Purification et caractérisation biophysique de la myosine-7a humaine basée sur le système MultiBac

Marvin Wright; Shayna Redford; Jacob Vehar; Kevin C. Courtney; Neil Billington; Rong Liu

doi:10.3791/67135

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Article de méthode

Purification et caractérisation biophysique de la myosine-7a humaine basée sur le système MultiBac

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DOI :

10.3791/67135

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23 août 2024

Marvin Wright^*¹ , Shayna Redford^*¹ , Jacob Vehar¹ , Kevin C. Courtney¹ , Neil Billington¹^,² , Rong Liu¹

¹Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, ²Microscope Imaging Facility, West Virginia University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole détaille les procédures de production recombinante de l’holoenzyme myosine-7a humaine à l’aide du système de baculovirus MultiBac et d’étude de sa motilité à l’aide d’un test de glissement de filament in vitro sur mesure.

Résumé

La myosine-7a est une protéine motrice basée sur l’actine essentielle aux processus auditifs et visuels. Les mutations de la myosine-7a conduisent au syndrome d’Usher de type 1, la forme la plus courante et la plus grave de surdicécité chez l’homme. On suppose que la myosine-7a forme un complexe d’adhésion transmembranaire avec d’autres protéines Usher, essentiel à l’intégrité structurelle et fonctionnelle des cellules photoréceptrices et des cellules ciliées cochléaires. Cependant, en raison des défis liés à l’obtention de protéines pures et intactes, les mécanismes fonctionnels exacts de la myosine-7a humaine restent insaisissables, avec peu d’études structurelles et biomécaniques disponibles. Des études récentes ont montré que la myosine-7a de mammifère est un complexe moteur multimérique composé d’une chaîne lourde et de trois types de chaînes légères : la chaîne légère régulatrice (RLC), la calmoduline et la protéine 4 de type calmoduline (CALML4). Contrairement à la calmoduline, CALML4 ne se lie pas aux ions calcium. Les calmodulines, sensibles au calcium et insensibles, sont essentielles à la myosine-7a de mammifère pour un bon réglage fin de ses propriétés mécaniques. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour produire une holoenzyme humaine recombinante de myosine-7a à l’aide du système d’expression de la protéine MultiBac Baculovirus. Cela permet d’obtenir des quantités de milligrammes de protéines complètes de haute pureté, ce qui permet leur caractérisation biochimique et biophysique. Nous présentons en outre un protocole pour évaluer ses propriétés mécaniques et mobiles à l’aide de tests de motilité in vitro sur mesure et de microscopie à fluorescence. La disponibilité de la protéine myosine-7a humaine intacte, ainsi que le protocole de caractérisation fonctionnelle détaillé décrit ici, ouvrent la voie à d’autres investigations sur les aspects moléculaires de la myosine-7a dans la vision et l’audition.

Introduction

Les myosines sont des protéines motrices moléculaires qui interagissent avec l’actine pour piloter de nombreux processus cellulaires 1,2,3,4. L’homme possède 12 classes et 39 gènes de la myosine⁵, qui sont impliqués dans un large éventail de fonctions physiologiques, telles que la contraction musculaire⁶ et les processus sensoriels⁷. Chaque molécule de myosine est un complexe multimérique composé d’une chaîne lourde et de chaînes légères....