Profilage des réponses comportementales maternelles lors de l’imagerie du cerveau entier

Résumé

Voici un pipeline d’analyse vidéo qui permet de surmonter les défis de la surveillance comportementale dans les environnements IRM, permettant de détecter des réponses comportementales non instruites à des signaux externes. Cette analyse facilitera une compréhension plus complète des changements d’état interne évoqués et de l’activité à l’échelle du cerveau.

Résumé

Les progrès récents des outils d’imagerie du cerveau entier ont permis aux neuroscientifiques d’étudier comment l’activité cérébrale coordonnée traite les signaux externes, influençant les changements d’état interne et suscitant des réponses comportementales. Par exemple, l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) est une technique non invasive qui permet de mesurer l’activité cérébrale globale chez des souris éveillées et se comportant à l’aide de la réponse dépendante du niveau d’oxygénation du sang (BOLD). Cependant, pour bien comprendre les réponses BOLD évoquées par des stimuli externes, il est crucial que les expérimentateurs évaluent également les réponses comportementales pendant les balayages. L’environnement de l’IRM pose des défis à cet objectif, rendant incompatibles les méthodes couramment utilisées de surveillance comportementale. Ces défis comprennent (1) un champ de vision restreint et (2) la disponibilité limitée d’équipements sans composants ferromagnétiques. Nous présentons ici un pipeline d’analyse vidéo comportementale qui surmonte ces limites en extrayant des informations précieuses des vidéos acquises dans le cadre de ces contraintes environnementales, permettant ainsi l’évaluation du comportement lors de l’acquisition de données neuronales du cerveau entier. En utilisant des méthodes telles que l’estimation du flux optique et la réduction de la dimensionnalité, des différences robustes peuvent être détectées dans les réponses comportementales aux stimuli présentés lors des examens IRMf. Par exemple, des résultats représentatifs suggèrent que les vocalisations des petits de souris, mais pas les tons purs, évoquent des réponses comportementales significativement différentes chez les souris maternelles par rapport aux souris femelles vierges. À l’avenir, ce pipeline d’analyse comportementale, initialement conçu pour surmonter les défis des expériences d’IRMf, peut être étendu à diverses méthodes d’enregistrement neuronal, offrant une surveillance comportementale polyvalente dans des environnements contraints. L’évaluation coordonnée des réponses comportementales et neuronales offrira une compréhension plus complète de la façon dont la perception des stimuli conduit à la coordination de sorties comportementales complexes.

Introduction

Le suivi des réponses comportementales pendant les enregistrements neuronaux est essentiel pour comprendre l’activité coordonnée évoquée par le stimulus dans le cerveau. Dans le cas où les animaux ne sont pas censés répondre aux stimuli d’une manière spécifique et orientée vers un but, l’observation de comportements non instruits peut donner un aperçu de la façon dont les signaux externes informent leurs états internes ^1,2. Les progrès récents des outils de neuroimagerie, tels que l’imagerie calcique à grand champ et l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), ont permis aux neuroscientifiques d’étendre leurs recherches au-delà des régions cérébrales singulières. Cependant, pour parvenir à une compréhension plus complète de ces données neuronales de grande dimension, la capacité d’évaluer les sorties comportementales de ces modèles complexes doit également progresser en conséquence.

Les méthodes de pointe pour caractériser les comportements dictés par des tâches sont largement utilisées dans la recherche en neurosciences, notamment les capteurs de température et de pression pour détecter les reniflements ^3,4, les faisceaux lumineux pour détecter les léchages⁵ et l’estimation de la pose sans marqueur pour suivre les parties du corps prédéterminées⁶. Cependant, l’évaluation basée sur les données de modèles comportementaux non instruits reste un défi sur le terrain⁷. Alors que les méthodes d’analyse comportementale basée sur les données progressent rapidement, les méthodes existantes nécessitent généralement une puissance de calcul substantielle, un équipement spécialisé ou une vue particulièrement claire de l’animal 2,6,8,9. Vous trouverez ici un pipeline d’analyse vidéo comportementale qui se prête facilement à toutes les données de vidéographie et permet d’extraire des mesures comportementales précieuses des vidéos acquises lors d’une stimulation passive.

Ce pipeline d’analyse comportementale a été conçu pour être compatible avec l’acquisition coordonnée de données neuronales et vidéo chez des animaux fixés sur la tête exposés à un large éventail de stimuli externes et à de multiples environnements d’enregistrement, même ceux avec des contraintes considérables. Par exemple, l’environnement IRM pose des défis spécifiques à la surveillance comportementale, notamment un champ de vision restreint et une disponibilité limitée d’équipements sans composants ferromagnétiques. Ces contraintes rendent les méthodes couramment employées incompatibles, laissant des mesures telles que le mouvement de la tête (c’est-à-dire comment le cerveau se déplace entre les acquisitions de volume) parmi les moyens les plus accessibles mais limités d’évaluer les réponses corporelles pendant les scanners¹⁰. En surmontant ces limitations, ce protocole a facilité l’analyse des données de vidéographie compatibles avec l’IRM, montrant que les souris femelles ayant des expériences maternelles différentes présentent des réponses comportementales distinctes aux stimuli auditifs. Les mères et les vierges ont été présentées avec des stimuli auditifs lors des examens IRMf, y compris des vocalisations de petits en détresse (« appels de chiots ») et des tons purs. Ces stimuli ont été présentés passivement, donc sans aucune sortie comportementale instruite. Alors que l’on s’attendait à ce que les mères montrent des réponses accrues aux appels de petits par rapport aux vierges, il existe peu de littérature sur la façon dont les souris femelles réagissent aux signaux du nourrisson dans un environnement à tête fixe. Par conséquent, il n’y avait pas de sortie comportementale spécifique à suivre a priori, ce qui fait de cette expérience le test parfait pour les analyses comportementales proposées basées sur les données. En utilisant des méthodes telles que l’estimation du flux optique et la réduction de la dimensionnalité, des différences entre les groupes dans les réponses comportementales ont été détectées, à la fois en ampleur et en manifestation spatiale.

À l’avenir, l’évaluation coordonnée des réponses comportementales et neuronales peut être exploitée pour parvenir à une compréhension plus complète de la façon dont les stimuli externes modifient les états internes et informent des sorties comportementales complexes. Cette compréhension devrait s’étendre aux stimuli présentés en l’absence de tâches imposées et de comportements instruits. Le pipeline d’analyse présenté ici peut être étendu à diverses techniques d’enregistrement neuronal, offrant une surveillance comportementale polyvalente, même dans des environnements contraints.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Columbia, et toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives, réglementations et recommandations pertinentes. Les détails de l’équipement et des logiciels utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Logiciel

1. Téléchargez MATLAB depuis le site Web Mathworks.
   REMARQUE : le code qui comprend ce pipeline d’analyse est exécutable uniquement via MATLAB et a été spécifiquement écrit pour être compatible avec MATLAB 2023a.
2. Ce pipeline nécessite la Computer Vision Toolbox et l’Image Processing Toolbox dans MATLAB. Ajoutez les boîtes à outils aux add-ons MATLAB en cliquant sur Gérer les add-ons, Obtenir les add-ons, puis recherchez-les et ajoutez-les.
   REMARQUE : cinq scripts MATLAB sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires, intitulés comme suit : script1_videocoreg.m (Fichier de codage supplémentaire 1), script2_optflow_roiselect.m (Fichier de codage supplémentaire 2), script3_optflow_analysis.m (Fichier de codage supplémentaire 3), script4_optflow_pca.m (Fichier de codage supplémentaire 4) et script5_optflow_pca_analysis.m (Fichier de codage supplémentaire 5). Deux exemples de vidéos (Vidéo 1 et Vidéo 2) et leurs fichiers de chronométrage d’événements correspondants (Fichier supplémentaire 1 et Fichier supplémentaire 2) sont également fournis. Il est recommandé de parcourir d’abord le pipeline avec les données d’exemple.
   ATTENTION : Méfiez-vous des commentaires dans le code qui incluent un point d’exclamation, car il s’agit de zones qui nécessitent une action avant l’exécution. Par exemple, il y a des commentaires tels que « Modifiez le bloc de code ci-dessous ! » pour mettre en évidence les endroits où les modifications doivent être apportées pour s’adapter aux structures de fichiers, aux détails de l’expérience ou aux besoins d’analyse. Ces choix sont définis par défaut pour s’adapter aux deux exemples de vidéos fournis, mais nécessitent des ajustements une fois que l’on commence à exécuter le pipeline avec ses propres données.
3. Pour exécuter chaque section de chaque script, cliquez sur Exécuter et avancer dans le menu Éditeur .

2. Co-enregistrement vidéo

REMARQUE : Le premier script fourni dans ce pipeline d’analyse est script1_videocoreg.m (Supplementary Coding File 1), qui aligne spatialement toutes les vidéos les unes par rapport aux autres via la coregistration. Les entrées de ce script sont les vidéos brutes, et les sorties principales sont les vidéos transformées.

1. Modifiez les sections 1, 2, 3, 4, 5 et 6 du script pour les adapter aux structures de données.
2. Exécutez la section 1.
3. Choisissez trois points dans chaque vidéo à étiqueter, comme dans la figure 1A. Ces trois points seront utilisés pour co-enregistrer toutes les trames les unes par rapport aux autres. Exécutez la section 2 du script pour afficher la première image de chaque vidéo et utilisez la souris pour cliquer une fois sur les deux premiers points, puis double-cliquez sur le troisième point. Une fois les points de la dernière vidéo sélectionnés, appuyez sur Entrée.
4. Exécutez les sections 3 et 4.
5. Réglez le drapeau aligné sur 0 et exécutez la section 5. Ensuite, réglez le drapeau aligné sur 1 et exécutez à nouveau la section 5 .
6. Exécutez la section 6 et comparez la figure côte à côte résultante à la figure 1B. Toutes les aberrations observées dans l’image moyenne non alignée à gauche doivent être atténuées dans l’image moyenne alignée à droite.

3. Estimation du flux optique : champ de vision complet

REMARQUE : Afin d’évaluer le mouvement à travers les vidéos de balayage, le flux optique doit être estimé pour chaque vidéo transformée. Cela peut être fait pour le champ de vision complet (FOV) de chaque vidéo avec le script fourni script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2). Les entrées de ce script sont les vidéos transformées, et les sorties sont des matrices 3D indiquant l’amplitude du flux optique de chaque pixel dans le temps pour chaque vidéo. La figure 2A montre un exemple de trame avec des vecteurs de flux optique superposés en bleu, où la longueur de chaque vecteur représente l’amplitude relative du flux optique de ce pixel. Il s’est avéré plus efficace d’enregistrer les sorties sous forme de vidéos que de les enregistrer sous forme de matrices 3D.

1. Modifiez la section 1 du script là où cela est indiqué pour s’adapter aux structures de données.
2. Exécutez la section 1.

4. Sélection du retour sur investissement

REMARQUE : Les étapes d’analyse suivantes sont beaucoup plus gérables en termes de charge de calcul et de besoins de stockage de données en sélectionnant une région d’intérêt (ROI) dans le champ de vision complet sur laquelle concentrer l’analyse. Le ROI peut être sélectionné en fonction de l’expérience et des comportements d’intérêt ou par une approche plus data-driven. Pour les résultats représentatifs présentés ici, l’écart-type de l’amplitude du flux optique de chaque pixel dans le champ de vision complet a été calculé à l’aide du script script2_optflow_roiselect.m, Section 2 (Supplementary Coding File 2). Les entrées de cette partie du script sont les sorties de la section 1, et la sortie principale est une visualisation de l’écart-type de l’amplitude du flux optique sur tous les pixels de toutes les vidéos. Dans les résultats représentatifs présentés, le champ de vision du miroir a montré un écart-type de flux optique relativement élevé, ce qui a guidé le choix démontré du retour sur investissement.

1. Modifiez la section 2 du script là où cela est indiqué pour l’adapter aux structures de données.
2. Exécutez la section 2 et utilisez l’image résultante pour voir où le flux optique fluctue le plus considérablement dans les vidéos analysées. La figure 2B donne un exemple de cette image.

5. Quantification du flux optique : retour sur investissement

REMARQUE : La section 3 du script script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2) permet à l’utilisateur de sélectionner un retour d’intérêt à l’aide d’un outil de dessin et d’enregistrer les coordonnées des limites. Les entrées de cette partie du script sont les sorties de la section 1, et les sorties sont des vecteurs 1D indiquant l’amplitude moyenne du flux optique du retour sur investissement au fil du temps pour chaque vidéo.

1. Modifiez la section 3 du script là où cela est indiqué pour s’adapter aux structures de données et aux besoins d’analyse.
   REMARQUE : Il existe quelques options concernant la façon de procéder à la sélection du retour sur investissement. Choisissez une option :
   1. Option 1 : Analysez le champ de vision complet de la vidéo.
      1. Définissez l’indicateur selectROI sur 0 et définissez provideROI sur 0.
   2. Option 2 : Analyser un nouveau retour sur investissement.
      1. Définissez l’indicateur selectROI sur 1 et le paramètre provideROI sur 0. Modifiez ensuite newCoordsName.
   3. Option 3 : Analyser un retour sur investissement précédemment dessiné.
      REMARQUE : Ne sélectionnez cette option que si l’on a déjà exécuté ce code et créé un retour sur investissement.
      1. Définissez l’indicateur selectROI sur 0 et provideROI sur 1. Ensuite, modifiez inputCoords pour fournir un ensemble prédéterminé de coordonnées.
2. Exécutez la section 3.

6. Comparaison de l’amplitude du flux optique

REMARQUE : Le script fourni script3_optflow_analysis.m (Supplementary Coding File 3) nécessite le plus de spécialisation pour s’adapter aux données de l’utilisateur. Les principales entrées sont les vecteurs 1D indiquant l’amplitude moyenne du flux optique du retour sur investissement au fil du temps pour chaque vidéo, et lorsqu’elles sont combinées de manière appropriée avec les déclencheurs d’événements et les informations de groupe/condition, les principales sorties sont des comparaisons statistiques qui peuvent être adaptées aux intérêts d’analyse.

1. Modifiez les sections 1 à 3 du script pour les adapter aux structures de données et aux besoins d’analyse.
2. Définissez les indicateurs d’options d’analyse zsc, blrm, blzsc, demeanPerTrial et applyLPfilter sur 0 ou 1 comme vous le souhaitez dans la section 1. Dans les résultats représentatifs présentés, zsc, blrm et applyLPfilter ont été définis à 1, et toutes les autres options ont été définies à 0.
3. Réglez LPfilter sur un nombre représentant le filtre passe-bas souhaité en hertz (Hz). Dans les résultats représentatifs présentés, un filtre passe-bas de 5 Hz a été appliqué, car les réponses comportementales ne devaient pas fluctuer à un rythme supérieur à 5 Hz.
4. Exécutez les sections 1 à 3. La section 3 doit produire des graphiques pour les séries chronologiques de flux optique moyen de groupe, le flux optique cumulatif moyen de groupe et le flux optique cumulatif récapitulatif, y compris des graphiques tels que ceux illustrés à la figure 3. La section 3 peut être exécutée pour n’importe quelle combinaison de comparaisons de groupes/conditions.

7. Flux optique PCA

REMARQUE : Sur la base de l’estimation de l’amplitude du flux optique, les sorties de script2_optflow_roiselect.m (Fichier de codage supplémentaire 2) contiennent également des informations sur la distribution spatiale du flux optique image par image par vidéo. Afin de réduire la dimensionnalité de ces informations spatiales, le script fourni script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4)  effectue une analyse en composantes principales (ACP) sur le flux optique estimé. Les entrées principales sont les matrices de flux optiques 3D, préalablement enregistrées sous forme de vidéos pour chaque vidéo comportementale, et la sortie principale est un fichier .mat par vidéo contenant des informations sur le PC et les variances expliquées.

1. Modifiez la section 1 du script pour l’adapter aux structures de données et aux besoins d’analyse.
2. Définissez les indicateurs d’options d’analyse stimnum, dsfactor et fnfactor comme vous le souhaitez dans la section 1. Dans les résultats représentatifs présentés, chaque type de stimulus a été analysé séparément, et la valeur par défaut de 1 a été maintenue pour dsfactor et fnfactor, ce qui a entraîné l’absence de sous-échantillonnage dans l’espace ou dans le temps.
3. Exécutez la section 1.

8. Comparaison de l’ACP à flux optique

REMARQUE : Le script fourni script5_optflow_pca_analysis.m (Supplementary Coding File 5) effectuera des comparaisons exploratoires des résultats de l’ACP entre les groupes. Les principales entrées sont le PC spécifique au stimulus et les informations de variance expliquée obtenues à partir de script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4), et les principales sorties sont des cartes thermiques statistiquement seuillées décrivant les charges du premier PC, bien que d’autres PC puissent également être analysés avec ce script.

1. Modifiez la section 1 du script pour l’adapter aux structures de données et à l’analyse.
2. Exécutez la section 1 et la section 2.
3. Modifiez les entrées de la section 3 , en particulier les variables group et myTitle , pour refléter l’analyse de groupe souhaitée, ainsi que threshT. threshT représente le seuil de statistique T au-dessus duquel les résultats seront considérés comme significatifs, qui peut être calculé sur la base des tables de valeurs T à p disponibles publiquement et des degrés de liberté.
4. Exécutez la section 3 pour chaque groupe d’intérêt. Le code doit produire une carte statistique récapitulative de groupe, telle que celles illustrées dans les panneaux de gauche et du centre de la figure 4. Ajustez la plage de caxis, et donc les limites de la barre de couleur, comme vous le souhaitez pour la visualisation.
5. Modifiez les entrées de la section 4 , en particulier les variables mag et myTitle pour refléter la comparaison de groupe souhaitée, ainsi que threshT. threshT représente le seuil de statistique T au-dessus duquel les résultats seront considérés comme significatifs, qui peut être calculé sur la base des tables de valeurs T à p disponibles publiquement et des degrés de liberté.
6. Exécutez la section 4 pour chaque comparaison de groupe d’intérêt. Le code doit produire une carte statistique de comparaison de groupe, comme illustré dans le panneau de droite de la figure 4. Ajustez la plage de caxis, et donc les limites de la barre de couleur, comme vous le souhaitez pour la visualisation.

Résultats

Pour démontrer le potentiel de ce pipeline d’analyse, des vidéos comportementales de souris femelles attachées à la tête – en particulier des mères et des vierges – ont été acquises pendant que les souris étaient présentées avec des stimuli auditifs lors d’examens d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf). Les stimuli consistaient en des appels de chiots et des tons purs présentés passivement, donc sans aucune sortie comportementale instruite. Les appels des petits étaient des enregistrements de vocalisations ultrasonores émises par des bébés souris âgés de 6 jours temporairement isolés de leur nid. Ces appels de chiots suscitent généralement l’acte maternel de récupération de chiot, dans lequel la mère localise, se déplace vers, enquête, puis ramasse le chiot et le ramène à la sécurité du nid - un comportement que les femelles vierges ne présentent généralement^pas. Des travaux antérieurs ont montré que les cris des petits suscitent une activité évoquée robuste dans le cortex auditif primaire des mères, mais pas chez les vierges, tandis que les réponses aux tons purs ne montrent aucune différence entre les groupes¹². Par conséquent, on a émis l’hypothèse que des différences entre les groupes dans les réponses comportementales aux appels de petits, mais pas des tons purs, seraient identifiées. Cependant, il existe peu de littérature sur les comportements spécifiques des souris femelles en réponse aux signaux des petits dans un environnement fixé par la tête. Par conséquent, aucun résultat comportemental spécifique n’était attendu, ce qui fait de cette expérience le test parfait pour les analyses comportementales basées sur les données proposées.

Au cours de huit jours, tous les animaux ont été progressivement habitués à la manipulation de l’expérimentateur, à la fixation de la tête et à l’environnement IRM. L’habituation à la fixation de la tête et à l’environnement expérimental est cruciale pour évaluer les réponses comportementales aux stimuli présentés. S’ils ne sont pas correctement habitués à l’environnement, les animaux peuvent ne montrer que des réponses de stress, effaçant tous les effets induits par le stimulus qui pourraient autrement être analysés par la vidéographie.

Bien que la configuration de l’appareil comportemental soit généralement la même pour chaque session d’acquisition de données, il est possible que le champ de vision de la caméra (FOV) se déplace légèrement chaque fois qu’un animal est fixé la tête pour les examens IRMf (voir les exemples de FOV dans la figure 1A). Cela était probablement dû à de légers changements dans le positionnement du support de caméra, ainsi qu’à des variations individuelles dans la fixation du crâne du poteau de tête pour chaque animal. Par conséquent, les vidéos des scans devaient être alignées les unes avec les autres via un co-enregistrement linéaire pour permettre la comparaison des informations spatiales qu’elles contenaient entre les scans et les animaux. La coregistration a été adaptée aux données représentatives. Par exemple, lors d’une journée de balayage standard, 3 à 4 balayages ont été acquis par animal, ce qui a donné lieu à 3 à 4 vidéos par animal et par jour. Entre chaque balayage, il n’y avait aucun mouvement des composants du berceau, y compris les composants de la caméra et de la fixation de la tête. Ainsi, une fois que la transformation du co-enregistrement pour une vidéo par animal et par jour a été déterminée, elle a pu être appliquée aux 2 ou 3 autres vidéos de cet animal le même jour. Bien que cela ait permis de gagner du temps lors de l’étape de co-enregistrement de ce pipeline, les transformations spatiales peuvent également être calculées pour chaque vidéo individuellement, si nécessaire. Trois caractéristiques présentes dans chaque vidéo ont été choisies comme points pour l’étiquetage et le calcul de la transformation spatiale. Dans les données représentatives présentées, ces trois points étaient le centre du poteau de tête, la vue frontale de l’œil droit de l’animal et la vue de profil de l’œil droit de l’animal (visible dans un miroir placé à un angle de 45 degrés). Des exemples de coregistration vidéo sont illustrés à la figure 1A,B, montrant l’image moyenne calculée à partir de toutes les vidéos prises au cours de cette expérience, avant et après le coregistration, pour démontrer l’effet de cette étape.

Ce pipeline s’appuie fortement sur le flux optique, une méthode de vision par ordinateur utilisée pour estimer le mouvement des objets dans une vidéo en estimant leurs vitesses apparentes entre des images consécutives¹³. Le flux optique a été choisi parce qu’il permet de quantifier le mouvement – un proxy des réponses comportementales – sans parties du corps prédéterminées ou actions d’intérêt. De plus, cette méthode s’est prêtée à la qualité d’image limitée des vidéos représentatives, qui ont été acquises avec la seule caméra compatible IRM accessible au moment de l’expérience. Dans ce pipeline, l’algorithme de Horn-Schunck d’estimation du flux optique global et dense est utilisé ; cependant, d’autres algorithmes, tels que l’algorithme de Lucas-Kanade, peuvent être facilement utilisés avec de légères modifications des scripts MATLAB fournis 14,15,16. La figure 2A représente un exemple d’image vidéo avec des vecteurs de vitesse de flux optique relatifs superposés pour chaque pixel. Notez que les vecteurs les plus grands apparaissent dans des zones où l’on s’attendrait à se déplacer, comme le museau et les pattes de l’animal.

Alors que le pipeline estimait le flux optique pour toutes les vidéos sur l’ensemble du FOV, les étapes d’analyse restantes ont été rendues beaucoup plus gérables en termes de charge de calcul et de besoins de stockage de données en sélectionnant une région d’intérêt (ROI) dans le FOV. Le ROI peut être sélectionné en fonction de l’expérience et des comportements d’intérêt prédéterminés ou par une approche plus data-driven. Étant donné que les données représentatives ne comprenaient pas de sortie comportementale spécifique à suivre a priori, une approche axée sur les données a été adoptée. L’écart-type de l’amplitude du flux optique a été calculé sur toutes les vidéos à chaque pixel, comme le montre la figure 2B. Les zones où l’écart-type était le plus élevé comprenaient les contours de l’animal, comme autour de l’œil et du museau, ce qui donne confiance que les fluctuations du flux optique observées étaient guidées par le mouvement de l’animal et non par le bruit dans les vidéos. Les zones de moindre écart-type comprenaient les contours du berceau, qui pouvaient être le résultat de petites vibrations dans l’appareil photo et le berceau qui se produisaient pendant le balayage. L’environnement IRM est inévitablement soumis à des vibrations lors de l’acquisition de données en raison de la commutation des gradients, ce qui peut se manifester par des fluctuations de flux optiques observées dans les composants réfléchissants du berceau. Heureusement, ces vibrations sont constantes tout au long de l’acquisition des données, donc indépendantes de la condition de stimulus et ne devraient pas affecter les résultats de l’analyse comportementale. Des écarts-types de flux optique particulièrement élevés ont été observés dans les pixels du miroir, correspondant à la vue de profil du visage de l’animal, ce qui a guidé la sélection du ROI pour les données représentatives. C’était également une région où l’on pouvait s’attendre à des réponses comportementales, telles que le fouet et le reniflement, dans le cadre du répertoire comportemental typique des souris femelles à la recherche d’un chiot isolé émettant des cris de^chiot17.

Après avoir choisi un retour sur investissement et extrait l’amplitude moyenne du flux optique par image pour toutes les vidéos, le flux optique pendant les périodes d’intérêt a pu être comparé entre les groupes et les conditions. Notez que les 20 premières seconde(s) du vecteur de flux optique de chaque vidéo ont été masquées pour la stabilisation de la luminosité ; Cependant, cela peut être ajusté pour répondre aux besoins expérimentaux. Pour chaque vidéo, le vecteur de flux optique par image pour le retour sur investissement choisi a été noté Z, puis, suite à des travaux antérieurs sur la classification des expressions faciales, il a été filtré passe-bas à 5 hertz (Hz) pour tenir compte du fait que la fréquence d’images de 30 Hz de la caméra est plus rapide que toutes les fluctuations comportementales attendues². Enfin, les vecteurs Z et filtrés ont été regroupés en époques de présentation du stimulus pour évaluer l’effet de la présentation du stimulus sur le flux optique. Pour chaque époque, le signal de base moyen avant le stimulus a été soustrait pour normaliser le flux optique à la période précédant le stimulus. La figure 3A montre un exemple de série chronologique de flux optique pour deux vidéos, l’une mère et l’autre vierge, avec des données de groupe récapitulatives dans la figure 3B-E. Les figures 3B et 3D montrent le flux optique cumulé au fil du temps pendant la présentation du stimulus par rapport à la ligne de base, tandis que les figures 3C et 3E résument le flux optique cumulé 2,5 s après le début du stimulus. Le flux optique cumulatif a été calculé pour capturer le mouvement global au fil du temps sans supposer que les réponses comportementales spontanées se produiraient de manière verrouillée dans le temps. Dans l’ensemble, ces résultats représentatifs démontrent que les cris de petits, mais pas les tons purs, ont suscité des réponses comportementales significativement différentes entre les souris maternelles et les souris femelles vierges, comme prévu (test U de Mann-Whitney entre groupes : appels de petits : p = 0,026 ; tons purs : p = 0,093). Cependant, cet effet de stimulus n’a pas survécu à une ANOVA à 2 voies, contrairement à l’effet de groupe (stimulus : F(1,10) = 0,19, p = 0,67 ; groupe : F(1,10) = 8,61, p = 0,015). Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que les mères ont montré un mouvement évoqué par stimulus plus élevé que les vierges, la réponse maternelle aux appels de chiots étant plus cohérente qu’aux tons purs. Cela peut refléter une attention ou un stress accrus chez les mères, ainsi que la pertinence comportementale des appels de petits, qui, contrairement aux tons purs, évoquent la réponse de récupération des petits chez les mères dans des contextes naturalistes. Pris ensemble, ces résultats représentatifs suggèrent que l’estimation du flux optique lors de la présentation d’un stimulus externe peut extraire des informations concernant des réponses comportementales nuancées et spontanées.

Enfin, une analyse plus exploratoire a été menée pour découvrir les caractéristiques spatiales du comportement capturé dans les données représentatives. Pour déterminer quels pixels du ROI ont fluctué de manière coordonnée lors de la présentation du stimulus, une analyse en composantes principales (PCA) a été effectuée sur les informations de flux optique spatial au fil du temps. Cette analyse a révélé les pixels qui contribuaient le plus au premier PC, ainsi que les pixels qui présentaient des différences de groupe pour chaque condition de stimulus, comme le montre la figure 4. Les panneaux les plus à droite de la figure 4A, B suggèrent que les mères ont montré plus de mouvement dans le nez que les vierges lors de la présentation des deux types de stimulus. Dans les deux groupes et les deux conditions de stimulus, le premier PC a expliqué 5,41 % ± 0,59 % de la variance totale dans l’analyse du flux optique. Bien que le retour d’intérêt miroir ait été maintenu pour cette partie de notre analyse, les analyses futures pourraient s’étendre à une partie plus large du champ de vision afin de caractériser les mouvements coordonnés au-delà du visage en réponse à des stimuli. Par exemple, la comparaison des mouvements des pattes peut révéler des différences plus significatives entre les groupes, étant donné que les appels de petits initient généralement la récupération des petits chez les mères mais pas chez les vierges, et que les pattes pouvaient bouger plus librement que la tête de l’animal.

Bien que les résultats représentatifs jusqu’à présent suggèrent que ce pipeline peut évaluer les réponses comportementales non instruites à des stimuli externes dans des environnements de vidéographie contraints, la question de savoir si les fluctuations observées du flux optique reflètent vraiment un comportement animal significatif. Pour répondre à cette question, un ensemble de données de validation distinct a été analysé à l’aide du même pipeline. Dans une expérience distincte, des souris mâles restreintes à l’eau ont été entraînées à associer un signal lumineux à l’administration d’une récompense d’eau de 6 μL (« récompense élevée ») ou de 1 μL (« récompense faible »). Notamment, contrairement à l’expérience de stimulation auditive, cette expérience avait une lecture comportementale a priori : le taux de léchage. Un lickomètre a été établi par détection vidéo des coups de langue, facilitée par l’analyse de la luminosité des pixels à proximité du jet d’eau. La lecture comportementale fournie par le lickomètre pourrait ainsi être utilisée pour comparer la lecture comportementale de ce pipeline fournie par l’estimation du flux optique, soutenant ainsi sa validité dans la détection des comportements spontanés. Suite à la co-inscription vidéo, à l’estimation du flux optique, à la sélection du retour sur investissement (contenant à nouveau le champ de vision miroir) et à la quantification du flux optique, la comparaison de l’amplitude du flux optique a révélé une différence significative entre les réponses comportementales aux récompenses élevées et faibles. Les résultats de cette analyse sont présentés dans les figures 5A, B, où la figure 5A montre la série chronologique moyenne du groupe, et la figure 5B résume le flux optique cumulatif 2,5 s après le début du stimulus (test de Wilcoxon à rang signé apparié entre les conditions : p = 0,031). Notez que les valeurs de flux optique étaient plus grandes par rapport au comportement spontané enregistré dans les données représentatives, soulignant davantage le défi d’évaluer les réponses comportementales non instruites et nuancées. La figure 5C illustre le taux de léchage réel enregistré par le lécheur pour chacune des deux conditions de récompense, tandis que la figure 5D montre qu’un plus grand nombre de léchages sont enregistrés pendant la condition de récompense élevée par rapport à la condition de récompense faible dans les 2,5 s suivant l’administration de la récompense (test de Wilcoxon de rang signé apparié entre les conditions : p = 0,031). Dans l’ensemble, les deux analyses ont révélé une tendance similaire dans la comparaison des réponses de récompense élevée et faible, validant le pipeline d’analyse vidéo présenté pour capturer des différences significatives dans le comportement des animaux dans toutes les conditions.

Dans l’ensemble, les résultats représentatifs présentés ici suggèrent que la présentation des cris de petits a suscité des réponses significativement différentes chez les souris maternelles par rapport aux souris femelles vierges, contrairement aux tons purs. L’analyse d’un ensemble de données de validation confère la confiance que les différences observées dans le flux optique reflètent des différences significatives dans les réponses comportementales aux stimuli externes.

(A) Exemples de co-enregistrement vidéo représentant des caractéristiques prédéterminées (centre du poteau de tête, vue frontale de l’œil droit, vue de profil de l’œil droit) étiquetées en trois images, chacune tirée de différentes vidéos d’animaux différents. Notez dans la superposition comment les trois points n’étaient pas alignés, démontrant comment la configuration comportementale a légèrement changé entre les sessions d’acquisition de données. (B) L’image moyenne sur les 10 dernières secondes de chaque vidéo avant (à gauche) et après (à droite) la co-inscription vidéo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Estimation du flux optique. (A) Exemple de trame avec les vecteurs de flux optiques relatifs superposés en bleu. (B) L’écart-type moyen au pixel près du flux optique sur l’ensemble des vidéos. Le retour d’intérêt choisi autour de la vue de profil du visage de l’animal via le miroir est décrit en magenta. La barre de couleur correspond à l’écart type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Visualisation et comparaison du flux optique entre les groupes et les conditions. (A) Exemples de séries temporelles de flux optique marquées Z et filtrées passe-bas 5 Hz pour une vidéo d’une mère et une vidéo d’une vierge. (B) et (D) Flux optique cumulatif mesuré pendant la période de stimulus des cris des petits (B) et des tons purs (D). L’ombrage représente l’erreur type de la moyenne (SEM). (C) et (E) Flux optique cumulatif pendant les 2,5 premières secondes de présentation du stimulus pour les appels de petits (C) et les tons purs (E). * Indique p < 0,05, test U de Mann-Whitney entre groupes (appels de petits : p = 0,026 ; tons purs : p = 0,093), N = 6 par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Comparaison du PC₁ entre les groupes. (A,B) Cartes illustrant les charges de la première composante principale (PC₁) du flux optique pendant les appels des petits (A) et les tons purs (B) entre les groupes, statistiquement seuillées à p < 0,05 sans correction pour les comparaisons multiples. La carte thermique indique le degré de contribution de la fluctuation du flux optique de chaque pixel au PC₁ par rapport aux autres pixels. Un petit texte noir indique le pourcentage de variance expliqué par le PC₁ (appels de chiots de mères : 4,95 % ± 0,72 % ; appeaux de chiots vierges : 4,44 % ± 0,59 % ; tons purs de mères : 4,95 % ± 0,39 % ; tons purs de vierges : 4,72 % ± 1,24 % (moyenne ±écart-type)). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Validation du pipeline d’analyse comportementale. (A) Séries temporelles moyennes de flux optique, notées Z moyennes, soustraites de la ligne de base pré-stimulus et filtrées passe-bas 5 Hz lors de l’administration de récompenses élevées et faibles. L’ombrage représente le MEB, la ligne verticale blanche indique la livraison de la récompense et les astérisques rouges indiquent des artefacts de flux optique temporaires dus à l’apparition et au décalage du repère lumineux. (B) Résumé du flux optique cumulé au cours des 2,5 premières s après la livraison de la récompense. * Indique p < 0,05, test de Wilcoxon apparié entre les conditions (p = 0,031). (C) Taux de léchage moyen, obtenu par lickomètre, lors de l’administration de récompenses élevées et faibles. L’ombrage représente le SEM, et la ligne verticale blanche indique la remise des récompenses. (D) Nombre de coups de langue enregistrés au cours des 2,5 premières secondes suivant l’attribution de la récompense. * Indique p < 0,05, test de Wilcoxon à rang signé apparié entre les conditions (p = 0,031), N = 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Exemple de vidéo 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Exemple de vidéo 2. PCR_Br014_20231015_1722_output.avi. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Fichier supplémentaire 1 : Fichier de chronométrage d’événement pour la vidéo 1. PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.mat. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Fichier de chronométrage d’événement pour la vidéo 2. PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.mat. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire de codage 1 : script1_videocoreg m. Ce script aligne spatialement toutes les vidéos les unes sur les autres via la coregistration. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire de codage 2 : script2_optflow_roiselect h Ce script estime le flux optique pour le champ de vision complet de chaque vidéo transformée et permet de sélectionner un retour sur investissement pour le reste du pipeline. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 3 : script3_optflow_analysis h Ce script compare l’amplitude du flux optique dans différents groupes/conditions pour le retour sur investissement choisi. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 4 : script4_optflow_pca h Ce script effectue une ACP sur le flux optique estimé du ROI choisi. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire de codage 5 : script5_optflow_pca_analysis h Ce script compare les résultats de l’ACP entre les groupes/conditions pour le retour sur investissement choisi. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le pipeline d’analyse comportementale présenté permet d’extraire des informations précieuses à partir de vidéos d’animaux présentant des comportements non instruits en réponse à des stimuli présentés passivement. Ces vidéos comportementales représentatives ont été acquises en conjonction avec des données d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) du cerveau entier, pour lesquelles de multiples contraintes ont été surmontées afin de capturer les réponses comportementales dans l’environnement IRM. En utilisant la méthode d’estimation du flux optique, des différences dans la façon dont les mères et les vierges réagissent aux appels des petits – mais pas aux tons purs – ont été révélées, soutenant l’hypothèse initiale 13,14,15,16. Profitant de la réduction de la dimensionnalité de l’information du flux optique, ce résultat a été étendu à une analyse exploratoire de la distribution spatiale de ces comportements.

Ce pipeline d’analyse se prête largement à divers paradigmes expérimentaux. Il est complètement indépendant du type de données neuronales acquises et ne nécessite pas de puissance de calcul excessive ou d’équipement spécialisé. La principale exigence expérimentale est que les données de vidéographie soient enregistrées avec les horodatages pertinents des événements de présentation des stimulus. De plus, en fournissant les scripts MATLAB utilisés pour effectuer les analyses démontrées, la mise en œuvre de ce pipeline devrait être assez simple, même pour ceux qui ont une expérience minimale de MATLAB. Les étapes générales, telles que décrites dans le protocole, comprennent le co-enregistrement vidéo, l’estimation du flux optique, la sélection de la région d’intérêt (ROI), la quantification du flux optique spécifique au ROI, la comparaison de l’amplitude du flux optique, l’analyse en composantes principales (PCA) et la comparaison PCA. À chaque étape, le pipeline peut être modifié pour répondre aux besoins expérimentaux et analytiques, comme indiqué dans le protocole et mis en évidence par des commentaires tout au long du code.

Il y a plusieurs limitations à garder à l’esprit lors de l’utilisation du pipeline d’analyse vidéo présenté. Tout d’abord, la conception de l’appareil comportemental doit être soigneusement étudiée. S’il n’est pas clair quelles réponses comportementales peuvent être attendues, il pourrait être bénéfique d’avoir autant de points de vue que possible sur l’animal. Par conséquent, il est recommandé d’installer un ou plusieurs miroirs pour capturer simultanément les vues de face et de profil de l’animal, comme le montrent les exemples de séquences vidéo de la figure 1A. Deuxièmement, il est recommandé que l’éclairage fourni pour l’acquisition vidéo soit suffisamment lumineux pour voir toutes les caractéristiques pertinentes du champ de vision (FOV), mais pas au point d’atteindre la saturation. Dans la figure 1A, on peut observer que la vue frontale du nez de la souris est à un point de quasi-saturation, ce qui rend difficile la capture des fluctuations de luminosité qui indiqueraient un mouvement. Cela peut avoir contribué à l’absence de variation du flux optique observée dans cette partie du champ de vision, comme le montre la figure 2B. Heureusement, la vue de profil du nez n’a pas rencontré ce problème, ce qui a permis d’analyser le retour sur investissement du miroir. De plus, la possibilité d’une saturation doit être envisagée si des stimuli visuels sont impliqués dans l’expérience. Dans l’expérience de l’ensemble de données de validation, un signal lumineux utilisé pour signaler la livraison d’une récompense d’eau a introduit une saturation temporaire dans les vidéos acquises, posant un artefact temporaire dans l’estimation du flux optique. Cet artefact peut être observé dans la figure 5A, où les deux pics aigus dans les traces de flux optique pour les deux conditions de récompense s’alignent exactement avec le moment où le signal lumineux a été allumé et éteint. Cet artefact a rendu ces courtes fenêtres temporelles difficiles à analyser avec le pipeline présenté, et s’il n’avait pas été présent, les résultats présentés à la figure 5B auraient pu être encore plus significatifs. L’éclairage constant de la scène est une hypothèse nécessaire pour la plupart des algorithmes de flux optique^14,16. Par conséquent, ce pipeline d’analyse vidéo n’est pas recommandé pour les expériences dans lesquelles l’éclairage de l’environnement change radicalement, à la fois au sein et entre les essais. Troisièmement et enfin, l’habituation suffisante des animaux à l’environnement d’enregistrement est un élément clé de toute expérience qui tirera parti de ce pipeline. S’ils ne sont pas correctement habitués, les animaux peuvent montrer des réponses de stress importantes, effaçant tous les effets subtils induits par les stimuli qui pourraient autrement être analysés par l’analyse vidéo.

À l’avenir, ce pipeline d’analyse comportementale peut être utilisé pour faciliter l’évaluation coordonnée des réponses comportementales et neuronales enregistrées simultanément. Comme nous l’avons montré, l’évaluation quantitative des comportements non instruits permet d’évaluer la saillance des stimuli dans un environnement d’enregistrement complexe, ainsi que de tester différentes réponses comportementales dans des groupes et des conditions expérimentaux. D’autres analyses peuvent être menées pour explorer les différences individuelles ou les tendances des réponses comportementales essai par essai, de sorte que l’activité neuronale correspondante puisse être examinée. De plus, l’intégration de l’ACP pour obtenir des informations spatiales sur le mouvement évoqué par le stimulus peut être utilisée pour déterminer si des types spécifiques de séquences comportementales observées lors de la présentation du stimulus diffèrent entre les groupes et les conditions. Ce pipeline d’analyse peut être facilement étendu à diverses méthodes d’enregistrement neuronal, offrant une surveillance comportementale polyvalente dans des environnements contraints. En étudiant comment les stimuli externes sont représentés à la fois dans le cerveau et le comportement, les chercheurs sont prêts à obtenir une compréhension plus complète de la façon dont la perception des stimuli affecte les états internes et leurs manifestations externes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MATLAB Computer Vision Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
MATLAB Image Processing Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
Logiciel MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
caméra compatible MR " 12M-i" avec éclairage LED intégré	MRC Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf