Détermination de la fonction ciliaire et de l’imperméabilité membranaire de l’épithélium des voies respiratoires pulmonaires pseudostratifié

Summary

La culture d’interface air-liquide est couramment utilisée pour développer un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié en différenciant les cellules épithéliales bronchiques humaines normales primaires qui imitent la face apicale des voies respiratoires pulmonaires. Nous décrivons ici un protocole simple pour déterminer sa qualité en surveillant ses propriétés biophysiques, telles que la fonction ciliaire et l’intégrité de la membrane.

Abstract

La différenciation des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires pulmonaires à l’interface air-liquide (ALI) est une technique populaire pour développer un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié multicellulaire qui imite la face apicale des voies respiratoires pulmonaires. Alors que la différenciation des cellules primaires des voies respiratoires pulmonaires est attendue, l’évaluation des propriétés biophysiques telles que la fonction ciliaire et l’imperméabilité de la membrane fournit une évaluation de qualité de l’épithélium des voies respiratoires et garantit la fiabilité de l’expérience. Ici, nous décrivons un protocole simple pour le développement d’épithélium des voies respiratoires pseudostratifié multicellulaire en culture ALI et évaluons deux propriétés biophysiques importantes : la fonction ciliaire et l’imperméabilité membranaire. Pour déterminer la fonction ciliaire, nous avons capturé le mouvement ciliaire d’un épithélium des voies respiratoires différencié de 4 semaines à l’aide d’une caméra à grande vitesse fixée à un microscope inversé, suivi de la quantification de la fréquence des battements ciliaires (CBF) à l’aide du système d’analyse vidéo Simon Amon (SAVA). Nous avons également mesuré la résistance électrique transépithéliale (TEER) à l’aide d’un voltmètre-ohm pour déterminer l’intégrité de la barrière épithéliale de l’épithélium des voies respiratoires.

Introduction

Les maladies respiratoires chroniques telles que l’asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) et la mucoviscidose sont parmi les principaux problèmes de santé dans le monde¹. La prévalence des maladies respiratoires causées par des virus tels que le virus de la grippe humaine A, le virus respiratoire syncytial (VRS) et le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) représente également un fardeau économique et de santé publique². Par conséquent, il existe un immense besoin de développer des schémas thérapeutiques pour les maladies respiratoires qui en....

Protocol

Le protocole doit être réalisé à l’état stérile sous une hotte à flux laminaire de niveau de biosécurité 2 (enceinte de biosécurité). Tous les fluides et solutions doivent être décongelés à 37 °C avant utilisation. La centrifugation doit être effectuée à 4 °C. Tout le matériel utilisé dans l’expérience doit être stérile. Les cellules primaires (donneur anonymisé) ont été obtenues en collaboration avec le Dr Kristina Bailey au Centre médical de l’Université du Nebraska (UNMC), à Omaha, dans le Nebraska. Les cellules primaires proviennent de donneurs anonymisés, et les cellules ne relèvent pas du sujet humain du NIH. Les cellules ont é....

Results

Nous avons évalué à la fois la fonction ciliaire et l’imperméabilité membranaire de l’épithélium des voies respiratoires obtenues à partir de cellules NHBE primaires différenciées de deux donneurs indépendants anonymisés (deux adultes non fumeurs, en bonne santé ou des adultes atteints de BPCO, de plus de 50 ans). Pour déterminer la fonction ciliaire, nous avons déterminé le CBF de l’épithélium différencié des voies respiratoires à 28 jours. Nous avons observé que le CBF atteignait au moins 3 Hz pour les deux épithéliums.......

Discussion

L’épithélium primaire des voies respiratoires humaines (culture ALI) est de plus en plus utilisé comme modèle pulmonaire in vitro pour les évaluations biologiques visant à étudier la fonction et les mécanismes et à réduire l’utilisation des animaux¹⁴. L’ALI présente plusieurs avantages par rapport à toute culture submergée monocouche. Par exemple, il fournit un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié semblable à un tissu qui imite la face apicale des vo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	14190-144
Milieu de croissance des cellules épithéliales des voies respiratoires	PromoCell, Allemagne	C-21060
Amphotéricine B	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	15290-026
Ohmmètre EVOM2 volts	World Precision Instruments, États-Unis	Sans objet
Solution d’héparine	Technologies STEMCELL, USA	07980
Stock d’hydrocortisone	STEMCELL technologies, USA	07926
Microscope : Leica DMI8 (Leica Microscope) avec caméra haute vitesse 120f/sec (Basler) associée au microscope. Microsope également fixé avec incubateur à chambre de scène i8.	Leica, États-Unis	Sans objet
Pénicilline-Streptomycine	Corning, États-Unis	30-002-CI
PneumaCult-ALI Milieu basal  ;	STEMCELL technologies, États-Unis	05002
PureCol	Advanced BioMatrix, États-Unis	5005
Système d’analyse vidéo Sisson-Ammons (SAVA). Logiciel V.2.1.15  ;	Amson Engineering, États-Unis	Sans objet