Fabrication et caractérisation de patchs de micro-aiguilles pour le chargement et l’administration d’exosomes

Résumé

Les exosomes possèdent un potentiel clinique important, mais leur application pratique est limitée en raison de la facilité d’élimination in vivo et de la faible stabilité. Les micro-aiguilles présentent une solution en permettant une administration localisée en perforant les barrières physiologiques et la conservation à l’état sec, remédiant ainsi aux limites de l’administration d’exosomes et élargissant leur utilité clinique.

Résumé

Les exosomes, en tant que biothérapies émergentes de « nouvelle génération » et vecteurs d’administration de médicaments, recèlent un immense potentiel dans divers domaines biomédicaux, allant de l’administration de médicaments et de la médecine régénérative au diagnostic des maladies et à l’immunothérapie tumorale. Cependant, la clairance rapide par injection traditionnelle en bolus et la faible stabilité des exosomes limitent leur application clinique. Les micro-aiguilles servent de solution qui prolonge le temps de séjour des exosomes sur le site d’administration, maintenant ainsi la concentration du médicament et facilitant les effets thérapeutiques durables. De plus, les micro-aiguilles possèdent également la capacité de maintenir la stabilité des substances bioactives. Par conséquent, nous introduisons un patch de micro-aiguilles pour le chargement et l’administration d’exosomes et partageons les méthodes, y compris l’isolement des exosomes, la fabrication et la caractérisation des patchs de micro-aiguilles chargés d’exosomes. Les patchs à micro-aiguilles ont été fabriqués en utilisant du tréhalose et de l’acide hyaluronique comme matériaux de pointe et de la polyvinylpyrrolidone comme matériau de support par une méthode de moulage en deux étapes. Les micro-aiguilles ont démontré une résistance mécanique robuste, avec des pointes capables de résister à 2 N. La peau de porc a été utilisée pour simuler la peau humaine, et les pointes des micro-aiguilles ont complètement fondu dans les 60 secondes suivant la perforation de la peau. Les exosomes libérés par les micro-aiguilles présentaient une morphologie, une taille de particules, des protéines marqueurs et des fonctions biologiques comparables à celles des exosomes frais, permettant l’absorption des cellules dendritiques et favorisant leur maturation.

Introduction

Les exosomes, qui sont de petites vésicules libérées par les cellules dans la matrice extracellulaire, ont été proposés comme biothérapies potentielles et vecteurs d’administration de médicaments pour le traitement de plusieurs maladies et cancers¹. Au cours de leur processus de biogenèse, les exosomes encapsulent diverses molécules biologiquement actives à l’intérieur des cellules, y compris des protéines fonctionnelles et des acides nucléiques². Par conséquent, lorsqu’ils sont absorbés par les cellules réceptrices pendant le processus de transport, les exosomes ont la capacité de moduler l’expression des gènes et les fonctions cellulaires dans les cellules cibles³. En tant que sorte de messager d’information naturel, les exosomes ont été pleinement exploités dans la régénération des tissus, la régulation immunitaire et en tant que vecteur de livraison⁴. Grâce à des techniques d’ingénierie, des ligands spécifiques peuvent être enrichis à la surface des exosomes, ce qui permet d’induction ou d’inhibition d’événements de signalisation dans les cellules réceptrices ou de cibler des types cellulaires spécifiques⁵. Les agents chimiothérapeutiques peuvent également être chargés dans les exosomes pour le traitement du cancer⁶. De plus, les exosomes ont la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique pour l’administration de cargaisons thérapeutiques, ce qui les rend très prometteurs pour le traitement des troubles cérébraux⁷. Par rapport aux liposomes, les exosomes présentent une absorption cellulaire accrue et une biocompatibilité améliorée⁸. Ils sont capables de pénétrer efficacement dans d’autres cellules tout en faisant preuve d’une meilleure tolérance et d’une toxicité plus faible⁹. Cependant, l’injection traditionnelle d’exosomes en bolus est sujette à la séquestration et à l’élimination rapide par le foie, les reins et la rate dans la circulation sanguine¹⁰. De plus, les exosomes ont une faible stabilité in vitro et sont sensibles aux conditions de stockage, ce qui limite leurs applications cliniques¹¹.

Les micro-aiguilles, un ensemble de pointes d’aiguilles de taille micrométrique, ont la capacité de pénétrer les barrières physiologiques pour l’administration de petites molécules de médicaments¹², de protéines¹³, d’acides nucléiques¹⁴ et de nanomédicaments¹⁵. Les micro-aiguilles sont conçues avec précision pour cibler les lésions à la surface de la peau, et leurs pointes dispersées assurent une distribution uniforme du médicament sur le site ciblé, amplifiant ainsi leur impact thérapeutique¹⁶. La conception et la composition des matériaux des micro-aiguilles facilitent le stockage à sec de substances bioactives telles que les protéines et les acides nucléiques, améliorant ainsi leur stabilité¹⁷. Les méthodes d’injection traditionnelles ont une durée d’action relativement courte et peuvent provoquer des douleurs, induisant la peur chez les patients¹⁸. La longueur de la micro-aiguille, de taille micrométrique, minimise les traumatismes tissulaires et empêche la stimulation nerveuse, éliminant ainsi la douleur et améliorant l’observance du patient¹⁹. De plus, la nature conviviale des micro-aiguilles permet aux patients de s’auto-administrer le traitement sans avoir besoin de personnel spécialisé¹⁶. En plus de la peau, les micro-aiguilles peuvent également être utilisées dans des tissus tels que les yeux²⁰, la muqueuse buccale²¹, le cœur²² et les vaisseaux sanguins²³. L’application de micro-aiguilles pour l’administration clinique d’exosomes fournit une stratégie prometteuse et prospective.

Par conséquent, nous introduisons un patch de micro-aiguille (exo@MN) chargé d’exosomes et divulguons sa méthode de fabrication. Les patchs à micro-aiguilles ont été fabriqués à l’aide d’une méthode de coulée en deux étapes, ainsi que d’une centrifugation et d’un séchage sous vide, ce qui favorise l’agrégation des exosomes à l’extrémité des micro-aiguilles, améliorant ainsi l’efficacité de l’administration. Les pointes des aiguilles et le support ont été fabriqués à l’aide de matériaux qui présentent une excellente biocompatibilité et une excellente solubilité dans l’eau. Le tréhalose et l’acide hyaluronique (HA) ont été incorporés comme matériaux de pointe pour protéger les exosomes, et la polyvinylpyrrolidone (PVP) dissoute dans de l’éthanol absolu a été choisie comme matériau de support. La morphologie du patch de micro-aiguilles a été caractérisée à l’aide de la microscopie et du microscope électronique à balayage (MEB). Les essais mécaniques des micro-aiguilles ont été évalués à l’aide d’un tensimètre pour confirmer leur capacité à pénétrer la peau, et le taux de libération sur la peau de porc a été évalué à 60 s. De plus, la morphologie, la taille et la teneur en protéines des exosomes frais et des exosomes en exo@MN ont été caractérisées à l’aide d’un microscope électronique à transmission (MET), d’une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et d’un western blot (WB). L’internalisation des exosomes par les cellules dendritiques (DC) a été caractérisée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (CLSM), et la maturation des DC a été évaluée par cytométrie en flux. La caractérisation morphologique et les fonctions biologiques des deux types d’exosomes sont essentiellement cohérentes.

Protocole

Cette étude n’a pas besoin d’une autorisation éthique, car la peau de porc utilisée pour les expériences décrites à la section 3 a été achetée sur le marché sous forme d’oreilles de porc comestibles et ne provient pas d’animaux de laboratoire.

1. Isolement des exosomes

1. Culture cellulaire
   1. Cultivez des cellules cancéreuses épithéliales de l’ovaire ID8 de souris dans un milieu de culture DMEM (Modified Eagle Medium) de souris contenant 10 % de sérum fœtal bovin et une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % (100×) (voir le tableau des matériaux) dans des boîtes de Pétri d’un diamètre de 15 cm.
   2. Incuber des cellules ID8 dans un incubateur de CO₂ (voir Tableau des matériaux) à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 90 %.
2. Isolement des exosomes
   1. Retirez le milieu de culture des boîtes de Pétri et lavez-le deux fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco. Ajouter 20 mL de DMEM sans sérum fœtal bovin (voir le tableau des matières) et une solution de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matériaux). Poursuivre l’incubation à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 48 h.
   2. Prélever le surnageant de culture cellulaire dans 20 boîtes de Pétri de 15 cm de diamètre. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant pour éliminer les cellules libres.
   3. Centrifuger à 2000 x g pendant 10 min 4 °C, et recueillir le surnageant pour éliminer les débris cellulaires.
   4. Connectez le système de filtration sous vide jetable de 0,22 μm (voir tableau des matériaux) à la pompe à vide d’eau de circulation (voir tableau des matériaux). Créez un vide pour permettre au surnageant de passer à travers la membrane de polyéther sulfone de 0,22 μm et d’entrer dans la chambre inférieure du système de filtration, éliminant ainsi efficacement les vésicules ou les impuretés de plus de 0,22 μm du surnageant.
      1. Pour connecter la pompe à vide, allumez l’interrupteur de la pompe, puis connectez-la à l’entrée d’air du système de filtration sous vide. Lors de la fermeture, débranchez d’abord la connexion avec la pompe, puis éteignez la pompe à vide. Cette procédure permet d’éviter le reflux de la pompe à vide et la contamination du liquide de culture.
   5. Ajouter 15 mL de surnageant dans le tube intérieur du tube d’ultrafiltration de 100 kDa (voir le tableau des matériaux). Centrifuger à 3500 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le liquide du tube extérieur.
      REMARQUE : Retenir les particules de plus de 100 kDa sur la membrane du tube intérieur, tandis que les protéines de moins de 100 kDa seront centrifugées dans le tube extérieur avec la solution. Les exosomes étaient supérieurs à 100 kDa et étaient agrégés sur la membrane du tube interne.
   6. Répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que le volume total du liquide soit inférieur à 5 ml. Recueillir le liquide de la chambre à air et ajouter 1 mL de DPBS. À l’aide d’une pipette, pipeter à plusieurs reprises dans le tube intérieur, en veillant à la remise en suspension des exosomes attachés dans le DPBS, puis collectez-les.
   7. Centrifuger à 10000 x g pendant 60 min à 4 °C et transférer le surnageant dans un tube à centrifuger à enclenchement rapide de 6 mL (voir le tableau des matériaux). Scellez le tube avec une thermosoudeuse.
   8. Centrifugeuse à 100 000 x g pendant 2 h 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux). Ouvrez le tube de centrifugation à enclenchement rapide, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 100 μL de DPBS. C’est la solution de l’exosome.
      REMARQUE : Pendant le processus de remise en suspension de la pastille, il est nécessaire de pipeter et d’agiter la paroi du tube au moins 200 fois à l’aide d’une pipette.

2. Fabrication de exo@MN

1. Préparation du moule maître
   1. Construisez un modèle de micro-aiguille avec un réseau de 10 x 10 à l’aide d’un logiciel de CAO, avec des pointes de forme conique avec les paramètres suivants : une hauteur de 1200 μm, un diamètre de base de 400 μm et un pas (distance entre les micro-aiguilles adjacentes) de 900 μm.
   2. Utilisez de la résine HTL comme matériau et imprimez le moule maître de la micro-aiguille à l’aide d’une imprimante 3D (voir tableau des matériaux).
   3. Plongez le moule maître dans de l’éthanol absolu pendant 1 h pour enlever toute résine adhérant à la surface.
   4. Exposez le moule à la lumière ultraviolette pendant 5 minutes pour le durcir.
   5. Plongez à nouveau le moule dans de l’éthanol absolu pendant 1 h, puis séchez-le à 60 °C dans une étuve de séchage pendant 1 h. Le moule maître est prêt.
2. Préparation du moule de production
   1. Mélangez les composants A et B du polydiméthylsiloxane (PDMS, voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 10:1. Mélangez bien et versez le mélange dans un moule maître.
   2. Placez le moule PDMS sous une pression de 1 psi pendant 15 min pour éliminer les bulles d’air du mélange PDMS.
   3. Durcir le moule PDMS à 60 °C pendant 2 h puis démouler pour obtenir le moule de production de la micro-aiguille.
   4. Nettoyez le moule de production avec de l’eau ultra-pure avant utilisation.
3. Préparation de la solution
   1. Quantifiez la teneur en protéines de la solution d’exosomes à l’aide d’un kit de dosage BCA (voir la table des matériaux). Ajouter une quantité appropriée de DPBS pour obtenir une concentration de 10 μg/μL pour la solution d’exosomes.
   2. Préparez une solution de tréhalose à 200 mg/mL (voir le tableau des matériaux) en utilisant le DPBS comme solvant. Remuer pendant 20 minutes pour assurer une dissolution complète.
   3. Préparez une solution de 200 mg/mL d’acide hyaluronique (HA, voir tableau des matériaux) en utilisant le DPBS comme solvant. Remuer toute la nuit pour assurer une dissolution complète.
   4. Préparez une solution de 150 mg/mL de polyvinylpyrrolidone (PVP, voir le tableau des matières) en utilisant de l’éthanol absolu comme solvant. Remuer toute la nuit pour assurer une dissolution complète.
   5. Mélanger la solution d’exosome (10 μg/μL) et la solution de tréhalose (200 mg/mL) dans un rapport de volume de 1:1. Ajouter ensuite un volume égal de solution d’AH (200 mg/mL). Mélangez soigneusement pour obtenir la solution de pointe.
4. Fabrication de exo@MN
   1. Traitez la surface du moule PDMS à l’aide d’un nettoyeur plasma (voir le tableau des matériaux) pendant 30 s à faible intensité pour améliorer son hydrophilie.
   2. Ajouter 40 μL de la solution de pointe dans le moule PDMS. Centrifuger à température ambiante (RT) et 3000 x g pendant 3 min pour s’assurer que le liquide remplit la couche d’aiguille du moule.
   3. Retirer l’excès de liquide dans le moule et sécher à RT dans une étuve de séchage sous vide (voir tableau des matériaux) pendant 1 jour.
   4. Ajouter 200 μL de solution PVP dans le moule PDMS. Centrifuger 3000 x g pendant 3 min à RT pour s’assurer que le liquide remplit la couche de support du moule.
   5. Sécher le moule à RT dans une étuve de séchage pendant 1 jour, puis démouler pour obtenir le patch exo@MN.
      REMARQUE : Conservez le patch exo@MN dans un four de séchage jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

Figure 1 : Processus de fabrication de exo@MN patchs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Caractérisation des patchs exo@MN

1. Observation de la morphologie
   1. Collez le support du patch sur une surface inclinée à 45° et placez-le sous un microscope stéréoscopique (voir Tableau des matériaux).
   2. Allumez l’illuminateur et capturez la morphologie du patch à l’aide d’un objectif 4x.
2. Microscopie électronique à balayage (MEB)
   1. Fixez le patch à la platine de l’échantillon à l’aide d’un adhésif conducteur et traitez-le avec un enduiseur automatique fin (voir le tableau des matériaux) pendant 30 s.
   2. Capturez des images du patch exo@MN à l’aide du MEB (voir Tableau des matériaux) avec une tension d’accélération de 1 kV.
3. Essais mécaniques
   1. Découpez un réseau de 3 x 3 dans le patch et placez-le avec les pointes vers le haut sur la plate-forme rigide d’un tensimètre (voir le tableau des matériaux). Ajustez la hauteur de la sonde pour la rapprocher des pointes des aiguilles sans les toucher.
   2. Réglez les paramètres pour qu’ils s’arrêtent automatiquement lorsque la pression atteint 20 N. Comprimez les pointes des aiguilles verticalement à une vitesse de 0,5 mm/min et enregistrez le profil de charge en fonction du déplacement.
4. Dissolution
   1. Achetez des oreilles de porc fraîches au marché et coupez-les en morceaux (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Étalez la peau de porc sur une table et utilisez du papier pour sécher l’humidité de surface.
   2. Préparez quatre patchs secs à micro-aiguilles avec les pointes des aiguilles vers le bas sur la peau du porc, en espaçant légèrement chaque patch. À l’aide du pouce et de l’index, appuyez verticalement sur chaque patch de micro-aiguille. Retirez un timbre toutes les 15 s.
   3. Placez immédiatement le patch retiré dans une étuve de séchage et séchez-le pendant 5 min. Coupez une colonne de pointes de micro-aiguilles, placez-les horizontalement sous un microscope (voir le tableau des matériaux) et utilisez une lentille d’objectif 4x pour observer la dissolution des pointes.

4. Caractérisation des exosomes dans exo@MN patch

REMARQUE : Les pointes des micro-aiguilles de exo@MN sont dissoutes dans 100 μL de solution de DPBS pour effectuer la caractérisation suivante sur les exosomes libérés.

1. Microscopie électronique à transmission (MET)
   1. Traitez le treillis de cuivre (voir Tableau des matériaux) avec un traitement hydrophile à l’aide d’un nettoyant ionique (voir Tableau des matériaux) pendant 5 min.
   2. Versez 10 μL de l’échantillon sur le côté carbone du treillis de cuivre. Laissez reposer pendant 1 min, puis retirez le liquide en l’épongeant avec du papier filtre sur les bords.
   3. Ajouter 10 μL d’acétate d’uranyle à 3 % (voir le tableau des matériaux) à l’échantillon. Laissez reposer pendant 10 s, puis retirez le liquide en épongeant avec du papier filtre sur les bords.
   4. Ajouter 10 μL d’acétate d’uranyle à 3 % à l’échantillon. Laissez reposer pendant 1 min, puis retirez le liquide en l’épongeant avec du papier filtre sur les bords et en le faisant sécher à l’air libre à RT.
   5. Capturer des images des exosomes à l’aide de la MET (voir Tableau des matériaux) avec une tension d’accélération de 80 kV.
2. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
   1. Diluer la solution d’exosomes avec du DPBS pour obtenir une concentration de particules de 1 x 10⁷ particules/mL. Injecter lentement 1 mL de la solution d’exosome dans la chambre d’échantillonnage du NTA à l’aide d’une seringue de 1 mL (voir le Tableau des matières).
   2. Réglez le type de procédure d’utilisation standard (SOP) de l’instrument sur EV-488 pour détecter la distribution granulométrique des exosomes.
3. Western blot (WB)
   1. Préparez le tampon de lyse en mélangeant le tampon de lyse du test de radio-immunoprécipitation (RIPA) : fluorure de phénylméthanesulfonyle (voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 100:1. Lyser les exosomes sur la glace pendant 20 min, en tourbillonnant toutes les 10 min.
   2. Centrifuger la solution à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Prélever le surnageant pour mesurer la concentration en protéines.
   3. Ajoutez 5 tampons de chargement SDS-PAGE (voir tableau des matériaux) au surnageant dans un rapport de volume de 1 : 4 et mélangez bien. Chauffer à 100 °C pendant 10 min pour dénaturer les protéines.
   4. Ajouter 5 μL d’un marqueur protéique pré-coloré de 180 kDa (voir le tableau des matériaux) et 10 μg d’échantillon dénaturé à un gel préfabriqué à 4 % à 20 % (voir le tableau des matériaux). Faites fonctionner le système d’électrophorèse (voir tableau des matériaux) à 60 V pendant 10 min, puis à 140 V pendant 50 min.
   5. Transférez les protéines du gel vers une membrane PVDF (voir Tableau des matériaux) pré-activée avec du méthanol. Effectuer le système d’électrophorèse à 290 mA pendant 90 min sur glace.
   6. Incuber la membrane PVDF dans une solution de lait écrémé à 5 % pendant 1 h. Laver trois fois avec une solution saline tamponnée avec tween (TBST, voir tableau des matériaux) pendant 5 min chacune.
   7. Découpez les bandes cibles en fonction de la position de la protéine. Incuber les bandes avec l’anticorps anti-souris CD63 et l’anticorps anti-souris Alix (voir le tableau des matériaux) dilués à la concentration appropriée selon les instructions du fabricant, et incuber toute la nuit à 4 °C.
   8. Lavez les bandes trois fois avec du TBST. Incuber avec des IgG anti-lapin conjuguées à la HRP (voir tableau des matériaux) à RT pendant 1 h. Ensuite, lavez à nouveau trois fois avec du TBST.
   9. Appliquez un réactif de détection super ECL (voir Tableau des matériaux) pour couvrir la surface des bandes, et exposez et capturez immédiatement les bandes à l’aide d’un imageur sur gel (voir Table des matériaux).
4. Microscopie confocale à balayage laser (CLSM)
   1. Cultivez 5 x 10⁵ DC dans une boîte confocale en utilisant 2 ml de milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (voir la table des matériaux). Ajouter des exosomes ou du exo@MN et incuber à 37 °C pendant 24 h.
   2. Ajouter une goutte de Hoechst 33342 dans chaque plat confocal et incuber dans l’obscurité à 37 °C pendant 20 min.
   3. Effectuez l’imagerie avec un CLSM (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’un objectif 60x. Appliquez une goutte d’huile d’immersion (voir tableau des matériaux) sur l’objectif et placez la parabole confocale sur la platine. Ajustez les axes x/y/z pour localiser le plan focal approprié des cellules.
   4. Lancez l’imagerie avec les canaux DAPI/TRITC/TD, sélectionnez une résolution de 1024 px et réglez le mode rapide sur 1/8 s.
5. Cytométrie en flux
   1. Cultivez les DC dans une plaque à 6 puits, chaque puits contenant 5 x 10⁵ cellules et 2 mL de milieu 1640. Ajouter des volumes égaux de solution de DPBS, d’exosomes, de micro-aiguilles sans exosomes et de exo@MN, respectivement, et incuber à 37 °C pendant 24 h.
   2. Transférez le fluide de chaque puits dans des tubes centrifuges. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à 4 °C et retirer le surnageant.
   3. Ajouter 0,5 μL d’anticorps FITC-CD11c, 2,5 μL d’anticorps APC-CD80 et 0,5 μL d’anticorps Pacific Blue I-A/I-E (voir le tableau des matières) à 100 μL de solution de BSA à 5 % (voir le tableau des matériaux). Mélangez bien, remettez les cellules en suspension et incubez sur un shaker dans de la glace et à l’obscurité pendant 20 min.
   4. Ajouter 1 mL de DPBS et centrifuger à 300 x g pendant 3 min à 4 °C, puis retirer le surnageant. Répétez le lavage deux fois pour éliminer les anticorps non liés, puis procédez à l’analyse des canaux fluorescents correspondants par cytométrie en flux (voir le tableau des matériaux).
      1. Tout d’abord, dans le diagramme de dispersion FSC-A/SSC-A, la population cellulaire principale est P1. Dans le nuage de points SSC-A/SSC-H de la population de cellules P1, tracez une barrière d’une région P2 carrée le long de la diagonale pour supprimer les cellules agrégées.
      2. Effectuez une analyse de fluorescence sur la population de cellules P2 à l’aide des canaux FITC, APC et Pacific Blue. Définissez la condition d’arrêt pour collecter 10 000 cellules dans la porte P2.

5. Analyse statistique

1. Exprimer les données quantitatives en moyens ±écarts-types (ET). Évaluez la signification statistique à l’aide de l’analyse du test t à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié. Considérez des valeurs p inférieures à 0,05 pour indiquer la signification statistique. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Résultats

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement des exosomes, la fabrication et la caractérisation de exo@MN patch. La figure 1 illustre l’organigramme du processus de fabrication de exo@MN patch. Les exosomes ont été mélangés avec du tréhalose et de l’HA, puis le mélange a été ajouté au moule à micro-aiguilles et centrifugé. Ce processus a facilité l’agrégation des exosomes à l’extrémité des aiguilles, favorisant une libération rapide. Après séchage, une solution PVP a été ajoutée et centrifugée pour remplir complètement le moule. Une fois le séchage terminé, le moule a été retiré pour obtenir les exo@MN patchs. La morphologie des micro-aiguilles a été caractérisée à l’aide de la microscopie et du MEB, comme le montre la figure 2. Les pointes de la exo@MN patch présentaient une forme conique disposée en un réseau de 10 x 10 avec des pointes d’aiguille pointues et intactes. La pointe de la micro-aiguille peut résister à une force de 2 N, ce qui lui permet de pénétrer à travers la barrière cutanée. De plus, la peau de porc a été utilisée comme substitut de la peau humaine pour simuler l’application de patchs exo@MN. Les patchs ont été pressés sur la peau du porc pour observer le temps de libération, les pointes des micro-aiguilles fondant complètement en 60 s. Les exo@MN plaques ont été dissoutes dans le DPBS et caractérisées, comme le montre la figure 3. Les images TEM ont capturé des vésicules avec des structures typiques en forme de coupe, compatibles avec la morphologie des exosomes. La distribution granulométrique de la solution exo@MN par NTA a révélé que les particules étaient principalement concentrées dans la plage de 50 à 250 nm. Cependant, il y avait aussi des particules plus grosses présentes, ce qui peut être attribué aux propriétés adhésives du matériau HA, provoquant l’agrégation d’exosomes. L’analyse WB des protéines CD63/Alix dans la solution exo@MN a démontré que exo@MN était capable de retenir partiellement les protéines des exosomes. La fonctionnalité biologique des exosomes libérés par le exo@MN a été validée dans la figure 4, en se concentrant sur l’absorption des exosomes par les cellules et l’activation des cellules dendritiques par rapport aux exosomes frais. Les images CLSM ont confirmé l’absorption efficace des exosomes frais et des exosomes dans le exo@MN par les DC. Des images représentatives et des statistiques proportionnelles de la cytométrie en flux démontrent que les exosomes dans exo@MN possèdent des fonctions biologiques qui favorisent l’activation des DC similaires aux exosomes frais.

Figure 2 : Caractérisation de exo@MN plaques. (A) Images stéréoscopiques de exo@MN plaques. Barre d’échelle = 400 μm. (B) Image MEB de exo@MN patchs. Barre d’échelle = 200 μm. (C) Les profils de charge en fonction du déplacement de exo@MN patch. (D) Images microscopiques de exo@MN plaques insérées dans la peau du porc à différents moments. Barre d’échelle = 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation des exosomes frais et des exosomes en exo@MN. (A) Morphologie des exosomes par MET. Barre d’échelle = 100 nm. (B) Distribution granulométrique des exosomes par NTA. (C) CD63 et Alix des exosomes par WB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Essais biologiques d’exosomes frais et d’exosomes en exo@MN. (A) Images CLSM d’exosomes absorbés par les DC. Barre d’échelle = 10 μm. (B) Graphiques représentatifs de l’activation des DC par cytométrie en flux. (C) Quantification du pourcentage de CD CD11c⁺CD80⁺MHCII⁺. Les données sont présentées en moyenne ± ET (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Actuellement, les principales méthodes d’isolement des exosomes comprennent l’ultracentrifugation, la centrifugation à gradient de densité, l’ultrafiltration, la précipitation, les billes magnétiques d’immunoaffinité et la microfluidique²⁴. En raison de la capacité de charge limitée des micro-aiguilles causée par leur petit espace de pointe d’aiguille, il est nécessaire d’augmenter la concentration d’exosomes pour charger davantage. Par conséquent, nous avons choisi l’ultrafiltration pour concentrer le surnageant de culture cellulaire, puis nous avons utilisé l’ultracentrifugation pour isoler les exosomes. La concentration d’exosomes a été augmentée par une petite quantité de liquide en suspension afin que les micro-aiguilles puissent être chargées avec des dizaines à des centaines de microgrammes d’exosomes. Cependant, cette méthode entraîne une présence importante de protéines dans la solution isolée de l’exosome. De plus, une perte substantielle d’exosomes se produit pendant le processus de centrifugation. De nos jours, l’une des limites de l’application thérapeutique des exosomes est le manque de méthodes efficaces pour isoler les exosomes de haute pureté et en grande quantité. Alors que le potentiel clinique des exosomes est de plus en plus exploré, il est nécessaire de développer des techniques plus avancées à l’avenir pour relever les défis associés à leur extraction.

La technologie clé de cette étude est la conception de micro-aiguilles à base d’exosomes. Afin de minimiser le gaspillage d’exosomes et d’obtenir des effets thérapeutiques plus forts, une méthode de moulage en deux étapes a été adoptée pour fabriquer exo@MN patchs. Le tréhalose a déjà été signalé comme un matériau approprié pour la conservation lyophilisée des exosomes²⁵, tandis que l’AH présente une excellente biocompatibilité, hydrophilie et fonctions dans l’inhibition de l’inflammation et la promotion de la réparation cutanée²⁶. La fabrication d’embouts d’aiguilles chargés d’exosomes à l’aide de ces deux matériaux aide à maintenir l’activité biologique des exosomes, permettant leur dissolution et leur libération rapides dans la peau. De plus, cette approche minimise le risque d’infection et contribue à la récupération rapide de la peau. Par centrifugation et séchage sous vide, les exosomes ont été concentrés à l’extrémité des micro-aiguilles. Compte tenu de l’incompatibilité de l’éthanol et du tréhalose, le PVP dissous dans de l’éthanol absolu a été choisi comme matériau de support. Cette méthode de fabrication en couches a efficacement amélioré l’efficacité de l’administration des exosomes.

La faible stabilité des exosomes in vitro, qu’ils soient stockés à 4 °C, 37 °C ou -80 °C, peut entraîner des modifications de la structure ou une dégradation des exosomes¹¹. Afin de résoudre ce problème, plusieurs études ont exploré les méthodes de stockage des exosomes, telles que la lyophilisation. La technologie des micro-aiguilles offre une autre stratégie novatrice. En séchant à RT, la technologie des micro-aiguilles peut améliorer la stabilité des exosomes et peut être directement utilisée pour l’administration d’exosomes sans autres traitements. De plus, le processus d’extraction des exosomes est complexe et sujet à la dégradation, ce qui rend les applications à grande échelle difficiles. Le stockage des exosomes extraits à l’aide de la technologie des micro-aiguilles ne simplifie pas les étapes d’extraction, mais réduit le nombre d’extractions nécessaires. Une seule extraction peut produire une grande quantité de patchs de exo@MN, qui peuvent être stockés pendant une période prolongée. L’utilisation de micro-aiguilles d’exosomes du même lot pour chaque traitement minimise l’impact potentiel des variations entre les différents lots sur les résultats thérapeutiques, améliorant ainsi la répétabilité et la fiabilité de la nanoplateforme d’exosomes²⁷. Cela offre plus de possibilités pour l’application clinique des exosomes.

Dans les recherches futures, il vaut la peine d’explorer des méthodes qui permettent un contrôle précis de la charge utile et minimisent les variations de médicament entre les pointes d’aiguille. Cela peut être accompli par l’optimisation des processus, la mise en œuvre de mesures de contrôle de la qualité et l’utilisation de techniques avancées. La prise en compte de ces aspects contribuera de manière significative à la mise au point de systèmes d’administration de médicaments fiables et cohérents.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100x solutions de pénicilline-streptomycine	Jrunbio Scientific	MA0110	Culture cellulaire
Marqueur protéique pré-coloré 180 kDa	Thermo	26616	Western blot
3 % Acétate d’uranyle	Henan Ruixin Fournitures expérimentales	GZ02625	Caractérisation morphologique des exosomes
Imprimante 3D	Technologie	BMF nanoArch S130	Moule Préparation
4 %&ndash ; 20 % gel préfabriqué	Genscript	ExpressPlus PAGE GEL	Western blot
5& fois ; Tampon de chargement SDS-PAGE	Titan	04048254	Western blot
Anticorps anti-souris Alix	Biolegend	12422-1-AP	blot
Anticorps anti-souris CD63	Biolegend	ab217345	Western blot
APC anti-souris CD80 anticorps	Biolegend	104713
Antibody Auto fine	coater ZIZHU	JBA5-100	Caractérisation morphologique d’un kit de dosage BCA à micro-aiguilles
	Beyotime	P0012	Dosage de la concentration en protéines
Centrifugeuse	Thermo Fisher	Muitifuge X1R pro	Centrifugeuse
à eau circulante Pompe à vide d’eau circulante	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	incubateur
CO2	Eppendorf	CellXpert C170	Culture cellulaire
Microscope confocal à balayage laser	Nikon	A1HD25	Imagerie par fluorescence
Maille de cuivre	Beijing Zhongjingkeyi Technology  ;	JF-ZJKY/300	Caractérisation morphologique des exosomes
D-(+)-tréhalose dihydraté	Aladdin	5138-23-4	Fabrication de micro-aiguilles  ;
Dulbecco' Eagle modifié' s milieu	Meilunbio	MA0212	Culture cellulaire
Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate	Meilunbio	MA0010	Culture cellulaire
Système d’électrophorèse	Bio-rad	PowerPac-basic	Western blot
Sérum fœtal bovin	Jrunbio Scientific	JR100	Culture cellulaire
FITC anti-souris Anticorps CD11c	Biolegend	117305
Anticorps Cytométrie en flux	BD	LSR Fortessa	Détection de fluorescence
Imageur gel	Cytiva	Amersham ImageQuant 800	Western blot
HRP conjugué anti-lapin IgG	CST	7074S	blot
Résine HTL	technologie BMF Préparation		moule
Acide hyaluronique (MW = 300 kDa)	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	Fabrication de micro-aiguilles  ;
Huile d’immersion	Nikon	MXA22168	Imagerie par fluorescence
Nettoyeur d’ions	JEOL	EC-52000IC	Caractérisation morphologique des exosomes
Microscope	Olympus	CKX53	Observer le processus de dissolution de la pointe d’une micro-aiguille
Cellule cancéreuse épithéliale de l’ovaire de souris ID8	MeisenCTCC	; CC90105	Culture cellulaire
Analyse de suivi des nanoparticules	Particle Metrix	ZetaView	Analyse de la taille des exosomes
Blue Anticorps anti-souris I-A/I-E Biolegend		107619	Anticorps
Fluorure de phénylméthanesulfonyle	Beyotime	ST507	Inhibiteurs de protéase
Nettoyeur de plasma	Hefei Kejing Technologie des matériaux	PDC-36G	Fabrication de micro-aiguilles  ;
Polydiméthylsiloxane	Dow Corning	9016-00-6	Préparation de moules
Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)	Aladdin	9003-39-8	Fabrication de micro-aiguilles  ;
Prisme  ;	GraphPad	Version 9	Analyse statistique
Membrane PVDF	Millipore	IPVH00010	Western blot
Centrifugeuse Quick-snap	Beckman	344619	Extraction d’exosomes
Tampon de lyse RIPA	Applygen	C1053	Membrane de lyse
Roswell park memorial institute 1640	Meilunbio	MA0548	Culture cellulaire
Microscope électronique à balayage	JEOL	JSM-IT800	Caractérisation morphologique de micro-aiguille
Stéréomicroscope	Olympus	SZX16	Caractérisation de la morphologie
Réactif de détection Super ECL	Applygen	P1030	blot
Tenducteur	Instron	68SC-05	Essais mécaniques
Microscope électronique à transmission	JEOL	JEM-2100plus	Caractérisation morphologique d’exosomes
Solution saline tamponnée Tris	Sangon Biotech	JF-A500027-0004	Western blot
Tween-20	Beyotime	ST825	blot
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Extraction d’exosomes
Tube d’ultrafiltration	Millipore	UFC910096	Concentration d’exosomes
Four de séchage sous vide	Shanghai Yiheng Technology	DZF-6024	Fabrication de micro-aiguilles Système de filtration sous
vide	Biosharp	BS-500-XT	Filtration