Une méthode automatisée de strabisme pour synchroniser le comportement et la dynamique cérébrale dans les études sur la douleur chez la souris

Summary

Ce protocole fournit une méthode pour suivre le strabisme oculaire automatisé chez les rongeurs au fil du temps d’une manière compatible avec le verrouillage temporel des mesures neurophysiologiques. Ce protocole devrait être utile aux chercheurs qui étudient les mécanismes des troubles de la douleur tels que la migraine.

Abstract

La douleur spontanée a été difficile à suivre en temps réel et à quantifier de manière à éviter les biais humains. Cela est particulièrement vrai pour les mesures de la douleur à la tête, comme dans des troubles tels que la migraine. Le strabisme est devenu une mesure variable continue qui peut être mesurée au fil du temps et qui est efficace pour prédire les états de douleur dans de tels tests. Cet article fournit un protocole pour l’utilisation de DeepLabCut (DLC) pour automatiser et quantifier le strabisme oculaire (distance euclidienne entre les paupières) chez les souris restreintes avec des mouvements de tête en rotation libre. Ce protocole permet d’associer et de comparer directement la quantification du strabisme oculaire à des mesures mécanistes telles que la neurophysiologie. Nous fournissons une évaluation des paramètres d’entraînement de l’IA nécessaires à la réussite, tels que définis par la discrimination des périodes de strabisme et de non-strabisme. Nous démontrons une capacité à suivre et à différencier de manière fiable le strabisme dans un phénotype de type migraineux induit par le CGRP à une résolution inférieure à la seconde.

Introduction

La migraine est l’un des troubles cérébraux les plus répandus dans le monde, affectant plus d’un milliard de personnes¹. Les modèles murins précliniques de la migraine sont apparus comme un moyen informatif d’étudier les mécanismes de la migraine, car ces études peuvent être plus facilement contrôlées que les études humaines, permettant ainsi une étude causale du comportement lié à la migraine². De tels modèles ont démontré une réponse phénotypique forte et reproductible aux composés induisant la migraine, tels que le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP). Le besoin de mesures robustes des comportements pertinents pour la migraine dans les modèles de rongeurs persiste, en particulier ceux qui peuvent être couplés à des mesures mécanistes telles que l’imagerie et les approches électrophysiologiques.

Les états cérébraux de type migraineux ont été caractérisés phénotypiquement par la présence d’une aversion à la lumière, d’une allodynie de la patte, d’une hyperalgésie faciale à des stimuli nocifs et d’une grimace faciale³. De tels comportements sont mesurés par le temps total passé à la lumière (aversion à la lumière) et les seuils de sensibilité au toucher de la patte ou du visage (allodynie de la patte et hyperalgésie faciale) et sont limités à une seule lecture sur de longues périodes de temps (minutes ou plus). Des comportements semblables à ceux de la migraine peuvent être provoqués chez les animaux en administrant des composés induisant la migraine tels que le CGRP, imitant les symptômes ressentis par les patients humains atteints de migraine³ (c’est-à-dire démontrant la validité apparente). De tels composés produisent également des symptômes de migraine lorsqu’ils sont administrés chez l’homme, démontrant la validité conceptuelle de ces modèles⁴. Des études dans lesquelles les phénotypes comportementaux ont été atténués pharmacologiquement ont conduit à des découvertes liées au traitement de la migraine et fournissent une justification supplémentaire de ces modèles (c’est-à-dire démontrant la validité prédictive)^5,6.

Par exemple, il a été démontré qu’un anticorps monoclonal anti-CGRP (ALD405) réduisait le comportement d’aversion à la lumière⁵ et la grimace faciale chez les souris⁶ traitées avec le CGRP, et d’autres études ont démontré que les médicaments antagonistes du CGRP réduisent les comportements de migraine induits par le protoxyde d’azote chez les animaux ^7,8. Des essais cliniques récents ont montré le succès du traitement de la migraine en bloquant le CGRP ^9,10, ce qui a conduit à plusieurs médicaments approuvés par la FDA ciblant le CGRP ou son récepteur. L’évaluation préclinique des phénotypes liés à la migraine a conduit à des percées dans les résultats cliniques et est donc essentielle pour comprendre certains des aspects les plus complexes de la migraine qui sont difficiles à tester directement chez l’homme.

Malgré de nombreux avantages, les expériences utilisant ces lectures comportementales de la migraine chez les rongeurs sont souvent limitées dans leurs capacités d’échantillonnage de points temporels et peuvent être subjectives et sujettes à l’erreur expérimentale humaine. De nombreux tests comportementaux sont limités dans leur capacité à capturer l’activité à des résolutions temporelles plus fines, ce qui rend souvent difficile la capture d’éléments plus dynamiques qui se produisent à une échelle de temps inférieure à la seconde, comme au niveau de l’activité cérébrale. Il s’est avéré difficile de quantifier les éléments les plus spontanés et naturels du comportement au fil du temps à une résolution temporelle significative pour l’étude des mécanismes neurophysiologiques. La création d’un moyen d’identifier l’activité semblable à la migraine à des échelles de temps plus rapides permettrait de valider extérieurement les états cérébraux de type migraine. Ceci, à son tour, pourrait être synchronisé avec l’activité cérébrale pour créer des profils d’activité cérébrale plus robustes de la migraine.

L’un de ces phénotypes liés à la migraine, la grimace faciale, est utilisé dans divers contextes comme mesure de la douleur chez les animaux qui peut être mesurée instantanément et suivie dans le temps¹¹. La grimace faciale est souvent utilisée comme indicateur de douleur spontanée basée sur l’idée que les humains (en particulier les humains non verbaux) et d’autres espèces de mammifères présentent des changements naturels dans l’expression faciale lorsqu’ils ressentent^{de la} douleur. Des études mesurant la grimace faciale comme indication de douleur chez la souris au cours de la dernière décennie ont utilisé des échelles telles que l’échelle de grimace de souris (MGS) pour normaliser la caractérisation de la douleur chez les rongeurs¹². Les variables d’expression faciale du MGS comprennent le resserrement orbitaire (strabisme), le renflement du nez, le renflement des joues, la position de l’oreille et le changement des moustaches. Même s’il a été démontré que le MGS caractérise de manière fiable la douleur chez les animaux¹³, il est notoirement subjectif et repose sur un score précis, qui peut varier d’un expérimentateur à l’autre. De plus, le MGS est limité en ce sens qu’il utilise une échelle non continue et qu’il n’a pas la résolution temporelle nécessaire pour suivre le comportement naturel au fil du temps.

Une façon de lutter contre cela est de quantifier objectivement un trait facial cohérent. Le strabisme est la caractéristique faciale la plus régulièrement suivie⁶. Le strabisme représente la majorité de la variabilité totale des données si l’on tient compte de toutes les variables MGS (strabisse, renflement du nez, renflement des joues, position de l’oreille et changement des moustaches)⁶. Étant donné que le strabisme contribue le plus au score global obtenu à l’aide du MGS et suit de manière fiable la réponse au CGRP ^6,14, c’est le moyen le plus fiable de suivre la douleur spontanée dans les modèles murins de migraine. Cela fait du strabisme un comportement non homéostatique quantifiable induit par le CGRP. Plusieurs laboratoires ont utilisé des caractéristiques d’expression faciale, y compris le strabisme, pour représenter la douleur spontanée potentielle associée à la migraine ^6,15.

Plusieurs défis sont restés à relever en ce qui concerne la réalisation de strabismes automatisés d’une manière qui puisse être couplée à des études mécanistes de la migraine. Par exemple, il a été difficile de suivre de manière fiable le strabisme sans s’appuyer sur une position fixe qui doit être calibrée de la même manière d’une session à l’autre. Un autre défi est la capacité à effectuer ce type d’analyse à une échelle continue plutôt qu’à des échelles discrètes comme le MGS. Pour atténuer ces défis, nous avons cherché à intégrer l’apprentissage automatique, sous la forme de DeepLabCut (DLC), dans notre pipeline d’analyse de données. DLC est un modèle d’apprentissage automatique d’estimation de pose développé par Mathis et ses collègues et qui a été appliqué à un large éventail de comportements¹⁶. À l’aide de leur logiciel d’estimation de pose, nous avons pu entraîner des modèles capables de prédire avec précision des points sur l’œil d’une souris avec une précision proche de celle de l’homme. Cela résout les problèmes de notation manuelle répétitive tout en augmentant considérablement la résolution temporelle. De plus, en créant ces modèles, nous avons créé un moyen reproductible de noter le strabisme et d’estimer l’activité cérébrale de type migraine sur des groupes expérimentaux plus importants. Ici, nous présentons le développement et la validation de cette méthode pour suivre les comportements du strabisme d’une manière qui peut être verrouillée dans le temps par rapport à d’autres mesures mécanistes telles que la neurophysiologie. L’objectif global est de catalyser des études mécanistes nécessitant des comportements de strabisme verrouillés dans le temps dans des modèles de rongeurs.

Protocol

REMARQUE : Tous les animaux utilisés dans ces expériences ont été manipulés conformément aux protocoles approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Iowa.

1. Préparer l’équipement pour la collecte de données

1. Assurez-vous de la disponibilité de tout l’équipement nécessaire : assurez-vous que le matériel recommandé pour l’exécution du DLC dispose d’au moins 8 Go de mémoire. Voir la table des matériaux pour plus d’informations sur le matériel et les logiciels.
   REMARQUE : Les données peuvent être collectées dans n’importe quel format, mais doivent être converties dans un format lisible par le DLC avant l’analyse. Les formats les plus courants sont AVI et MP4.
2. Configurez au moins une caméra de manière à ce qu’un œil d’un animal puisse être détecté. Si les deux yeux sont visibles, effectuez un filtrage supplémentaire, car cela pourrait provoquer des interférences dans le suivi. Voir la section 10 pour un exemple d’un tel filtrage pour les données fournies ici.
3. Installez le DLC à l’aide du package disponible à l’Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.
4. Dans la configuration de l’appareil photo, incluez une seule caméra à un angle latéral (~90°) par rapport à la souris. Pour suivre cet exemple, échantillonnez à 10 Hz, avec les souris restreintes mais libres d’accéder à toute leur gamme de mouvements de tête par rapport au corps. Gardez entre 2 et 4 pouces de l’appareil photo par rapport à l’animal.

2. Configuration du DLC

1. Après avoir installé le DLC, créez l’environnement à partir duquel travailler. Pour ce faire, accédez au dossier dans lequel le logiciel DLC a été téléchargé à l’aide du répertoire de modification avec la commande suivante.
   CD folder_name
   REMARQUE : C’est là que se trouve le fichier DEEPLABCUT.yaml.
2. Exécutez la première commande pour créer l’environnement et activez-la en tapant la seconde.
   conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
   conda activate Deeplabcut
   REMARQUE : Assurez-vous que l’environnement est activé avant chaque utilisation du DLC.
   Après avoir activé l’environnement, ouvrez l’interface utilisateur graphique (GUI) à l’aide de la commande suivante et commencez à créer le modèle.
   python -m deeplabcut

3. Créez le modèle

1. Une fois l’interface graphique ouverte, commencez à créer un modèle en cliquant sur Créer un nouveau projet en bas.
2. Nommez le projet de manière significative et unique pour l’identifier plus tard et entrez un nom en tant qu’expérimentateur. Consultez la section Emplacement pour voir où le projet sera enregistré.
3. Sélectionnez Parcourir les dossiers et recherchez les vidéos pour entraîner le modèle. Sélectionnez Copier les vidéos dans le dossier du projet si les vidéos ne doivent pas être déplacées de leur répertoire d’origine.
4. Sélectionnez Créer pour générer un nouveau projet sur l’ordinateur.
   REMARQUE : Les vidéos doivent couvrir toute la gamme des comportements que vous observerez (c’est-à-dire pliss, non-strabisme et tous les comportements intermédiaires). Le modèle ne sera capable de reconnaître qu’un comportement similaire à celui des données d’entraînement, et si certains composants du comportement sont manquants, le modèle peut avoir du mal à le reconnaître.

4. Configurer les paramètres

REMARQUE : C’est ici que des détails tels que les points à suivre, le nombre d’images à extraire de chaque vidéo d’entraînement, la taille du point d’étiquetage par défaut et les variables relatives à la façon dont le modèle s’entraînera peuvent être définis.

1. Après avoir créé le modèle, modifiez les paramètres de configuration en sélectionnant Modifier le fichier config.yaml. Sélectionnez Modifier pour ouvrir le fichier de paramètres de configuration afin de spécifier les paramètres clés relatifs au modèle.
2. Modifiez les parties du corps pour inclure toutes les parties de l’œil à suivre, puis modifiez numframes2pick au nombre d’images nécessaires par vidéo de formation pour obtenir un total de 400 images. Enfin, modifiez la taille du point à six afin que la taille par défaut lors de l’étiquetage soit suffisamment petite pour être placée avec précision sur les bords de l’œil.

5. Extraire les cadres d’entraînement

1. Après la configuration, accédez à l’onglet Extraire les cadres en haut de l’interface graphique et sélectionnez Extraire les cadres en bas à droite de la page.
2. Surveillez la progression à l’aide de la barre de chargement située en bas de l’interface graphique.

6. Étiqueter les cadres de formation

1. Accédez à l’onglet Cadres d’étiquettes dans l’interface graphique et sélectionnez Cadres d’étiquettes. Recherchez la nouvelle fenêtre qui affiche les dossiers de chacune des vidéos de formation sélectionnées. Sélectionnez le premier dossier et une nouvelle interface graphique d’étiquetage s’ouvrira.
2. Étiquetez les points définis lors de la configuration pour chaque image de la vidéo sélectionnée. Une fois que toutes les images sont étiquetées, enregistrez-les et répétez le processus pour la vidéo suivante.
3. Pour un marquage adéquat du strabisme, utilisez deux points aussi près que possible du plus grand pic de l’œil (centre) et indiquez les positions haut/bas pour chaque point. Le strabisme approximatif est la moyenne de ces deux longueurs.
   REMARQUE : Lors de l’étiquetage, DLC n’enregistre pas automatiquement la progression. Il est recommandé d’effectuer des sauvegardes périodiques pour éviter la perte de données étiquetées.

7. Créer un jeu de données d’entraînement

1. Après l’étiquetage manuel, accédez à l’onglet Entraîner le réseau et sélectionnez Entraîner le réseau pour inviter le logiciel à commencer l’entraînement du modèle.
2. Surveillez la progression dans la fenêtre de commande.

8. Évaluez le réseau

1. Une fois l’entraînement réseau terminé, accédez à l’onglet Évaluer le réseau et sélectionnez Évaluer le réseau. Attendez quelques instants jusqu’à ce que le cercle de chargement bleu disparaisse, indiquant qu’il a terminé l’auto-évaluation et que le modèle est prêt à l’emploi.

9. Analyser les données/générer des vidéos étiquetées

1. Pour analyser des vidéos, accédez à l’onglet Analyser les vidéos . Sélectionnez Ajouter d’autres vidéos , puis sélectionnez les vidéos à analyser.
2. Sélectionnez Enregistrer le(s) résultat(s) au format csv si une sortie csv des données est suffisante.
3. Une fois que les vidéos ont toutes été acquises, sélectionnez Analyser les vidéos en bas pour commencer l’analyse des vidéos.
   REMARQUE : Cette étape doit être terminée avant de générer des vidéos étiquetées à l’étape 9.5
4. Une fois les vidéos analysées, accédez à l’onglet Créer des vidéos et sélectionnez les vidéos analysées.
5. Sélectionnez Créer des vidéos et le logiciel commencera à générer des vidéos étiquetées qui représentent les données affichées dans le .csv correspondant.

10. Traiter les données finales

1. Appliquez les macros trouvées dans https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc pour convertir les données brutes dans le format utilisé pour cette analyse (c’est-à-dire la distance euclidienne).
2. Importez et appliquez les macros étiquetées Étape 1 et Étape 2 au fichier CSV pour filtrer tous les points de données non optimaux et convertir les données en une distance euclidienne moyenne pour les points les plus centraux en haut et en bas de l’œil.
3. Exécutez la macro appelée Step3 pour marquer chaque point comme 0 sans strabisme et 1 strabisme en fonction de la valeur de seuil du script, qui est définie sur 75 pixels.
   REMARQUE : Les paramètres de ces macros peuvent nécessiter un ajustement en fonction de la configuration expérimentale (voir discussion). Le seuil de strabisme et le filtre automatique pour la valeur maximale de l’œil sont des paramètres qui peuvent être modifiés en fonction de la taille de l’animal et de la distance de la caméra. Vous pouvez également ajuster les valeurs utilisées pour supprimer les points sous-optimaux en fonction de la sélectivité du filtrage des données.

Results

Ici, nous fournissons une méthode pour la détection fiable du strabisme à haute résolution temporelle à l’aide de DeepLabCut. Nous avons optimisé les paramètres d’entraînement, et nous fournissons une évaluation des forces et des faiblesses de cette méthode (Figure 1).

Après avoir entraîné nos modèles, nous avons vérifié qu’ils étaient capables d’estimer correctement les points supérieur et inférieur de la paupière (Figure 2), qui servent de points de coordonnées pour la mesure de la distance euclidienne. La distance euclidienne est définie comme la longueur moyenne des distances entre les deux points supérieur et inférieur de l’œil. Notre modèle a été capable de détecter des cas de non-strabisme (Figure 2A) et de strabisme (Figure 2B). Les points bleus indiquent les points utilisés pour déterminer la distance euclidienne pour chaque image. Les points verts, jaunes, oranges et violets ont été utilisés pour aider le modèle à estimer correctement la distance euclidienne et à diminuer la valeur de probabilité lorsque la tête est dans une position sous-optimale (c’est-à-dire en tenant compte des mouvements de la tête et des changements de position entre les sessions). Nous avons ensuite validé la précision du modèle à l’aide d’un certain nombre de méthodes différentes.

Pour valider le nombre idéal de cadres utilisés pour le modèle, nous avons entraîné et testé quatre modèles de différentes tailles de cadre d’échantillon (Figure 3). Nous avons d’abord comparé les valeurs de l’erreur quadratique moyenne (EQM) entre les données de test et d’entraînement afin de valider la capacité des modèles à prédire avec précision les données de test sur lesquelles ils n’avaient pas été entraînés. Cette comparaison a montré que la variabilité entre les points étiquetés manuellement et les points étiquetés par modèle s’est stabilisée après 300 images. Cette tendance était corrélée aux moyennes de vraisemblance rapportées qui semblaient également se stabiliser après 300 images étiquetées. Nous avons utilisé ces valeurs de vraisemblance rapportées pour filtrer les points inférieurs à 0,92. Ces valeurs de vraisemblance indiquent le degré de confiance du modèle dans le fait qu’un point donné a été correctement étiqueté sur la base des données d’entraînement. Nous avons fait la moyenne de ces valeurs pour les points qui contribuent à la métrique de distance euclidienne afin d’examiner les performances des modèles les uns par rapport aux autres. Bien qu’il n’y ait pas de différence significative entre 300 et 400 images, nous avons utilisé 400 images parce qu’elles étaient en moyenne supérieures à la valeur de vraisemblance de 0,95, ce qui se rapproche de notre seuil pour le filtrage manuel et s’aligne sur le seuil utilisé dans des modèles similaires pour l’estimation de la pose¹⁶.

Une autre façon de valider la précision du modèle a été d’utiliser une matrice de confusion comparant les cadres annotés manuellement aux cadres étiquetés DLC. Deux personnes aveugles ont annoté manuellement 300 images du même œil dans huit vidéos. Nous avons utilisé ces données pour construire une matrice de confusion afin d’évaluer les vrais et les faux positifs et négatifs (figure 4), où les données notées manuellement ont été utilisées comme vérité terrain. Pour DLC, une valeur positive du strabisme a été enregistrée lorsque la distance euclidienne a été enregistrée à moins de 75 pixels (c’est-à-dire que l’animal plisse les yeux), et une valeur négative a été enregistrée pour des valeurs supérieures à 75 pixels (c’est-à-dire que l’animal ne plisse pas les yeux). Nous avons trouvé une valeur prédictive positive de 96,96 %, qui est le pourcentage de temps pendant lequel le modèle prédit avec précision le strabisme par rapport à un strabisme annoté manuellement. Nous avons trouvé une valeur prédictive négative de 99,66 %, qui est le pourcentage de temps pendant lequel le modèle prédit avec précision l’absence de strabisme par rapport au strabisme annoté manuellement. Ceux-ci montrent la proportion de valeurs négatives et positives qui ont été correctement étiquetées. Nous avons également trouvé un taux de vrais positifs de 98,1 % et un taux de vrais négatifs de 99,46 %, qui représentent la prédiction précise du modèle des valeurs positives et négatives par rapport à toutes les valeurs positives et négatives, respectivement. Notre coefficient de corrélation de Matthews, ou MCC, était de 93,8 %, indiquant le coefficient de corrélation entre les valeurs observées et prédites.

Une fois que nous avons été convaincus que notre modèle suit de manière fiable le strabisme, nous avons comparé cette méthode DLC à une méthode de suivi du strabisme précédemment publiée à l’aide d’un ensemble de données précliniques sur la migraine¹⁴. Nous appellerons cette autre méthode le « modèle de strabisme de zone (ASM) » car elle a été développée en utilisant la zone oculaire ouverte comme variable continue mesurant le strabisme¹⁴. Le modèle de strabisme de zone utilise un logiciel de détection faciale entraîné combiné à un script MATLAB personnalisé pour analyser la surface moyenne des pixels de l’œil tout en excluant les images avec un taux d’erreur de suivi de >15 %¹⁴. L’une des principales limitations est que l'« ASM » n’est pas open source et, par conséquent, n’est pas largement accessible. Le DLC permet une optimisation et une adaptabilité accrues sans nécessiter un achat important de logiciels et de matériel.

Nous avons utilisé un ensemble de données de 10 souris CD1 femelles et 10 souris CD1 mâles. Expérimentalement, tous les animaux ont été acclimatés à des contraintes douces pendant 30 minutes sur un total de 3 jours avant le début des enregistrements. Chaque animal a été enregistré pendant 5 minutes pour les enregistrements de base, puis 5 minutes pour les enregistrements de traitement. Au cours des séances de traitement, les animaux ont été traités avec du PBS (véhicule) ou 0,1 mg/kg de CGRP (traitement) par voie intrapéritonéale pour induire un état semblable à celui de la migraine. Les données ont été recueillies dans une pièce bien éclairée à l’aide de caméras équipées d’une lumière infrarouge pour éclairer le visage, assurant ainsi une détection précise des points de repère. La caméra infrarouge était équipée d’un objectif à iris manuel Kowa LM35JC 2/3" 35 mm F1.6 à monture C avec une distance focale de 254 mm et une ouverture ajustée de manière appropriée. Après avoir collecté les données, nous avons utilisé l’ASM et le DLC pour analyser les données. Étant donné que la notation manuelle a été conventionnellement utilisée sur le terrain pour quantifier la grimace faciale, le strabisme étant une composante de la grimace faciale¹⁴, nous avons également comparé nos données aux données notées manuellement.

Sur la base des résultats précédents selon lesquels l’injection périphérique de CGRP induit une réponse de strabisme chez la souris, nous nous attendions à observer des différences significatives dans la réponse de strabisme entre le véhicule et le traitement par CGRP ^6,14. Nous avons comparé les méthodes ASM, manuelles et DLC et avons constaté que notre modèle détectait de manière robuste un phénotype de strabisme, tout comme le faisaient les méthodes manuelles et ASM (Figure 5). Il est important de noter que le modèle ASM a été utilisé pour évaluer la douleur et le strabisme induits par le CGRP. Dans cette étude, Rea et al. ont comparé la réponse au strabisme après CGRP à la réponse au strabisme après l’injection de formol de la patte arrière dans le cadre d’un test d’induction de la douleur « plus traditionnel »¹⁴. De plus, il est bien documenté que le CGRP induit une hypersensibilité au toucher chez les souris grâce à l’utilisation de von Frey ^3,17. Conformément au terrain, nous avons normalisé le strabisme moyen pendant la séance de traitement à une base de prétraitement de 5 minutes pour chaque animal et comparé le PBS (n = 10) aux animaux traités au CGRP (n = 11). Les analyses statistiques des groupes PBS par rapport aux groupes traités par CGRP sont les suivantes. Nous avons constaté que les animaux traités au CGRP présentaient une diminution de la surface moyenne des pixels en utilisant la méthode de suivi par strabisme de zone (p = 0,012, figure 5A) et une diminution de la distance euclidienne lorsqu’ils étaient notés manuellement (p = 0,0007, figure 5B) et en utilisant notre modèle DLC (p = 0,007, figure 5C). Lorsque nous avons comparé chaque méthode au fil du temps chez un seul animal représentatif, le même schéma a été observé (Figure 5). Cet animal a montré un phénotype de strabisme très clair en réponse au traitement par CGRP, mais pas au PBS. Tous les modèles ont été en mesure de détecter ces différences, mais les données étaient plus clairement représentées dans notre modèle DLC (Figure 5). Des mesures précises et exactes sont particulièrement importantes lorsque les données doivent être analysées à des résolutions plus fines où la moyenne n’est pas indicative de la lecture comportementale complète (par exemple, l’activité cérébrale). La méthode DLC de détection du strabisme chez la souris nous permet de collecter des données à l’ordre de la milliseconde et de les verrouiller dans le temps pour mesurer l’activité cérébrale (par exemple, les potentiels de champ locaux), ce qui se produit à l’échelle de l’ordre de la milliseconde. Nous pouvons ensuite utiliser cette technique pour établir un profil plus robuste d’un état cérébral indiquant une douleur spontanée dans le contexte de la migraine et d’autres troubles cérébraux complexes.

Figure 1 : Vue d’ensemble de la procédure de génération d’un réseau entraîné avec DLC. Schéma général du processus par lequel les caractéristiques oculaires d’un animal sont suivies puis analysées à l’aide de l’apprentissage automatique. Abréviation : DLC = DeepLabCut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemple de suivi automatisé du strabisme chez une souris CD1 représentative. (A) Exemple d’une image montrant le strabisme de suivi DLC (points colorés) sur le contour de l’œil pendant la journée de traitement lorsque la souris ne plisse pas les yeux. (B) Exemple d’une image montrant la détection automatisée du strabisme le jour du traitement, à l’aide de notre modèle DLC. La distance euclidienne a été mesurée à l’aide de la distance moyenne entre B et C, les points bleus, en haut et en bas de l’œil. Les ensembles de points bleus en haut et en bas de l’œil sont utilisés pour suivre la distance euclidienne. Les autres points (vert, jaune, orange, violet) sont des points de repère utilisés à la fois pour aider le modèle à estimer les points de distance euclidiens et à filtrer le positionnement sous-optimal de la tête après la collecte de données. Abréviation : DLC = DeepLabCut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Justification du nombre de cadres utilisés pour l’entraînement du modèle. (A) L’analyse de l’erreur quadratique moyenne indique la distance moyenne entre les valeurs prédites et observées pour les ensembles de données d’essai et d’entraînement. L’ensemble de données d’entraînement représente les images échantillonnées lors de l’entraînement du modèle, et l’ensemble de données de test représente les images non d’entraînement utilisées pour valider la capacité du modèle à identifier des images similaires mais différentes. Nous avons utilisé cinq ensembles de données d’entraînement et de test et avons constaté que les valeurs RMSE se stabilisaient autour de 300 images pour le groupe de test. (B) La probabilité qu’un point donné soit correctement étiqueté (moyenne + SEM). Cela a montré que 400 trames étiquetées manuellement étaient idéales car les ensembles de données brutes avaient une probabilité moyenne supérieure à 0,95, tout en ayant un score RMSE le plus proche de celui des données d’entraînement. Cela signifie que le modèle a été capable d’approximer étroitement les points sur lesquels il avait été entraîné tout en rapportant la plupart des images avec une forte probabilité. Abréviation : RMSE = erreur quadratique moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Matrice de confusion pour les mesures de strabisme DLC. Nous avons échantillonné 300 secondes de huit vidéos (cinq CGRP et trois PBS) et avons comparé ces points à un score binaire oui ou non étiqueté manuellement pour le strabisme. Nous avons quantifié les valeurs prédites comme celles identifiées par DLC et les valeurs réelles comme celles notées manuellement par un humain. Nous avons ensuite comparé cela aux données notées manuellement pour voir combien de fois le strabisme était correctement identifié par rapport au oui ou non binaire noté manuellement du strabisme. Abréviations : DLC = DeepLabCut ; CGRP = peptide lié au gène de la calcitonine ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate ; TP = vrais positifs ; FP = faux positifs ; FN = faux négatifs ; TN = vrais négatifs ; PPV = valeur prédictive positive ; VAN = valeur prédictive négative ; TPR = taux de vrais positifs ; TNR = taux négatif réel ; MCC = coefficient de corrélation de Matthieu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Phénotype du strabisme sur trois modèles différents pour détecter le strabisme. Les deux rangées supérieures contiennent le même animal représentatif de chaque condition (PBS ou CGRP) dans trois modèles différents pour détecter le strabisme. La rangée du bas reflète les moyennes pour tous les animaux. (A) Il y a eu une diminution de la surface moyenne des pixels (surface globale moyenne des pixels/ligne de base) chez les souris traitées au CGRP par rapport aux souris traitées au PBS (t(18) = 2,805, p = 0,012) après le traitement de toutes les données à l’aide du modèle de strabisme de zone¹⁴ précédemment publié et validé. (B) Il y avait une réponse similaire dans les données notées manuellement (t(18) = 4,064, p = 0,0007). (C) Les souris traitées au CGRP ont montré une diminution de la distance moyenne entre les paupières (distance euclidienne de traitement/distance euclidienne de prétraitement, ligne de base) par rapport aux souris traitées par PBS (t(18) = 3,040, p = 0,007 lors de l’utilisation du DLC pour traiter toutes les données. N = 20 (10 femelles, 10 mâles). Les barres d’erreur indiquent la moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole fournit une méthode approfondie facilement accessible pour l’utilisation d’outils basés sur l’apprentissage automatique qui peuvent différencier le strabisme avec une précision proche de celle de l’homme tout en maintenant la même (ou meilleure) résolution temporelle que les approches précédentes. Principalement, cela rend l’évaluation du strabisme automatisé plus facilement accessible à un public plus large. Notre nouvelle méthode d’évaluation du strabisme automatisé présente plusieurs améliorations par rapport aux modèles précédents. Tout d’abord, il fournit une métrique plus robuste que l’ASM en utilisant moins de points qui contribuent réellement à la quantification du strabisme. Cela réduit la probabilité de faux positifs et négatifs en faisant en sorte que l’analyse repose sur moins de points lors de la génération des valeurs qui indiquent le strabisme. En d’autres termes, le modèle DLC rend chaque point autour de l’œil nécessaire mais pas suffisant pour l’inclusion d’un point temporel. Cela nous permet de filtrer les données sous-optimales en utilisant le même nombre de points que l’ASM sans avoir à compter sur la plus grande variabilité qui découle de l’utilisation d’un tel nombre de points constitutifs. De plus, nous avons réduit le risque d’erreur humaine en concevant des modèles qui ne reposent pas entièrement sur la précision des personnes formées.

Lors du traitement des données, nous avons constaté que notre méthode filtrait avec précision les points sous-optimaux et les points aberrants qui étaient plus grands que ce qui était possible, compte tenu de la taille maximale de l’œil de la souris (section 10 du protocole). Nous avons utilisé des macros qui vérifiaient si chacun des 10 points entourant l’œil individuellement avait une valeur de vraisemblance supérieure à 0,92 et filtrions ceux qui étaient inférieurs à cette valeur. À l’avenir, cela peut être ajusté pour rendre les données traitées plus ou moins sélectives. Les macros ont également filtré toutes les valeurs de distance euclidienne supérieures à 200 pixels, car nous avons constaté que la plus grande distance possible entre le haut et le bas de l’œil était de 150 pixels. Cela peut devoir changer en fonction de la configuration expérimentale. Si l’appareil photo n’est pas à la même distance de l’œil, la valeur maximale peut être nettement supérieure ou inférieure. La force de ces macros est qu’elles nous ont permis d’extraire des mesures entre le haut et le bas de l’œil d’une manière qui dépendait du modèle rapportant une probabilité plus élevée pour tous les points constitutifs entourant l’œil.

DLC et l’ASM sont tous deux limités en ce sens qu’ils reposent sur le fait que la souris est dans une position fixe à une distance prédéterminée de la caméra pour permettre une mise à l’échelle cohérente du grossissement entre les conditions de base et les conditions de traitement. Ainsi, un mouvement de l’animal lui-même, un positionnement incorrect dans l’appareil ou un changement dans la procédure expérimentale compromettrait la capacité du modèle à détecter la surface totale de l’œil. Notre modèle améliore quelque peu ces limitations en utilisant la distance euclidienne, c’est-à-dire la distance de haut en bas de la longueur de l’œil, ce qui permet un meilleur suivi malgré les différences d’angles de la caméra, le mouvement de l’animal et les variations expérimentales entre différentes sessions sans nécessiter de recalibrage supplémentaire. Cependant, nous reconnaissons que des améliorations de la normalisation pour tenir compte du mouvement de la tête pourraient entraîner un suivi encore meilleur du strabisme chez les animaux en mouvement.

Une autre limitation de notre méthode est qu’elle filtre les points où la distance euclidienne s’approche de zéro, dénotant la fermeture de l’œil. Malgré le filtrage de ces contributeurs significatifs au strabisme, nous avons tout de même été en mesure de détecter une réponse au strabisme induite par le CGRP de manière plus robuste que les méthodes précédentes (p = 0,007). La suppression de cette composante du strabisme devient particulièrement limitative lorsque l’on essaie de comparer avec d’autres points d’intérêt, tels que l’activité cérébrale. Nous pensons que trouver une signification tout en supprimant ces points montre la robustesse de cette méthode, mais nous reconnaissons que l’élimination de ces composants du strabisme n’est pas idéale. Les études futures utilisant cette méthode devraient inclure un plus grand nombre d’images aberrantes pour mieux entraîner les modèles à reconnaître le strabisme lorsqu’il s’approche de zéro. Dans l’ensemble, le développement d’une méthode de suivi fiable du strabisme automatisé peut permettre des études visant à associer des caractéristiques importantes du comportement naturel à son état cérébral, permettant une étude robuste des profils d’activité cérébrale tels que dans le contexte de la migraine.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CUDA toolkit 11.8
cuDNN SDK 8.6.0
Ordinateurs Intel avec Windows 11, 13e génération  ;
Module complémentaire de suivi des paupières LabFaceX 2D pour une souris en itinérance libre :	FaceX LLC	NA N’importe	quelle caméra capable d’enregistrer l’œil d’un animal est suffisante, mais il s’agit de notre matériel de suivi oculaire.
Pilote de GPU NVIDIA de version 450.80.02 ou ultérieure
NVIDIA RTX A5500, 24 Go DDR6	NVIDIA	[490-BHXV]	Tout GPU répondant à la configuration minimale requise spécifiée pour votre version de DLC, actuellement de 8 Go, est suffisant. Nous avons utilisé NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU
Python 3.9-3.11
TensorFlow version 2.10