Method Article

Purification et caractérisation biophysique de la myosine-7a humaine basée sur le système MultiBac

DOI:

10.3791/67135

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August 23rd, 2024

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1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, 2Microscope Imaging Facility, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille les procédures de production recombinante de l’holoenzyme myosine-7a humaine à l’aide du système de baculovirus MultiBac et d’étude de sa motilité à l’aide d’un test de glissement de filament in vitro sur mesure.

Abstract

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La myosine-7a est une protéine motrice basée sur l’actine essentielle aux processus auditifs et visuels. Les mutations de la myosine-7a conduisent au syndrome d’Usher de type 1, la forme la plus courante et la plus grave de surdicécité chez l’homme. On suppose que la myosine-7a forme un complexe d’adhésion transmembranaire avec d’autres protéines Usher, essentiel à l’intégrité structurelle et fonctionnelle des cellules photoréceptrices et des cellules ciliées cochléaires. Cependant, en raison des défis liés à l’obtention de protéines pures et intactes, les mécanismes fonctionnels exacts de la myosine-7a humaine restent insaisissables, avec peu d’études structurelles et biomécaniques disponibles. Des études récentes ont montré que la myosine-7a de mammifère est un complexe moteur multimérique composé d’une chaîne lourde et de trois types de chaînes légères : la chaîne légère régulatrice (RLC), la calmoduline et la protéine 4 de type calmoduline (CALML4). Contrairement à la calmoduline, CALML4 ne se lie pas aux ions calcium. Les calmodulines, sensibles au calcium et insensibles, sont essentielles à la myosine-7a de mammifère pour un bon réglage fin de ses propriétés mécaniques. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour produire une holoenzyme humaine recombinante de myosine-7a à l’aide du système d’expression de la protéine MultiBac Baculovirus. Cela permet d’obtenir des quantités de milligrammes de protéines complètes de haute pureté, ce qui permet leur caractérisation biochimique et biophysique. Nous présentons en outre un protocole pour évaluer ses propriétés mécaniques et mobiles à l’aide de tests de motilité in vitro sur mesure et de microscopie à fluorescence. La disponibilité de la protéine myosine-7a humaine intacte, ainsi que le protocole de caractérisation fonctionnelle détaillé décrit ici, ouvrent la voie à d’autres investigations sur les aspects moléculaires de la myosine-7a dans la vision et l’audition.

Introduction

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Les myosines sont des protéines motrices moléculaires qui interagissent avec l’actine pour piloter de nombreux processus cellulaires 1,2,3,4. L’homme possède 12 classes et 39 gènes de la myosine5, qui sont impliqués dans un large éventail de fonctions physiologiques, telles que la contraction musculaire6 et les processus sensoriels7. Chaque molécule de myosine est un complexe multimérique composé d’une chaîne lourde et de chaînes légères. La chaîne lourde est divisée en régions de la tête, du cou et de la queue. La tête contient des sites de liaison à l’actine et aux nucléotides qui sont responsables de l’hydrolyse de l’ATP et de la génération de la force sur les filaments d’actine2. Le col est formé de plusieurs motifs IQ α-hélicoïdaux où un ensemble spécifique de chaînes lumineuses sont liés. Ensemble, ils fonctionnent comme un bras de levier pour amplifier les changements conformationnels du moteur en grands mouvements 8,9,10. La queue contient des sous-domaines spécifiques à une classe et joue un rôle régulateur dans l’ajustement de l’activité motrice de la myosine et la médiation des interactions avec les partenaires de liaison cellulaire 2,11.

La myosine humaine 7a, membre des myosines de classe 7, est essentielle aux processus auditifs et visuels12,13. Les motifs IQ de la myosine-7a humaine sont associés à une combinaison unique de chaînes légères, y compris la chaîne légère régulatrice (RLC), la calmoduline et la protéine 4 de type calmoduline (CALML4)14,15,16. En plus de stabiliser le bras de levier, ces chaînes légères régulent les propriétés mécaniques de la myosine-7a en réponse à la signalisation calcique, une caractéristique qui semble être unique à l’isoforme14 des mammifères.

Des défauts dans le gène codant pour la chaîne lourde de la myosine-7a (MYO7A/USH1B) sont responsables du syndrome d’Usher de type 1, la forme la plus grave de perte combinée de la vision et de l’ouïe chez l’homme17. De plus, le gène de la chaîne légère CALML4 fait partie des gènes candidats cartographiés pour contenir l’allèle causal de l’USH1H, une autre variante du syndrome d’Usher de type 115,18. Dans la rétine, la myosine-7a est exprimée dans l’épithélium pigmentaire rétinien et les cellules photoréceptrices13. Il a été impliqué dans la localisation des mélanosomes dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)19 et la phagocytose des disques du segment externe des photorécepteurs par les cellules EPR20. Dans l’oreille interne, la myosine-7a se trouve principalement dans les stéréocils, où elle joue un rôle essentiel dans l’établissement des faisceaux de cheveux et dans le déclenchement du processus de transduction mécano-électrique 12,21,22.

Si l’importance de la myosine-7a dans les cellules sensorielles est bien établie, ses mécanismes fonctionnels au niveau moléculaire restent mal compris. Cette lacune dans les connaissances est en partie due aux défis liés à la purification de la protéine intacte, en particulier de l’isoforme de mammifère. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés en utilisant le système MultiBac pour exprimer de manière recombinante l’holoenzyme14 complète de la myosine humaine 7a. Cette avancée a permis des caractérisations structurales et biophysiques de cette protéine motrice, conduisant à la découverte de plusieurs propriétés uniques de la myosine-7a humaine qui sont spécifiquement adaptées aux fonctions auditives des mammifères14,23.

Le système MultiBac est une plate-forme avancée de cellules de baculovirus/insectes spécialement conçue pour l’expression de complexes multimériques eucaryotes24,25. Une caractéristique clé de ce système est sa capacité à héberger plusieurs cassettes d’expression génique, chacune codant pour une sous-unité du complexe, au sein d’un seul baculovirus MultiBac. L’assemblage des cassettes d’expression multigénique est facilité par un module dit de multiplication : un site d’endonucléase à tête chercheuse (HE) et un site BstXI conçu par correspondance flanquant les sites de clonage multiple (MCS). Ce module permet l’assemblage itératif d’une cassette d’expression unique par restriction/ligature, en tirant parti du fait que les sites de restriction HE et BstXI sont éliminés lors de leur ligature. Dans cet article, la chaîne lourde de la myosine-7a humaine, la RLC, la calmoduline et le CALML4 sont chacun clonés dans le module de multiplication du vecteur pACEBac1 (Figure 1A), qui sont ensuite assemblés en une cassette d’expression multigénique par le processus itératif (Figure 1B). La cassette multigénique de la myosine-7a est intégrée dans le génome du baculovirus (bacmid) par la transposition de l’élément mini-Tn7 du vecteur pACEBac1 vers le site cible de la mini-attTn7 dans le génome (Figure 1C). Suivant les procédures de purification du bacmid, de production et d’amplification du baculovirus (figures 1D, E), le baculovirus recombinant myosine-7a MultiBac est préparé et peut être utilisé pour la production de protéines à grande échelle (figure 1F). De plus, les chaînes légères de myosine-7a peuvent être produites séparément chez E. coli et purifiées à l’aide d’une étiquette His6-SUMO clivable 26,27,28. Les chaînes légères purifiées sont utiles pour étudier leur dynamique de liaison et la régulation de la myosine-7a.

La protéine myosine-7a purifiée peut être soumise à des études structurales, biochimiques et biophysiques pour mieux comprendre la régulation structurelle-fonctionnelle de cette protéine motrice. De plus, ses interactions avec le réseau d’actine et d’autres protéines de liaison29 peuvent être examinées à l’aide de diverses approches de reconstitution in vitro. Les résultats de ces analyses éclaireront les propriétés biophysiques de cette myosine, conduisant à une compréhension mécaniste de la façon dont la myosine-7a entraîne les changements cytosquelettiques et, en fin de compte, façonne la morphologie et la fonction uniques des cellules sensorielles. Dans cet article, nous détaillons un flux de travail pour le test de glissement des filaments d’actine qui a été spécifiquement adapté à la myosine-7a de mammifère. Le test de glissement des filaments d’actine est un test de motilité in vitro robuste qui étudie quantitativement le mouvement des filaments d’actine fluorescents propulsés par un grand nombre de moteurs de myosine immobilisés sur une surface de lamelle 30,31,32. Les avantages de ce test comprennent sa simplicité d’installation, ses exigences minimales en matière d’équipement (un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un appareil photo numérique) et sa grande reproductibilité. De plus, comme le mouvement des filaments d’actine est entraîné par un groupe de moteurs de myosine immobilisés, ce test est particulièrement utile pour étudier la motilité des myosines monomères telles que la myosine-7a14,33. Les protocoles comprennent plusieurs modifications, allant des procédures expérimentales à l’analyse d’imagerie, spécifiquement adaptées aux propriétés mobiles uniques de la myosine-7a de mammifère. Grâce à la disponibilité de la protéine myosine-7a intacte et au protocole de caractérisation fonctionnelle décrit ici, cet article jette les bases d’une étude plus approfondie des rôles moléculaires de la myosine-7a dans les processus physiologiques et pathologiques.

Protocol

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REMARQUE : Nous décrivons ici un protocole permettant de synthétiser l’holoenzyme humaine intacte myosine-7a et de caractériser sa motilité in vitro. Ce protocole est divisé en trois sections : premièrement, l’expression de la myosine-7a humaine à l’aide du système d’expression de la protéine du baculovirus MultiBac ; Deuxièmement, la purification des chaînes légères de myosine-7a séparément à l’aide du système E.coli His6-SUMO ; et enfin, l’étude de la motilité de la myosine-7A humaine à l’aide du test de glissement des filaments d’actine.

1. Production de complexes myosine-7a basée sur le système MultiBac

  1. Création d’une cassette multigénique de baculovirus pour l’expression du complexe myosine-7a humaine (16 jours)
    REMARQUE : Il faut un cycle de clonage (4 jours) pour insérer les ADNc des sous-unités de la myosine-7a dans les vecteurs pACEBac1 et trois cycles de clonage pour terminer la ligature par étapes de tous les modules de multiplication nécessaires à l’expression du complexe myosine-7a, ce qui donne un total de 16 jours.
    1. Cloner les ADNc codant pour la chaîne lourde (HC) de la myosine-7a, la calmoduline, le CALML4 et le RLC dans les vecteurs pACEBac1 à l’aide d’un kit commercial suivant les protocoles du fabricant (voir le tableau des matériaux ; Figure 1A). Une étiquette FLAG est insérée à l’extrémité C de la myosine-7a HC pour faciliter la purification.
      REMARQUE : La myosine-7a de mammifère est produite sous la forme de deux isoformes d’épissage, ne différant que par un segment de 11 acides aminés à l’extrémité N-terminale23. Cette courte extension N-terminale joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité ATPase de la myosine-7a14. Il a été démontré que l’ajout d’une balise N-terminale peut perturber la régulation normale par cette extension N-terminale et réduire significativement l’activité enzymatique et la motilité du moteur14. Par conséquent, une balise C-terminale FLAG est utilisée pour éviter de perturber la régulation naturelle de la protéine.
    2. Construire la cassette d’expression multigénique de l’holoenzyme myosine-7a en utilisant la multiplication de l’endonucléase à tête chercheuse/BstXI comme décrit ci-dessous (Figure 1B).
      REMARQUE : L’endonucléase à tête chercheuse I-CeuI produit des extrémités cohésives qui sont compatibles avec les extrémités générées par la digestion BstXI. Lors de la ligature, un site de restriction hybride endonucléase/BstXI est créé qui ne peut être coupé par aucune des enzymes. La même procédure peut être répétée pour intégrer d’autres modules de multiplication. Si plusieurs sites de restriction pour l’I-CeuI et le BstXI sont présents sur l’insert ou la construction du vecteur, ces sites supplémentaires doivent être éliminés par mutagenèse dirigée pour s’assurer que les sites de coupe I-CeuI et BstXI sont uniques.
    3. Préparation de l’insert : Digérer la construction de l’insert (par exemple, pACEBac-M7a HC) avec l’endonucléase à tête chercheuse I-CeuI (voir le tableau des matériaux), puis purifier le plasmide linéarisé à l’aide d’un kit de purification PCR (voir le tableau des matériaux). De plus, digérer le plasmide linéarisé avec BstXI (voir Tableau des matériaux), séparer le fragment contenant la cassette d’expression génique par électrophorèse sur gel et purifier à l’aide d’un kit d’extraction de gel (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : I-CeuI et BstXI nécessitent des conditions de tampon différentes, selon les protocoles du fabricant, pour atteindre une activité de 100 %. De plus, une coupe complète avec I-CeuI nécessite un minimum de 3 h, tandis que BstXI ne nécessite que 15 min de temps d’incubation. Les digestions doivent donc être effectuées de manière séquentielle.
    4. Préparation des vecteurs : Linéariser la construction du vecteur (p. ex., pACEBac-CaM) par digestion BstXI. La phosphatase alcaline est incluse dans la préparation du vecteur pour empêcher le plasmide du vecteur de se ligaturer sur lui-même (voir le tableau des matériaux). Obtenez le produit de digestion par électrophorèse et purifiez-le avec un kit d’extraction de gel.
    5. Ligature : Ligate l’insert traité I-CeuI/BstXI et le vecteur traité BstXI avec l’ADN ligase T4 (voir Tableau des Matériaux). Effectuez des réactions de ligature à température ambiante (20 °C -25 °C) pendant 10 min avec un rapport de 1:1 en masse de l’ADN de l’insert à l’ADN vecteur, en maintenant la masse totale proche de 100 ng dans chaque réaction de ligature.
    6. Transformation et analyse plasmidique : Transformer les mélanges de ligature en cellules DH5α (voir Tableau des matériaux) en suivant les recommandations du fabricant et dépister la résistance à la gentamicine dans les colonies positives. Purifiez les plasmides à l’aide d’un kit commercial (voir le tableau des matériaux) et vérifiez les bons clones (par exemple, les plasmides contenant à la fois M7a HC et CaM) en fonction de modèles de digestion de restriction spécifiques et du séquençage de l’ADN des inserts.
    7. Intégration de plusieurs cassettes d’expression génique : Répétez les étapes 1.1.2 à 1.1.6 pour intégrer des cassettes de gènes supplémentaires exprimant d’autres sous-unités de la myosine-7a.
  2. Production et purification de l’ADN bacmid recombinant (4 jours ; Figure 1C).
    REMARQUE : Jour 1 - Transformation bactérienne et croissance des colonies transformées. Jours 2-3 - Croissance des colonies et dépistage pour une transformation réussie. Jour 3 - Sélection et striage des colonies positives, à partir de l’inoculation pendant la nuit. Jour 4 - Purification de l’ADN de Bacmid.
    1. Transformer les cellules compétentes DH10Bac (voir Tableau des matériaux) avec 1 ng du plasmide séquencé pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM en suivant les recommandations du fabricant.
    2. Déposer sur une plaque de 20 à 200 μL de cellules une gélose contenant 50 μg/mL de kanamycine, 7 μg/mL de gentamicine, 10 μg/mL de tétracycline, 100 μg/mL d’indolyl-β-galactoside halogéné et 40 μg/mL d’IPTG (voir le tableau des matériaux) et incuber la plaque à 37 °C pendant 48 h pour permettre le développement d’une couleur bleu foncé chez les clones négatifs.
      REMARQUE : L’indolyl-β-galactoside halogéné colore les colonies qui continuent d’exprimer LacZ (indiquant que la transposition a échoué), ce qui permet de sélectionner les colonies blanches où la transposition a réussi.
    3. Sélectionnez soigneusement une colonie blanche isolée et cultivez des cellules pendant la nuit dans 5 ml de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine, 7 μg/mL de gentamicine et 10 μg/mL de tétracycline à 37 °C dans un agitateur orbital à 225 tr/min.
    4. Centrifuger la culture à 2 465 x g pendant 10 min pour granuler l’E. coli. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 300 μL de tampon P1 du kit.
      REMARQUE : Bien que les tampons du kit Miniprep soient utilisés ici, le protocole de purification du produit bacmid diffère du protocole fourni avec le kit.
    5. Ajoutez 300 μL de tampon P2 du kit. Mélangez en inversant les tubes plusieurs fois, puis incubez à température ambiante pendant 3 min.
    6. Ajouter 300 μL du tampon N3 du kit et mélanger par inversion pour arrêter la réaction de lyse. Centrifugeuse à 17 885 x g pendant 10 min à 4 °C.
    7. Transférez le surnageant dans un tube stérile propre et répétez la centrifugation pendant encore 10 min.
    8. Transvaser 800 μL du surnageant dans un autre tube de microcentrifugation stérile de 1,7 mL (voir le tableau des matériaux) et ajouter 600 μL d’isopropanol froid (voir le tableau des matériaux), en mélangeant par inversion rigoureuse. Centrifuger ensuite à 17 885 x g pendant 20 min à 4 °C.
    9. Jetez le surnageant et localisez la petite pastille blanche. Laver la pastille avec 800 μL d’éthanol à 70 % froid (voir tableau des matériaux) et centrifuger à 17 885 x g pendant 5 min à 4 °C. Ajoutez délicatement de l’éthanol le long de la paroi du tube pour éviter de déranger le granulé.
    10. Jetez le surnageant et répétez le lavage à l’éthanol une fois. Faites sécher le granulé à l’air libre à température ambiante pendant 5 min. Aspirez soigneusement tout excès de liquide, si nécessaire.
    11. Dissoudre la pastille avec 20 μL de tampon EB du kit. Assurez-vous que la pastille est complètement dissoute en agitant le tube ou en mélangeant doucement par pipetage. Déterminer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux).
    12. Ajustez le volume de la mémoire tampon au besoin pour que la concentration de bacmid soit d’environ 1 μg/μL. Conservez l’ADN du bacmid à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la production du virus P0.
      REMARQUE : Le bacmid purifié peut être conservé à 4 °C et reste efficace pendant plusieurs mois. Nous avons vu des transfections réussies avec des produits bacmid jusqu’à 1 an. Alternativement, le bacmid peut être aliquote et stocké à -20 °C. Les cycles multiples de congélation/décongélation doivent être évités car ils diminuent l’efficacité de la transfection.
  3. Transfecter des cellules d’insectes Sf9 avec du bacmid pour produire un baculovirus recombinant (6 jours ; Graphique 1D)
    REMARQUE : Jour 1 - Transfection de cellules avec de l’ADN bacmid. Jours 2 à 6 - Observer la croissance et l’expression des cellules. Jour 6 - Collecte du virus P0.
    1. Ajouter des cellules Sf9 dans un milieu de culture (voir le tableau des matériaux) dans une plaque à 6 puits à une concentration de 0,33 x 106 cellules/mL avec 3 mL par puits. Laissez la plaque reposer à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de se fixer au bas de la plaque.
    2. Pour chaque puits, préparer un mélange de transfection en combinant 10 μL de réactif de transfection lipidique cationique (voir le tableau des matériaux) avec 250 μL de milieu essentiel minimal (MEM) amélioré (voir le tableau des matériaux) dans un tube de microcentrifugation stérile. Mélanger par inversion et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    3. Ajouter 1 μg (en fonction de la concentration déterminée à l’étape 1.2.12) de myosine-7a bacmid non diluée au mélange de transfection. Mélanger par inversion et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    4. Répartissez uniformément l’ensemble du mélange ADN-lipides goutte à goutte dans les puits. Laissez-en un puits pour les cellules non transfectées comme contrôle négatif.
    5. Scellez la plaque à 6 puits avec un film (voir le tableau des matériaux) et incubez à 27 °C pendant 6 jours. Observez la croissance et le détachement tout au long de cette période. S’il y a une étiquette fluorescente présente sur la construction, vérifiez le développement de la fluorescence (Figure 2).
    6. Lorsque les cellules transfectées montrent des signes d’infection à un stade avancé, transférez le milieu contenant le virus des puits infectés dans un tube conique de 15 mL et centrifugez-le à 805 x g pendant 10 min.
    7. Transférez le surnageant dans un tube conique propre de 15 ml, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et rangez-le à 4 °C. Ce produit est maintenant le virus P0 et peut être stocké et utilisé efficacement jusqu’à quatre mois d’après notre expérience.
  4. Amplifier le stock de baculovirus (3-5 jours ; Graphique 1E)
    1. Préparez 100 mL (ou le volume désiré) de cellules Sf9 à une concentration de 2 x 106 cellules/mL dans un milieu de culture cellulaire Sf9 dans un erlenmeyer de 250 mL (voir le tableau des matières).
    2. Ajouter un rapport 1:100 (v/v) de stock de virus P0 à la culture de cellules en suspension Sf9 et incuber à 27 °C dans un agitateur orbital à 135 tr/min.
    3. Surveillez la croissance toutes les 24 h jusqu’à ce que les cellules atteignent ~90% de mort cellulaire. Une fois à cette distance, centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 10 min et prélever le surnageant contenant le virus P1.
    4. Filtrez le surnageant à l’aide d’une filtration sous vide de 0,22 μm (voir tableau des matériaux). Conservez le produit filtré dans l’obscurité et à 4 °C. Ce produit est maintenant le virus P1.
      REMARQUE : Le titre du virus diminue avec un stockage à long terme à 4 °C. Envisagez de faire du stock de virus frais s’il a été stocké pendant plus de 4 mois, ou de titrer le stock de virus avant de l’utiliser dans l’expression34.
  5. Expression protéique (60 à 72 h entre le début de l’expression et la collecte de la cuiller cellulaire ; Graphique 1E)
    1. Préparez des cellules Sf9 en croissance en phase logarithmique à une concentration de 2 x 106 cellules/mL et ajoutez le virus P1 à raison de 12 mL de virus pour 300 mL de suspension cellulaire.
      REMARQUE : Le rendement en protéines est d’environ 1 mg / L. Il est recommandé d’utiliser un minimum de 1,5 L de suspension cellulaire pour l’expression de cette protéine.
    2. Cultivez les cellules à 27 °C dans un agitateur orbital à 135 tr/min pendant environ 60 h.
      REMARQUE : De petits échantillons peuvent être prélevés à différents moments et analysés à l’aide de gels SDS pour évaluer les niveaux d’expression des protéines. De plus, si les protéines sont fusionnées avec des marqueurs fluorescents, les niveaux d’expression peuvent être évalués à l’aide de la microscopie à fluorescence. Les cellules doivent être récoltées au plus tard au début de la mort cellulaire.
    3. Centrifuger la suspension cellulaire à 3 735 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules. Les granulés peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure ou conservés pour un stockage à long terme. Nous utilisons généralement des granules cellulaires en quelques semaines, mais nous avons récupéré des protéines actives plusieurs mois après la congélation.
  6. Purification des protéines (2 jours ; Graphique 1F)
    REMARQUE : Jour 1 - Extraction et purification des protéines à l’aide de la chromatographie d’affinité FLAG. Jour 2 - Aliquote et congélation des échantillons après la dialyse pendant la nuit. Le protocole décrit ci-dessous concerne la purification de la myosine-7a à partir de granules de cellules de 1,5 L.
    1. Préparez le tampon maître contenant 10 mM de MOPS (pH 7,2), 500 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM d’EGTA, 1 μg/mL de leupeptine et 100 μg/mL de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Filtrez-le avec un filtre à pores de 0,22 μm et stockez le tampon à 4 °C (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE : Le PMSF est instable dans les solutions aqueuses. Préparez la solution mère PMSF sous forme de 1 M dans de l’éthanol à 100 % et conservez-la à -20 °C jusqu’à 6 mois.
    2. Préparez 75 ml de tampon d’extraction en complétant le tampon principal avec 3 comprimés inhibiteurs de protéase sans EDTA, 2 mM d’ATP et 0,1 mM de dithiothréitol (DTT ; voir le tableau des matériaux).
    3. Ajoutez 75 ml de tampon d’extraction à la pastille pendant qu’elle est encore congelée. Laissez les granulés dans le tampon d’extraction sur de la glace jusqu’à ce qu’ils décongèlent. À l’aide d’une pipette sérologique, on brise la pastille afin d’accélérer le processus de décongélation.
    4. À l’aide d’une pointe de 1/2 pouce (13 mm), sonicer la remise en suspension sur la glace pendant 10 min à 50 % d’amplitude, 5 s en marche, 5 s en arrêt.
    5. Centrifuger le lysat total à 33 746 x g pendant 30 min à 4 °C. Lors de la centrifugation, préparer 1,5 mL de résine FLAG en lavant 3 mL de la suspension à 50 % de résine d’affinité Anti-FLAG (voir le tableau des matériaux) avec 40 mL de PBS. Granuler la résine par centrifugation à 800 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez délicatement le PBS sans déranger la résine.
    6. Ajouter le surnageant de la centrifugation du lysat à la résine lavée et incuber avec une rotation continue à 4 °C pendant 1 h.
    7. Granuler la résine par centrifugation à 800 x g pendant 2 min à 4°C. Sans perturber la résine, retirez le surnageant.
    8. Remettre la résine en suspension dans 40 mL de Master Buffer et centrifuger à 800 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la résine. Répétez le lavage 1 fois.
    9. Transférez la résine lavée dans deux colonnes de centrifugation en polypropylène (voir tableau des matériaux). Lavez chaque colonne 1 fois avec 2 ml de tampon principal. Retirez le tampon principal en centrifugeant la colonne à 1 400 x g pendant 2 min à 4 °C. La résine sera tassée sur le fond.
    10. Préparez un tampon d’élution en ajoutant 100 μg/mL de peptide FLAG (voir le tableau des matériaux) au tampon maître.
    11. Ajoutez 300 μL de tampon d’élution à la résine tassée dans chaque colonne et mélangez doucement par pipetage pour vous assurer que la résine est complètement hydratée par le tampon d’élution. Laissez la résine incuber avec le tampon d’élution sur de la glace pendant 10 min.
    12. Centrifuger les colonnes à 1 400 x g pendant 2 min à 4 °C. Transférez le flux dans un tube de microcentrifugation propre et maintenez-le sur de la glace. C’est la première fraction.
    13. Répétez les étapes 1.6.11 et 1.6.12 de sorte que 4 fractions soient prélevées dans chaque colonne.
    14. Effectuer l’électrophorèse sur gel SDS-PAGE35 avec les fractions d’élution pour déterminer leurs concentrations relatives. Pendant que le gel fonctionne, préparez un tampon de dialyse contenant 500 mM de NaCl, 10 mM de MOPS, 2 mM de MgCl2, 0,1 mM d’EGTA et 1 mM de DTT.
    15. Mélangez les fractions les plus concentrées. Transférez l’échantillon dans une cassette de dialyse MWCO 10K (voir tableau des matériaux) et dialysez pendant la nuit à 4 °C. Utilisez 1 L de tampon de dialyse pour environ 500 μL de protéines. Effectuez au moins trois changements du tampon de dialyse.
      REMARQUE : La méthode d’élution par colonne de spin et par centrifugation permet d’éluer les protéines à des concentrations élevées (0,5-1 mg / mL). D’autres étapes de concentration ne sont généralement pas nécessaires. Cependant, si des protéines plus concentrées sont souhaitées, chargez les échantillons dans des tubes de concentration de 100 000 MWCO (voir le tableau des matériaux) et centrifugez-les à 1 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Répétez ce processus jusqu’à ce que le volume de solution protéique souhaité soit atteint.
    16. Le lendemain, déchargez soigneusement l’échantillon de la cassette de dialyse. Aliquote 15 μL par tube PCR et déposez les tubes dans un récipient d’azote liquide pour la congélation instantanée. Les protéines congelées peuvent être stockées à -80 °C pour une utilisation future (Figure 3A).
      REMARQUE : Le rendement en myosine-7a avec cette méthode se situe généralement entre 0,5 et 1 mg/L.

2. Purification des chaînes légères RLC et CALML4 à l’aide du système E. coli His6-SUMO (7 jours)

REMARQUE : Jours 1 à 4 - Clonage et purification des plasmides. Jour 5 - Transformation bactérienne. Jours 6-7 - Purification, aliquotage et congélation des protéines finales.

  1. Clonez les ADNc codant pour RLC et CALML4 dans un vecteur pET-SUMO, qui contient une séquence His6 avant SUMO pour faciliter la purification. Si nécessaire, le domaine His6-SUMO peut être clivé de la protéine de fusion à l’aide d’une protéase SENP226,36.
  2. Pour chaque protéine à chaîne légère, transformez les cellules compétentes de BL21 E . coli (voir le tableau des matières) avec le plasmide et commencez une culture liquide de 5 mL pendant la nuit avec les cellules transformées.
  3. Le lendemain, inoculer la culture de nuit de 5 mL dans 1 L de bouillon Luria-Bertani (LB) contenant 50 μg/mL de kanamycine. Laisser la culture croître à 37 °C en agitant continuellement à 270 tr/min jusqu’à ce que la densité optique (D.E.) atteigne 0,6 - 1,0.
    REMARQUE : La valeur OD double environ toutes les 20 minutes une fois qu’elle atteint 0,2. Surveillez fréquemment le diamètre extérieur.
  4. Initier l’expression de la protéine en ajoutant 250 μM d’isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture. Incuber pendant 3 à 5 h à 37 °C ou 16 °C pendant la nuit avec agitation continue à 270 tr/min.
  5. Granulez E . coli en centrifugeant la suspension cellulaire à 4 347 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  6. Préparez un tampon de remise en suspension contenant 50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 5 mM d’imidazole et 10 % de glycérol, pH 7,4 (voir le tableau des matériaux). Restez sur la glace.
  7. Remettez la pastille en suspension dans 15 à 25 ml de tampon de remise en suspension et transférez la suspension dans un bécher propre, en ajustant le volume total à 35 ml. Ajouter la DNase et la RNase à la suspension dans un rapport de 1:1000 (v/v) pour une concentration finale de 1 μg/mL et 2 μg/mL, respectivement. Ajoutez un comprimé d’inhibiteur de protéase sans EDTA, 4 mM de 2-mercaptoéthanol et 1 % de Triton X à la suspension (voir le tableau des matériaux). Garder sur la glace pendant 20 min.
  8. Soniquez la suspension de granulés dans de l’eau glacée avec 1 s de marche et 1 s de repos pendant un total de 1 min à 100 % d’amplitude. Laisser le lysat homogénéisé à 4 °C avec rotation continue pendant 2 h.
    REMARQUE : L’ajout de Triton X aide à lyser les cellules en préparation de la sonication.
  9. Centrifuger les lysats à 26 900 x g pendant 45 min à 4 °C. Pendant ce temps, commencez à préparer la résine de cobalt (voir le tableau des matériaux). Utilisez 500 μL de résine de cobalt pour 1 L de culture d’E. coli . Lavez la résine 2 fois avec de l’eau ultra-pure et une fois avec un tampon de suspension en centrifugeant à 4 347 x g pendant 2 min à 4 °C.
  10. Après la centrifugation au lysat, mélanger le surnageant avec la résine lavée et creuser doucement à 4 °C pendant 30 min.
  11. Centrifuger la suspension de lysat-résine à 4 347 x g pendant 2 min à 4 °C. La résine sera tassée au fond du tube. Sans perturber la résine, retirez le surnageant.
  12. Lavez la résine avec le tampon de suspension en centrifugeant à 4 347 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez le surnageant. Répétez les lavages jusqu’à ce que le surnageant soit incolore.
  13. Préparez un tampon d’élution contenant 50 mM de Tris HCl, 300 mM de NaCl, 5 mM d’imidazole, 10 % de glycérol, 4 mM de 2-mercaptoéthanol et 0,25 μM de protéase SENP2 (voir le tableau des matériaux). Gardez-le sur de la glace.
  14. Remettez la résine en suspension dans 1 mL de tampon de remise en suspension et incubez-la pendant la nuit à 4 °C avec une rotation continue.
  15. Le lendemain, centrifuger à 4 347 x g pendant 2 min pour granuler la résine. Récupérez le surnageant, qui contient la protéine de la chaîne légère clivée et la protéase.
  16. Ajouter 1 mL de tampon d’élution à la résine. Répétez la centrifugation et récupérez le surnageant.
  17. Retirer la protéase par chromatographie liquide protéique rapide (FPLC). Préparez brièvement la colonne d’exclusion granulométrique (voir le tableau des matériaux) avec un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 % de glycérol et 5 mM de DTT (pH 7,4). Concentrer le surnageant à 500 μL à l’aide d’un tube concentrateur de 10 000 MWCO. Chargez l’échantillon concentré sur une colonne reliée à un système de chromatographie automatisé à l’aide d’une seringue, à travers laquelle circulez avec un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 % de glycérol et 5 mM de DTT (pH 7,4). Surveiller les fractions collectées à l’aide d’une spectrophotométrie ultraviolette. Recueillir les fractions protéiques dont le poids moléculaire correspond aux chaînes légères.
    REMARQUE : La protéase peut également être éliminée par chromatographie d’affinité si une étiquette de purification (par exemple, une étiquette GST) est intégrée à la protéase.
  18. Exécutez un gel SDS-PAGE avec les fractions d’élution pour déterminer la pureté et les concentrations relatives des protéines de la chaîne légère dans chaque fraction. Les fractions souhaitées sont celles qui contiennent des protéines de chaînes légères concentrées sans bandes de protéase visibles. Combinez les fractions protéiques souhaitées et concentrez-les à l’aide d’un tube de concentration35 de 10 000 MWCO.
  19. Congeler instantanément des aliquotes de protéines dans de l’azote liquide et les transférer immédiatement à -80 °C pour un stockage à long terme (figure 3B).
    REMARQUE : Le rendement en RLC et CALML4 à l’aide du système E . coli His6-SUMO est d’environ 1 à 2 mg/L.

3. Test de glissement du filament d’actine adapté à la myosine-7a (3 h)

REMARQUE : Les méthodes utilisées dans cette section sont similaires à celles décrites pour d’autres myosines31 , les principales modifications étant l’incubation et l’application de la myosine dans un tampon à haute force ionique et le long intervalle nécessaire pour obtenir une mesure précise des déplacements d’une image à l’autre.

  1. Préparez une quantité de 20 μM d’actine filamenteuse (F-actine) en polymérisant de l’actine globulaire (G-actine) dans un tampon de polymérisation (50 mM de KCl, 25 mM de MOPS, 2 mM de MgCl2, 1 mM de DTT (pH 7,0)) à 4 °C pendant la nuit. Étiquetez l’actine F en ajoutant 1,2x l’excès molaire de rhodamine-phalloïdine (voir tableau des matériaux). Couvrir de papier d’aluminium et incuber sur de la glace pendant au moins 2 h.
    REMARQUE : La G-actine peut être achetée auprès de vendeurs commerciaux (voir le tableau des matériaux) ou purifiée à partir de poudre d’acétone musculaire de lapin31,37. L’actine F marquée peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2 mois à cette concentration.
  2. Préparez une chambre d’écoulement comme décrit précédemment31. Brièvement, placez deux bandes de ruban adhésif double face espacées de 2 à 3 mm sur une lame de microscope nettoyée et traitée à la nitrocellulose (voir le tableau des matériaux). Placez la lamelle côté nitrocellulose vers le bas sur les bandelettes, créant ainsi une chambre d’écoulement d’un volume approximatif de 10 μL (figure 4).
  3. Réalisation d’un test de glissement des filaments d’actine
    1. Dans la chambre d’écoulement, ajoutez un volume de chambre de 0,2 mg/mL de protéine de myosine-7a humaine purifiée dans un tampon de motilité 500 mM NaCl (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA (pH 7,4)). Laissez incuber 5 min à température ambiante.
      REMARQUE : Il est essentiel d’ajouter de la myosine-7a dans un tampon à haute teneur en sel car cela soulage l’état auto-inhibé et permet à la myosine-7a d’adhérer à la surface dans la conformation activée.
    2. Laver la chambre d’écoulement avec des volumes à trois chambres de 1 mg/mL BSA (voir tableau des matériaux) dans un tampon de motilité NaCl de 150 mM (150 mM de NaCl, 20 mM de MOPS, 5 mM de MgCl2, 0,1 mM d’EGTA, 1 mM de DTT (pH 7,4)) en aspirant le liquide à l’aide d’une lingette propre à la sortie pour absorber l’excès de liquide. Incuber pendant 1 min après le 3èmelavage.
    3. Écoulez un volume de chambre de 10 nM de rhodamine phalloidine marquée à la f-actine dans un tampon de motilité NaCl de 150 mM à travers la chambre d’écoulement. Surveiller la liaison des filaments d’actine à la surface à l’aide d’un microscope fluorescent avec objectif 100x. La densité des filaments d’actine doit être optimale (figure 5A), ce qui permet d’obtenir suffisamment de filaments dans le champ de vision pour le suivi, mais suffisamment clairsemée pour éviter le chevauchement de plusieurs filaments, ce qui complique le suivi.
    4. Lavez la chambre d’écoulement avec des volumes à trois chambres de 150 mM de tampon de motilité NaCl pour éliminer les filaments d’actine non liés et l’excès de rhodamine-phalloïdine.
    5. Amorcez la motilité en ajoutant un volume de chambre du tampon final (200 mM de NaCl, 20 mM de MOPS, 5 mM de MgCl2, 0,1 mM d’EGTA, 50 mM de DTT, 2 mM d’ATP, 2,5 mg/ml de glucose, 100 μg/mL de glucose oxydase, 2 μM de RLC, 2 μM de CaM, 2 μM de CALML4).
    6. Enregistrez des images au microscope à fluorescence en utilisant une excitation de 561 nm pour visualiser l’actine marquée à la rhodamine phalloïdine. Trouvez une zone sur la lame avec la densité d’actine souhaitée (Figure 5A) et capturez des images toutes les 30 s pendant 30 min.
      REMARQUE : La vitesse de la myosine-7a de mammifère est d’environ 5 nm / s. Lors du réglage de la fréquence d’images d’acquisition, il est important de s’assurer que les déplacements des filaments entre les images sont suffisamment longs (plus d’un pixel) pour permettre un suivi précis. Les mouvements de sous-pixels entre les images peuvent entraîner une surestimation de la vitesse. La fréquence d’images de 30 s permet aux filaments d’actine de se déplacer d’environ 150 nm entre les images, ce qui correspond à plus de deux pixels sur le microscope. Cependant, il faut veiller à ce qu’un déplacement significatif puisse être observé sur le microscope utilisé. Le cas échéant, l’enregistrement multi-positions peut être utilisé pour collecter simultanément plusieurs champs de vision à des fins d’analyse.
  4. Analyse du mouvement des filaments d’actine à l’aide du programme FAST (installé sur un Mac)38.
    REMARQUE : Le programme FAST utilisé ici n’est qu’une des nombreuses options pour quantifier le mouvement du filament. Nous avons choisi d’utiliser FAST car il est automatisé, rapide et ne nécessite pas de logiciel payant. D’autres options incluent des algorithmes basés sur MATLAB tels que FIESTA, des méthodes basées sur ImageJ/FIJI telles que MTrack2 et Manual Tracking, et des méthodes basées sur Python telles que Philament39.
    1. Téléchargez et installez le programme FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - version compatible python3 avec un module supplémentaire pour la conversion de fichiers nd2. NB : La version originale de python2 peut être trouvée à github.com/turalaksel/FASTrack).
    2. Exécutez le programme FAST comme décrit à lasection 38 en utilisant une valeur de tolérance de 33 pour ne conserver que les filaments en mouvement lisse.
      REMARQUE : Si les images contiennent des problèmes mécaniques avec la scène ou de la collecte de plusieurs séries simultanément, les films doivent d’abord être stabilisés. Pour cela, nous vous recommandons le plugin FIJI Image Stabilizer, disponible en téléchargement à l’adresse suivante - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
    3. Utilisez le programme FAST pour analyser les images de .tif nouvellement créées en définissant d’abord les valeurs -xmax et -ymax. Ceux-ci définissent les paramètres du nuage de points généré par le programme et représentent la plus longue longueur de filament (en nm) et la vitesse maximale du filament (en nm/s). Dans cet exemple, nous avons utilisé 20 000 nm pour -xmax et 20 nm/s pour -ymax afin de nous assurer que toutes les données sont capturées (Figure 5D).
    4. Utilisez -px pour définir la taille en pixels de l’image acquise, qui sera ici de 65 nm, et -minv pour définir la vitesse minimale (en nm/s) requise d’un filament pour l’inclusion dans l’analyse. Pour la faible vitesse de la myosine-7a dans cet exemple, utilisez 0,1 nm/s.
    5. Utilisez -maxd pour définir la distance maximale autorisée entre les cadres pour que les filaments soient liés. Ceci est réglé pour éviter de lier des filaments séparés entre les cadres et dans cet exemple, nous utilisons la valeur par défaut de 2000 nm.
    6. Utilisez -pt pour définir la tolérance aux fluctuations de vitesse des filaments et n’incluez que les filaments avec des mouvements fluides. Cet exemple utilise un seuil de tolérance de 33 %. Cela signifie que les filaments dont l’écart-type de vitesse est supérieur à 33 % de la moyenne de vitesse seront exclus d’une analyse plus approfondie.
    7. Enfin, utilisez -d pour indiquer le dossier contenant les piles de .tif à analyser. La chaîne de commande entière avec les paramètres et les valeurs donnés sera : rapide -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [nom du dossier contenant les films].
      REMARQUE : Le programme FAST produit des diagrammes de dispersion (figure 5D) avec leurs données brutes associées, qui peuvent être extraites à des fins d’analyse et de visualisation dans d’autres programmes (figure 5C). Il produira également un tracé des trajectoires des filaments suivis (figure 5B), qui devrait être utilisé pour vérifier que le suivi fonctionne comme prévu. Des exemples de graphiques et d’autres visualisations de données possibles sont inclus ci-dessous.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le complexe myosine-7a purifié et les protéines à chaînes légères peuvent être évalués par électrophorèse sur gel SDS-PAGE, comme le montre la figure 3. La bande au-dessus du marqueur de 200 kDa correspond à la chaîne lourde de la myosine-7a (255 kDa). Les trois bandes qui migrent entre les marqueurs de 22 et 14 kDa de haut en bas sont respectivement RLC (20 kDa), calmoduline et CALML4. Alors que la calmoduline et CALML4 ont un poids moléculaire similaire d’environ 17 kDa, les deux protéines peuvent être séparées à l’aide d’un gel de tris-glycine à 16 %.

La vidéo 1 et la figure 5 montrent un test de glissement de filaments d’actine caractéristique avec de la myosine-7a de mammifère. Une caractéristique immédiate révélée par ce test est la motilité lente de la myosine-7a. La vidéo est lue à une vitesse 500 fois supérieure à la normale afin de mieux visualiser le mouvement des filaments d’actine entraînés par cette myosine. Ce test peut être modifié pour étudier davantage comment des facteurs externes tels que la température, la force ionique et la viscosité de la solution influencent l’activité de la myosine-7a. De plus, des protéines de liaison à la myosine-7a peuvent être introduites dans la cellule d’écoulement pour étudier leurs effets sur les interactions et la motilité de l’actomyosine.

figure-results-1
Figure 1 : Flux de travail pour la production d’holoenzymes myosine-7a basée sur le système MultiBac. (A) Insérer les ADNc codant pour la chaîne lourde de la myosine-7a, RLC, CALML4 et la calmoduline dans les sites de clonage multiples (MCS) du vecteur pACEBac1. (B) Construire la cassette d’expression multigénique pour coder le complexe myosine-7a en ligaturant de manière itérative les vecteurs pACEBac1 qui contiennent les ADNc de la chaîne lourde de la myosine-7a, RLC, CALML4 et calmoduline. (C) Intégrer la cassette multigénique de la myosine-7a dans le génome du baculovirus par la transposition de l’élément mini-Tn7 du vecteur pACEBac1 vers le site cible mini-attTn7 dans le génome. (D) Produire des baculovirus exprimant le complexe myosine-7a en transfectant des cellules Sf9 avec le bacmid recombinant contenant la cassette multigénique de la myosine-7a. (E) Le baculovirus peut être amplifié en inoculant le virus P0 dans une culture en suspension de cellules Sf9 et en recueillant le surnageant. Le produit résultant, le virus P1, peut être utilisé pour l’expression de protéines à grande échelle. (F) Flux de travail pour la purification du complexe de myosine-7a par colonne d’affinité FLAG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Images fluorescentes représentatives de cellules Sf9 transfectées avec un bacmid exprimant la myosine-7a avec une étiquette GFP C-terminale. Les images montrent la progression normale de l’infection à baculovirus : les cellules commencent à exprimer la myosine-7a vers le 4e jour après la transfection, presque toutes les cellules étant infectées dans la semaine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Gels SDS de protéines du complexe myosine-7a purifiées et de protéines à chaîne légère. (A) Holoenzyme myosine-7a humaine purifiée sur toute la longueur à l’aide du système MultiBac. La chaîne lourde (HC) et les chaînes légères sont indiquées. (B) RLC et CALML4 purifiés à l’aide du système His6-SUMO. La calmoduline (CaM) est achetée (voir la table des matières) et purifiée à partir du cerveau bovin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Flux de travail pour l’assemblage de la chambre d’écoulement et les tests de glissement d’actine. Une lamelle traitée à la nitrocellulose est fixée à une lame de microscope à l’aide de deux morceaux de ruban adhésif double face. Cela crée une chambre d’écoulement d’un volume d’environ 10 μL. Les protéines sont ajoutées séquentiellement à la chambre, tandis que les solutions en excès sont évacuées à travers le canal à l’aide de papier de soie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Résultats représentatifs des dosages des filaments d’actine glissés et de l’analyse de suivi. (A) Image d’exemple d’un enregistrement en accéléré montrant le mouvement des filaments d’actine entraîné par des moteurs à la myosine-7a décorés en surface. (B) Image de suivi du filament sortie du programme FAST pour le même champ de vision que celui illustré en (A). (C) Histogramme représentatif de la vitesse de glissement de l’actine générée par la myosine-7a de mammifère : 4,2 ± 1,4 nm/s (moyenne ± écart-type ; le nombre de traces = 550). (D) Exemple de sortie générée automatiquement à partir du programme FAST montrant la longueur et les vitesses du filament calculées. %STUCK indique le pourcentage de filaments considérés comme bloqués en fonction de la vitesse minimale de coupure fournie par l’utilisateur. MVEL représente la vitesse moyenne de tous les filaments non collés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Essai de glissement des filaments d’actine réalisé avec la myosine-7a. La myosine-7a humaine purifiée sur toute la longueur est attachée à la surface. Cette vidéo a été acquise à raison de 1 image toutes les 30 s avec une exposition de 200 ms. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voici un protocole détaillé pour la production de la protéine myosine-7a humaine recombinante à partir de cellules d’insectes. Bien que le système Sf9/baculovirus ait été utilisé pour produire une variété de myosines 40,41,42,43, ce n’est que récemment que la myosine-7a de mammifère a été purifiée avec succès à l’aide du système de baculovirus MultiBac 14. La myosine-7a de mammifère s’associe à trois types de chaînes légères, qui sont toutes essentielles à l’intégrité structurelle et fonctionnelle de la protéine14. Cela contraste avec son homologue invertébré et la plupart des autres myosines, qui ne se lient généralement qu’à un ou deux types de chaînes légères44,45. Cela signifie que pour synthétiser l’holoenzyme humaine myosine-7a, au moins quatre gènes différents doivent être exprimés simultanément dans chaque cellule Sf9. Dans ce cas, le système MultiBac offre des avantages significatifs par rapport à la co-infection avec plusieurs baculovirus, car il garantit des rapports reproductibles des sous-unités du complexe myosine-7a dans chaque cellule infectée. En fait, Belyaev et al. l’ont démontré statistiquement : à mesure que le nombre de types de virus augmente, la probabilité que les cellules reçoivent un rapport viral égal diminue considérablement46. Par exemple, avec deux types de virus, seulement 12,78 % des cellules atteignent un rapport égal, alors que ce pourcentage tombe à 0,29 % lorsque quatre types de virus sont utilisés, en supposant que chaque type de virus est distribué entre les cellules indépendamment. Cette variabilité peut être problématique lorsque les protéines de la sous-unité doivent s’assembler dans un rapport constant pour produire le rendement maximal du complexe. Bien que cet article se concentre sur la myosine-7a de mammifère, il est de plus en plus évident que le système MultiBac offre une approche plus optimisée pour la production de complexes multimériques que la méthode de co-infection, en particulier pour les protéines avec plus de sous-unités et produites à faible rendement.

Plusieurs facteurs sont essentiels pour obtenir une production à haut rendement de la protéine myosine-7a en utilisant cette méthode. Tout d’abord, il est crucial de déterminer le moment optimal pour la récolte des cellules Sf9 . Cela permet une production maximale de protéines tout en minimisant les effets néfastes de la lyse et de la mort cellulaires causées par le virus. La production de complexes protéiques à base de MultiBac présente souvent un pic d’expression retardé par rapport aux systèmes de baculovirus monocistroniques ou lors de l’expression de protéines plus petites. Nous avons constaté que le meilleur moment pour récolter des cellules infectées par le virus myosine-7a MultiBac se situe entre 60 et 65 heures après l’infection. Une surveillance continue des niveaux d’expression des protéines tout au long du processus est fortement recommandée. Cela peut être accompli à l’aide de la microscopie fluorescente si une étiquette de protéine fluorescente est fusionnée ou par l’analyse SDS-PAGE sinon. De plus, il est important de surveiller simultanément la viabilité cellulaire afin d’identifier le moment optimal pour atteindre le rendement protéique le plus élevé avec une mort cellulaire minimale.

La myosine-7a est une grande myosine monomère sensible à la dégradation des protéines14. Pour éviter la dégradation pendant le processus de purification, il est important de s’assurer que tous les tampons sont pré-refroidis et que toutes les procédures sont effectuées à 4 °C. De plus, il est essentiel de minimiser l’exposition de la myosine-7a aux protéases. En plus d’utiliser des cocktails d’inhibiteurs de protéase, nous recommandons de maintenir l’incubation du lysat cellulaire avec la résine FLAG à seulement 1 h. Il n’a pas été démontré que l’allongement de cette durée améliore significativement la liaison à la résine ou augmente le rendement total en protéines, et peut présenter un risque plus élevé de dégradation des protéines.

Une caractéristique distinctive de la myosine-7a de mammifère, par rapport aux isoformes de l’espèceinférieure 44, est sa combinaison de composants uniques de chaînes légères. Ces chaînes légères jouent un rôle régulateur important dans la fonction de la myosine-7a. Par exemple, la calmoduline interagit dynamiquement avec la chaîne lourde de la myosine d’une manière dépendante de Ca2+ 47, modulant sa motilité et sa production mécanique, un mécanisme qui semble spécifiquement adapté aux cellules ciliées auditives des mammifères14. Bien que les affinités de liaison exactes de la calmoduline aux motifs individuels du QI n’aient pas encore été déterminées dans le contexte de la molécule entière, nous avons observé qu’une partie de la calmoduline se dissocie progressivement à mesure que les chaînes légères en excès dans le lysat cellulaire sont éliminées lors de la purification. Cela peut altérer les propriétés mécaniques de la myosine-7a. Pour atténuer ce phénomène, nous utilisons des colonnes de centrifugation douces combinées à une centrifugation douce pour l’étape d’élution. Cela permet aux protéines d’être éluées dans un petit volume et à une concentration élevée, ce qui peut éviter le besoin d’étapes de concentration. Cette pratique raccourcit le processus total de purification des protéines et minimise le risque de dissociation des chaînes légères. Dans les tests de glissement d’actine, nous incluons des protéines de chaîne légère en excès dans le tampon final pour nous assurer que les chaînes légères natives restent liées à la chaîne lourde de la myosine-7a.

La nécessité d’un excès de chaînes légères représente l’une des nombreuses différences entre le test de glissement d’actine avec la myosine-7a et celui d’autres myosines bien étudiées telles que la myosine-2. Les dosages de la myosine-2 sont généralement effectués à une faible force ionique (par exemple, 50 mM). Lorsque la force ionique est élevée vers 150 mM, les filaments d’actine ont tendance à se détacher et la motilité ralentit. Dans le cas de la myosine-7a, la motilité est bloquée à une faible force ionique, et le glissement n’est observé qu’à une force supérieure ou égale à 150 mM. En raison de l’auto-inhibition de la myosine-7a sur toute la longueur, il est appliqué sur la lamelle dans une solution à haute force ionique d’une manière similaire à la façon dont les filaments de myosine sont dissous avant l’application pour permettre aux protéines de se lier dans une orientation et une conformation qui permettent un glissement ultérieur.

La faible vitesse observée dans les tests de glissement d’actine avec la myosine-7a présente certains défis dans l’acquisition et l’analyse des données de motilité. En effet, la translocation est plusieurs ordres de grandeur plus lente par rapport à la myosine musculaire squelettique, qui était utilisée lors de la mise au point initialede ce test 30. Cette faible vitesse peut entraîner des difficultés de mesure précise et une surestimation de la vitesse qui s’adapte à une fréquence d’imagesde 48. La précision de localisation de toute méthode de suivi est finie, et même un objet statique a un décalage apparent de position entre des images successives. À mesure que le taux d’échantillonnage augmente, cela conduit à une valeur de vitesse artificiellement élevée. Cet effet est vrai pour tout type de test de motilité, mais l’effet relatif est très faible pour les tests où un grand mouvement de plusieurs pixels se produit entre les images. En prenant des points de données à de très longs intervalles (toutes les 60 s, 90 s, etc.), il est possible de vérifier que la vitesse mesurée est précise puisque la valeur ne doit pas être affectée par la fréquence d’échantillonnage. Étant donné que l’intervalle d’enregistrement de la myosine-7a est si long, le délai peut être utilisé pour enregistrer à partir de plusieurs positions au cours de la même acquisition. Cela permet effectivement l’enregistrement de plusieurs films à la fois. Un inconvénient de cette méthode est que les imperfections mécaniques de la platine entraîneront une dérive supplémentaire due au changement de position. Cela peut être pris en compte à l’aide de la stabilisation d’image décrite ci-dessus.

Dans la version Python2 originale du logiciel FAST (github.com/turalaksel/FASTrack), chaque point de données de sortie représente une vitesse pour un filament dans une fenêtre à N images (5 images par défaut). Une version Python3 modifiée du logiciel (github.com/NeilBillington/FASTrack3) comprend une sortie supplémentaire dans laquelle les points de données sont sur une base filament par filament. Les tracés par défaut produits par le logiciel sont basés sur l’ensemble de données de type N fenêtres. Les deux types de sortie sont tout aussi valides, et bien que la sortie originale produise beaucoup plus de points de données par film, nous utilisons généralement les données basées sur le filament car elles sont plus directement comparables aux méthodes existantes de quantification du glissement du filament et fournissent des informations plus intuitives sur le nombre de filaments avec des vitesses spécifiques dans un film particulier. Notez que même dans cette analyse de type filament, le nombre de points de données ne correspondra pas exactement au nombre réel de filaments puisque le suivi s’arrête lorsque les filaments croisent leur chemin, et que de nouvelles traces sont alors détectées lorsqu’elles émergent après le croisement.

Les limites des méthodes décrites dans cet article sont que les protéines de mammifères sont exprimées dans les cellules d’insectes. Bien que de nombreuses protéines de ce type, y compris celle-ci, aient été exprimées avec succès de cette manière, il existe d’autres systèmes d’expression qui peuvent imiter plus étroitement l’environnement natif de la protéine. Les systèmes d’expression des mammifères pourraient introduire d’importantes modifications post-traductionnelles de la protéine qui sont absentes dans le système des insectes. Il en va de même dans une plus grande mesure pour l’expression dans un système bactérien, tel qu’il est utilisé ici pour produire des chaînes légères de myosine. Néanmoins, nous pensons que la simplicité relative et le rendement élevé dans ces cas l’emportent sur les limites potentielles. Le test de motilité in vitro utilisé pour caractériser la protéine est limité dans la quantité d’informations qu’il peut fournir sur la protéine. Par exemple, de nombreux aspects de la régulation de la myosine sont masqués ou contournés par le test et ne peuvent donc pas être étudiés à l’aide de cette technique. De nombreux autres types de tests, tels que la motilité des molécules uniques, le piégeage optique et les techniques biochimiques et biophysiques, existent pour étudier les propriétés de la myosine in vitro, mais le test de glissement filamentaire est choisi ici comme méthode pour mesurer l’activité de la myosine car il nécessite moins de protéines que de nombreux tests biochimiques, est simple à réaliser et où une motilité réussie peut être démontrée, nous dit que la protéine est à la fois biochimiquement et mécaniquement active.

Le flux de travail décrit ici représente une série de méthodes pour produire la protéine myosine-7a de haute qualité et caractériser ses propriétés mécaniques. Bien que ces méthodes soient spécifiquement adaptées à cette classe de myosines, les procédures d’expression et de purification sont plus généralement utiles comme ligne directrice pour la production de ce type de protéine labile, composée de plusieurs polypeptides distincts et ayant une tendance à la dissociation et à la dégradation. De plus, les méthodes de caractérisation sont utiles pour tous les types de protéines motrices, et en particulier, la prise en compte des paramètres d’acquisition et d’analyse des données est destinée à être utile à toute personne mesurant le taux de translocation des moteurs moléculaires à faible vitesse.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le centre d’imagerie microscopique et le centre de fonction visuelle et de morphologie de l’Université de Virginie-Occidentale pour la discussion et l’aide à l’analyse des images. Ce travail est soutenu par les fonds de démarrage menant à la permanence de la faculté de médecine de l’Université de Virginie-Occidentale à R.L. Ce travail est également soutenu par le Centre d’excellence en recherche biomédicale (Vs-CoBRE) (P20GM144230) de l’Institut national des sciences médicales générales (NIGMS) et le Réseau d’excellence en recherche biomédicale de Virginie-Occidentale (WV-INBRE) (P20GM103434).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubes de microcentrifugation de 1,7 mLVWR87003-294
1X FLAG PeptideGenScriptN/ASynthèse peptidique personnalisée
22x22mm N° 1,5 lamellesVWR48366-227
250 mL Tubes à centrifuger coniquesNunc376814
250 mL Erlenmyer Shaker Flaskventilé IntelixBioDBJ-SF250VP
2-MercaptoethanolVWRM131
75x25x1 mm Lames de microscope VistavisionVWR16004-42
Protéine d’actine (>99 % pure)CytosqueletteAKL99
Amicon Ultra-0.5 Unité de filtre centrifugeMillipore SigmaUFC510024
Amicon Ultra-4 Unité de filtre centrifugeMillipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Colonne de chromatographie jetable Bio-SpinBio-Rad732-6008
BL21 Competent E. coliNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher
Albumine sérique bovineMillipore Sigma5470
BstXI EnzymeNew England BiolabsR0113S
CalmodulineMillipore Sigma208694
CatalaseMillipore SigmaC40
Champion pET-SUMO Système d’expressionThermo FisherK30001
Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA RocheDiagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DNase I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
Ruban adhésif double faceOffice Depot909955
EGTA, Biologie moléculaireGrade Millipore Sigma324626-25GM
EGTA, Biologie moléculaireGrade Millipore Sigma324626-25GM
EthanolThermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Refection ReagentGibcoA38915
FAST programhttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements;  ;
Fisherbrand  ; Modèle 505 Sonic DismembratorFisher ScientificFB505110
Gentamicin SolutionGibco15710-06410 mg/mL dans de l’eau distillée
GlucoseMillipore SigmaG5767
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
GlycérolInvitrogen15514-011
Résinede cobalt HisPurThermo Fisher89966
I-CEUII EnzymeNew England BiolabsR0699S
Stabilisateur d’image Pluginhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
ImidazoleMillipore SigmaI2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
IsopropanolFisher ScientificA451SK
KanamycinFisher ScientificAAJ67354AD
Pointes de pipette à grand orificeFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB Agar, Poudre prête à l’emploiThermo FisherJ75851-A1
Inhibiteur de la lupeptine protéaseThermo Fisher78435
Chlorure de magnésiumThermo FisherJ61014.=E1M
Chlorure de magnésiumThermo FisherJ61014.=E1M
Efficacité maximale DH10Bac Cellules compétentesGibco10361012
Tubes de microcentrifugation, 1,7 mLVWR87003-294
Tubes de microcentrifugation, 1,7 mlVWR87003-294
1,7 mlVWR87003-294
Modèle Nikon : Eclipse Ti avec système H-TIRF avec objectif
TIRF Caméra de microscope Appareilde microscope ORCA-Fusion BT
Andor iXon Ultra
Miller' s LB BouillonCorning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Spectrophotomètre UV-Vis microvolumeThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Spectrophotomètre UV-Vis microvolumeThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alpha E.coli compétent (haute efficacité)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElementsNikon
NIS-ElementsNikon
NitrocelluloseLADD Research Industries53152
Opti-MEM I Sérum réduit MediumGibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)QIAGEN28104
Quick CIPNew England BiolabsM0525S
Rhodamine phalloidinInvitrogenR415
S.O.C. MediumInvitrogen15544034
SENP2 protéasePMID :17591783Purifiée en laboratoire
Cellules Sf9Thermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Média sans sérum CompletGibco12658-027
Cassettes de dialyse Slide-A-Lyzer G3, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
Chlorure de sodiumMillipore SigmaS7653
Chlorure de sodiumMillipore SigmaS7653
Système de filtration jetable sous vide à dégagement rapide StericupMillipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X avec 10 mM d’ATPNew England BiolabsB0202A
Chlorhydrate de tétracyclineMillipore SigmaT7660-5G
TrisMillipore Sigma10708976001
Triton XAmerican Bioanalytical9002-93-1
15519028 réactive Tubes de microcentrifugation , Microscope 100X laser

References

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