Quantification du glucose Bergmeyer pour les échantillons microbiologiques

Summary

La quantification du glucose de Bergmeyer est une technique enzymatique spectrophotométrique principalement utilisée pour les tests cliniques qui mesurent avec précision et sensibilité la quantité de glucose. Nous présentons ici un protocole d’utilisation de cette méthode pour les échantillons microbiologiques.

Abstract

La concentration de glucose est un indicateur clé du métabolisme cellulaire et pourrait indiquer le taux de métabolisme total, une aberration dans le métabolisme du glucose et, dans certains cas, comment les cellules couplent le métabolisme du glucose au métabolisme énergétique. De plus, les taux de glucose intracellulaires et extracellulaires sont indicatifs de l’état métabolique cellulaire. Les techniques enzymatiques, telles que la quantification du glucose de Bergmeyer, sont plus précises et plus sensibles que d’autres techniques, telles que l’acide dinitrosalicylique ou les méthodes de fluorescence, qui sont généralement utilisées en microbiologie. Bien qu’elle soit principalement utilisée dans le domaine clinique, la quantification du glucose de Bergmeyer peut également être appliquée à n’importe quelle cellule, mais n’a pas été rapportée en détail pour les bactéries, les champignons, les levures ou d’autres micro-organismes.

Nous présentons ici une méthodologie permettant de quantifier le glucose à partir d’échantillons de bactéries et de levures à l’aide de la méthode enzymatique de quantification du glucose de Bergmeyer. La procédure a impliqué les enzymes glucose oxydase, peroxydase et dichlorhydrate d’o-dianisidine incubées à 37 °C pendant 20 min, suivies de l’ajout d’acide sulfurique. L’absorbance est ensuite mesurée à 545 nm. Il est important de souligner que bien que cette technique présente des difficultés pour mesurer des concentrations élevées de glucose (supérieures à 60 g/L), il est possible de mesurer des concentrations inférieures à 50 g/L à l’aide de facteurs de dilution. Cette approche enzymatique est précieuse pour la recherche et l’analyse en microbiologie et dans d’autres domaines scientifiques. La précision et la sensibilité de la méthode la rendent utile pour détecter même de faibles concentrations de glucose dans des échantillons microbiologiques.

Introduction

Le glucose sert de source d’énergie et de carbone principale pour de nombreux micro-organismes, notamment les bactéries, les levures et les champignons. Ces micro-organismes absorbent le glucose par des transporteurs situés sur la membrane extracellulaire, où il subit une série de réactions biochimiques dans la voie métabolique de la glycolyse pour être converti en pyruvate¹. Il existe différentes techniques pour quantifier les sucres réducteurs tels que le glucose. Par exemple, le réactif de Benedict², l’utilisation de l’acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS)^3,4, la méthode anthrona⁵ ou la méthode de l’acide phénol-sulfurique⁶ peuvent être utilisés. Cependant, ces méthodes détectent tout sucre réducteur présent dans l’échantillon, tel que le fructose et le maltose, qui peut contribuer au signal et compliquer la quantification précise d’un sucre particulier.

De plus, ils nécessitent un contrôle strict de la température et la manipulation de substances dangereuses, ce qui peut compliquer le processus et affecter la précision. Ces méthodes peuvent également subir des interférences d’autres composés présents dans l’échantillon, ce qui rend difficile une quantification précise du glucose. À l’inverse, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) offre une alternative plus précise, permettant de discriminer le glucose et les autres sucres réducteurs, bien qu’avec des coûts d’exploitation plus élevés. Ces méthodes contrastées soulignent le besoin continu de développer des techniques de quantification du glucose précises et rentables⁷.

La méthode glucose oxydase-peroxydase-acide sulfurique (GOX-H₂SO₄) utilise deux enzymes, la glucose oxydase (GOD) et la peroxydase (POD). GOD est une enzyme oxydoréductase qui est très sélective pour l’oxydation du β-D-glucose⁸. Ce complexe agit comme un catalyseur lors de la réaction qui se produit lorsque le glucose est en présence d’oxygène, produisant de l’acide gluconique et du peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). Le H₂O₂ est détecté au moyen d’un accepteur d’oxygène chromogène, l’o-dianisidine, qui, lors de l’interaction avec le PDD, provoque son oxydation et la libération de H₂O₂ , empêchant l’acide gluconique d’être reconverti en glucose (voir Figure 1). La couleur obtenue est stabilisée par l’ajout d’acide sulfurique (H₂SO₄), ce qui stoppe également la réaction enzymatique, évitant ainsi d’éventuelles interférences qui pourraient se produire si la réaction se poursuit⁹.

Figure 1 : Vue d’ensemble de la méthode de quantification du glucose à l’aide de l’enzyme glucose oxydase, qui réagit avec le glucose pour produire du peroxyde d’hydrogène (_H2,_O2, 2) et de l’acide gluconique. Par la suite, l’enzyme peroxydase réagit avec_H2O₂ en présence de chlorhydrate d’O-dianisidine. Dans la dernière étape, de l’acide sulfurique (H₂SO₄) est ajouté pour arrêter la réaction enzymatique, ce qui donne une couleur rose qui est mesurée à 529 nm. Abréviations : POD = peroxydase ; DIEU = glucose oxydase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La méthode enzymatique GOX-H₂SO₄ est une technique largement utilisée pour mesurer la concentration de glucose dans des échantillons biologiques, dont la plupart présentent un intérêt clinique. Cependant, peu d’études se sont penchées sur une technique permettant de quantifier la quantité de glucose dans un milieu de croissance pour évaluer sa consommation. Par conséquent, dans le présent protocole, la méthodologie permettant de quantifier le glucose au moyen de la réaction enzymatique de la glucose oxydase, de la peroxydase, du dichlorhydrate d’o-dianisidine et du H₂SO₄ dans des échantillons de liquide microbiologique est présentée, qui résulte d’une modification du travail effectué par Bergmeyer⁹, en utilisant 50 % (v/v) de H₂SO₄ et des quantités inférieures de réactifs.

Protocol

1. Préparation de la solution

1. Préparez 100 mL de tampon phosphate 0,1 M. Pesez 1,28 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄) et 0,1304 g de phosphate dipotassique (K₂HPO₄) et ajoutez-les dans un bécher en verre. Maintenant, ajoutez 70 ml d’eau désionisée (H₂Odi) et ajustez le pH à 5,5 en utilisant de l’acide chlorhydrique 1 M (HCl) ou de l’hydroxyde de potassium (KOH). Transvaser la solution dans une fiole jaugée et ajuster le volume final à 100 mL. Ensuite, transférez la solution dans un récipient ambré et conservez la solution à 4-8 °C jusqu’à 3 mois.
   ATTENTION : Portez des gants en nitrile tout au long du processus de préparation pour éviter tout contact avec la peau et toute contamination potentielle, car le dichlorhydrate d’o-dianisidine est potentiellement cancérigène.
2. Préparez une solution à 1 % p/v de dichlorhydrate d’o-dianisidine. Pesez 0,01 g de dichlorhydrate d’o-dianisidine et placez-le dans un tube à centrifuger de 2,0 ml. À l’aide d’une micropipette de 1 000 ml, ajoutez 1,0 ml de H₂Odi pour dissoudre le composé, puis mélangez lentement en pipetant de haut en bas. Protégez la solution de la lumière en enveloppant le récipient dans du papier d’aluminium et stockez-le à -20 °C pour maintenir la stabilité.
   REMARQUE : Pour faciliter le support du tube lors de la mesure sur la balance analytique, un bécher de 10 mL peut être utilisé comme support supplémentaire. Cela permet de stabiliser le tube, d’assurer une mesure précise en minimisant le risque de déplacement ou d’inclinaison qui pourrait altérer les résultats obtenus sur la balance.
3. Dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter 10 mL de solution tampon de phosphate suivie de 1 mL de solution de dichlorhydrate d’o-dianisidine à 1 % v/v. Ensuite, ajustez le volume final à 100 mL avec un tampon phosphate pour obtenir une concentration finale de 0,01 % de mélange o-dianisidine-tampon. Transférez la solution dans une fiole ambrée et enveloppez-la de papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Conservez la solution à 4-8 °C jusqu’à 3-4 mois.
   REMARQUE : La réfrigération est essentielle pour éviter la décomposition, qui pourrait compromettre l’intégrité des mesures expérimentales. Pour éviter la dégradation du mélange o-dianisidine-tampon, une petite portion de 13 mL (suffisante pour 12 échantillons) peut être placée dans un tube de plastique de 14 mL sur de la glace jusqu’à l’utilisation.
4. Préparez une solution à 50 % de H₂SO₄ . Placez une fiole jaugée de 100 mL avec 30 mL de H₂Odi dans un bain de glace et laissez-la refroidir pendant 10 min. Ensuite, verser lentement 51 mL de H₂SO₄ (98 % v/v) sur les parois du ballon, en agitant soigneusement pour homogénéiser la solution. Attendez que le mélange refroidisse, car la réaction est exothermique (génère de la chaleur). Ajustez le volume final à 100 mL avec_H2Odi et transférez la solution dans une fiole en verre ambré.
   REMARQUE : Utilisez une hotte et suivez tous les protocoles de sécurité, assurez-vous de porter un équipement de protection approprié. Préparez 50 ml d’une solution de carbonate de calcium à 40 % pour neutraliser tout déversement possible qui pourrait se produire.
5. Préparez une solution d’acétate de sodium de 50 mM en dissolvant 0,04 g d’acétate de sodium dans 5 mL de_H2Odi dans un bécher. Ajustez le pH à 5,1 en utilisant de l’acide acétique glacial. Enfin, réglez le volume à 10 mL avec H₂Odi.

2. Préparation des enzymes

1. Dans un microtube stérile de 2,0 mL, peser 0,01 g de glucose oxydase et mélanger avec 1 mL d’acétate de sodium à 50 mM, pH 5,0, pour obtenir une concentration finale de 10 mg/mL. Couvrez le tube d’une feuille d’aluminium et rangez-le à -20 °C.
   REMARQUE : La solution peut être conservée jusqu’à 2 mois à -20 °C.
2. Calculer le volume de la solution enzymatique V₂ nécessaire pour obtenir l’activité enzymatique souhaitée dans chaque cuvette en plastique (avec un volume total de 1,5 mL) à l’aide de l’équation (1) : V₁C₁ =_{V 2}C₂, où V₁ est de 1 500 μL, C₁ est de 28,5 U d’activité enzymatique et C₂ (la concentration de la solution enzymatique) est de 12 970 U/mL (10 mg de l’enzyme [129 000 unités/g] dans 1 mL de H₂Odi).
   V₂ = (1 500 μL × 28,5 U)/12 970 U = 3,29 μL (1)
   REMARQUE : Pour un pipetage plus précis, la valeur peut être arrondie à 3,3 μL.
3. Dans un nouveau microtube de 2 mL, peser 0,0031 g d’enzyme peroxydase et ajouter 1 mL de tampon phosphate, pH 5,5, pour obtenir une concentration finale de 3,1 mg/mL. Couvrez le microtube d’une feuille d’aluminium et conservez-le à -20 °C.
4. Calculez le volume de la solution de peroxydase nécessaire pour obtenir l’activité enzymatique souhaitée par cuvette à l’aide de l’équation (1). Commencez avec un volume total de cuvette de 1 500 μL et une activité enzymatique cible de 1,25 U. Ensuite, déterminez le volume nécessaire de la solution enzymatique, compte tenu de sa concentration de 1 551 U.
   V₂ = (1 500 μL × 1,25 U)/1 551 U = 1,208 μL
   REMARQUE : Pour un pipetage plus précis, la valeur a été arrondie à 1,20 μL.

3. Étalon de glucose

1. Préparez un étalon de D-glucose de 1 g/L en ajoutant 0,01 g de D-glucose à 10 mL de_H2Odi dans une fiole jaugée. Pour diluer la concentration à 0,5 g/L, prélever 500 μL de la solution mère et la mélanger avec 500 μL de_H2Odi pour obtenir un volume final de 1 mL.
   REMARQUE : Ce processus de dilution est essentiel pour créer des solutions standard précises.

4. Préparation de la courbe standard

1. À l’aide d’un microtube neuf de 2 ml, ajoutez le tampon et les volumes de glucose indiqués au tableau 1.
2. Réglez le thermobain sec à 37 °C. Une fois que la température est stable, ajoutez 3,3 μL de glucose oxydase dans tous les tubes, puis ajoutez 1,2 μL de peroxydase dans chaque tube. Incuber les tubes à 37 °C pendant 20 min.
3. Après l’incubation, ajouter immédiatement 750 μL de 50 % H₂SO₄ (v/v) dans chaque microtube et laisser refroidir le mélange dans un bain de glace pendant 2 min. Il en résulte un volume final de 1 500 μL. Enfin, transférez la solution dans une cuvette en plastique et mesurez l’absorbance à 529 nm.

Tableau 1 : Courbe d’étalonnage de la glycémie pour la méthode GOX-H₂SO₄ . Abréviations : DIEU = glucose oxydase ; POD = peroxydase ; H₂SO₄ = acide sulfurique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

5. Analyse d’échantillons microbiologiques

1. Obtenez l’échantillon en cultivant des bactéries ou des levures dans un milieu de culture liquide dans des conditions spécifiques, notamment la température, la vitesse d’agitation et le temps d’incubation. Une fois que la culture atteint la densité optique (DO) ou la concentration cellulaire souhaitée, collectez la culture pour un traitement ultérieur.
   REMARQUE : Pseudomonas reptilivora a été cultivé à une vitesse d’agitation constante de 300 tr/min et 28 °C, tandis que Debaryomyces hansenii a été cultivé avec une vitesse d’agitation de 200 tr/min à 30 °C dans un agitateur orbital. Dans le cas spécifique de D. hansenii, l’huile de canola comestible a également été utilisée comme inducteur pour la production de lipase.
2. Nettoyez la zone de travail avec une solution d’alcool à 70 % ou un agent de nettoyage approprié conformément aux protocoles de biosécurité. Allumez un brûleur pour assurer l’asepsie.
3. Transvaser 100 μL du milieu de culture dans un microtube de 1,5 mL ou 2 mL à l’aide d’embouts stériles.
4. Centrifuger les échantillons à 7 500 × g pendant 7 min à 4 °C, ou à 10 000 × g pendant 7 min sans contrôle de la température. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant, qui contient du glucose en solution, et jetez la pastille.
5. Utilisez 0,5 μL de surnageant pour des concentrations de glucose allant de 1 à 20 g/L, puis mélangez avec 749,5 μL de tampon o-dianisidine, 3,3 μL de GOD, puis 1,2 μL de POD. Incuber les microtubes pendant 20 min à 37 °C, comme indiqué à l’étape 4.2 et ajouter immédiatement 750 μL de 50 % H₂SO₄ et laisser refroidir dans un bain de glace pendant 2 min.
   1. Pour des concentrations supérieures à 20 g/L, effectuer une dilution 1:1 avec du_H2Odi stérile avant de continuer.
   2. Si les échantillons de surnageant ont déjà été congelés à -80 °C ou -20 °C, décongelez-les à température ambiante et agitez pendant 30 s avant de les utiliser. Si une dilution est nécessaire, utilisez du_H2Odi stérile.
   3. Pour les échantillons dont la concentration en glucose est supérieure à 30 g/L, effectuer une dilution de 1:1 avec du_H2ODI stérile, ce qui donne un facteur de dilution de 2.
6. Calculez la concentration totale de glucose dans chaque échantillon à l’aide de l’équation (2) dans un tableur.
   (2)
   Où:
   x = concentration de glucose (g/L) δ = volume de réaction final (0,0015 L)
   y = absorbance M.S. = quantité d’échantillon utilisée*
   REMARQUE : Les valeurs b et m proviennent de l’équation qui modélise la ligne de tendance de la courbe d’étalonnage de la méthode (y = mx + b). *La valeur MS doit être basée sur la quantité d’échantillon utilisée pour obtenir le rapport à la dilution correspondante (c.-^à-d . si vous prenez 0,5 μL du surnageant, MS = 0,0000005 L = 0,5 × 10-6 L) ; si un facteur de dilution (DF) est utilisé, multiplier l’absorbance obtenue par le DF.
   Par exemple, si l’on obtient une absorbance de 0,5 et qu’on utilise un DF de 2, le résultat sera de 1,0. Par conséquent, y = 1,0, et cette valeur doit être entrée dans l’équation (2), comme décrit précédemment.

6. Validation analytique

1. Calculer les paramètres de validation analytique de la méthode GOX-H₂SO₄ selon ce qui est établi par le Centre National de Métrologie et l’Entité d’Accréditation Mexicaine¹⁰ (CENAM-ema).
   1. Calculer la précision en pourcentage du coefficient de variation ou %CV = (S/x) × 100, où x est la moyenne du groupe d’échantillons et S est l’écart-type avec une valeur d’acceptation de ≤10 %.
   2. Déterminez la linéarité en ajustant la courbe standard au modèle linéaire R² supérieur à 0,995.
   3. Calculez la limite de quantification (LQ) à l’aide de l’équation : LQ = yB + 10sB, où yB représente la concentration de l’analyte qui produit un signal équivalent au signal cible, et 10sB désigne 10x l’écart-type du blanc
   4. Calculez l’erreur systématique à l’aide de l’équation suivante : Oblique = x - m, où x = moyenne de la concentration expérimentale et m est la concentration théorique.
   5. Déterminez l’exactitude comme le degré d’accord entre une valeur réelle et une valeur théorique.
      Taux de récupération = (CR/CV) × 100
      où CR est la moyenne de la concentration expérimentale et CV est le coefficient de variation de la concentration théorique.

7. Interférence par d’autres sucres réducteurs

1. Évaluez séparément quatre sucres réducteurs : le glucose, le fructose, le galactose et le xylose à partir d’une solution mère de 0,5 g/L. De plus, utilisez le tréhalose comme contrôle négatif. Suivez le protocole pour tous les échantillons et mesurez l’absorbance à 545 et 529 nm.

Results

L’analyse spectrophotométrique de GOX-H₂SO₄ a révélé une absorbance maximale unique à 529 nm (λmax) (Figure 2A), avec des valeurs d’absorbance supplémentaires observées à 545 nm. En analysant les valeurs d’absorbance à différentes concentrations de glucose, nous avons obtenu une linéarité (R²) de 0,9977 pour λ529 nm et R² de 0,9967 pour λ545 nm (Figure 2B). La linéarité, à l’intérieur d’une plage donnée, fait référence à la capacité de ...

Discussion

La quantification du glucose dans les milieux de culture est essentielle pour comprendre la croissance microbienne et l’activité métabolique, car le glucose sert de source d’énergie primaire pour de nombreux micro-organismes. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthode GOX-H₂SO₄ pour mesurer avec précision les niveaux de glucose dans les milieux de culture, dans le but d’optimiser les processus microbiens dans les fermentations de bactéries ou de levures. Nos ré...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtube de 1,5 mL	Eppendorf	-	-
Microtube de 2,0 mL	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	Carbonate de calcium
D-Glucose	Meyer	50-99-7	D-Glucose  ;
Drybath	FisherScientific	11-718-4	Numéro de série 911NO251. Bloc LxPxH mm/po : 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Glucose oxydase  ;	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Poudre enzymatique
H2O	-	-Eau	déminéralisée
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Acide sulfurique
HCl	Meyer	7647-01-0	Acide chlorhydrique  ;
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Phosphate dipotassique
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Phosphate monopotassique
KOH	Meyer	1310-58-3	Hydroxyde de potassium
Lambda 35	PerkinElmer-Spectrophotometer
Microtube centrifugeuse	-	-	-
o-Dichlorhydrate de dianisidine	Sigma Aldrich	D3252
Peroxydase	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzyme
poudre pH-mètre	Hanna  ;	1131	Hanna 1170
Acétate de sodium	Meyer	127-09-3	Meyer
Spatules de pesée  ;	-	-	-