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Article de méthode

Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo

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DOI :

10.3791/67123

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10 janvier 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

Dans cet article

Résumé

La modélisation de l’érythropoïèse offre une occasion précieuse de comprendre l’importance biologique des acteurs de ce processus et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’atténuer les défauts de différenciation. Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour différencier efficacement les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices CD34+ ex vivo.

Résumé

L’érythropoïèse, un processus remarquablement dynamique et efficace responsable de la génération du quota quotidien de globules rouges (environ 280 ± 20 milliards de cellules par jour), est cruciale pour le maintien de la santé individuelle. Toute perturbation de cette voie peut avoir des conséquences importantes et entraîner des problèmes de santé. Selon l’Organisation mondiale de la santé, on estime que 25 % de la population mondiale présente des symptômes d’anémie. Ce protocole décrit comment générer des cellules érythroïdes humaines à la fois in vitro à l’aide de cellules souches hématopoïétiques et de cellules progénitrices (HSPC) à partir de sources telles que le sang de cordon ombilical (UCB) ou de sang prélevé sur des donneurs sains et ex vivo avec des HSPC isolées dans la moelle osseuse des patients. En utilisant l’approche génétique, les gènes d’intérêt peuvent être modulés dans les HSPC, et leur impact sur l’érythropoïèse peut être surveillé à différentes étapes du processus de différenciation. Cette méthode permet de cribler des composés perturbant, améliorant ou sauvant la capacité des HSPC à se différencier en cellules érythroïdes matures et d’étudier le rôle des gènes d’intérêt au cours du processus de différenciation érythroïde.

Introduction

Chaque jour, environ 280 milliards de globules rouges (GR) sont produits dans la moelle osseuse pour assurer le transport de l’oxygène dans tout le corps1. L’érythropoïèse est un processus de différenciation finement réglé qui produit des globules rouges matures et fonctionnels à partir de cellules souches hématopoïétiques. De nombreuses maladies, acquises et congénitales, peuvent affecter ce processus, notamment le syndrome myélodysplasique, l’anémie aplasique, la thalassémie et l’anémie dysérythropoïétique congénitale2.

La manifestation clinique de l’érythropoïèse perturbée est l’anémie, une cause majeure de morbidité dans le monde. Les symptômes de l’anémie vont de la fatigue, de l’essoufflement et des étourdissements à des conditions potentiellement mortelles, telles que l’insuffisance cardiaque et l’arrêt cardiaque3. Avec une anémie touchant 1,8 milliard de personnes dans le monde4, la modélisation de l’érythropoïèse ex vivo afin d’étudier ces affections et leurs mécanismes sous-jacents reste une priorité mondiale. La méthode décrite ici vise à fournir un modèle simple et robuste pour étudier la différenciation érythroïde saine et malade. Ce modèle permet de disséquer les rôles de gènes spécifiques dans ce processus et de tester des composés qui pourraient bénéficier aux patients anémiques. Historiquement, la modélisation d’une érythropoïèse inefficace a rencontré de nombreux défis, notamment une pénurie de cellules souches dans certaines moelles osseuses malades et des difficultés à imiter la niche de la moelle osseuse.

Des études antérieures ont utilisé des protocoles similaires ou plus complexes ; par exemple, Bondu et al. ont utilisé un cocktail de cytokines comprenant l’érythropoïétine (EPO), le facteur de cellules souches (SCF) et l’interleukine-6 (IL6) pendant 4 jours avant de retirer l’IL6 du cocktail de différenciation érythroïde, en revanche, Yip et al. n’ont ajouté de l’EPO à leur cocktail de cytokines qu’après 7 jours de culture liquide. Elvarsdóttir et al. ont développé un modèle de culture tridimensionnel (3D) pour les cellules CD34+ afin de faciliter l’expansion et la maturation les plus élevées des cellules érythroïdes, y compris la génération d’îlots érythroblastiques et d’érythrocytes énucléés, qui sont importants pour étudier des phénomènes tels que les sidéroblastes en anneau 5,6,7,8 . Ce protocole n’utilise que trois cytokines lors de l’expansion des cellules (c’est-à-dire SCF, thrombopoïétine [TPO] et tyrosine kinase 3 de type FMS [FLT3]) et trois cytokines maintenues tout au long du processus de différenciation (c’est-à-dire EPO, IGF1 et SCF). L’un des critères clés partagés entre ces différentes études est l’utilisation de cellules CD34+. Bien que l’origine de ces cellules varie, elles sont systématiquement utilisées dans ces différents protocoles. Les sources peuvent aller de la collecte non invasive d’UCB à des procédures plus invasives pour obtenir des échantillons de moelle osseuse adulte qui peuvent être prélevés soit sur des patients mobilisés par le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), soit sur des ponctions de moelle osseuse. En général, les modèles de culture liquide sont portés sur 14 jours, tandis que les modèles 3D peuvent maintenir les cellules sur de plus longues périodes. Ces protocoles sont essentiels pour modéliser les maladies génétiques et les perturbations de l’érythropoïèse. Des approches génétiques, telles que l’inactivation de l’ARN en épingle à cheveux (shRNA), peuvent être utilisées pour réduire au silence les gènes d’intérêt et étudier leurs rôles dans l’érythropoïèse. L’impact du silençage génique peut ensuite être surveillé à différents stades de différenciation, fournissant un modèle humain ex vivo de la production de globules rouges pour étudier l’anémie à la fois en santé et en maladie. Ce protocole comprend la transduction de cellules de sang de cordon CD34+ avec des shRNA qui expriment constitutivement un gène rapporteur, tel que la protéine de fluorescence verte améliorée (EGFP), permettant aux échantillons d’être triés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les cellules sont ensuite incubées dans des milieux de différenciation pendant 2 semaines et surveillées par analyse par cytométrie en flux et coloration immunochimique.

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Protocole

La recherche sur des échantillons primaires a été effectuée dans le respect des directives institutionnelles (référence REC : 21/EE/0133 ; N° de projet IRAS : 283103).

1. Production de lentivirus

REMARQUE : Les lentivirus doivent être produits dans un laboratoire de niveau de biosécurité L2 dans des conditions stériles. Tous les EPI requis pour ce laboratoire doivent être portés, y compris des gants doubles. Les matières contaminées sont décontaminées à l’aide d’un désinfectant virucide avant d’être éliminées dans un bac autoclave. Ici, un brouillage shRNA (contrôle) hébergeant un gène rapporteur EGFP est utilisé pour illustrer le processus.

Jour 1

  1. Réchauffez la gélatine à 37 °C dans un bain-marie jusqu’à ce qu’elle se dissolve complètement. Diluer la gélatine à 0,1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Enduire un plat de 150 mm de 2 ml de gélatine à 0,1 %. Utilisez 2 plats par virus. Incuber les plats pendant 30 min à 37 °C.
  3. Ensemencez 5 millions de cellules HEK293T par boîte recouverte de gélatine dans 20 ml de milieu d’aigle modifié (DMEM) à 10 % de Dulbecco et placez les cellules dans un incubateur à 37 °C.

Jour 2

  1. Vérifiez que les cellules ont atteint une confluence d’environ 50 %. Changez le milieu avec 22 mL de DMEM à 10 % sans perturber la couche cellulaire 2 h avant la transfection.
  2. Préparez le mélange de transfection.
    REMARQUE : Un mélange de transfection est préparé par plat, car un volume plus important peut avoir un impact sur la formation de précipité de calcium-phosphate.
    1. Préparez le mélange réactionnel dans un tube à centrifuger de 15 mL comme suit : 32 μg de plasmide, 20 μg de plasmide PAX (pCMVdR8.74), 9 μg de plasmide VSVG (pMD.G2), et portez le volume à 1125 μL en utilisant H2O.
    2. Ajouter 125 μL de CaCl2 à la réaction et incuber 5 min à température ambiante (RT) sur un rouleau.
    3. Préparez 1,25 ml de 2x HEPES dans un tube à centrifuger séparé de 15 ml.
    4. Ajoutez 2x HEPES goutte à goutte au mélange réactionnel tout en tourbillonnant doucement, puis placez le mélange sur un rouleau pendant 10 min à RT.
  3. Distribuez la réaction goutte à goutte sur les cellules en spirale et placez les cellules dans un incubateur à 37 °C après avoir doucement déplacé la plaque en forme de croix pour homogénéiser le milieu.

Jour 3

  1. Changez le milieu avec 16 ml de DMEM à 10 % sans perturber la couche de la cellule.

Jour 4

  1. Recueillir le surnageant et le conserver à 4 °C pendant la nuit. Ajouter 16 ml de DMEM frais dans chaque assiette sans perturber la couche cellulaire.

Jour 5

  1. Récupérez le surnageant et regroupez-le avec lui à partir du jour 4. Filtrez pour éliminer les débris avec un filtre de 0,45 μM.
  2. Transvaser chaque surnageant de 30 mL (jour 4 + jour 5) dans un tube conique pour l’ultracentrifugation. Ajoutez les tubes dans un seau pivotant, avec des adaptateurs pour le fond conique si nécessaire.
  3. Équilibrez les tubes face à face avec une précision de 0,02 g et ultracentrifugeuse à 90 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
  4. Jeter le surnageant et ajouter 200 μL de milieu de cellules souches par tube. Fermez les tubes avec du parafilm et incubez le tube dans une chambre froide pendant 2 à 4 h sous agitation.
  5. Faites une aliquote de 20 μL de chaque virus et conservez les flacons à -80 °C. Conservez 2 μL de chaque virus et ajoutez 400 μL de DMEM.
    REMARQUE : Cette dilution sera utilisée pour le titrage.

2. Titrage des lentivirus

REMARQUE : Les lentivirus doivent être manipulés dans un laboratoire de niveau de biosécurité L2 dans des conditions stériles. Tous les EPI requis pour ce laboratoire doivent être portés, y compris des gants doubles. Les matières contaminées sont décontaminées à l’aide d’un désinfectant virucide avant d’être éliminées dans un bac autoclave.

  1. Grainez HEK293T dans une plaque à 24 puits. Ajouter 50 000 cellules/puits dans 500 μL de DMEM à 10 %.
    REMARQUE : Utilisez 6 puits par virus et conservez un puits pour les cellules non transduites.
  2. Effectuez la transduction. Ajouter dans les différents puits : 2 μL, 4 μL, 8 μL, 16 μL, 32 μL et 64 μL du virus dilué de l’étape 1.13. Homogénéiser doucement.
  3. Changez le milieu 24 h plus tard en ajoutant 500 μL de DMEM à 10 %.
  4. Au 4e jour après la transduction, préparez les cellules pour la cytométrie en flux.
    1. Préparez le tampon FACS avec du PBS, du sérum fœtal de bovin (FBS) à 2 %, de la pénicilline-streptomycine à 1 % (P/S), de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 2 mM et du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
    2. Retirez le surnageant et ajoutez 500 μL de tampon FACS directement avec de l’EDTA dans chaque puits.
    3. Détachez les cellules en pipetant de haut en bas.
  5. Filtrez les cellules à travers une crépine de 40 μm et transférez-les dans des tubes FACS.
  6. Déterminer le pourcentage de cellules EGFP par cytométrie en flux.
  7. Configurez les barrières suivantes :
    1. Configurez DAPI par rapport à la diffusion latérale (SSC-A) pour exclure les cellules mortes.
    2. Configurez la hauteur du SSC (SSC-H) en fonction de la surface du SSC (SSC-A) pour exclure les agrégats de cellules et sélectionner des cellules uniques.
    3. Configurez une zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) par rapport à SSC-A pour bloquer les cellules et éliminer les débris en fonction de leur taille.
    4. Configurez la protéine de fluorescence verte (GFP) par rapport à la SSC-A pour sélectionner les cellules GFP+ .
  8. Titre du virus.
    1. Calculer la concentration en particules (nombre de particules/mL) pour chaque condition :
    2. Cellules EGFP x Facteur de dilution virus (200) x Nombre de cellules ensemencées x1000)/ volume du virus.
      REMARQUE : Par exemple, les cellules ont été traitées avec 64 μL de virus dilué à 1/200. Après analyse par cytométrie en flux, 54 % des cellules étaient EGFP+. Dans ces conditions, le titre sera de (54 % x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8,44 x 107 particules/mL.

3. Transduction de cellules CD34+ isolées du sang de cordon ombilical

REMARQUE : Cette pièce est réalisée dans des conditions stériles. Ici, les cellules CD34+ UCB (pureté >85 %) sont transduites avec un shRNA (contrôle) hébergeant un rapporteur eGFP. L’expérience est réalisée avec trois répliques techniques. La proportion doit être ajustée au nombre d’échantillons.

Jour 1

  1. Préparez le support et la mémoire tampon suivants :
    1. Préparez le milieu de décongélation : FBS complété par 1 % de P/S et 10 μg/mL d’ADNASE
    2. Préparation du tampon FACS : PBS complété par 1 % de P/S et 2 % de FBS (± 10 μg/mL d’ADNASE)
    3. Préparez le milieu de stimulation (dans un milieu de cellules souches) en ajoutant 150 ng/mL de SCF, 150 ng/mL de FLT-3, 10 ng/mL d’IL-6, 25 ng/mL DE G-CSF, 20 ng/mL de TPO et 1 % d’HEPES.
  2. Décongelez 100 000 cellules CD34+ UCB en les plongeant pendant 30 s dans le bain-marie à 37 °C. Ajouter 1 mL de milieu de décongélation goutte à goutte dans chaque flacon, puis remettre doucement en suspension en pipetant de haut en bas.
  3. Transférez doucement la suspension cellulaire goutte à goutte dans un total de 5 ml de milieu de décongélation.
    REMARQUE : Pour éviter de perdre des cellules, gardez de côté une aliquote de 2 ml de produit de décongélation qui sera utilisée à la fin pour laver l’embout et le flacon.
  4. Centrifugeuse pendant 8 min à 320 x g à RT. Laver les cellules dans 10 mL de tampon FACS + DNAse.
  5. Centrifuger pendant 8 min à 320 x g à RT. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de fluide de stimulation (embout de lavage et tube avec milieu de stimulation).
  6. Comptez les cellules à l’aide de 5 μL de suspension cellulaire et de 5 μL de bleu trypan.
    REMARQUE : Visez un minimum de 75 000 cellules au total (25 000 cellules/condition).
  7. Transvasez les 2 mL de suspension cellulaire dans une plaque à 24 puits et incubez pendant ≥4 à 6 h à 37 °C.
    REMARQUE : Toutes les cellules (75 000 à 100 000) sont ensemencées dans un seul puits à cette étape.
  8. Prélever les cellules dans des tubes FACS et compléter avec 1 mL de milieu de cellules souches. Centrifugeuse pendant 8 min à 320 x g à RT.
  9. Décongelez le virus et ajoutez le volume requis aux milieux de stimulation à une multiplicité d’infection (MOI) de 30.
  10. Remettre en suspension les cellules granulées dans un milieu contenant le virus à raison de 100 000 cellules par 100 μL de virus dans 1 puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter du PBS dans les puits vides et incuber toute la nuit à 37 °C.

Jour 2

  1. Préparez le milieu d’expansion (dans un milieu de cellules souches) en ajoutant 150 ng/mL de SCF, 150 ng/mL de FLT3-L et 20 ng/mL de TPO.
  2. Ajouter tout le volume de suspension cellulaire du puits à plaque de 96 puits dans des tubes FACS avec 1 mL de milieu de cellules souches. Lavez le puits et l’extrémité avec un milieu de cellules souches, ce qui permet d’ajouter 2 ml de milieu de cellules souches à la suspension cellulaire dans le tube FACS.
  3. Centrifugeuse pendant 8 min à 320 x g à RT.
  4. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu d’expansion. Ajouter la suspension cellulaire dans une plaque à 24 puits (laver le puits et l’incliner dans le processus pour obtenir un total de 2 ml). Incuber les cellules pendant 4 jours à 37 °C.
    REMARQUE : Le tri cellulaire est ensuite effectué le jour 7.

4. CD34+ EGFP+ Tri cellulaire et différenciation érythroïde

REMARQUE : Cette pièce est réalisée dans des conditions stériles.

  1. Préparez le support et la mémoire tampon suivants.
    REMARQUE : Les milieux contenant des cytokines doivent être préparés frais :
    1. Préparez le tampon FACS en complétant le PBS avec 1 % P/S et 2 % FBS.
    2. Préparez le milieu d’expansion (dans un milieu de cellules souches) en ajoutant 150 ng/mL de SCF, 150 ng/mL de FLT3-L et 20 ng/mL de TPO.
    3. Préparez le milieu de différenciation érythrocytaire (dans un milieu de cellules souches) en ajoutant 25 ng/mL de SCF, 3 U/mL d’EPO et 50 ng/mL d’IGF1.
    4. Préparez 2 milieux de différenciation érythrocytaire (dans un milieu de cellules souches) en ajoutant 50 ng/mL de SCF, 6 U/mL d’EPO et 100 ng/mL d’IGF1.
  2. Ajoutez le volume complet de cellules dans un tube FACS séparé (lavez le puits et l’embout dans le processus avec un milieu de cellules souches). Centrifuger pendant 8 min à 320 x g à RT. Remettre en suspension les cellules granulées dans 100 μL de tampon FACS.
  3. Ajouter 5 μL de CD34 Ab/tube et incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 20 min.
  4. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon FACS avec DAPI (dilution 1/2000 dans le tampon FACS) et centrifuger pendant 8 min à 320 x g à RT.
  5. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS avec DAPI (dilution 1/2000 dans le tampon FACS) et filtrer les cellules à travers une crépine de 40 μM avant le tri.
  6. Préparez les billes pour le contrôle :
    1. Ajouter 0,5 μL d’anticorps CD34 (Ab) à 1 goutte de billes dans 100 μL de PBS et incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 20 min.
    2. Ajouter 1 mL de PBS. Centrifuger pendant 8 min à 320 x g à RT. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 500 μL de PBS.
  7. Préparez les lignées cellulaires leucémiques pour le contrôle de la GFP.
    REMARQUE : Utilisez n’importe quelle lignée cellulaire GFP+ disponible comme contrôle ; Des perles peuvent être utilisées à la place.
    1. Ajoutez des cellules GFP- (2 tubes FACS avec 100 000 cellules) et GFP+ (1 tube FACS avec 100 000 cellules) dans le tube FACS.
      REMARQUE : Un total de 3 tubes.
    2. Laver les cellules dans 1 mL de tampon FACS. Centrifugeuse pendant 8 min à 320 x g à RT.
    3. Remettre en suspension 100 000 cellules GFP- dans 500 μL de tampon FACS (non coloré), 100 000 cellules GFP- dans 500 μL de tampon FACS avec DAPI (dilution 1/2000 dans le tampon FACS) (coloré DAPI) et 100 000 cellules GFP+ dans 500 μL de tampon FACS (cellules GFP+ ).
      REMARQUE : Des tubes de contrôle seront utilisés pour les réglages de contrôle et de compensation au niveau du cytomètre en flux. Si les cellules utilisées sont 100 % GFP, des cellules GFP- peuvent être ajoutées au tube (50 000 cellules GFP et 50 000 cellules GFP+).
    4. Filtrez les cellules à travers une passoire de 40 μm avant le tri.
  8. Configurez les barrières suivantes :
    1. Configurez DAPI par rapport à la diffusion latérale (SSC-A) pour exclure les cellules mortes.
    2. Configurez la hauteur SSC en fonction de la surface SSC (SSC-A) pour exclure les agrégats de cellules et sélectionner des cellules uniques.
    3. Configurez une zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) par rapport à SSC-A pour éliminer les débris en fonction de leur taille.
    4. Configurez GFP par rapport à SSC-A pour sélectionner les cellules GFP+ .
    5. Configurez CD34 (PerCP-Cy5.5) par rapport à SSC-A pour sélectionner les cellules CD34+ .
  9. Retournez le tube FACS de collecte avant le prélèvement des cellules pour enduire les parois du tube avec FBS.
  10. Prélever des cellules dans le milieu de cellules souches.
    REMARQUE : Visez 75 000 à 80 000 cellules (25 000 cellules x 3)
  11. Centrifuger pendant 8 min à 320 x g à RT et remettre les cellules en suspension dans 3 mL de milieu de différenciation érythroïde.
  12. Remettre en suspension puis distribuer 1 mL par puits dans 3 puits d’une plaque de 24 puits. Remplissez tous les puits extérieurs avec du PBS.
  13. Effectuez une demi-déplétion du milieu tous les deux jours et remplacez-le par un milieu de différenciation érythrocytaire 2x.
    1. Pour rafraîchir le support, assurez-vous que les cellules sont installées au bas de la plaque. Inclinez doucement la plaque et retirez 500 μL de support.
    2. Rafraîchissez en ajoutant 500 μL avec un milieu de différenciation cytokinique érythroïde 2x.
    3. Transférez les cellules le jour 6 dans une plaque à 12 puits et ajoutez 1 mL de milieu pour obtenir un volume final de 2 mL.

5. Analyse de la différenciation érythroïde par cytométrie en flux deux fois par semaine du jour 6 au jour 14

  1. Préparez le support et la mémoire tampon suivants.
    1. Préparez le tampon FACS en complétant le PBS avec 1 % P/S et 2 % FBS
    2. Préparez le milieu de différenciation érythrocytaire (dans un milieu de cellules souches) en ajoutant 25 ng/mL de SCF, 3 U/mL d’EPO et 50 ng/mL d’IGF1.
  2. Prélever 200 μL de cellules dans chaque puits de la plaque de 12 puits et les remplacer par 250 μL de milieux de différenciation érythroïde 2x. Ajouter 1 mL de tampon FACS dans chaque tube.
  3. Centrifuger pendant 8 min à 320 x g à RT. Remettre en suspension les cellules granulées dans 100 μL de tampon FACS.
  4. Ajouter 1 μL de CD71 Ab (1/100), 1 μL de CD34 Ab (1/100) et 1 μL de CD235a Ab (1/100) et incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 20 min.
  5. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon FACS avec DAPI (dilution 1/2000 dans le tampon FACS). Centrifugeuse pendant 8 min à 320 x g à RT.
  6. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS avec DAPI (dilution 1/2000 dans le tampon FACS).
  7. Préparez les billes pour le contrôle :
    1. Ajoutez 1 goutte de billes de compensation dans deux tubes dans 100 μL de PBS, puis ajoutez 0,55 μL d’un seul anticorps dans chaque tube pour effectuer des contrôles de coloration unique (un pour CD34, un pour CD71 et un pour CD235a).
      REMARQUE : 1 goutte suffit pour les deux commandes.
    2. Incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 20 min. Ajouter 1 mL de PBS.
    3. Centrifuger pendant 8 min à 320 x g à RT. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 500 μL de PBS.
  8. Préparez une lignée cellulaire leucémique pour le contrôle.
    REMARQUE : Les cellules K562 expriment le marqueur CD71 et peuvent être utilisées comme contrôle positif pour configurer le FACS.
    1. Ajoutez des cellules GFP- (2 tubes FACS avec 100 000 cellules) et des cellules GFP+ (1 tube FACS avec 100 000 cellules) dans le tube FACS.
    2. Laver les cellules dans 1 mL de tampon FACS. Centrifugeuse pendant 8 min à 320 x g à RT.
    3. Remettre en suspension 100 000 cellules GFP- dans le tampon FACS (non colorées), 100 000 cellules GFP- dans le tampon FACS avec DAPI (dilution 1/2000 dans le tampon FACS) (colorées DAPI) et 100 000 cellules GFP+ dans le tampon FACS (cellules GFP+ ).
  9. Configurez les barrières suivantes :
    1. Configurez DAPI par rapport à la diffusion latérale (SSC-A) pour exclure les cellules mortes.
    2. Configurez la hauteur SSC en fonction de la surface SSC (SSC-A) pour exclure les agrégats de cellules et sélectionner des cellules uniques.
    3. Configurez une zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) par rapport à SSC-A pour éliminer les débris en fonction de leur taille.
    4. Configurez le CD235a (APC-Cy7) par rapport au CD71 (PE).
    5. Configurez CD34 (PerCP-Cy5.5) par rapport à SSC-A.
  10. Analysez un échantillon de cellules GFP non colorées et de cellules entièrement colorées afin d’ajuster les tensions afin que les cellules se trouvent au bon endroit.
  11. Exécutez des billes, des cellules GFP+ et des cellules colorées au DAPI. Compensez et appliquez une compensation aux paramètres du cytomètre.
  12. Exécutez les exemples et enregistrez les événements.

6. Analyse de la différenciation érythroïde par coloration Giemsa

  1. Préparez 5 pots de coloration de lames :
    1. Préparez un bocal de coloration de lames avec la solution d’eosin-méthylène de May-Grünwald 1:1 et du PBS.
    2. Préparez un pot de coloration pour lames avec 2,5 ml de bouillon Giemsa + 50 ml de PBS.
    3. Préparez un pot de coloration de lames avec de l’eau distillée.
    4. Préparez un pot de coloration de lames avec du PBS.
    5. Préparez un pot de coloration de lames avec du méthanol froid glacé.
  2. Collectez 100 000 cellules pour une coloration optimale, ajoutez 1 ml de PBS et centrifugez 300 x g pendant 5 min.
  3. Jeter le milieu et remettre en suspension dans 150 μL de PBS.
  4. Préparez les lames, le papier filtre et l’adaptateur conique dans une cytocentrifugeuse et déposez lentement la préparation cellulaire dans l’adaptateur conique.
  5. Essorer à 800 x g pendant 3 min. Retirez les lames et placez-les dans le bocal à lames de méthanol dans de la glace pendant 15 min.
  6. Immergez les lames dans la solution May-Grünwald pendant 5 minutes et agitez de temps en temps pour assurer une coloration correcte.
  7. Ensuite, plongez les lames dans le bocal PBS jusqu’à ce qu’aucune tache ne s’écoule.
  8. Immergez les lames dans la solution Giemsa pendant 20 minutes et agitez de temps en temps pour assurer une coloration correcte.
  9. Immergez soigneusement les lames avec du PBS jusqu’à ce qu’aucune tache ne s’écoule.
  10. Laissez les diapositives rester dans PBS pendant 3 minutes supplémentaires.
  11. Immergez rapidement les lames dans de l’eau distillée et séchez-les à l’air libre.
  12. Ajoutez une goutte de résine synthétique à chaque endroit des cellules et ajoutez doucement une lamelle sur le dessus.
  13. Laissez sécher les lames pendant 1 h à RT et scellez la lamelle avec du vernis à ongles pour éviter qu’elle ne glisse.

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Résultats

Les cellules CD34+ du sang de cordon ombilical ou de la moelle osseuse sont d’abord décongelées, stimulées et transduites avec un shRNA exprimant la GFP (Figure 1A). Les cellules CD34+GFP+ sont triées 4 jours après la transduction, selon la stratégie de déclenchement illustrée à la figure 1B. Des résultats représentatifs ont montré la maturation des cellules CD34+ après transduction et tri FACS. Les cellules sont analy...

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Discussion

Ici, nous avons décrit une méthode efficace et fiable pour induire la différenciation érythroïde des cellules souches hématopoïétiques CD34+ (HSPC) isolées soit de la moelle osseuse adulte (BM), soit du sang de cordon ombilical (UCB). Ce pipeline comprend l’édition/modification de cellules primaires pour étudier la fonction de tout gène d’intérêt au cours du processus de différenciation érythroïde. Cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier la pertinence fonctionnel...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

C.P., S.B. et K.RP. ont été soutenus par le programme HARP, la Barts Charity (G-002167), le fonds Kay Kendall pour la leucémie (KKL1149) et l’Académie des sciences médicales (SBF004\1099). Nous remercions le Dr Pantelitsa Protopapa pour l’acquisition de la coloration MGG et de la microscopie. Nous saluons également les installations de cytométrie en flux et de microscopie du Barts Cancer Institute de l’Université Queen Mary de Londres. Nous remercions l’organisation caritative britannique Anthony Nolan de nous avoir fourni les unités de sang de cordon ombilical utilisées dans ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2x HEPESMerck51558
PerlesThermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 anticorpsBD Biosciences347222
CD71 PEAnticorps Biolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
Support de montage DPX  ;VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion  ;BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
GélatineMerckG1393
Giemsa solutionAbcamab150670
HEPESMerck H0887-100mL
EPO humainPeproTech100-64
Humain Flt-3 ligandPeproTech300-19
G-CSF humainPeproTech300-23
IGF1 humainPeproTech100-11
IL-6humain PeproTech200-06
SCFhumain PeproTech300-07
TPO humainPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesNA
May-Grunwald solution  ;Generon26250-01
Pannoramic 250 Scanner à haut débit  ;3DHISTECHNA
Pénicilline/StreptomycineThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3  ;Thermo ScientificNA
Cellules souches Milieu moyenTechnologies des cellules souches9655

Références

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