 et doivent être préparées à l’avance. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation expérimentale

1. Avant de commencer l’isolement, étiquetez deux tubes de centrifugation de 50 mL comme « Spins 1 et 2 » et « Spin 3 ».
2. Placez des tubes, un tampon d’isolement (IB) fraîchement décongelé, des ciseaux de hachage tranchants, une sonde d’homogénéisation assemblée et un bécher de 5 ml ou un récipient de taille équivalente sur de la glace.
3. Placez le tampon respiratoire (RB) fraîchement décongelé dans un incubateur pour le réchauffer en vue des tests respiratoires ultérieurs.
4. Pré-refroidissez une centrifugeuse réfrigérée à 4 °C.
5. Assurez-vous que tout l’équipement est disposé et que 20 μL de protéase 7-15 U/mg de Bacillus licheniformis ont été ajoutés au tube étiqueté « Spins 1 et 2 ».
6. Mettre en place un système de pression dépendant de la gravité pour la perfusion par canulation à l’aide d’un tampon de cardioplégie (CB, tableau 1), d’une canule en verre et d’un tube en plastique avec une valve d’arrêt attachée.
7. Disposez des outils chirurgicaux et prévoyez des ciseaux et des pinces appropriés pour la dissection et la canulation du cœur.
   REMARQUE : Toute l’eau doit être de qualité pure (18,2 MΩ·cm)

2. Dissection tissulaire

1. Injecter aux animaux du sulfate d’héparine stérile par voie intrapéritonéale à une dose de 500 U/kg.
2. Laissez l’animal reposer dans la chambre d’induction pendant 15 minutes après l’administration d’héparine. Pendant ce temps, fournissez 2 L/min de gaz O₂ pur pour oxygéner complètement les animaux, les calmer et minimiser tout stress pouvant avoir des conséquences néfastes sur les tissus d’intérêt.
3. Commencer l’induction de l’anesthésie par un flux continu d’isoflurane à 0,5%. Après 1 min, augmentez à 1%. Continuez à augmenter de 1 % toutes les minutes jusqu’à ce que 5 % soient atteints. Une fois à 5 %, attendez 1 minute et surveillez le rythme respiratoire de l’animal.
4. Une fois que la respiration a ralenti et devient laborieuse (environ au bout de 6,5 minutes), coupez le flux d’isoflurane et d’oxygène.
5. Retirez rapidement l’animal de la chambre d’induction et vérifiez la profondeur de l’anesthésique en serrant une patte et en vérifiant le réflexe cornéen. Si l’animal répond à l’un ou l’autre stimulus, remettez-le dans la chambre d’induction, administrez à nouveau l’anesthésie et répétez la vérification de la profondeur de l’anesthésique.
6. Une fois que la profondeur appropriée de l’anesthésie est atteinte, décapitez rapidement avec une guillotine pour sévèrer la colonne cervicale et placez le corps couché sur de la glace.
7. Faites deux incisions verticales parallèles à partir des clavicules en longeant la cage thoracique latérale sur toute la longueur du thorax. Assurez-vous que les incisions sont suffisamment profondes pour couper les côtes du thorax latéral, mais évitez d’endommager les structures intrathoraciques telles que le cœur ou les gros vaisseaux.
   REMARQUE : La taille des incisions verticales dépend de l’animal utilisé. Si vous utilisez des cobayes et des rats, coupez jusqu’au diaphragme (environ 6,35 cm pour les rats et 11 cm pour les cochons d’Inde). Si vous utilisez des souris, effectuez une thoracotomie standard²⁷.
8. Exposez le cœur à l’aide d’un hémostatique pour déplacer le thorax antérieur et remplissez la cavité thoracique exposée avec de la glace. Cette étape minimise le temps d’ischémie chaude et améliore la viabilité des organites isolés.
9. À l’aide d’une pince à épiler, disséquez brutalement le thymus et le péricarde et exposez complètement le cœur.
10. À l’aide d’une pince, appliquez une légère traction inférieure sur le cœur pour exposer et identifier l’aorte. L’aorte est le gros vaisseau le plus épais qui se ramifie à partir de la base du cœur. D’autres gros vaisseaux, tels que la veine pulmonaire, sont nettement plus translucides que l’aorte.
11. Coupez l’aorte à environ 4 à 6 mm au-dessus de la racine aortique mais en dessous des points de ramification carotidiens.
12. Canuler l’aorte et perfuser le cœur^28,29 avec une solution glacée de cardioplégie (CB) à l’aide d’une tête de pression dépendante de la gravité jusqu’à ce que les artères coronaires soient débarrassées du sang et que l’organe semble blanchi.
    REMARQUE : Pour les gros rongeurs, un diamètre de canule de 1,8 à 2,2 mm fonctionne bien, tandis que pour les petits rongeurs, une plage de diamètre de 1,4 à 1,8 mm est recommandée. La rétro-perfusion ne devrait pas prendre plus de 15 à 30 s pour que les vaisseaux coronaires se débarrassent du sang.
13. Isolez le myocarde ventriculaire en disséquant les oreillettes, le tissu valvulaire cartilagineux et les tissus adipeux.
14. Placer les ventricules dans un bécher pré-refroidi de 10 ml contenant 0,1 à 0,2 ml d’IB glacé.
15. Hacher le tissu avec des ciseaux chirurgicaux tranchants jusqu’à ce que les morceaux mesurent environ 1 mm³.

3. Purification mitochondriale et quantification des protéines

1. Transférez le tissu haché dans le tube à centrifuger pré-refroidi étiqueté « Spins 1 et 2 » contenant la solution de protéase.
2. Ajouter de l’IB glacé à un volume final de 25 ml.
3. À l’aide d’un homogénéisateur rotor-stator portatif motorisé, disperser le tissu à 18 000 tr/min sur de la glace pendant 20 à 25 s.
4. Centrifugeuse homogénéiser le tissu dans un tube étiqueté « Spins 1 and 2 » à 8 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Jetez le surnageant (qui contient de la protéase) en le versant dans la tourie à déchets et rincez doucement la pastille avec 5 ml d’IB pour éliminer la protéase résiduelle.
6. Après avoir jeté le rinçage, remettre la pastille en suspension avec de l’IB frais et glacé jusqu’à un volume final de 25 ml par un léger vortex.
7. Centrifugeuse à 800 x g pendant 10 min à 4 °C.
8. Retirez le surnageant (contient des mitochondries) en le versant doucement dans un tube pré-refroidi de 50 ml étiqueté « Spin 3 ». Pendant le versement, veillez à ne pas déloger la partie supérieure lâche de la pastille. Comme alternative, une pipette de transfert ou une stripette peut être utilisée pour recueillir le surnageant.
9. Centrifuger le surnageant à 8000 x g pendant 10 min à 4 °C.
10. Jetez le surnageant résultant et conservez la pastille contenant des mitochondries.
11. Utilisez une lingette non pelucheuse pour absorber l’excès de surnageant de la paroi intérieure du tube, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Conservez le granulé à 4 °C sur de la glace autant que possible.
12. Pour remettre les mitochondries en suspension, ajoutez 80 μL d’IB glacé au fond du tube. Remettez doucement le granulé en suspension en lavant à plusieurs reprises IB sur le granulé.
13. Pour éviter de créer des bulles, réglez une micropipette pour aspirer et délivrer entre 40 et 60 μL de volume.
14. Au fur et à mesure que la pastille mitochondriale se disperse, augmentez le volume de la micropipette pour remettre efficacement en suspension les mitochondries granulées. Évitez de toucher la pastille avec la pointe de la pipette et évitez de faire des bulles.
15. Une fois remises en suspension, transférez les mitochondries dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi et étiquetez-les comme mitochondries mères. Notez le volume total de remise en suspension.
16. Pour déterminer la concentration en protéines mitochondriales dans l’échantillon, effectuez un dosage des protéines totales à l’aide des dosages bien connus des protéines BCA ou Bradford, tels que définis dans les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Une stratégie alternative ou complémentaire pour évaluer le rendement consiste à déterminer l’activité de la citrate synthase. À titre de référence, le contenu mitochondrial peut être quantifié en suivant le protocole décrit dans Vinnakota et ^al.30.

4. Contrôles de qualité

1. Dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi, diluez le stock mitochondrial à la concentration de travail souhaitée avec IB.
   REMARQUE : Les stocks mitochondriaux sont dilués à 40 mg/mL pour fonctionner à une concentration finale de 0,1 mg/mL pour les tests de respirométrie lors de l’utilisation d’isolats de tissu cardiaque.
2. Rincez dix fois les chambres d’oxygraphe, les bouchons et les seringues d’un microlitre avec de l’eau distillée pour les nettoyer avant de les utiliser dans les tests de respirométrie.
3. Pour tester la viabilité et la qualité des isolats mitochondriaux, chargez 2,3 mL de tampon respiratoire (RB) dans les chambres d’oxygraphie et laissez le signal de consommation d’oxygène s’équilibrer à 37 °C pendant environ 10 minutes ou lorsque le taux est proche de 0.
4. Une fois le signal équilibré, enfoncez les bouchons et aspirez l’excès de tampon qui sort du capillaire du bouchon.
5. Ajouter 1 mM d’EGTA à l’aide d’une seringue d’un microlitre pour chélater tout calcium résiduel dans les tampons ou l’échantillon mitochondrial.
6. Pour alimenter la respiration, ajoutez 5 mM de pyruvate de sodium et 1 mM de L-malate.
7. Après l’ajout de substrats, ajoutez un bolus de mitochondries diluées pour obtenir une concentration de travail et permettre à la respiration de se produire pendant 5 min. Cette période est appelée FUITE ou respiration de l’état 2.
8. Au bout de 5 minutes, ajoutez un bolus de 500 μM ADP pour initier la respiration de l’état 3, également appelé OXHPOS, et laissez les mitochondries respirer jusqu’à l’anoxie.
9. Calculez le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant le taux maximal de consommation d’oxygène pendant l’état 3 par le taux de consommation d’oxygène juste avant l’ajout de l’ADP dans l’état 2 (voir Figure 1).
   REMARQUE : Une autre expression RCR de 1 - 1/RCR peut également être utilisée comme mesure de la qualité, qui est bornée entre 0 et 1 ; cependant, il est difficile de différencier la qualité à l’aide de cette mesure lorsque le RCR > 10 (voir la figure 2).
10. Rincer les chambres et les bouchons 10 fois à l’eau pure pour nettoyer l’oxygraphe en vue des tests ultérieurs. Si la respirométrie est terminée, remplissez les chambres avec de l’éthanol à 70 % et placez les bouchons dans les chambres jusqu’à la prochaine utilisation.

Résultats

Une fois l’isolement mitochondrial terminé, la qualité et la fonctionnalité des isolats doivent être testées en quantifiant les taux de consommation d’oxygène (J_O2) à l’aide d’une respirométrie à haute résolution. Pour ce faire, les stocks mitochondriaux ont été dilués à 40 mg/mL pour permettre des concentrations de travail de 0,1 mg/mL dans 2 mL de RB pour tous les tests de respirométrie utilisant des mitochondries cardiaques isolées. La respiration a été alimentée par 5 mM de pyruvate de sodium et 1 mM de L-malate en présence de 1 mM d’EGTA, un chélateur du calcium, et a été laissée s’équilibrer pendant 5 minutes pour établir l’état 2 de la respiration. Au cours de cet état, les taux de consommation d’oxygène devraient être en moyenne de 45 à 55 pmol/mL/s ou de 27 à 33 nmol/mg/min. Soyez conscient du taux de consommation d’oxygène dépendant de l’électrode et effectuez les corrections de fond appropriées si nécessaire. La phosphorylation oxydative (état 3) est initiée au bout de 5 min par un bolus de 500 μM ADP. Les ajouts de substrat et le traçage représentatif sont détaillés à la figure 1. Les mitochondries fonctionnelles auront une augmentation immédiate de J_O2 après l’ajout d’ADP, qui varie en fonction de la source tissulaire, comme le montre la figure 2. Sans l’utilisation d’EGTA, le calcium résiduel a des effets variables sur les taux maximaux de J_O2 pendant l’OXPHOS, en fonction de la concentration mitochondriale, de la disponibilité du substrat et d’autres facteurs environnementaux. La composition du tampon est importante pour la préservation de l’intégrité et de la fonctionnalité de la membrane mitochondriale. Toutes les recettes de tampons mentionnées dans le protocole sont détaillées dans le tableau 1 et peuvent être utilisées pour toutes les préparations mitochondriales décrites dans le présent document.

L’isolement réussi des mitochondries est indiqué par l’obtention de valeurs RCR qui se situent dans la plage donnée pour chaque espèce et source tissulaire, comme le montre le tableau 2. D’après les données recueillies à l’aide de ce protocole, si l’on isole les mitochondries cardiaques de cobayes, de rats ou de souris, les RCR doivent être respectivement de ≥16, ≥8 et ≥5. En cas d’isolement du foie ou des reins de rat, les RCR doivent être de ≥6, tandis que les RCR des cellules sont considérés comme acceptables s’ils sont supérieurs à 3,8. Si les valeurs RCR tombent en dessous de ces plages ou s’il existe des différences qualitatives dans les tracés de respirométrie, il est recommandé d’effectuer un test supplémentaire avec de nouveaux RB et substrats pour exclure les problèmes de contamination. Bien que la transformation 1-1/RCR limite les valeurs entre 0 et 1, cette mesure n’est pas conseillée lors de la comparaison de la qualité mitochondriale entre les sexes ou les espèces lorsque la valeur RCR est supérieure à 10. Pour cette raison, les valeurs standard RCR (État 3/État 2 ou OXPHOS/LEAK) ont été quantifiées pendant toutes les expérimentations. Le tableau 3 détaille les informations concernant les modulations qui peuvent être apportées à ce protocole pour mieux isoler les mitochondries du cœur, du foie, des reins et des cellules de souris.

Figure 1 : Régions d’intérêt pour les contrôles de qualité à l’aide de la respirométrie à haute résolution. Les chambres respiratoires ont été chargées de 2 mL de RB et laissées s’équilibrer à 37 °C jusqu’à ce que le taux de consommation d’oxygène soit proche de 0. Une fois équilibrés, 1 mM d’EGTA, un chélateur de calcium, a été ajouté avec 5 mM de pyruvate de sodium et 1 mM de L-malate. Suite à l’ajout de ces substrats, les mitochondries ont été ajoutées à la concentration de travail souhaitée (0,1 mg/mL) et laissées respirer pendant 5 minutes pour atteindre l’état de respiration 2 (jaune). Au bout de 5 minutes, 500 μM d’ADP ont été ajoutés pour initier la respiration de l’état 3 (rouge). Les RCR ont été déterminés en faisant la moyenne temporelle des taux de consommation d’oxygène indiqués par les cases rouge et jaune pour comparer l’état 3 à l’état 2. L’état 4 est désigné par la boîte verte et représente la période d’hydrolyse de l’ATPase extramitochondriale de l’ATP et peut être utilisé pour évaluer l’intégrité de la membrane externe dans les dosages du cytochrome C. Les données affichées ont été recueillies à l’aide de mitochondries cardiaques de rat SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Tracés représentatifs de J_O2 et rapports de contrôle respiratoire à travers des sources animales et tissulaires. La qualité des mitochondries isolées a été testée en quantifiant les taux de consommation d’oxygène à l’aide d’une respirométrie à haute résolution. La respiration a été alimentée par 5 mM de pyruvate de sodium et 1 mM de L-malate en présence de 1 mM d’EGTA. Les mitochondries et les substrats ont été laissés respirer pendant 5 minutes pour que l’état 2 de la respiration se stabilise. Les taux maximaux de consommation d’oxygène après l’ajout d’ADP ont été comparés aux taux de consommation d’oxygène de l’État 2 avant ADP afin de calculer les rapports de contrôle respiratoire (RCR) pour chaque tissu. La qualité mitochondriale a été évaluée en calculant les valeurs 1-1/RCR caractérisées par les normes d’efficacité de contrôle P-L. Les diagrammes à barres à droite de chaque tracé indiquent les valeurs moyennes du RCR masculin (bleu) et féminin (vert) et les valeurs 1-1/RCR ± l’écart-type pour un tissu donné. (A), (B) et (C) font référence aux données recueillies à l’aide de cobayes, de rats Sprague Dawley (SD) et de cœurs de souris du virus de la leucémie Friend B (FVB), respectivement. Les détails (D) et (E) proviennent du foie et des reins de rat SD, tandis que (F) fait référence aux cellules HEK293. Les trois plus gros lobes hépatiques ont été prélevés, tandis que les deux reins ont été utilisés pour l’isolement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Recettes de tampon .Le tampon de cardioplégie (CB), le tampon d’isolement (IB) et le tampon respiratoire (RB) utilisés tout au long du processus d’isolement doivent être préparés à l’avance selon les instructions énumérées. Le CB peut être conservé jusqu’à un mois à 4 °C, tandis que l’IB et le RB peuvent être conservés pendant 4 mois à -80 °C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Analyse du rapport de contrôle respiratoire. L’isolement mitochondrial pour les analyses fonctionnelles a été effectué sur un large éventail d’espèces et de sources tissulaires chez des rongeurs mâles et femelles ainsi que sur des cellules HEK293. La taille de l’échantillon de chaque sexe, source de tissu et espèce est détaillée, ainsi que les valeurs moyennes RCR et 1-1/RCR ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Modulations recommandées du protocole d’isolement mitochondrial pour différents tissus afin d’augmenter le rendement en protéines. Les changements dans les quantités de protéase et les centrifugations sont affichés en fonction de la source tissulaire. Des quantités moyennes de protéines totales (mg) ont été calculées à partir des résultats du dosage des protéines BSA et du volume de remise en suspension de la pastille mitochondriale finale. Les valeurs sont indiquées sous forme de moyenne ± écart-type. Des instructions en gras incluses dans la colonne de centrifugation indiquent s’il faut jeter, conserver ou regrouper le surnageant. La mise au rebut fait référence à l’élimination du surnageant dans un conteneur de déchets biologiques, tandis que la rétention et la mise en commun font référence au transfert du surnageant dans le tube de centrifugation suivant ou à sa collecte pour l’essorage final, respectivement. De plus amples détails concernant les modifications apportées au protocole peuvent être trouvés dans la section des discussions. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Le respect des méthodes décrites de manière concise dans ce protocole garantira l’isolement des mitochondries bien couplées du tissu cardiaque de petits rongeurs, en plus d’autres types et sources de tissus. Dans l’ensemble, le processus devrait durer de 3 à 3,5 heures, au cours desquelles tous les tissus animaux, les échantillons et les isolats devraient rester sur la glace à 4 °C autant que possible pour limiter la dégradation. Cette procédure est robuste et peut être modifiée de plusieurs façons pour mieux s’adapter aux objectifs expérimentaux et aux modèles utilisés. Une modulation qui peut être faite pendant le processus de dissection tissulaire est l’exclusion de l’héparine. L’héparine est administrée pour prévenir la formation de caillots sanguins³¹ mais n’est pas nécessaire si le cœur est canulé et perfusé assez rapidement (dans les 1,5 minutes suivant la décapitation). De plus, la perfusion du cœur à l’aide de CB est recommandée pour les rongeurs plus gros, donc lorsque vous travaillez avec des cœurs de souris ou d’autres organes, il est conseillé d’inclure des lavages IB avant le hachage et l’homogénéisation initiale. Cette étape permet d’éliminer le sang provenant du processus de dissection. D’autres changements incluent des modifications des vitesses d’homogénéisation et de centrifugation pour augmenter le rendement en protéines mitochondriales. Celles décrites ci-dessus visent à isoler les mitochondries cardiaques des cobayes et des rats. Il est important de noter que ce protocole peut être adapté pour isoler les mitochondries du foie, des reins, du cœur et des cellules de souris des rongeurs. Les modifications recommandées du volume de protéase, d’homogénéisation et de centrifugation en fonction de types de tissus et d’animaux spécifiques sont détaillées dans le tableau 3.

Après la formation de la pastille mitochondriale purifiée à partir de l’étape finale de centrifugation, les mitochondries doivent être remises en suspension dans des IB pré-refroidis. Le volume d’IB ajouté dépend de la taille de la pastille mitochondriale, mais est d’environ 80 μL pour les cobayes et les rats. En cas d’isolement du cœur de souris, 60 μL d’IB sont ajoutés pour la remise en suspension. Lors de l’isolement initial des mitochondries, il est conseillé d’ajouter de plus petits volumes d’IB afin de ne pas diluer la solution mère. En raison de la consistance des granules mitochondriales formées après la purification des échantillons de foie et de reins, il faut ajouter beaucoup moins d’IB (20 μL) pour la remise en suspension. D’autres méthodes suggèrent l’utilisation d’une remise en suspension mécanique par grattage qui peut être abrasive pour les membranes mitochondriales et diminuer l’intégrité globale^32,33. Lors de l’utilisation de ce protocole, il est conseillé de laver doucement la pastille avec IB pour améliorer la qualité des mitochondries. Au cours de ce processus, veillez à ne pas produire de bulles ou à ne pas perturber la pastille avec la pointe de la pipette, car cela peut entraîner une rupture de la membrane et un mauvais repliement des protéines³⁴. Ce n’est qu’en poussant jusqu’à la première butée de la pipette que vous pouvez réduire le risque de formation de bulles. Un lavage doux des pipettes doit être effectué jusqu’à ce que la totalité de la pastille soit en suspension. Le rendement total de remise en suspension doit être de 150 à 200 μL pour les mitochondries cardiaques des cobayes et des rats et apparaître de couleur brun clair. Les échantillons plus concentrés seront d’une nuance de brun plus foncé et pourront être dilués pour s’adapter à la plage de concentration de travail souhaitée après quantification de la protéine mitochondriale.

Les dosages standard des protéines utilisant la BSA sont optimaux pour la quantification des protéines mitochondriales³⁵. Les dosages des protéines doivent être retardés et incubés pendant les durées et les températures recommandées, telles que définies par le protocole du fabricant. Pour les mitochondries isolées, l’incubation à 37 °C pendant 30 min permet un développement bien réparti de la couleur et une quantification précise des protéines. Lors de la quantification de la quantité totale de protéines, il est recommandé de diluer les mitochondries et l’IB remis en suspension à des ratios de 1:50, 1:100 et 1:200 pour s’assurer que les résultats du dosage des protéines seront dans la plage d’étalonnage. De plus amples détails sur la façon d’effectuer des dosages de protéines en utilisant le BSA comme norme sont fournis dans le kit du fabricant, de sorte que les recommandations énumérées dans le présent document peuvent ne pas s’appliquer. Un test CS doit également être effectué pour déterminer le contenu mitochondrial de chaque échantillon. Ce test est bien établi et permet une normalisation plus poussée si l’on étudie les différences biologiques entre les sous-types mitochondriaux³⁶.

Après la détermination de la protéine, le stock mitochondrial doit être dilué pour atteindre la concentration de travail finale souhaitée pour les tests de respirométrie. Les mitochondries isolées de cobayes et de cœurs de rats sont diluées à 40 mg/mL, et 5 μL de ce stock sont ajoutés à la chambre respiratoire pour obtenir une concentration de travail de 0,1 mg/mL. Si l’isolement provient du cœur d’une seule souris ou des reins et du foie, la dilution du stock mitochondrial peut ne pas être nécessaire. De plus grands volumes de mitochondries peuvent également être ajoutés pour obtenir les concentrations souhaitées. Des taux de consommation d’oxygène pendant l’état 2 qui se situent entre 35 et 55 pmol/mL/s sont acceptables pour la plupart des analyses de respirométrie²⁸. Les détails relatifs à la façon dont les ECR sont menés et analysés sont expliqués à la figure 1 et dans la section des résultats représentatifs ; Cependant, il est important de noter que la respiration est alimentée par le pyruvate et le malate. D’autres conditions de substrat, telles que le succinate et la roténone, entraîneront des valeurs RCR différentes puisque le rapport P/O et d’autres variables bioénergétiques sont différents³⁷. L’utilisation du pyruvate et du malate comme carburants respiratoires permet d’atteindre un renouvellement presque maximal du cycle TCA et une production d’équivalents réducteurs ; cependant, l’activité maximale du cycle TCA et la fonction couplée de l’ETS sont obtenues avec 5 mM de pyruvate, 1 mM de L-malate et 20 mM de succinate. Lors de la stimulation de la phosphorylation oxydative pour quantifier les taux de consommation d’oxygène au cours de l’état 3, l’ADP est ajouté à des concentrations au moins 10 fois supérieures à l’estimation de K_D pour l’ADP du translocateur de nucléotides^{adénine 38}. Cela peut être réalisé avec des bolus supérieurs à 350 μM ADP, et c’est pourquoi 500 μM ont été utilisés dans tous les essais expérimentaux. Si la durée de l’état 3 est trop courte, des concentrations mitochondriales plus faibles peuvent être utilisées pour la prolonger. Pour une analyse plus poussée de la respiration, des modulations peuvent être apportées à la concentration d’ADP qui est introduite dans le système afin de mieux ajuster les paramètres expérimentaux³⁹. Lors de la mise au point initiale de ce protocole, un test du cytochrome C a été utilisé pour évaluer l’intégrité de la membrane externe des isolats mitochondriaux⁴⁰. Si les valeurs RCR sont inférieures aux plages attendues, effectuez le test du cytochrome C pour évaluer si les dommages à la membrane externe sont importants. Pour ce faire, ajoutez 10 μM de cytochrome C dans la chambre respiratoire et confirmez que l’augmentation de la respiration est inférieure à 5 ou 10 % du taux d’état 4. Les fourchettes attendues proviennent d’études publiées antérieurement et sont spécifiques à l’espèce, au tissu et au substrat. Si l’ajout de cytochrome c stimule la respiration de l’état 4 au-dessus de 10 %, le dernier spin de 8 000 x g peut être répété pour éliminer les mitochondries endommagées. Cela dit, les lésions de la membrane externe peuvent faire partie du phénotype d’une maladie, et donc, le test du cytochrome C doit être interprété dans cet^esprit41. Une fois que des valeurs RCR constamment élevées avec des effets stimulés par le cytochrome C faibles (<10 %) sont obtenues, ce test ne devient nécessaire et conseillé que si les valeurs RCR se situent en dehors des plages acceptables. Si le test du cytochrome C est de <10 % et que les valeurs de RCR se situent en dehors de la plage attendue, comme indiqué dans le tableau 2, répéter le test de respirométrie avec un nouveau RB après un lavage à l’eau distillée 10 fois. Si des taux réduits sont toujours observés, de nouveaux réactifs (pyruvate, malate, EGTA et ADP) doivent être fabriqués pour diagnostiquer le problème. De plus, des tests de cytochrome C peuvent être effectués par le biais d’ELISA et de l’utilisation de colorants mitochondriaux tels que TMRE^33,42. Selon le type de tissu et la source, ces options peuvent être mieux adaptées pour déterminer l’intégrité de la membrane externe.

Bien qu’il n’y ait pas de limites majeures à l’utilisation de ce protocole pour isoler les mitochondries cardiaques, il est important de noter que certaines considérations doivent être prises en compte lors de l’utilisation de ces méthodes. La qualité des isolats mitochondriaux est grandement affectée par la température et le temps nécessaire pour perfuser le cœur et remettre en suspension la pastille purifiée. Par conséquent, il peut être nécessaire de connaître ces processus pour obtenir des RCR comparables à ceux présentés ici. De plus, la composition des tampons et des solutions utilisés pendant le processus d’isolement est importante car elle affecte directement l’intégrité et la fonction mitochondriales⁴³. Les tampons énumérés dans le tableau 1 sont fournis à titre de référence et ont permis d’isoler des mitochondries bien couplées à travers diverses sources tissulaires, mais des modifications peuvent être apportées pour limiter la quantité de chlorure dans les analyses de respiration, car cela peut interférer avec la translocation des nucléotides adénine et la fonction^{ETS 28}. La composition du tampon peut également être modifiée pour mieux isoler les mitochondries du foie. Comme le foie est riche en acides gras, il est conseillé de laver l’organe et les tissus hachés avec un tampon contenant des concentrations élevées de BSA si des RCR en dehors de la plage attendue sont observés. Bien que la qualité des isolats mitochondriaux obtenus à partir de coupes de foie soit bien couplée et constante, cette altération pourrait entraîner une amélioration de la fonction des organites. Il faut également reconnaître que l’isolement des mitochondries à partir des cellules à l’aide de ces méthodes nécessite une grande quantité de cellules en culture, ce qui constitue une limitation potentielle. De plus, ce protocole n’est pas spécifiquement conçu pour les isolats cellulaires, mais a fait ses preuves lors de sa mise en œuvre. Par conséquent, les méthodes d’isolement ciblées des cellules cultivées peuvent être plus utiles. Alternativement, pour évaluer la qualité mitochondriale, les chercheurs peuvent opter pour des sondes fluorescentes pour calculer les RCR. Les méthodes spectrofluorométriques sont un choix populaire, surtout si de plus petites quantités de protéines sont extraites^44,45.

Dans l’ensemble, ce protocole peut être utilisé pour isoler de manière cohérente les mitochondries cardiaques bien couplées de petits animaux tels que les cobayes et les rats. Il peut être facilement modifié pour augmenter les rendements en protéines en modifiant les vitesses d’homogénéisation, les temps de centrifugation et le nombre de spins pour permettre l’isolement mitochondrial des cœurs, du foie, des reins et des cellules de souris. De plus, ce protocole est suffisamment général et robuste pour être utilisé pour étudier la fonction mitochondriale d’espèces non mammifères telles que la lamproie marine⁴⁶, ainsi que pour effectuer une analyse structurale à l’aide de la microscopie classique et de la cryo-microscopie électronique^40,47. Alors que de nombreuses études récentes se concentrent sur l’exploration du comportement mitochondrial dans les systèmes cellulaires et tissulaires intacts, l’ampleur et la profondeur des informations extraites de mitochondries isolées à l’aide de ces méthodes révèlent des impacts sur la métabolomique, le stress oxydatif et la production d’ATP qui ne seront jamais sans mérite. L’isolement de mitochondries bien couplées permet aux chercheurs d’étudier des aspects clés du développement et de la progression de la maladie qui ne sont pas autrement possibles dans des modèles de cellules entières. En raison de la polyvalence de ce protocole, les changements dans l’énergie mitochondriale observés dans des pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète et les troubles neurologiques peuvent être explorés à l’aide de la méthodologie décrite ici.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			de microcentrifugation de 1,7 mL
Bécher			Pour la dsection et le hachage d’organes Tubes
centrifugation Centrifugation
Adénosine 5'-diphosphate sel monopotassique dihydraté	Sigma  ;	A5285	Dosages de respirométrie
BSA Kit de dosage des protéines Thermo	Scentific	PI23225	Quantification des protéines mitochondriales
Dextrose	Sigma  ;	DX0145	Pour tampon (CB)
Éthylène glycol-bis(2-amino-éthylétre)-N,N,N',N'-acide tétraacétique  ;	Sigma  ;	E4378	Pour les tampons (CB et IB) et les tests de respirométrie
Canule en verre	Radnoti		Perfusion cardiaque de cobaye et de rat
Héparine sodique muqueuse porcine	Sigma  ;	SRE0027-250KU	Injection IP animale
Respiromètre			Électrode de type Clark ; oxygraphe avec chambres de 2 mL
Chambre d’induction
Isoflurane	Sigma  ;	792632	Anesthésique  ;
Acide L-malique	Sigma  ;	02288-50G	Dosages de respirométrie
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma  ;	M9272	Pour tampon (RB)
Mannitol	Sigma  ;	MX0214	Pour tampon (IB)
Seringues			d’un microlitre Tailles allant de 5&ndash ; 50 et micro ; L
Lecteur			Doit pouvoir incuber à 37 ° ; C  ;
MOPS	Sigma  ;	475898	Pour tous les tampons
O2 réservoir
OMNI THQ Homogénéisateur	OMNI International  ;	12-500	Des homogénéisateurs à rotor et stator similaires peuvent faire fonctionner
des pipettes			Volumes de  ; 2&ndash ; 20 et micro ; L; 20&ndash ; 200 et micro ; L; 200&ndash ; 1000 et micro ; L
Chlorure de potassium	Sigma  ;	P3911	Pour tampons (RB et CB)
Phosphate de potassium dibasique	Sigma  ;	795496	Pour tampons (IB et RB)
Protéase de Bacillus licheniformis	Sigma  ;	P5459
Chlorure de sodium	Sigma  ;	S9888	Pour tampon (CB)
Pyruvate de sodium	Fisher bioréactifs	BP356-100	Dosages
Saccharose	Sigma  ;	8510-OP	Pour tampon (IB)
		dissection chirurgicale	Dépend de la source animale et tissulaire
Centrifugeuse			Doit refroidir à 4 ° ; C  ;