Analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’ADN réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’ADN naissant associé aux protéines

Résumé

L’enrichissement et le séquençage de l’ADN naissant associé aux protéines (eSPAN) ont été développés pour détecter l’abondance relative d’une protéine associée à la chromatine sur deux brins d’ADN réplicatifs, révélant ainsi une compréhension moléculaire de la réplication de la chromatine et de ses processus couplés. Ce protocole décrit les procédures eSPAN chez les cellules souches embryonnaires (ES) de levure et de souris.

Résumé

La duplication du génome est orchestrée par des protéines réplicantes, y compris les hélicases, qui déroulent l’ADN double brin en brins simples antiparallèles individuels, chacun nécessitant des modes de réplication distincts : continu (avant) et discontinu (retard). Comprendre les interactions des protéines associées à la chromatine avec les brins d’ADN réplicatifs in vivo est crucial pour élucider les mécanismes d’assemblage de la chromatine et de réparation de l’ADN couplés à la réplication de l’ADN. Ce protocole présente la méthode d’enrichissement et de séquençage de l’ADN naissant associé aux protéines (eSPAN), conçue pour quantifier les niveaux relatifs de protéines sur les brins d’ADN naissants et en retard aux fourches de réplication. La procédure eSPAN commence par l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP, chez la levure) ou clivage sous cibles et la marquage (CUT&Tag ; dans les cellules de mammifères) d’une protéine d’intérêt, suivie d’un enrichissement de l’ADN naissant associé à une protéine par immunoprécipitation par bromodéeoxyuridine (BrdU). Un séquençage de nouvelle génération spécifique au brin est appliqué à l’ADN isolé du ssDNA. Cette technique peut être utilisée pour déterminer si une protéine est enrichie aux fourches de réplication avant ou en retard. L’eSPAN fournit la préférence de brin génomique pour les protéines associées à la chromatine, y compris les histones aux fourches de réplication.

Introduction

Chez les organismes eucaryotes, la duplication du génome est initiée à partir de plusieurs sites appelés origines de réplication, où le complexe de reconnaissance des origines (ORC) se lie et initie la machinerie protéique de recrutement, y compris l’hélicase CMG, pour initier la réplication de^{l’ADN 1}. La machine à réplisomes à chaque origine de réplication forme deux fourches de réplication qui se déplacent^{bidirectionnellement 2,3}. Les fourches de réplication jumelles répliquent les deux brins parents d’ADN par la synthèse continue du brin principal et la synthèse discontinue du brin retardatif. Étant donné cette nature asymétrique de chaque fourche de réplication, les composants de réplication, y compris les ADN polymérases sur les brins avant et en retard, sont différents. Des analyses génétiques antérieures basées sur des ADN polymérases mutantes montrent que la ε de l’ADN Pol et la δ de l’ADN Pol sont les principales polymérases responsables respectivement de la réplication des brinages de retard et de retard, ^4,5. Plusieurs méthodes ont été développées pour détecter la préférence de brin de la polymérase d'ADN, notamment Pu-seq ^6,7, HydEn-seq⁸, et emRiboSeq ou RiboSeq ^9,10. Ces méthodes génétiques pour disséquer la spécificité du brin se limitent aux ADN polymérases et nécessitent d’introduire des mutations sur chaque^protéine 4,5,11,12. Suivre l’association de toute protéine cible avec les brins avancés et retardés des fourches de réplication de l’ADN fournira des informations précieuses sur la réplication de l’ADN. Dans ce domaine, nous avons d’abord développé la technique eSPAN (enrichissement et séquençage de l’ADN naissant associé à une protéine, Figure 1) dans des cellules de levure. En tant qu’étude de preuve de principe, nous avons d’abord montré que les δ Pol et Pol δ sont enrichies respectivement sur les brins avant et en retard. Nous avons également découvert la préférence de brin pour les composants clés de la réplication de l’ADN, notamment l’hélicase réplicative de l’ADN, la protéine de liaison à l’ADN simple brin (protéine de réplication A), ainsi que la lampe à antigène nucléaire cellulaire proliférant (PCNA) ainsi que son facteur de réplication chargeur C (RFC⁾¹³. Il est important de noter que nous et d’autres avons utilisé cette méthode pour découvrir les mécanismes du transfert parental des histones, un processus qui a été intractable pendant plus de 4 décennies^{14, 15, 16, 17}.

La méthode eSPAN comprend deux étapes séquentielles : l’enrichissement de la protéine cible par ChIP¹⁸ ou CUT&^{Tag 19} et l’enrichissement de l’ADN naissant associé à la protéine par immunoprécipitation BrdU. Dans une souche de levure standard (W303 ou S288C), les BrdU ou EdU extracellulaires ne peuvent pas pénétrer dans les cellules ni s’incorporer dans les chromosomes. Ces souches manquent d’un transporteur nucléoside approprié pour l’absorption de la thymidine ainsi que de la thymidine kinase nécessaire pour phosphoryler la thymidine en TMP, qui convertit BrdU (ou EdU) en BrdUMP (EdUMP). L’expression du transporteur nucléoside équilibré humain 1 (hENT1) et du virus de l’herpès simplex thymidine kinase (HSV-TK) augmente l’absorption de thymidine et la conversion de BrdU (ou EdU) en BrdUMP (EdUMP⁾²⁰. Par conséquent, pour réaliser l’expérience eSPAN sur la levure, les souches devaient être insérées avec une structure BrdU-Incorporant (BrdU-Inc) (HSV-TK et hENT1)^13,21.

Auparavant, nous fournissions le protocole eSPAN pour les protéines de réplication de l’ADN chez la^{levure 22}. Récemment, nous avons intégré la méthode CUT&Tag au protocole eSPAN dans les cellules de mammifères afin de traiter des étapes techniquement complexes nécessitant une optimisation, telles que la réticulation, le cisaillement de la chromatine, et pour minimiser le nombre de cellules de départ^17,23. Ici, nous avons fourni l’eSPAN des histones pour la visualisation à l’aide de cellules de levure (Figure 2). Cette méthode est principalement utilisée pour analyser la distribution de formes modifiées d’histones sur les brins d’ADN en réplication. Bien que nous ayons testé plusieurs marques d’histones, nous avons utilisé H3K4me3, une marque sur l’histone parentale H3, comme exemple. Pour analyser les composants et facteurs réplicotiques impliqués dans la réparation de l’ADN aux fourches de réplication, nous recommandons de cisailler la chromatine en petits fragments par sonication, comme décrit dans notre première publication²². Pour les cellules de mammifères, nous avons adopté les procédures modifiées Cut&Tag pour remplacer l’étape ChIP décrite dans la^{levure 23}. Cette modification réduit la quantité de matière de départ (cellules) et, surtout, permet la génération de bibliothèques eSPAN pour le séquençage sans recourir à des kits de préparation d’ADN simple brin. Pour le protocole de levure, nous avons choisi de ne pas utiliser la méthode Cut&Tag car la quantité de matière de départ était suffisante. Plus important encore, nous avons constaté que les procédures Cut&Tag n’étaient pas systématiquement efficaces pour les cellules de levure dans nos mains.

Protocole

REMARQUE : Pour les directives de préparation des tampons et des réactifs, voir les directives de préparation des tampons et des réactifs (Fichier supplémentaire 1).

1. Histone eSPAN dans la levure bourgeonnante

REMARQUE : La plupart des souches de levure n’ont pas de transporteur nucléoside fonctionnel pour capter la thymidine. Pour marquer efficacement l’ADN avec BrdU ou EdU pour eSPAN, une souche thymidine kinase (TK+) positive²¹ est nécessaire. De plus, seules les souches de levure de type « A » d'accouplement peuvent être utilisées pour l'arrêt du cycle cellulaire à l'aide du facteur alpha.

1. Synchronisation des cellules de levure et marquage BrdU (8 h)
   1. Inoculez une seule colonie de souche de levure appropriée (TK+) dans 10 mL de milieu YPD et cultivez à 30 °C sur un incubateur secouant toute la nuit à 220 tr/min.
   2. Mesurez la densité optique, OD600 nm, avec un spectrophotomètre et diluez la culture en 200 mL frais de milieu YPD avec OD600 ~0,2-0,3.
   3. Faites pousser la culture jusqu’à OD600 ~0,4-0,5 (généralement 3-4 heures) à 30 °C dans un incubateur secouant à 220 tr/min.
   4. Ajoutez 300 μL de facteur α (5 mg/mL) et faites la culture pendant 1,5 h à 25 °C, 220 tr/min.
   5. Ajoutez une autre dose de 300 μL de facteur α (5 mg/mL) et faites pousser pendant 1,5 heure supplémentaire à 25 °C, 220 tr/min.
   6. Préparez la solution de fixation au paraformoldéhyde à 37,5 % et préchauffez le milieu (200 mL YPD + HU (hydroxyurée)+BrdU) à 30°C lors de la synchronisation des cellules.
      ATTENTION : Manipulez le BrdU avec prudence car il s’agit d’un mutagène et d’un tératogène potentiel. Préparez une solution de paraformaldéhyde à 37,5 % dans une hotte chimique pour éviter toute exposition à des fumées nocives, car le paraformaldéhyde est un cancérogène potentiel.
   7. Vérifiez la morphologie des cellules (forme de barre) au microscope optique pour vous assurer qu’au moins 90 % des cellules de levure sont en phase G1 15 minutes avant l’arrêt de G1 à 3 h. Alternativement, effectuer une analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour confirmer l’arrêt de^{G1 24}.
      REMARQUE : Vérifiez la morphologie cellulaire et confirmez l’arrêt de G1 (90 % avec une forme de barre) à cette étape.
   8. Collectez les cellules (pellets) par centrifugation à 1600 g pendant 5 minutes à 4 °C et lavez les granulés deux fois avec 20 mL d’eau double distillée glacée.
   9. Resuspendez les cellules dans 200 mL préchauffés (30 °C) de YPD +HU+ BrdU.
      REMARQUE : Le but de la libération de HU est de garantir que la plupart des cellules de levure soient dans la phase S de réplication précoce, ce qui améliorera la consistance et garantira la reproductibilité des résultats. Omettre l’HU est acceptable si le travail avec des cellules de phase logarithmique est nécessaire.
   10. Cultivez les cellules sur un incubateur secouant à 30 °C, 220 tr/min pendant 45 minutes.
       REMARQUE : L’analyse FACS peut être réalisée pour confirmer la phase S précoce. Pour l’analyse FACS, il est important d’inclure un échantillon en phase logarithmique comme témoin afin de définir avec précision la population cellulaire G1. Pour une incorporation efficace de BrdU, il est avantageux de commencer par des cellules à croissance rapide. Certains mutants présentant des défauts de croissance lentes ont tendance à montrer une faible efficacité de marquage BrdU. L’efficacité de l’incorporation de BrdU et la performance de BrdU-IP sont évaluées par PCR quantitative en comparant les régions²² répliquées et non répliquées à l’aide d’ADN isolé à l’étape 1.6.7.
2. Fixation et collecte de l’échantillon (1 h)
   1. Ajoutez 6 mL de paraformoldéhyde fraîchement préparés à une concentration finale de 1 %, mélangez bien, puis faites éclore à 25 °C pendant 20 minutes avec un léger secouement à 90 tr/min.
   2. Trempez la fixation en ajoutant 12 mL de glycine à 2,5 M, mélangez bien, puis incubez à 25 °C pendant 5 minutes avec un léger secouement à 90 tr/min.
   3. Pelletez les cellules à 1600 g pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 20 mL d’eau froide en les faisant tourner à 1600 g pendant 5 minutes.
   4. Rassemblez les cellules dans des tubes à bouchon vissé de 2 mL (50 mL de cellules/tube) et stockez-les à -80 °C.
      REMARQUE : Les cellules peuvent être stockées jusqu’à un an (point de pause).
3. Lyse cellulaire de levure et fragmentation de la chromatine (5 h)
   1. Décongelez les granulés cellulaires, resuspendez-les par un vortex doux, puis lavez-les avec 0,4 mL de tampon de lyse ChIP avec inhibiteurs de protéases et un mélange antibiotique (empêchant la croissance des bactéries contaminantes) et faites tourner à 5 000 g pendant 1 minute.
   2. Ajoutez 0,1 mL de tampon de lyse ChIP contenant des inhibiteurs de protéases et un mélange antibiotique, suivi d’environ 100 μL de billes de verre (0,5 mm).
   3. Lyse by bead battant pendant 3 cycles (30 s allumé/arrêt, 1 minute éteint) dans une chambre froide à 4 °C.
   4. Percer des trous au fond du tube avec une aiguille chaude de 16 G.
      REMARQUE : Pour garder l’aiguille chaude, essayez de garder le tube près du feu.
   5. Collectez le lysat en imbriquant le tube dans un tube vide à faible liaison d’ADN de 1,5 mL et centrifugez à 1600 g pendant 2 minutes, RT.
   6. Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pellete (la chromatine sera dans la fraction de débris cellulaires).
      ATTENTION : Faites attention à ne pas aspirer accidentellement la granule cellulaire lors de l’utilisation de l’aspirateur.
   7. Resuspendez les granulés cellulaires en pipettant 0,35 mL de tampon de digestion MNase complétés avec 0,5 mM de spermidine et 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol.
   8. Ajoutez 10 unités de MNase aux réactions, mélangez-les doucement en inversant 4 à 6 fois immédiatement, puis incubez à 37 °C dans un bain-marie pendant 20 minutes.
      REMARQUE : Les conditions digestives doivent être optimisées pour chaque lot d’enzyme MNase afin d’enrichir les fractions mono-, di- ou tri-nucléosome.
   9. Trempez la digestion de la MNase en ajoutant 5 μL de 0,5 M EDTA pour une concentration finale de 10 mM d’EDTA. Mélangez-les doucement par inversion et laissez immédiatement les tubes dans la glace pendant au moins 30 minutes.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C toute la nuit à cette étape. Les conditions de digestion de la MNase doivent être optimisées pour obtenir la majorité des fractions mono-, di- ou tri-nucléosome (140-450 pb)
   10. Soniser le mélange de réaction avec des microtubes biorupteurs (1,5 mL) pendant 3 minutes (haute puissance, 30 secondes allumé/arrêt). Faites tourner à 10 000 g pendant 5 minutes à 4 °C.
       REMARQUE : Cette brève sonication aide à libérer la chromatine dans le tampon.
   11. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes et faites tourner encore 10 minutes à 10 000 g à 4 °C.
   12. Collectez le surnageant (environ 400 μL), conservez 30 μL de l’échantillon comme ADN d’entrée, et congelez à -20 °C. Utilisez le lysat cellulaire restant (~370 μL) lors de la prochaine immunoprécipitation de chromatine (étape 1.4.1).
4. Immunoprécipitation par chromatine histone (du jour au lendemain)
   1. Ajouter 0,5 μg d’anticorps H3K4me3 au lysat et nuter sur le rotor, 10 tr/min à 4 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : Ici, H3K4me3 est utilisé comme exemple. La quantité d’anticorps doit être testée expérimentalement.
   2. Faites tourner à 15 800 × g pendant 10 minutes à 4 °C et transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
   3. Ajoutez 20 μL de billes de sépharose prélavées en protéines G (3 fois lavées avec un tampon de lyse ChIP), faites nuter sur le rotor pendant 3 minutes chacune, collectez les billes par centrifugation à 350 × g, 4 °C) et incubez à 4 °C pendant 2 heures.
   4. Tournez à 350 × g en RT, et lavez les billes selon l’ordre suivant.
      1. Lavez deux fois avec 1 mL de tampon de lyse glacé pendant 3 minutes à chaque fois en rotation à 10 tr/min sur un rotateur en RT.
      2. Lavez une fois avec 1 mL de tampon de lyse glacé avec 0,5 M de tampon NaCl pendant 3 minutes en rotation à 10 tr/min sur un rotateur en RT.
      3. Lavez une fois avec 1 mL de tampon de lavage Tris/LiCl bien froid pendant 3 minutes en rotation à 10 tours sur un rotateur en RT.
      4. Lavez-en un avec 1 mL de tampon de lavage RT Tris/EDTA (pas tampon TE, fichier supplémentaire 1 pour la recette). Éliminez tout le liquide possible du pellet avec une aiguille de 16 G et demi.
5. Extraction ADN (2 h)
   1. Ajoutez 0,1 mL de résine chélante bien mélangée à 10 % pour l’extraction d’ADN aux billes lavées (à partir de l’étape 1.4.4.4), à l’échantillon d’entrée (à partir de l’étape 1.3.12) et au vortex.
   2. Faites bouillir pendant 10 minutes sur un bloc chauffant à 100 °C, puis refroidissez en RT pour inverser la réticulation.
      REMARQUE : Les clips de verrouillage stop-pop pour tubes centrifugeuses sont fortement recommandés pour maintenir l’étanchéité de fermeture.
   3. Ajoutez 5 μL de protéase K à 20 mg/mL aux billes et incubez à 55 °C pendant 30 minutes tout en secouant à 400 tr/min.
   4. Faites bouillir les billes sur un bloc thermique à 100 °C pendant encore 10 minutes pour inactiver l’activité de la protéase K.
      REMARQUE : Les clips de verrouillage stop-pop pour tubes centrifugeuses sont fortement recommandés pour maintenir l’étanchéité de fermeture.
   5. Réduisez les billes à 6000 g pendant 2 minutes en temps de réanimation, et économisez le surnageant.
   6. Ajoutez 100 μL de 2XTE à la pastille. Vortex et centrifugation à 6000 g pendant 2 minutes en temps de réanimation.
   7. Mélangez et conservez les surnatants (des étapes 1.5.5 et 1.5.6) prises ci-dessus (environ 180 μL).
   8. Purifiez des échantillons de 30 μL en 18 μL de tampon d’élution (EB, fourni avec un kit de purification PCR) à l’aide de colonnes de purification de l’ADN pour la préparation de la bibliothèque d’ADN ssDNA (de l’étape 1.3.12 en entrée et de l’étape 1.5.7 comme échantillons H3K4me3 ChIP-seq).
      REMARQUE : Les échantillons d’ADN peuvent être stockés à -20 °C pendant jusqu’à un mois (point de pause).
6. Immunoprécipitation BrdU (5 h)
   1. Faites bouillir les échantillons (environ 150 μL d’entrée et H3K4me3 ChIP de l’étape 1.5.7) pendant 5 minutes sur un bloc chauffant à 100 °C, puis refroidissez immédiatement dans la glace pendant 5 minutes. Ajoutez 15 μL de 10x PBS et + 1,35 mL de tampon IP BrdU + 0,5 μL d’anti-BrdU Ab + 1 μL d’ARNt d’E.coli (10 mg/mL).
      REMARQUE : C’est une étape cruciale. Utilisez les tubes centrifugeuses à faible liaison à l’ADN pour éviter la liaison non spécifique à l’ADN.
   2. Nutate pendant 2 h sur un rotor à 4 °C à 10 tr/min.
   3. Transférer le mélange dans un tube de 1,5 mL contenant 20 μL de billes de sépharose de protéine G (lavées trois fois avec 1 mL de tampon IP BrdU et faire tourner pendant 3 minutes à 10 tr/min pour chaque lavage à RT) et nuter pendant 1 h à 4 °C sur le rotor à 10 tr/min.
   4. Faites tourner à 800 × g pendant 1 minute en RT et lavez selon les critères suivants : trois fois avec 1 mL de tampon IP BrdU froid, 3 minutes sur un rotor, et une fois avec 1 mL de tampon TE pendant 3 minutes.
   5. Faites tourner à 800 × g pendant 1 minute à la répression et aspirez le surnageant.
   6. Ajoutez 100 ×μL de TE + 1 % de tampon SDS dans les billes restantes. Incubez à 65 °C pendant 5 minutes. Tourne à 800 × g pendant 1 minute en temps récréatif.
   7. Purifiez le surnageant en 18 μL d’EB à l’aide de colonnes de purification de l’ADN (échantillon IP de BrdU et échantillon d’eSPAN H3K4me3).
      REMARQUE : Utilisez les tubes centrifugeuses à faible liaison pour éviter la liaison non spécifique à l’ADN. Les échantillons d’ADN peuvent être conservés à -20 °C pendant jusqu’à un mois (point de pause).
7. Préparation et séquençage de la bibliothèque ssDNA (3 h)
   1. Préparer les bibliothèques d’ADN simple brin avec 15 μL d’apports purifiés, IP BrdU, H3K4me3 ChIP et échantillons eSPAN (étapes 1.5.8 et 1.6.7) (y compris les étapes d’adaptase, d’extension et de ligation) selon les manuels fournis par ssDNA et le kit de préparation de la bibliothèque d’ADN à faible entrée, et purifier le produit de ligature obtenu en 20 μL de tampon d’élution à faible EDTA (fourni par DNA Library Prep Kit).
      REMARQUE : Il y a deux étapes de purification par ligature avec le kit. Ce protocole suit la procédure de 200 pb, <1 ng.
   2. Amplifiez la bibliothèque d’ADN à l’aide d’un mélange réactionnel total de 50 μL (réactifs fournis par le kit de préparation de la bibliothèque ssDNA) : 20 μL de bibliothèque d’ADN purifiée, 4 μL de réactif W2, 10 μL de réactif W3, 1 μL d’enzyme W4, 1,5 μL d’amorces Indexes I7 (10 μM, voir Séquence Oligo Supplémentaire) et 1,5 μL d’amorce Indexes I5 (10 μM, voir Séquence oligo-supplémentaire supplémentaire), 16 μL de ddH₂O sans DNase. Chauffez le mélange PCR à 98 °C pendant 30 s, suivi de 18 cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 60 °C, 1 min à 68 °C, et un cycle de 10 minutes à 68 °C.
      REMARQUE : Chaque bibliothèque doit utiliser une combinaison unique d’amorces i7 et i5. Le nombre de cycles d’amplification doit être ajusté en fonction de la quantité de la bibliothèque pour éviter une suramplification, qui peut entraîner des artefacts PCR. Étant donné la quantité d’ADN généralement faible dans les échantillons d’eSPAN, utilisez jusqu’à 18 cycles.
   3. Purifiez les produits PCR en y incorporant 60 μL (1,0x volume) de billes (préchauffées à 30 °C) (voir Tableau des matériaux).
   4. Mélangez soigneusement les produits PCR et les billes.
      1. Laissez-le en RT pendant 5 minutes. Fixez les billes sur le support magnétique pendant 3 minutes et lavez-les deux fois avec (chaque fois 200 μL) d’éthanol fraîchement préparé à 80 %.
      2. Faites sécher les billes à l’air pendant 2 minutes et éluez dans un tampon à faible EDTA de 20 μL (fourni dans le kit de préparation de la bibliothèque ADN).
   5. Mesurer la concentration de la bibliothèque et la distribution de la taille des fragments à l’aide de systèmes d’électrophorèse à haute résolution (voir Tableau des matériaux).
   6. Regroupez un nombre égal de bibliothèques individuelles, y compris les entrées, H3K4me3 ChIP, BrdU IP et eSPAN, et effectuez un séquençage parallèle en binômes avec la plateforme de séquençage Illumina. Pour le processus d’analyse des données, se référer à la section 3.
      REMARQUE : Les critères d’évaluation pour les résultats de contrôle qualité sont : (i) Aucun pic adaptateur/amorce-dimer (inférieur à 180 pb) n’est détecté. (ii) Toutes les bibliothèques à regrouper ont une distribution de taille similaire et étroite (~300 pb). Le surséchage des billes peut entraîner un faible rendement ; utiliser un poste de travail ADN pour éviter toute contamination. Les bibliothèques peuvent être stockées indéfiniment à -20°C (point de pause).

2. Histone eSPAN avec cellule ES de souris

REMARQUE : L’eSPAN à l’histone avec cellule ES de souris est essentiellement identique à un^{protocole 23} précédemment publié.

1. Marquement BrdU et collecte d’échantillons pour les cellules ES de souris (3 h)
   1. Cultivez des cellules ES de souris dans un milieu de culture cellulaire ES à 37 °C avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ pour atteindre une confluence de 70 % à 80 %. En général, environ 1 million de cellules étaient nécessaires pour l’eSPAN des histones. Faites des cellules de graines un jour avant les expériences pour s’assurer que les cellules croissent à un stade exponentiel.
   2. Changer le milieu et incuber les cellules avec BrdU à une concentration finale de 50 μM pendant 30 minutes à 37 °C avec une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ .
      REMARQUE : L’efficacité du marquage du BrdU peut être surveillée par analyse quantitative PCR. Alternativement, l’immunofluorescence ou l’analyse FACS peut être utilisée pour surveiller l’efficacité d’incorporation du BrdU. Les cellules non marquées peuvent être utilisées comme témoins négatif. Ce sont les conditions d’affichage standard pour les cellules ES de souris. Il est recommandé d’ajuster les conditions de marquage en conséquence pour les cellules ayant des taux de prolifération et une durée de phase S variables.
   3. Rincez les cellules deux fois doucement avec du PBS bien froid.
   4. Trypsinisez et collectez les cellules en granulant à 200 × g pendant 5 minutes.
   5. Pipettez doucement les cellules jusqu’au milieu pour les resuspendre, puis comptez-les. Centrifugez le nombre nécessaire de cellules à 500 × g pendant 5 minutes en RT.
   6. Reposez la pastille cellulaire dans 4 mL de tampon de lavage en pipettant et jetez le surnageant. Centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes en temps de traitement à la centrifuge.
   7. Résuspendez à nouveau les granulés avec 4 mL de tampon de lavage et centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes en RT.
   8. Jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans le wash buffer.
   9. Placez les billes magnétiques recouvertes de ConA (utilisez 10 μL de billes pour 250 000 cellules ; augmentez l’échelle en utilisant plus de cellules) et resuspendez-les dans 1 mL de tampon de liaison. Après plusieurs inversions, placez les tubes sur le support magnétique pour permettre aux billes de se déposer.
   10. À l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur à basse vitesse, éliminez les surnatants. Répétez deux fois les étapes de lavage et resuspendez les billes dans le tampon de liaison.
   11. Ajoutez des billes magnétiques pré-lavées recouvertes de ConA aux échantillons. Mélangez bien et faites tourner à RT pendant 10-20 minutes.
   12. Placez les tubes sur un support à aimants pour éliminer tous les surnatants.
2. Tagment¹⁹ pour les cellules ES de souris (2 jours)
   1. Resuspendez les billes (billes magnétiques recouvertes de ConA liées aux cellules de l’étape 2.1.10) dans 200 μL de tampon anticorps glacé. Ajoutez IgG comme témoin négatif ou les concentrations appropriées d’anticorps primaires contre les protéines d’intérêt.
   2. Mélangez bien et faites nuter à 4 °C toute la nuit.
   3. Mélangez 2 μg de l’anticorps secondaire et une quantité appropriée de pA-Tn5 au rapport molaire de 1:2. Portez le volume total à 8 μL/échantillon avec 50 % (v/v) de glycérol. Pipeter plusieurs fois pour bien mélanger et incuber en RT pendant 1 heure.
   4. Placez les échantillons CUT&Tag sur un support magnétique pendant 30 secondes et jetez tous les surnatants. Ajoutez 1 mL de tampon Dig-wash à la pellete de billes et inversez plusieurs fois.
      REMARQUE : De ce passage aux étapes de lavage suivantes (étapes 2.2.5-2.2.6), il est recommandé d’incuber les billes dans les tampons pendant 3 à 5 minutes après l’étape d’inversion pour éviter une liaison non spécifique.
   5. Placez les tubes sur un support magnétique et retirez tous les surnatants. Ajoutez 200 μL de tampon Dig-300 pour resuspendre les billes et ajoutez les 8 μL du mélange d’anticorps secondaire et de pA-Tn5 à chaque échantillon. Après avoir bien mélangé plusieurs fois avec la pipette, incubez à RT pendant 1 heure.
   6. Placez les tubes sur un support magnétique et retirez tous les surnatants. Ajoutez 1 mL de tampon Dig-300 pour resuspendre les billes et inversez plusieurs fois.
   7. Placez les tubes sur un support magnétique et retirez tous les surnatants. Répétez l’étape du lavage encore 3 fois.
   8. Retirez complètement les surnadants et ajoutez 250 μL de tampon de tagmentation pour resuspendre les billes et incuber à 37 °C pendant 1 heure.
      REMARQUE : Un léger secouement est recommandé lors de l’étape de réaction sur un thermomélangeur car les billes peuvent sédimenter jusqu’au fond des tubes.
   9. Placez les tubes sur un support magnétique et retirez tous les surnatants. Utilisez 1 mL de tampon de lavage TAPS pour resuspendre les billes et inversez plusieurs fois.
   10. Placez les tubes sur un support à aimants et jetez tous les surnatants.
   11. Ajoutez 250 μL de tampon Dig-300 contenant 15 mM d’EDTA, 0,1 % (p/v) de SDS et 0,1 mg/mL de protéinase K dans les billes restantes. Vortex pour bien mélanger et incuber à 37 °C toute la nuit avec un léger secouement.
3. Purification de l’ADN génomique et marquage in vitro chez les cellules ES de souris (pendant la nuit)
   REMARQUE : L’ADN génomique provenant des mêmes cellules pour eSPAN est extrait et préparé pour une marquage in vitro , utilisée pour BrdU-IP-ssSeq. La marquage génomique de l’ADN et son BrdU-IP-ssSeq suivant sont destinés à la normalisation de l’eSPAN.
   1. Resuspendez les cellules dans 300 μL de tampon de lyse de l’ADN génomique et de vortex à vitesse maximale jusqu’à ce qu’aucune pellete ne soit visible.
   2. Pour chaque échantillon, ajoutez la RNase A à 100 μg/mL. Une fois combinés, couver à 37 °C pendant 10 minutes.
   3. Ajoutez 100 μL de solution de précipitation protéique à chaque échantillon. Mélangez bien en vortexant et centrifugez à 15 000 g en RT pendant 3 minutes.
   4. Sauvez le surnageant en le transférant dans de nouveaux tubes de 1,5 mL. Ajoutez 1x volume d’isopropanol aux échantillons et mélangez bien.
   5. Faites tourner à vitesse maximale en RT pendant 3 minutes pour pelleter l’ADN génomique. Verse soigneusement les surnatants.
   6. Ajoutez 1 mL d’éthanol fraîchement préparé à 70 % (v/v) à chaque échantillon et inversez plusieurs fois. Centrifugez à vitesse maximale en RT pendant 3 minutes.
   7. Centrifugez à 15 000 g pendant 1 minute en RT et retirez l’éthanol restant à l’aide d’une pipette P20. Laissez sécher à l’air libre pendant 5 à 10 minutes.
   8. Ajoutez 50 μL de ddH_{, 2}O et formez brièvement un vortex pour resuspendre l’ADN génomique. Dissous à 65 °C pendant 30 minutes.
   9. Centrifugez brièvement et transférez les surnatants dans de nouveaux tubes de 1,5 mL. Quantifier la concentration d’ADN par spectrophotomètre.
   10. Mettez en place la réaction de marquage in vitro comme indiqué dans le tableau 1.
   11. Mélangez bien et éclovez pendant 30 minutes à 37 °C avec un léger secouement.
   12. Ajoutez 10 mM d’EDTA, 0,1 % (p/v) de SDS et 0,1 mg/mL de Protéinase K à chaque échantillon. Mélangez bien en vortexant et incubez toute la nuit à 37 °C avec secouement.
4. Extraction d’ADN et remplacement d’oligo-oligographie (3 h)
   REMARQUE : Le phénol-chloroforme-alcool isoamylique (PCI) et la purification en colonne peuvent être appliqués pour l’extraction d’ADN. Ici, des procédures détaillées utilisant la purification par colonne sont fournies.
   1. Ajoutez 1,25 mL (volume 5x) de tampon de liaison (fourni avec le kit de purification PCR) aux échantillons (étapes 2.2.11. et 2.3.12) et mélange bien en inversant plusieurs fois.
   2. Chargez le mélange dans des colonnes de purification de l’ADN (dans des tubes de collecte de 2 mL) et centrifugez pendant 30 s à 10 000 × g à RT. Éliminez le flux direct.
   3. Ajouter un tampon d’élution de 600 μL (inclus dans le kit) aux colonnes et centrifuger pendant 1 minute à 10 000 × g à RT. Supprimer le flux direct.
   4. Centrifugez à vitesse maximale pendant 2 minutes pour éliminer complètement le tampon restant. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes de 1,5 mL avec couvercles ouverts et laissez-les sécher à l’air libre pendant 1 minute.
   5. Ajoutez 32 μL de ddH₂O sans DNase (ou 10 mM de Tris·HCl, pH = 8,0) au centre de la membrane et laissez-la reposer pendant 1 minute. Centrifugez à vitesse maximale pendant 2 minutes et l’ADN CUT&Tag est maintenant en solution.
   6. Ajoutez 32 μL d’échantillon d’ADN CUT&Tag dans un nouveau tube PCR, puis ajoutez 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM chacun), 4 μL de tampon 10x Ampligase, et 2 μL de rep-B (10 μM). Tapotez doucement et mélangez en pipettant.
   7. Arrêtez brièvement et exécutez le programme suivant pour le remplacement^{d’oligo 23}.
      50 °C, 1 min
      45 °C, 10 min
      Rampe à 37 °C, 0,1 °C/s
      37 °C, tenez
   8. Dans le thermocycleur, ajoutez 1 μL de polymérase ADN T4 et 1 μL d’Ampligase à chaque tube (volume final, 40 μL/échantillon). Mélangez en pipettant doucement.
   9. Poursuivez la réaction à 37 °C dans le thermocycleur pendant 30 à 60 minutes.
      REMARQUE : L’ADN peut être stocké à -20 °C si cela ne passe pas directement à l’IP BrdU juste après cette étape (point de pause sûr).
5. Immunoprécipitation BrdU (essentiellement identique au protocole de levure) (2 h)
   1. Transférez les échantillons dans des tubes à faible liaison à ADN de 1,5 mL. Faites bouillir des échantillons 5 minutes sur un bloc chauffant à 100 °C, puis refroidissez immédiatement dans la glace pendant 5 minutes. Ajoutez 15 μL de 10x PBS et + 1,35 mL de tampon IP BrdU + 0,5 μL d’anti-BrdU Ab + 1 μL d’ARNt d’E.coli (10 mg/mL).
   2. Noutate pendant 2 h sur un rotor à 4 °C.
   3. Transférez le mélange dans un tube contenant 20 μL de perles de sépharose en protéine G (lavées trois fois avec 1 mL de tampon IP BrdU, chacune pendant 3 minutes).
   4. Incubez à 4 °C pendant 1 heure.
   5. Centrifugez à 800 × g pendant 1 minute et lavez-vous selon les critères suivants : trois fois avec 1 mL de tampon IP BrdU froid, 3 minutes sur un rotor ; une fois avec 1 mL de tampon TE pendant 3 minutes.
   6. Faites tourner à 800 × g pendant 1 minute et aspirez le surnageant.
   7. Ajoutez 100 μL de tampon TE + 1 % de SDS dans les billes restantes. Incubez à 65 °C pendant 15 minutes. Faites tourner à 800 × g pendant 1 minute.
   8. Purifiez le surnageant en 18 μL de tampon d’élution (fourni avec le kit) à l’aide de colonnes de purification de l’ADN (BrdU IP et échantillon de H3K4me3 eSPAN).
6. Amplification et séquençage PCR (1,5 h)
   1. Amplifier et étiqueter les échantillons de bibliothèque d’ADN simple brin en utilisant différentes combinaisons d’index. Préparez la réaction PCR en ajoutant les composants suivants (ADN purifié [ChIP ou ESPAN], amorce d’indexation I5 [1 μL], amorce d’indexation I7 [1 μL], NEBNext Mélange maître PCR haute fidélité 2X (2x) [10 μL], ddH₂O jusqu’à 20 μL), mélangeant les échantillons par pipetage et tournant brièvement.
   2. Chauffez le mélange PCR à 98 °C pendant 30 s, suivi de 12 à 14 cycles de 10 s à 98 °C et 20 s à 63 °C, et d’un cycle de 2 minutes à 72 °C.
   3. Purifiez les produits PCR avec 18 μL de billes paramagnétiques (0,8x volume) en 20 μL de tampon à faible EDTA.
   4. Mesurez la concentration de la bibliothèque et la distribution de la taille des fragments à l’aide de systèmes d’électrophorèse à haute résolution.
   5. Regroupez un nombre égal de bibliothèques individuelles, y compris les entrées, H3K4me3 ChIP, BrdU IP et eSPAN, et effectuez un séquençage parallèle en binômes avec la plateforme de séquençage Illumina.

3. Analyse des données eSPAN pour les cellules de levure (1 jour)

REMARQUE : Ce processus d’analyse des données ne concerne que les données sur la levure ; l’analyse des données eSPAN pour les cellules ES peut être suivie comme décrit dans une publication^{récente 23}.

1. Extraire les fichiers de séquences brutes, trimer les séquences d’adaptateurs avec les outils Trim Galore, et supprimer les lectures inférieures à 10 bp pour réduire la taille du fichier de sortie et éviter les plantages des programmes d’alignement. Assurez-vous que les fichiers sont au format file1_1.fq, file1_2.fq pour les lectures jumelées :
   /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --longueur 10 - apparié
2. Générez des fichiers index nœud papillon pour le génome de référence :
   Bowtie2-build genome.fa
3. Associez les lectures au génome de référence correspondant (génome Saccharomyces (sacCer3) pour la levure) à l’aide de Bowtie 2 :
   Bowtie2 -x génome -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --local --non-queue-d’aronde --non-discordant --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
4. Supprimez les lectures multimap avec des outils SAMs et dupliquez les lectures avec les outils Sambamba :
   Vue Samtools -BHS - Q 40 Input.BAM -O Output.BAM
   sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-Static markdup output.bam filtered.bam -r
5. Utilisez deeptools pour générer séparément les fichiers majeurs de la couverture de lecture sur les brins Watson et Crick pour chaque échantillon à partir de fichiers BAM propres :
   bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
   bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
6. Calculez le biais moyen à chaque position^{nucléosomique 25} pour chaque échantillon en fonction de la formule : log2 les lectures avant (brin Watson)/arrière (brin de Crick) suivant le positionnement nucléosomique de référence ont été^{séparées 25}. Les scripts R pour ces calculs sont disponibles à https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. Pour un calcul standard, utilisez les commandes suivantes.
   REMARQUE : Cette étape ne concerne que les données sur la levure ; le calcul du biais pour les cellules ES peut être suivi comme décrit dans une publication^{récente 23}.
   Rscript cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
7. Si nécessaire, ajustez la polarisation du brin selon la polarisation BrdU :
   Script normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --cible target_list --contrôle control_list
   REMARQUE : « matrix_files » est une liste de fichiers générés par le cal_bias. Script R séparé par des virgules. par exemple « fichier1 », « fichier 2 », « fichier 3 ». « classes_list » est une liste de classes d'exemple correspondant à chaque fichier séparé par des virgules (par exemple, « brdu », « H3K4me3_eSPAN », « H3K56ac_eSPAN »). « condition_list » est une liste de conditions d’échantillonnage correspondant à chaque fichier et séparées par des virgules. Chaque fichier sera apparié par classe et condition pour l’ajustement du biais. « target_list » est une liste de cours tirés de la classes_list. Il définira les classes qui serviront de données à ajuster par les contrôles (par exemple, « H3K4me3_eSPAN », « H3K56ac_eSPAN »). « control_list » est une liste de cours tirés de la liste des cours. Il définira les classes qui serviront de données à ajuster par les contrôles. Assurez-vous que la longueur de la liste est la même que celle du target_list (par exemple, « brdu »)
8. Après calcul et ajustement, regroupez les échantillons et créez des visualisations des données.
   Script draw_bias. R -s'bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g groupe 1,groupe 2 --intervalle=T
   -s nécessite une liste de fichiers de polarisation générés par les scripts ci-dessus
   -o est le fichier de sortie
   -g définit les groupes expérimentaux à calculer, c’est-à-dire les réplications biologiques pour tracer le biais moyen.
   --intervalle T ou F, pour afficher les erreurs standard sur les graphiques au sein des groupes expérimentaux.
   REMARQUE : Les informations sur les origines de la réplication ont été définies par les données IP BrdU. Les informations sur la position d’un seul nucléosome ont été obtenues à partir d’un article précédemment^{publié 25}. Pour l’analyse des données des cellules ES de souris, les informations d’origine ont été obtenues à partir du jeu de données^{OK-seq 26}, et le calcul moyen du biais doit suivre le protocole décrit dans le travail^{précédent 23}.

Résultats

eSPAN peut être utilisé pour acquérir des informations spécifiques au brin concernant une protéine cible, telle que les histones et les modifications des histones. Dans ce résultat représentatif, la collecte d’échantillons et les processus eSPAN ont été réalisés en suivant le schéma décrit à la Figure 2 en utilisant le système de levure bourgeonnante. Le traitement et la collecte de l’échantillon suivent la condition précoce de phase S traitée par hydroxyurée selon ce protocole. Deux souches...

Discussion

La détection des protéines associées aux brins de réplication avancés et en retard est importante pour comprendre les mécanismes de réplication de la chromatine et le processus associé, qui sont directement pertinents pour la recherche sur le cancer humain et les mécanismes de résistance aux médicaments. Plusieurs méthodes, telles que le gel 2D, l’immunoprécipitation native de la chromatine (nChIP), l’iPOND et la capture naissante^{de la chromatine} 29,30,31, ont été employées pour étudier la réplica...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher Scientific	15575020
1,5 mL de tubes à faible liaison d’ADN   ;	Eppendorf	22431021
Tampon Ampligase 10x	Lucigen	A1905B
10x PBS & nbsp ;	Corning	21-040-CV
10x TBS	BioRad	1706435
16 G x 1-1/2 in. BD PrécisionAiguille glissante	BD Biosciences	305198
KIT DE BIBLIOTHÈQUE ACCEL-NGS 1S PLUS ADN	Technologies ADN intégrées	10009817	kit de préparation de la bibliothèque d’ADN ssDNA et à faible entrée   ;
Bioanalyseur Agilent 2100   ;	Agilent	Bioanalyse 2100
Kit Agilent DNA 1000   ;	Agilent	5607-1504
Ampligase  ;	Lucigen	A0110K	Manipulez le paraformol avec précaution, il est inflammable, solide et dangereux.
AMPure XP	Beckman	A63881
Réactif SPRI XP AMPure	Beckman Coulter	A63882
Anticorps anti-BrdU   ;	BD Biosciences	555627
Anticorps anti-H3K4me3 & nbsp ;	Abcam	ab8580
Compteur de cellules automatisé  ;, modèle TC10	BioRad	145-0001
Bacitracine   ;	Sigma	11702
Bacto peptone  ;	Thermo Fisher Scientific	211830
Chlorhydrate de benzamidine   ;	Sigma	B2417	Solides combustibles
BrdU  ;	Sigma	B5002	Manipulez le BrdU avec précaution, car il s’agit d’un mutagène et d’un tératogène potentiel.
BSA	New England Biolabs	B9000S
CaCl2	Sigma	C4901
Incubateur de cultures cellulaires & nbsp ;	Thermo Fisher Scientific & nbsp ; Incubateur de CO2 à chemise d’eau modèle Forma série II	3140
Milieu de culture cellulaire & nbsp ;
Lignée cellulaire ES-E14  ;
Chelex-100  ;	BioRad	1422842	200&ndash ; Taille 400 en maille sèche
Chloroforme  ;	Sigma	366919
Billes magnétiques recouvertes de concanavaline A (ConA)   ;	Polysciences	86057-10
Digitonin	Millipore	300410-5MG
DMSO	Sigma	D8418
E. coli  ; ARNt & nbsp ;	Sigma	10109541001
Éthanol & nbsp ;	Thermo Fisher Scientific	BP2818100	Manipulez l’éthanol avec précaution, il est inflammable
Glucose	Sigma	G7021
Glycérol   ;	Sigma	G5516
HCl  ;	Sigma	H1758
HEPES  ;	Sigma	H3375
Isopropanol  ;	Thermo Fisher Scientific	BP26324	Manipulez l’isopromoteur avec précaution, il est inflammable
KAPA HiFi HotStart Ready Mix	Roche	7958889001
KCl	Sigma	P9541
KOH	sigma	221473	Manipulez le KOH avec précaution, c’est corrosif
Vide à basse vitesse
Stand magnétique   ;	Millipore	LSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler	Eppendorf	5331
MgCl2	Sigma	M8266
Nucléase microcoque   ; (MNase)	Worthington	LS004798
Kit de purification PCR MinElute & nbsp ;	Qiagen	28006
Batteur à mini-perles	Mini BeadBeater 24 Disrupteur	607
Mini-centrifugeuse & nbsp ;	Eppendorf	5424R
MnCl2	Sigma	244589
Vibrateur multiplateforme	Fisherbrand	02-217-765
Incubateur à vibrateurs multiplateformes	Référence	INCU-SHAKER 10L
Bloc thermique multithermique & nbsp ;	Eppendorf	Thermomélangeur C
N-[Tris(hydroxyméthyl)méthyl]-3-acide aminopropanesulfonique   ; (TAPOTEMENTS)	Sigma	T5130	200&ndash ; Taille 400 en maille sèche
NaCl  ;	Sigma	S9888
NaOH  ;	Sigma	S8045	Manipulez le NaOH avec précaution, il est corrosif
NEBNext HiFi 2 fois ; Mix maître PCR	New England Biolabs	M0541
NP-40 Igepal CA-630	Thermo Scientific	J61055. AP
Paraformaldhyde	sigma	158127	Manipulez le paraformol avec précaution, il est inflammable, solide et dangereux.
enzyme pA-Tn5   ;	Addgene	121137
Pefabloc	Sigma	11429868001
Phénol-chloroforme-isoamyle alcool & nbsp ;	Invitrogen	15593049
Pipette P1000, P200, P20 et P2	Eppendorf	2231300004
PMSF	Sigma	10837091001
Comprimé cocktail inhibiteur de protéase	Sigma	S8830
Comprimé cocktail inhibiteur de protéase   ;	Sigma	S8830
Protéines G-perles de sépharose   ;	GE Healthcare	17-0618-02
Solution de précipitation des protéines	Qiagen	848023
Solution de précipitation des protéines	Qiagen	848023	Manipulez le KOH avec précaution, c’est corrosif
Solution de précipitation des protéines   ;	Qiagen	848023
Protéinase K  ;	Sigma	311584401
QIAquick kit de purification PCR   ;	Qiagen	28106
RNase A	Sigma	10109169001
SDS  ;	Sigma	L3771
Spectrophotomètre & nbsp ;	Thermo Scientific.	2000/2000c
Spermidine  ;	Sigma	S2626
T4 DNA Pol	New England Biolabs,   ;	M0203
centrifugeuse de table   ;	Beckman Coulter	Allegra X-5
Tris  ;	Sigma	11814273001
Triton X-100 & nbsp ;	Sigma	T8787
extrait de levure & nbsp ;	Thermo Fisher Scientific	212730