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Article de méthode

Détermination de la fonction ciliaire et de l’imperméabilité membranaire de l’épithélium des voies respiratoires pulmonaires pseudostratifié

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DOI :

10.3791/67094

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21 février 2025

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1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

Dans cet article

Résumé

La culture d’interface air-liquide est couramment utilisée pour développer un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié en différenciant les cellules épithéliales bronchiques humaines normales primaires qui imitent la face apicale des voies respiratoires pulmonaires. Nous décrivons ici un protocole simple pour déterminer sa qualité en surveillant ses propriétés biophysiques, telles que la fonction ciliaire et l’intégrité de la membrane.

Résumé

La différenciation des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires pulmonaires à l’interface air-liquide (ALI) est une technique populaire pour développer un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié multicellulaire qui imite la face apicale des voies respiratoires pulmonaires. Alors que la différenciation des cellules primaires des voies respiratoires pulmonaires est attendue, l’évaluation des propriétés biophysiques telles que la fonction ciliaire et l’imperméabilité de la membrane fournit une évaluation de qualité de l’épithélium des voies respiratoires et garantit la fiabilité de l’expérience. Ici, nous décrivons un protocole simple pour le développement d’épithélium des voies respiratoires pseudostratifié multicellulaire en culture ALI et évaluons deux propriétés biophysiques importantes : la fonction ciliaire et l’imperméabilité membranaire. Pour déterminer la fonction ciliaire, nous avons capturé le mouvement ciliaire d’un épithélium des voies respiratoires différencié de 4 semaines à l’aide d’une caméra à grande vitesse fixée à un microscope inversé, suivi de la quantification de la fréquence des battements ciliaires (CBF) à l’aide du système d’analyse vidéo Simon Amon (SAVA). Nous avons également mesuré la résistance électrique transépithéliale (TEER) à l’aide d’un voltmètre-ohm pour déterminer l’intégrité de la barrière épithéliale de l’épithélium des voies respiratoires.

Introduction

Les maladies respiratoires chroniques telles que l’asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) et la mucoviscidose sont parmi les principaux problèmes de santé dans le monde1. La prévalence des maladies respiratoires causées par des virus tels que le virus de la grippe humaine A, le virus respiratoire syncytial (VRS) et le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) représente également un fardeau économique et de santé publique2. Par conséquent, il existe un immense besoin de développer des schémas thérapeutiques pour les maladies respiratoires qui entraînent des lésions irréversibles des tissus respiratoires. Le tissu épithélial respiratoire lui-même est non seulement impliqué dans l’absorption d’oxygène, mais fournit également une barrière pour protéger le corps contre les agents pathogènes envahissants et les produits chimiques dangereux3. L’épithélium respiratoire a une organisation cellulaire complexe composée de trois grands types de cellules : les cellules ciliées, les cellules caliciformes et les cellules basales. Récemment, un rapport a été publié sur la présence de cellules ionocytaires nouvelles mais rares dans l’épithélium4 des voies respiratoires. Le tissu complexe fonctionne de manière coordonnée pour fournir des réponses immunitaires innées telles que la sécrétion de peptides antimicrobiens, la libération de cytokines pour activer une réponse immunitaire adaptative et la clairance mucociliaire5. L’absence d’un modèle de voies respiratoires adapté est l’un des freins à l’étude des infections respiratoires et au développement de traitements.

Le modèle d’interface air-liquide (ALI) devient un outil clé pour la recherche sur les maladies respiratoires6. Il s’agit d’un modèle efficace des voies respiratoires pulmonaires in vitro, car les cellules primaires des voies respiratoires pulmonaires se différencient en un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié composé d’au moins trois types de cellules qui résident généralement du côté apical des voies respiratoires. Tout d’abord, les cellules ciliées recouvrent la majorité de la face apicale des voies respiratoires et contribuent à la clairance mucociliaire. Deuxièmement, les cellules caliciformes produisent du mucus et sont les plus grandes cellules qui cohabitent avec les cellules ciliaires du côté apical des voies respiratoires. Troisièmement, les cellules basales résident dans la couche basale des voies respiratoires et sont les cellules progénitrices qui se différencient en différentes cellules épithéliales 5,7. Bien que les ionocytes et les cellules de touffe soient rares dans l’épithélium des voies respiratoires, ils peuvent également jouer un rôle dans la fonction ciliaire et la perméabilité membranaire4. Cette technique diffère de la culture cellulaire submergée traditionnelle, qui n’imite pas l’environnement pulmonaire in vivo. Étant donné que l’ALI est produit à partir de cellules épithéliales primaires dérivées de personnes en bonne santé, de patients asthmatiques et de BPCO, il offre une plate-forme plus diversifiée pour étudier les réponses aux infections et la physiopathologie de la maladie.

L’évaluation de la santé des cultures développées par l’ALIA est un aspect essentiel à surveiller, afin de garantir la viabilité, la fonctionnalité et la pertinence physiologique des cellules cultivées. Il renforce la confiance dans l’intégrité, la fiabilité et la reproductibilité des cultures ALI. Comme nous l’avons déjà publié, notre groupe a évalué l’intégrité de la culture ALI en évaluant deux paramètres biophysiques : la fonction ciliaire en quantifiant la fréquence des battements ciliaires (CBF) et l’intégrité de la barrière épithéliale en déterminant la résistance électrique transépithéliale (TEER)6,7,8. La clairance mucociliaire (CMC) est l’une des caractéristiques importantes de l’épithélium des voies respiratoires porté par les cellules ciliées. Des organites spécialisés appelés cils à la surface des cellules ciliées battent en ondes métachrronales pour dégager les voies respiratoires des infections et des particules inhalées coincées dans la couche muqueuse de l’épithélium des voies respiratoires. L’efficacité de la MCC dépend totalement de la bonne activité ciliaire9. Un bon CBF est indicatif d’un épithélium des voies respiratoires sain et intact ; par conséquent, la surveillance de la FBC pour les cultures ALI fournit des informations précieuses sur l’intégrité de l’épithélium10. Bien qu’il existe de multiples façons de quantifier la FCB, par exemple, la vidéomicroscopie à grande vitesse11 et la tomographie par cohérence optique Doppler résolueen phase 12, chaque méthode nécessite une expertise technique et un équipement spécialisé. Dans ce protocole, nous fournissons un moyen plus simple et moins technique de quantifier le CBF de l’épithélium différencié des voies respiratoires. Nous avons également décrit une méthode de quantification de la TEER du même épithélium, qui indique l’intégrité et la fonction barrière des tissus épithéliaux13.

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Protocole

Le protocole doit être réalisé à l’état stérile sous une hotte à flux laminaire de niveau de biosécurité 2 (enceinte de biosécurité). Tous les fluides et solutions doivent être décongelés à 37 °C avant utilisation. La centrifugation doit être effectuée à 4 °C. Tout le matériel utilisé dans l’expérience doit être stérile. Les cellules primaires (donneur anonymisé) ont été obtenues en collaboration avec le Dr Kristina Bailey au Centre médical de l’Université du Nebraska (UNMC), à Omaha, dans le Nebraska. Les cellules primaires proviennent de donneurs anonymisés, et les cellules ne relèvent pas du sujet humain du NIH. Les cellules ont été obtenues dans le cadre d’un accord de transfert de matériel (MTA) approuvé entre l’Université du Dakota du Nord, à Grand Forks, dans le Dakota du Nord, et l’UNMC, à Omaha, dans le Nebraska. Ici, nous avons utilisé des cellules NHBE acheminées 4. Bien qu’il ait également été démontré que les cellules NHBE à passage supérieur (jusqu’au passage 8) se différencient en épithélium des voies respiratoires, nous utilisons régulièrement des cellules NHBE de passage quatre car il n’y a pas de différence évidente dans les profils de transcription du génome entier entre les passages 1 à 4 6,14.

1. Culture cellulaire primaire

REMARQUE : Une manipulation soigneuse des cellules primaires est cruciale. L’ensemble du protocole doit éviter un traitement sévère et un pipetage excessif des cellules primaires.

  1. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, ajoutez 5 ml de collagène dans une boîte de culture tissulaire (TC) de 100 mm pour pré-enrober la boîte. Incuber la boîte TC avec du collagène à température ambiante (RT) pendant 20 min.
  2. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, aspirer le collagène de la boîte TC et le remplacer par 8 mL de milieu de cellules épithéliales complètes des voies respiratoires (AEC) prédécongelé complété par 2 % (v/v) de pénicilline-streptomycine et 1 % (v/v) d’amphotéricine B (tableau 1).
  3. Décongeler un flacon (contenant 5 x 105 cellules) de cellules épithéliales bronchiques humaines normales primaires (NHBE) dans un bain-marie à 37 °C.
  4. À l’aide d’une pipette sérologique stérile de 5 ml, ajouter 1 ml de milieu AEC complet prédécongelé aux cellules par goutte à goutte pour acclimater les cellules NHBE, et recueillir toutes les cellules dans un tube conique stérile de 15 ml.
  5. Granuler les cellules par centrifugation à 212 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez délicatement le milieu du tube et remettez en suspension les cellules dans les gouttes de milieu restantes dans le tube en tapotant doucement.
    REMARQUE : Il faut éviter de tapoter excessivement et durement.
  6. À l’aide d’une pipette sérologique stérile de 5 ml, ajoutez lentement 2 ml de milieu AEC complet aux cellules remises en suspension et prélevez toutes les cellules.
  7. Ajouter les cellules à la plaque pré-ajoutée avec 8 mL de milieu AEC complet. Déplacez l’antenne TC sur le côté pour répartir uniformément les cellules dans l’antenne.
  8. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire de CO2 humide à 85 % à 95 %. Après 24 h, observez les cellules NHBE au microscope à 10x ou 20x pour leur fixation à la boîte TC et leur croissance. Si les cellules sont suspendues dans le milieu, cela montre des cellules mortes.
  9. Après 48 h, aspirer l’ancien milieu de la boîte TC à l’aide d’une pipette sérologique stérile.
  10. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, ajoutez 10 mL de milieu AEC complet et préchauffé dans les cellules. Ajoutez le support lentement dans un coin ; Évitez de verser directement sur le dessus des cellules.
  11. Changez le média AEC complet toutes les 48 h jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 95 % à 100 %.

2. Culture d’interface air-liquide

  1. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 μL de collagène dans un insert transwell pré-enduit de 6,5 mm avec une membrane polyester à 0,4 μm de pores (ci-après dénommés inserts) et incubez à RT pendant 20 min.
  2. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, aspirer le milieu des cellules NHBE confluentes.
  3. Ajouter 5 ml de 1 solution saline tampon phosphate de Dulbecco (DPBS) à l’aide d’une pipette sérologique stérile dans un coin de la boîte TC.
  4. Tournez doucement la plaque pour laver les cellules et aspirez le 1x DPBS avec une pipette sérologique stérile. Assurez-vous que les cellules ne se dessèchent à aucune étape du protocole.
  5. À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 5 mL de TrypsinLE dans les cellules et incuber à 37 °C dans un incubateur humide de culture cellulaire de CO2 jusqu’à ce que toutes les cellules soient dissociées de la surface inférieure de la plaque.
  6. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, prélever toutes les cellules dans un tube conique de 15 mL. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, ajoutez 3 ml de trypsine dans la boîte TC et prélevez les cellules résiduelles.
  7. Granuler les cellules par centrifugation à 212 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le milieu et tapotez doucement le tube pour remettre en suspension les cellules dans les gouttes de trypsine restantes dans le tube.
  8. À l’aide d’une pipette sérologique, ajoutez 2 mL de milieu AEC complet dans les cellules remises en suspension.
  9. Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
  10. Diluer les cellules avec un milieu AEC complet, chaque insert recevant 5 x 104 cellules dans un volume de 200 μL.
  11. À l’aide d’une pince stérile, transférez les inserts dans un puits vide dans une boîte de culture à 24 puits.
  12. À l’aide d’une pipette P1000, ajoutez 500 μL de média AEC complet dans le puits basal de la plaque.
  13. À l’aide d’une pince stérile, transférez les inserts dans le puits basal avec un milieu AEC complet ajouté.
  14. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 5 x 104 cellules NHBE remises en suspension dans 200 μL du milieu AEC complet sur la face apicale de l’insert. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire de CO2 humide à 85 % - 95 %.
  15. Après 24 h, observez les cellules au microscope pour voir si elles ont formé une couche confluente dans le puits.
    REMARQUE : Si les cellules ne forment pas une couche confluente, changez le milieu AEC basal toutes les 48 heures avec un milieu AEC frais et complet jusqu’à ce que les cellules forment une monocouche confluente. Lors du changement de milieu basal, transférez les inserts dans le puits vide à l’aide d’une pince stérile. Aspirez l’ancien milieu à l’aide d’une pipette P1000, ajoutez un milieu frais et replacez les inserts dans un milieu AEC frais et complet.
  16. Une fois que les cellules sont confluentes, transférez les inserts dans un puits vide à l’aide d’une pince stérile. À l’aide d’une pipette P1000, aspirer tout le milieu AEC basal.
  17. À l’aide d’une pipette P1000, ajoutez 500 μL de milieu de différenciation d’interface air-liquide (ALI) complet frais complété par 2 % (v/v) de pénicilline-streptomycine et 1 % (v/v) d’amphotéricine B dans le puits basal.
  18. Transférez les inserts dans le puits basal avec le milieu ALI complet ajouté à l’aide d’une pince stérile. À l’aide d’une pipette P200, aspirez doucement le milieu apical AEC du puits.
    REMARQUE : La face apicale ne doit pas être ajoutée avec le milieu ALI complet. Aspirez soigneusement le milieu AEC par le côté apical pour éviter tout détachement cellulaire.
  19. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humide de culture cellulaire de CO2 . Après 48 h, transférez les inserts dans un puits vide à l’aide d’une pince stérile.
  20. À l’aide d’une pipette P1000, aspirez l’ancien milieu et ajoutez 500 μL de milieu ALI complet.
  21. À l’aide d’une pince stérile, remettez les inserts dans le puits avec du milieu frais. Continuez à changer le milieu ALI complet toutes les 48 heures jusqu’au jour 28 (quatre semaines).
  22. Le 28e jour, à l’aide d’une pipette P200, ajouter 100 μL de 1x DPBS sur la face apicale des inserts et incuber à 37 °C dans un incubateur humide de culture cellulaire de CO2 pendant 30 min. Aspirez le 1x DPBS avec une pipette P200.
    REMARQUE : DPBS doit être ajouté en versant sur le mur plutôt que directement dans les cellules. Lors de l’aspiration du DPBS, évitez de toucher l’épithélium et de pipeter vigoureusement, car tout dommage à l’épithélium peut compromettre l’intégrité de l’épithélium (semblable à un tissu).
  23. A partir de la2ème semaine de différenciation, évaluer la production de mucus en observant au microscope une éventuelle couche plus foncée due au mucus sur l’épithélium. L’excès de mucus peut être éliminé par le lavage DPBS. En bref, ajouter 200 μL de 1x DPBS sur le côté apical des inserts sur une plaque à 24 puits et incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humide de culture cellulaire de CO2 pendant 30 min. Retirez le DPBS et maintenez la plaque à 37 °C dans un incubateur humide de culture cellulaire de CO2 .

3. Détermination de la fréquence des battements ciliaires

REMARQUE : Pour la détermination du CBF à 37 °C (si nécessaire), le microscope doit disposer d’un incubateur à chambre environnementale fournissant 5 % de CO2 à 37 °C et d’humidité.

  1. Allumez le microscope avec son ordinateur et la chambre d’environnement. Ouvrez la porte de la chambre pour placer la plaque contenant les inserts sur la platine du microscope.
  2. Une fois la plaque posée sur la platine, fermez la chambre. À l’aide du bouton de commande de la platine du microscope, déplacez la plaque pour afficher les inserts.
  3. Sélectionnez l’objectif de grossissement 20x en mode de contraste de phase. Observez la plaque à travers l’oculaire du microscope et faites la mise au point de la cellule à l’aide du bouton de réglage.
  4. Sur l’écran de l’ordinateur, cliquez sur l’icône du système SAVA . Le programme SAVA doit être installé sur l’ordinateur connecté au microscope.
  5. Sur l’interface du logiciel, cliquez sur Configurer l’expérience. Dans l’onglet suivant, cliquez sur Créer une expérience.
  6. Un nouvel onglet apparaît, donnant les détails du répertoire où les données seront stockées dans le nom du répertoire Entrer le nom du répertoire de l’expérience et les détails de l’expérience dans la description de l’expérience, puis cliquez sur OK.
  7. Cliquez sur l’expérience qui a été créée et qui est affichée dans le Répertoire sous les Expériences.
  8. Cliquez sur Modifier et fournissez les détails de l’exemple dans la description de l’échantillon. Cliquez sur Ajouter puis sur Quitter pour sortir de cet onglet.
  9. Sur l’interface logicielle principale, sur l’emplacement de l’expérience, sélectionnez l’expérience créée dans le menu déroulant de l’interface principale.
  10. Cliquez sur Enregistrer une vidéo et surveillez la fréquence des battements ciliaires (CBF) sur l’écran de l’ordinateur. L’écran affichera le mouvement ciliaire ciliaire.
  11. Pour chaque insertion, enregistrez 6 trames aléatoires différentes pendant 2,1 s à 120 images par seconde. Cliquez sur Enregistrer la vidéo pour surveiller les données CBF.
  12. Pour analyser les données, cliquez sur Analyser la vidéo dans l’interface du logiciel. Dans l’onglet suivant, cliquez sur OK.
  13. Dans l’onglet suivant, cliquez sur Analyser tout. Téléchargez la feuille de calcul générée pour chaque expérience dans le dossier d’acquisition de données SAVA de l’ordinateur.
  14. Prenons l’exemple de la fréquence moyenne gaussienne pour la présentation des données.

4. Quantification de la résistance électrique transépithéliale

REMARQUE : La quantification TEER nécessite un liquide du côté apical de l’épithélium des voies respiratoires. Pour établir ce protocole, ajoutez 100 μL de 1x DPBS du côté apical de l’épithélium des voies respiratoires dans les inserts qui contiennent déjà le milieu basal (expérimental) ou 500 μL de 1x DPBS.

  1. Allumez l’ohmmètre EVOM2 volts à l’aide de l’interrupteur d’alimentation. Connectez la résistance de test à l’EVOM2 au niveau de la fente d’entrée.
  2. Surveillez la lecture sur l’écran EVOM2. S’il est supérieur ou inférieur à 1000, il doit être calibré. À l’aide d’une pince, tournez l’interrupteur ADJ sur l’ohmmètre EVOM2 volts jusqu’à ce qu’il affiche une lecture uniforme de 1000.
  3. Prenez un encart vide pour la lecture de contrôle expérimental. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 μL de 1x DPBS sur le côté apical de l’insert vide, tandis que 500 μL de 1x DPBS sont ajoutés sur le côté basal avec une pipette P1000.
  4. Débranchez la résistance de test et connectez l’électrode STX2 à la fente d’entrée sur EVOM2. Nettoyez délicatement l’électrode STX2 avec de l’éthanol à 70 %.
  5. Insérez l’électrode STX2 dans l’insert vide avec 1x DPBS, en gardant la patte d’électrode la plus courte sur la partie apicale de chaque insert et la jambe d’électrode la plus longue sur la partie basale.
  6. Enregistrez la lecture stable sur l’écran EVOM2, car la lecture peut fluctuer en raison d’un mouvement ou d’autres raisons indéterminées.
  7. Insérez l’électrode STX2 dans l’insert avec un épithélium différencié de 28 jours, en gardant la patte d’électrode la plus courte sur la partie apicale de chaque insert et la jambe d’électrode la plus longue sur la partie basale du milieu.
  8. Enregistrez la lecture stable sur l’écran EVOM2. Prenez plusieurs lectures indépendantes pour calculer une moyenne fiable. Soustrayez l’arrière-plan (lecture de l’insert vide) de la lecture de l’insert expérimental pour le calcul.

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Résultats

Nous avons évalué à la fois la fonction ciliaire et l’imperméabilité membranaire de l’épithélium des voies respiratoires obtenues à partir de cellules NHBE primaires différenciées de deux donneurs indépendants anonymisés (deux adultes non fumeurs, en bonne santé ou des adultes atteints de BPCO, de plus de 50 ans). Pour déterminer la fonction ciliaire, nous avons déterminé le CBF de l’épithélium différencié des voies respiratoires à 28 jours. Nous avons observé que le CBF atteignait au moins 3 Hz pour les deux épithéliums...

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Discussion

L’épithélium primaire des voies respiratoires humaines (culture ALI) est de plus en plus utilisé comme modèle pulmonaire in vitro pour les évaluations biologiques visant à étudier la fonction et les mécanismes et à réduire l’utilisation des animaux14. L’ALI présente plusieurs avantages par rapport à toute culture submergée monocouche. Par exemple, il fournit un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié semblable à un tissu qui imite la face apicale des vo...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été financé par la subvention pilote NIH P20GM113123 et UND SMHS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x DPBSThermo Fisher Scientific, États-Unis14190-144
Milieu de croissance des cellules épithéliales des voies respiratoiresPromoCell, AllemagneC-21060
Amphotéricine BThermo Fisher Scientific, États-Unis15290-026
Ohmmètre EVOM2 voltsWorld Precision Instruments, États-UnisSans objet
Solution d’héparineTechnologies STEMCELL, USA07980
Stock d’hydrocortisoneSTEMCELL technologies, USA07926
Microscope : Leica DMI8 (Leica Microscope) avec caméra haute vitesse 120f/sec (Basler) associée au microscope. Microsope également fixé avec incubateur à chambre de scène i8.Leica, États-UnisSans objet
Pénicilline-StreptomycineCorning, États-Unis30-002-CI
PneumaCult-ALI Milieu basal  ;STEMCELL technologies, États-Unis05002
PureColAdvanced BioMatrix, États-Unis5005
Système d’analyse vidéo Sisson-Ammons (SAVA). Logiciel V.2.1.15  ;Amson Engineering, États-UnisSans objet

Références

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