Utilisation d’un test de décalage thermique pour sonder la liaison du substrat à la sélénoprotéine O

Une grande partie du protéome humain reste mal caractérisée. L'« effet de lumière publique » décrit par Dunham et Kustatscher et al. fait référence au phénomène où les protéines largement étudiées reçoivent plus d’attention, laissant les protéines sous-étudiées négligées ^1,2. Les facteurs contribuant à cet effet comprennent l’importance biologique et la pertinence de certaines protéines pour la maladie. De plus, les recherches antérieures qui offrent des connaissances fondamentales, ainsi que la disponibilité d’outils pour l’analyse fonctionnelle, stimulent davantage la recherche sur les protéines ^1,2 très étudiées. Des projets tels que l’Initiative sur les protéines sous-étudiées, le Consortium en génomique structurale et l’Initiative sur la fonction enzymatique visent à caractériser les protéines sous-étudiées à l’aide de la protéomique structurale et fonctionnelle ^2,3,4. Une approche complémentaire pour identifier les fonctions moléculaires des protéines sous-étudiées consiste à examiner les interactions de ces protéines avec de petites molécules afin d’obtenir des informations précieuses sur la régulation et la spécificité du substrat.

La liaison de petites molécules peut augmenter la stabilité thermique d’une protéine⁵. Ce phénomène, connu sous le nom de stabilisation de conformation induite par le ligand, entraîne souvent une augmentation de la température de fusion d’une protéine, fournissant une indication mesurable de la liaison du ligand⁶. La stabilité thermique d’une protéine peut être mesurée à l’aide de la fluorimétrie différentielle à balayage (DSF), également connue sous le nom de thermofluor, ou du test de décalage thermique (TSA)7,8,9,10. Dans la TSA, un échantillon de protéine est soumis à des températures croissantes en présence d’un colorant sensible à l’environnement⁶. Au fur et à mesure que la protéine se déploie et se dénature, le colorant se lie aux régions hydrophobes exposées de la protéine et émet une fluorescence. Les colorants fluorescents extrinsèques, ou colorants sensibles à l’environnement, n’ont pas de fluorescence intrinsèque et deviennent fluorescents lors de l’interaction avec leur molécule cible ^9,11,12. Le colorant le plus couramment utilisé, SYPRO Orange, offre plusieurs avantages tels qu’une stabilité accrue et une fluorescence de fond minimale ^8,9,12. Notamment, SYPRO Orange est compatible avec les systèmes de réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) compte tenu de ses longueurs d’onde d’excitation et d’émission d’environ 470 nm et 570 nm, respectivement. Cette caractéristique unique permet d’obtenir des mesures à haut débit, précises et sensibles, compatibles avec les systèmes de détection de fluorescence couramment utilisés dans les systèmes RT-PCR⁸.

La TSA est un outil polyvalent pour étudier les interactions des protéines avec des cofacteurs ou des médicaments potentiels et pour identifier les conditions stabilisatrices de la cristallographie. Certains de ses avantages par rapport aux autres méthodes de criblage sont sa relative simplicité de configuration et son débit élevé avec des plaques de 96 ou 384 puits 13,14,15. Le développement de cette technique a transformé les études de découverte de médicaments, offrant une commodité et permettant l’étude de divers additifs tels que les ions, les ligands et les médicaments ^6,16. De plus, l’adaptabilité de la TSA a encouragé les scientifiques à étendre son utilité, facilitant la mesure des affinités de liaison parallèlement aux tests de dépistage^17,18. La TSA est un outil efficace dans les études de biologie structurale pour identifier les conditions qui favorisent la stabilisation de la protéine d’intérêt pour la cristallisation¹⁹. Ainsi, sa flexibilité et sa relative facilité ont positionné la TSA comme une technique fondamentale dans la caractérisation des protéines. Ici, nous utiliserons la TSA pour analyser la liaison des métaux et des nucléotides à la pseudokinase sous-étudiée, la sélénoprotéine O (SelO), à titre d’exemple.

Les kinases sont l’une des familles de protéines les plus ciblées dans la découverte de médicaments²⁰. Environ 10 % des kinases humaines sont prédites comme étant inactives et appelées pseudokinases parce qu’elles manquent de résidus catalytiques clés nécessaires à la catalyse^21,22. La sélénoprotéine O (SelO) est une pseudokinase conservée au cours de l’évolution qui n’a pas l’aspartate conservé dans le motif catalytique HRD²³. Chez les eucaryotes, SelO se localise dans les mitochondries et protège les cellules du stress oxydatif^24,25. Les analyses structurales et biochimiques montrent que SelO transfère l’adénosine monophosphate (AMP) de l’ATP aux substrats protéiques dans une modification post-traductionnelle connue sous le nom d’AMPylation²⁵. Des études récentes indiquent que les enzymes qui catalysent l’AMPylation peuvent se lier à d’autres nucléotides tels que l’UTP in vitro ^26,27. Notamment, des études ont démontré que l’homologue SelO de Salmonella typhimurium catalyse la protéine UMPylation, ou le transfert d’UMP, de manière dépendante du manganèse²⁸. Compte tenu de ces observations intrigantes, nous testons la liaison de SelO à l’ATP et à l’UTP en présence de magnésium et de manganèse, servant d’exemple représentatif des applications de la TSA. Le protocole suivant peut être facilement adapté pour optimiser et examiner les interactions d’autres protéines et additifs d’intérêt.

1. Dispositif expérimental

1. Utilisez un thermocycleur capable de détecter la fluorescence, tel qu’un instrument RT-PCR, pour exécuter le protocole décrit. Si vous utilisez SYPRO Orange, comme décrit dans ce protocole, utilisez un mode de balayage qui permet une excitation autour de 470 nm et une détection d’émission autour de 570 nm. Programmez le thermocycleur pour qu’il maintienne l’échantillon à 20 °C pendant 2 min, suivi d’une augmentation de la température de 0,5 °C/1 min jusqu’à 95 °C ; mesurer l’intensité de la fluorescence tous les 1 °C.
   REMARQUE : nous recommandons une étape facultative à la fin du cycle pour ramener le bloc d’échantillon à 20 °C (Figure 1).
2. Chaque réaction contient quatre composants : tampon, protéine d’intérêt, additif et colorant fluorescent extrinsèque. Concevez l’expérience de manière à ce qu’elle comprenne des contrôles tels que l’absence de protéines, l’absence de colorants, les protéines sans additifs et les additifs seuls afin de déterminer toute fluorescence de fond susceptible d’influencer l’interprétation des résultats. Si disponible, incluez un témoin positif tel qu’un additif connu pour lier et stabiliser la protéine d’intérêt.
3. Utilisez des protéines purifiées pour le dosage. Pour suivre cet exemple, utilisez E. coli SelO, exprimé et purifié comme décrit précédemment^25,29. En bref, exprimez SelO (E. coli SelO ppSumo) marqué His-sumo dans les cellules Rosetta DE3 et purifiez-le en utilisant l’affinité Ni²⁺-NTA. Couvrez l’étiquette His-sumo à l’aide de la protéase Ulp et purifiez davantage SelO par chromatographie par filtration sur gel.
4. La fluorescence de SYPRO Orange va dépendre de son interaction avec la protéine d’intérêt. Comme ces interactions varieront d’une protéine à l’autre, optimisez la concentration en protéines et en colorants pour obtenir le rapport signal/bruit maximal du signal de fluorescence.
   REMARQUE : SYPRO Orange n’est pas compatible avec certaines protéines et additifs tels que les détergents^11,30. Les colorants extrinsèques supplémentaires énumérés au ^{point 12} peuvent être examinés au besoin.

2. Détermination de la concentration optimale de colorant (Figure 2A)

1. Préparez des dilutions de 20 μL de SYPRO Orange 50x, 40x, 30x, 20x et 10x à partir de la solution mère, qui est fournie à 5 000x dans le DMSO.
2. Distribuer 8 μL de protéine 6,25 μM diluée dans un tampon TSA dans six puits distincts d’une plaque PCR de 384 puits.
   REMARQUE : Dans notre exemple, nous avons utilisé le tampon TSA suivant pour effectuer les dilutions : 10 mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl et 1 mM de DTT. Les échantillons peuvent être analysés en trois exemplaires pour améliorer la fiabilité des résultats.
3. Ajouter 1 μL de tampon TSA dans chaque puits.
   REMARQUE : Ce volume de tampon sera remplacé par l’ajout de petites molécules après optimisation de la concentration du colorant et des protéines.
4. Ajouter 1 μL de chaque dilution en série de la solution de colorant SYPRO Orange dans chaque puits. Ajouter 1 μL de tampon sans colorant dans le puits final pour le contrôle sans colorant.
5. Recouvrez la plaque d’un film adhésif optiquement transparent.
6. Faites tourner brièvement la plaque à 1 000 × g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque PCR.
7. Placez la plaque dans une machine RT-PCR et démarrez le protocole de thermocyclage décrit à l’étape 1.1.

3. Détermination de la concentration optimale en protéines (Figure 2B)

1. Préparez 20 μL de dilutions en série de 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM et 1,56 μM de protéines à l’aide d’un tampon TSA (10 mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl et 1 mM de DTT).
2. Distribuer 8 μL de dilutions en série de la protéine dans cinq puits séparés d’une plaque de 384 puits.
3. Distribuer le tampon uniquement dans le 6ème^{puits comme} un contrôle sans protéines.
4. Ajouter 1 μL de tampon TSA dans chaque puits.
   REMARQUE : Ce volume de tampon sera remplacé par l’ajout de petites molécules après optimisation de la concentration du colorant et des protéines.
5. Ajouter 1 μL de chaque solution de colorant SYPRO Orange 50x dans chaque puits.
6. Recouvrez la plaque d’un film adhésif optiquement transparent.
7. Faites tourner brièvement la plaque à 1 000 × g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque PCR.
8. Placez la plaque dans une machine RT-PCR et démarrez le protocole de thermocyclage décrit à l’étape 1.1.

4. Mise en place d’une expérience TSA (Figure 3A)

REMARQUE : Après optimisation des concentrations de protéines et de colorant SYPRO Orange, le test peut être effectué avec l’ajout des petites molécules souhaitées pour analyser la liaison.

1. Définir le nombre de conditions en tenant compte des répétitions et des contrôles adéquats.
   REMARQUE : Par exemple, nous allons tester la liaison de SelO à huit conditions en trois exemplaires. En incluant les contrôles (pas d’additif, pas de protéine et pas de colorant), nous avons 11 réactions x 3 (en trois exemplaires) = 33 réactions au total.
2. Sur la base de la concentration optimale de protéines et de colorants observée pour SelO, assurez-vous que chaque réaction contient 8 μL de protéine 6,25 μM, 1 μL d’additif et 1 μL de colorant SYPRO Orange 50x pour un volume de réaction total de 10 μL. Ainsi, la concentration finale utilisée est de 5 μM de protéine et de 5x SYPRO Orange.
3. Préparez 288 μL de solution protéique de 6,25 μM à l’aide d’un tampon TSA. Ce volume de solution de travail protéique représente 36 réactions (33 réactions avec 10% supplémentaires pour les variations de pipetage).
4. Distribuez 8 μL de protéine 6,25 μM dans des puits séparés d’une plaque de 384 puits. Distribuez le tampon uniquement pour le contrôle sans protéines.
5. Ajoutez 1 μL de petites molécules à une concentration de 10x pour obtenir le 1x final. Pour suivre cet exemple, ajoutez 1 μL de 20 mM de MgCl₂ pour obtenir une concentration finale de 2 mM. Distributeur de tampon uniquement pour le contrôle sans additif.
6. Ajouter 1 μL de chaque solution de colorant SYPRO Orange 50x dans chaque puits.
7. Recouvrez la plaque d’un film adhésif optiquement transparent.
8. Faites tourner brièvement la plaque à 1 000 × g pendant 1 min dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de plaque PCR.
9. Placez la plaque dans une machine RT-PCR et démarrez le protocole de thermocyclage décrit à l’étape 1.1.

5. Analyse des données

1. Exporter les données de la machine RT-PCR pour les unités de fluorescence relative (RFU) par rapport à la température (°C).
2. Utilisez le logiciel de votre choix pour extraire et tracer des points de données jusqu’à l’intensité la plus élevée mesurée pour chaque courbe de fusion. Il est important de noter que les témoins sans protéine et sans colorant présentent une faible fluorescence de fond sans augmentation de la fluorescence dépendante de la température (figures 3A, B et tableau supplémentaire S1). Effectuez l’analyse de données à l’aide de logiciels librement accessibles tels que MoltenProt³¹ ou DSFWorld³².
3. Déterminez la température de fusion à l’aide de l’ajustement sigmoïdal de Boltzmann pour les données. La température de fusion (T_m) est définie comme la température à laquelle une dénaturation de 50 % ou une intensité mi-maximale est observée (Figure 3C).
4. Un décalage thermique dans la courbe de fusion peut suggérer des additifs stabilisants ou déstabilisants. Pour calculer la variation de la température de fusion (T_m), utilisez la formule : T_m = T_m additif_- T_m tampon. Une valeur positive décrit une condition stabilisatrice ou un additif en interaction ; une valeur négative décrit une condition déstabilisante (figure 3D).

SelO eucaryote se compose d’une séquence de ciblage mitochondrial N-terminal, d’un domaine de type kinase et d’une sélénocystéine hautement conservée à l’extrémité C-terminale de la protéine23. Cette enzyme mitochondriale code pour un domaine pseudokinase qui est conservé des bactéries à l’homme23. L’analyse structurale de l’homologue SelO de Pseudomonas syringae a révélé des altérations des acides aminés dans le site actif qui facilitent la liaison de l’ATP dans une orientation inversée par rapport aux kinases canoniques25. En conséquence, SelO catalyse l’amplylation, plutôt que la phosphorylation, de plusieurs protéines impliquées dans la signalisation antioxydante pour protéger les cellules contre les dommages oxydatifs et la mort cellulaire25. En plus de l’AMPylation, il a été démontré que certaines AMPylases procaryotes et eucaryotes catalysent l’UMPylation27,28.

Nous avons utilisé E . coli recombinant purifié SelO dans la TSA pour examiner la liaison des nucléotides ATP et UTP à SelO en présence de cations divalents. Semblable aux kinases canoniques, SelO héberge le motif DFG dans lequel l’aspartate se lie à l’ion métallique pour coordonner le nucléotide dans le site actif. Tout d’abord, nous avons optimisé la concentration de protéines et de colorants pour des mesures de fluorescence robustes dans la TSA, en déterminant que 5 μM à 10 μM E. coli SelO étaient optimaux avec 5x SYPRO Orange (Figure 2). De plus, nous avons montré que les témoins sans protéine, ainsi que les contrôles sans colorant, avaient un signal de faible fluorescence qui ne répondait pas à l’augmentation de la température. Nous avons détecté des augmentations d’environ +4 °C et +12 °C de la stabilité thermique d’E. coli SelO en présence d’ATP-Mg2+ et d’ATP-Mn2+, respectivement (Figure 3). Cependant, nous n’avons pas observé de changement de stabilité thermique lors de l’incubation avec UTP, ce qui indique que E. coli SelO peut ne pas présenter de liaison détectable à UTP.

Figure 1 : configuration du thermocycleur Un exemple du programme de thermocycleur utilisé pour augmenter la température de l’échantillon de +0,5 °C/min tout en mesurant la fluorescence SYPRO Orange à l’aide du canal FRET. La recommandation comprend également une incubation à température ambiante au début et à la fin du protocole. Abréviation : FRET = Transfert d’énergie de résonance de Förster. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Optimisation des concentrations en protéines et en colorants. (A) Résultats représentatifs de l’optimisation de la concentration du colorant SYPRO Orange à l’aide de 5 μM d’Escherichia coli SelO. (B) Résultats représentatifs de l’optimisation de la concentration d’E. coli SelO à l’aide du colorant orange SYPRO 5x. La courbe de dénaturation thermique représente les unités de fluorescence relatives (axe y) par rapport à la température (axe x). Les résultats représentent la moyenne ± écart-type des puits triples (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Courbes de dénaturation thermique et analyses ΔTm de SelO en présence de cations nucléotidiques et divalents. (A) Données brutes des courbes de dénaturation thermique des échantillons (5 μM d’Escherichia coli SelO en présence de 200 μM d’ATP ou UTP et de cations divalents 2 mM, 5x SYPRO Orange) exportées de la machine RT-PCR et tracées. SelO ATP-Mg représente les échantillons avec SelO, ATP et MgCl2, SelO ATP-Mn représente les échantillons avec SelO, ATP et MnCl2, SelO UTP-Mg représente les échantillons avec SelO, UTP et MgCl2, SelO UTP-Mn représente les échantillons avec SelO, UTP et MnCl2. Notez que les témoins sans colorant et sans protéine présentent une faible fluorescence. Les résultats représentent la moyenne ± écart-type des puits triples (n = 3). (B) Courbes de dénaturation thermique tracées à l’intensité la plus élevée et ajustées à l’équation sigmoïdale de Boltzmann. Bien que la dénaturation thermique de SelO n’ait pas été affectée par l’UTP, nous avons observé un changement marqué de la dénaturation thermique en présence d’ATP (courbes violettes). Les résultats représentent la moyenne ± écart-type des puits triples (n = 3). (C) Histogramme illustrant les valeurs de Tm dérivées de l’ajustement sigmoïdal de Boltzmann des données représentées à la figure 3B. Les résultats représentent la moyenne ± écart-type des puits triples (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histogramme illustrant la variation de la température de fusion ΔTm (Tm additif - Tm tampon). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire S1 : Exemples de données pour la TSA de SelO en présence de métaux et de nucléotides. Tableur des données brutes exportées à partir de l’appareil RT-PCR et des données traitées pour supprimer les valeurs après l’intensité maximale de la RFU, comme décrit dans les étapes de protocole 5.1 et 5.2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.