Article de méthode

Conception et développement guidés par la structure de nouveaux inhibiteurs de la cyclophiline A et dérivés du ganoderiol-F : une approche in-silico

DOI :

10.3791/67145

⸱

23 juin 2026

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour la conception guidée par la structure de l’interaction de liaison protéine-ligand entre la sanglifehrine A et la cyclophiline A/Ganoderiol-F, essentielle à la découverte de nouveaux médicaments. La stabilité du complexe ligand-récepteur a été évaluée à l’aide de simulations de dynamique moléculaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’axe cycline Ds-CDKs (Cyclophiline A (Cyp /Ganodériol F)) joue un rôle crucial dans le cancer à travers divers processus, tels que le contrôle de la prolifération et l’inhibition des cellules cancéreuses. Les dérivés du ganodériol F peuvent servir de cibles oncogéniques pour plusieurs types de cancers. Cette étude a démontré que la conception guidée par la structure et le développement de nouveaux inhibiteurs de Cyp A et de dérivés de Ganodériol F peuvent être utilisés pour sélectionner des positions calculées afin d’augmenter leur efficacité dans les inhibiteurs chimiques et leur interaction avec les récepteurs choisis. Pour cette approche, de nombreuses applications logicielles ont été utilisées afin d’obtenir des interactions moléculaires optimales. Au total, 117 nouvelles molécules inhibitrices de ligand de cyclophiline ont été construites à l’aide du logiciel Chemsketch. Les fichiers PDB convertis des nouveaux ligands inhibiteurs du Cyp A ont été préparés pour l’introduction du récepteur enzymatique Sanglifehrin A. Les interactions d’amarrage ligand-protéine ont été réalisées à l’aide du logiciel AutoDock 4.2.6 pour révéler les meilleures interactions géométriques. Les confirmations d’amarrage ont été effectuées à l’aide du logiciel PyMOL 2.5. Enfin, des liaisons hydrogène ont été détectées à l’aide des logiciels Chimera et Maestro. Le complexe sélectionné accroché au ligand-récepteur a été soumis à une simulation de dynamique moléculaire. Le processus de simulation de la MD a démontré la stabilité du complexe et a indiqué que le ligand choisi peut être utilisé comme inhibiteur de médicaments pour les cellules cancéreuses. Dans les résultats, les acides aminés actifs dans le site de liaison ont été identifiés comme étant l’arginine 55 en mouvement de 1,53Å, l’asparagine (Asn), la glycine (Gly), la thréonine (Thr), la lysine (Lys), l’isoleucine (Iso), l’histidine (Hid), la phénylalanine (Phe) et la cystéine (Cys) avec le plus grand nombre de ligands de liaison hydrogène de 45 hydroxymangiféronique. Cela se connectait avec le récepteur 1nmk dans la coordonnée de la boîte de grille X 38,86, Y de 10,987 et Z de 40,734. L’évaluation du complexe récepteur-ligand 1nmk dans la simulation de dynamique moléculaire (MD) dans la version CHARMM 36 de Gromac présente des degrés optimaux.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cyclophiline A est un puissant inhibiteur du Cyp A humain. La cyclophiline est un inhibiteur robuste qui ne nuit pas au système immunitaire, possède de meilleures qualités pharmacologiques et réduit l’inhibition du transporteur. Un mauvais pronostic a été lié à la surexpression de cyclophilines, une famille de protéines ayant une activité isomérasepeptidyl-prolyl 1. Il a été rapporté que les cyclophilines sont surexprimées dans de nombreux cancers, y compris le carcinome hépatocellulaire. Dans le carcinome hépatocellulaire (CCH), les cyclophilines sont cruciales tant pour la résistance aux médicaments contre le cancer que pour laprolifération 2. L’inhibition acquiert des informations essentielles pour identifier de nouveaux immunosuppresseurs basés sur des dérivés de la quinoxaline en utilisant un docking moléculaire au niveau atomique et une simulation de MD pour déterminer le site de liaison précis de DC838 à CypA 3.

De plus, des recherches in vivo ont montré que la cyclophiline DC838 empêche la prolifération des cellules de rate de souris induite par la concanavaline. Plusieurs études ont rapporté une série d’inhibiteurs macrocyclophilines synthétisés à partir de la sanglifehrine A (SFA), une substancenaturelle 4. L’optimisation initiale du composé a révélé que le groupe hydroxyle du résidu de tyrosine m5, les stéréocentres en C14 et C15, ainsi que le tripeptide de l’acide valine5m5tyrosine5piperazique dans le noyau de Sanglifehrine étaient des facteurs essentiels influençant la puissancedu composé 5. L’unité C185C21 diène de SFA pourrait être remplacée par un groupe styryle pour créer des composés puissants présentant un nouveau mode de liaison, dans lequel la moitié styrène interagit avec l’arginine (Arg)556 du Cyp A via une interaction d’empilement. Les inhibiteurs de la cyclophiline non immunosuppresseurs sont efficaces pour traiter le virus de l’hépatite C. La cyclosporineA1, l’alisporivir et la plupart des autres cyclosporines sont de puissants inhibiteurs de MRP2, MDR1, OATP1B1 et d’autres transporteurs cruciauxde médicaments 7,8.

En revanche, le Ganodériol F purifié à partir de Ganoderma leucocontextum ralentit la progression du cycle cellulaire en inhibant les cyclines CDK4/CDK6 9, et les kinases dépendantes des cyclines (CDK) sont essentielles dans le contrôle du cycle cellulaire des mammifères. La cycline D-CDK4/CDK6 et la cycline E-CDK2 sont les acteurs clés dans le contrôle de la progression du cycle cellulaire par le Ganoderiol F. Par conséquent, le Ganodériol F pourrait être utilisé comme inhibiteur potentiel de CDK4/CDK6 dans le traitement du cancer dusein 10,11. L’AF inhibe la phase G1 du cycle cellulaire, ce qui empêche la croissance des macrophages dépendantes du M-CSF sans affecter la viabilité cellulaire12. L’immunosuppresseur inhibe la prolifération en désactivant l’activité de CDK2. Dans le contexte du cancer, le rôle de la cycline D-CDK4/6, ainsi que d’autres cyclines et CDK, est bien établi. Le cancer se caractérise par une dérégulation anormale de la voie cycline-CDK. Plus précisément, lorsque la cellule est prête à initier la synthèse de l’ADN, CDK4 médie le passage à travers la phase G1 en conjonction avec les cyclines de type D. Ce processus est crucialement lié au développement et à la progression du cancer9.

Le site actif de Cyp A se caractérise par l’arginine catalytique invariante (Arg55) et un mélange très conservé de résidus hydrophobes, aromatiques et polaires, tels que Arg55, Glutamine (Gln), Glycine (Gly) et Thréonine (Thr)1,13,14. Le site actif de la famille des cyclophilines est également constitué d’alanine (Ala) et d’asparagine (Asn)1. Parallèlement, le site actif de SFA est constitué des acides aminés Arg5515, Gln, Gly, Thr, Ala et Asn, qui forment une poche hydrophobe englobant la moitié d’acide piperazine de SFA. Contrairement au Cyp A non ligandé, le liaison entre le macrocycle et le vélo de spinning de SFA force Trp121 à réaligner ses chaîneslatérales 16.

Le 1nmk est sélectionné comme un code PDB spécifique de Sanglifehrin A, comme mentionné dans des étudesprécédentes 17. La SFA, une substance naturelle immunosuppressive, a été découverte pour la première fois dans Streptomyces sp. A92-3081 5,18. La SFA présente de fortes affinités pour le Cyp A et possède une structure distincte par rapport à la CsA, utilisant une méthode unique pour supprimer le système immunitaire. La structure moléculaire complexe de la SFA comprend un macrocycle à 22 membres avec un lien de neuf carbones en position 23, se terminant par une moitié spiro-bicyclique fortement substituée. Des études in vitro avec des fibroblastes pulmonaires humains fibrotiques et des échantillons de patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique ont démontré que l’AFS augmente la production de cyclophiline B et inhibe la sécrétion de collagène de typeI 19,20. Au total, 20 sanglifehrines différentes ont été utilisées pour isoler la SFA (C16). Son affinité pour les cyclophilines est environ 60 fois supérieure à celle des autres membres du groupe SFA dans une expérience de liaison compétitivesans cellules 15. Par exemple, la SFA réduit significativement la quantité d’IL-12p70 bioactif, la principale source d’IL-12 libérée par les cellules dendritiques, inhibant ainsi l’activité cellulaire dendritique. Cette étude suggère que la SFA est un nouveau médicament immunosuppresseur puissant1.

Dans ce protocole, de nouvelles structures de ligands pour le Ganoderiol F/Cyp A étaient générées en utilisant des méthodes in silico avec le logiciel Chemsketch, puis converties en fichiers PDB à l’aide d’un logiciel compatible. La conception de la liaison protéine-ligand est un enjeu important dans le processus de découverte et de conception dumédicament 21,22. Les interactions ligand-récepteur étaient amarrées via le logiciel AutoDock 4.2.6. Les systèmes d’amarrage computationnel génèrent typiquement plusieurs configurations potentielles de complexe protéine-ligand. Un ou quelques candidats ayant la liaison énergétique la plus faible au récepteur 1nmk peuvent être sélectionnés pour l’étape suivante de la conception du médicament afin d’assurer l’efficacité des essais in silico de conception du médicament. Un logiciel Chimère a été utilisé pour identifier le ligand optimal de liaison à l’hydrogène. Enfin, des simulations de dynamique moléculaire (MD) ont été réalisées sur le complexe ligand-récepteur pour en mesurer la stabilité. Cette méthode est décrite dans le protocole ci-dessous.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Génération in silico de ligands et préparations de ligands dans le logiciel ChemSketch

REMARQUE : Ce logiciel sera utilisé pour dessiner la structure d’un ligand/molécule, c’est-à-dire pour l’édition moléculaire.

  1. Dessinez le ligand/la structure comme indiqué dans le processus de dessin suivi dans le logiciel, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 1).
  2. Appuyez sur f9 pour nettoyer la structure après avoir dessiné la structure complète.
  3. Cliquez sur Fichier puis Enregistrer sous . (Naviguez jusqu’au dossier, par exemple, la molécule 1 sera enregistrée dans le dossier 1, et ainsi de suite).
  4. Changez le type Enregistrer sous en molfiles mdl, puis cliquez sur Enregistrer (pas besoin de spécifier un nom de fichier ; utilisez le nom de fichier par défaut fourni par le logiciel, par exemple, noname).
    REMARQUE : Un fichier sera créé dans le dossier, et chaque fichier aura le format mdl d’un ligand de structure 2D.
  5. Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les molécules.

2. Conversion du format de fichier (logiciel Open Babel)

REMARQUE : Le logiciel convertit les formats de fichiers. Ici, le fichier .mol sera converti au format .pdb, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 2).

  1. À gauche, dans le format d’entrée, veuillez sélectionner mol--mdl mol format dans le menu déroulant. De même, à droite, dans le format de sortie, sélectionnez pdb--format de base de données protéique.
  2. Sous le format d’entrée (à gauche), cliquez sur ... (le bouton de navigation).
  3. Naviguez jusqu’au dossier (par exemple, dossier 1), cliquez sur le fichier Chemsketch que je viens de dessiner, puis ouvrez-le.
  4. Sous le format de sortie, cliquez sur ....
  5. Une fenêtre par défaut s’ouvre. Tape 1.pdb ici pour nommer le fichier. Pour la structure 1, tapez 1.pdb et cliquez sur Enregistrer. Répétez cette étape pour la molécule/structure 2, en typant 2.pdb , et ainsi de suite.
  6. Enfin, depuis le centre de l’interface logicielle, cliquez sur Convertir. Cela convertira les coordonnées du format mol MDL au format PDB.
    REMARQUE : Maintenant, un fichier supplémentaire sera ajouté au dossier. Chaque fichier aura un fichier pdb de ligands qui sera utilisé dans les étapes suivantes.
  7. Faites un clic droit sur le fichier nouvellement créé, sélectionnez Ouvrir avec, puis choisissez Notepad.
  8. Répétez les mêmes étapes pour toutes les molécules.
    REMARQUE : AutoDock 4.2.6 apparaîtra sur le bureau après l’installation des outils MGL 1.5.7.
  9. Préparez le fichier d’entrée 1nmk.pdb comme décrit ci-dessous.
  10. Dans le fichier 1nmk.pdb, retirez tous les ligands externes en visitant le site pdb.org et en sélectionnant la structure 1nmk. Cherchez les ligands sous le titre de petite molécule sur la structure 1nmk, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 3).
  11. Trouvez le ligand nommé SFM, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 4), et ouvrez le fichier 1nmk. Téléchargez le fichier PDB 1nmk depuis le site web du PDB. Localiser le résidu de terminaison (TER.), comme montré dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 5).
  12. Supprimez les résidus des ligands externes (SFM) dans la structure 1nmk, en commençant par le résidu après TER et avant le résidu listé avant la fin. Sauvegardez le fichier PDB 1nmk modifié sur le système.
    REMARQUE : Le fichier PDB 1nmk sera prêt, et la préparation du fichier du site de coordonnées actives du récepteur sera dans le tableau 1.
  13. Ouvrez le fichier 1nmk et localisez Arg au nombre d’acide aminé 55.
  14. Trouvez les coordonnées x, y et z, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 6).

3. Préparation des paramètres d’amarrage à l’aide du logiciel AutoDock 4.2.6.

  1. Ouvre le logiciel AutoDock 4.2.6 depuis le bureau.
  2. Sélectionnez AutoDock 4.2.6 4.0 pour la préparation du récepteur 1nmk, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 7).
  3. Ouvre le menu Fichier, choisis Lire les molécules, navigue dans le dossier, sélectionne 1nmk, puis appuie sur Ouvrir.
  4. Appuyez sur Modifier, choisissez Hydrogène, puis cliquez sur Ajouter. Sélectionnez Polar uniquement, puis appuyez sur OK. (Fichier supplémentaire 1, capture d’écran 8).
  5. Appuyez sur Modifier, choisissez Charges, puis sélectionnez Kollman Charges.
  6. Appuyez sur Éditer, choisissez Atomes, puis sélectionnez Assigner un type ad4 (choisissez n’importe lequel d’entre eux).
  7. Ouvre le menu Fichier, choisis Enregistrer et tape pdbqt. Une fenêtre s’ouvrira. Parcourez le dossier 1, tapez le nom du fichier 1nmk.pdbqt, puis cliquez sur Enregistrer.
  8. Sélectionnez depuis Atom, puis ajoutez comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 9). Cochez les cases pour les nœuds de tri, enregistrez les coordonnées de transformation, écrivez tous les enregistrements, puis cliquez sur OK.
  9. Ouvre le ligand, sélectionne entrée, puis ouvre. Naviguez jusqu’au dossier 1, changez le type de fichier pour tous les fichiers, sélectionnez 1.pdb, puis cliquez sur Ouvrir. Une petite fenêtre apparaîtra, fournissant des informations sur le ligand sélectionné, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 10).
  10. Ouvrez le ligand, puis l’arbre de torsion, et enfin Détectez la racine, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 11).
  11. Ouvre le ligand, puis la sortie, puis sauvegarde en pdbqt. Naviguez jusqu’au dossier 1, tapez le nom de fichier 1. pdbqt, puis cliquez sur Enregistrer, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 12).
    REMARQUE : Tous les fichiers pdbqt ligands seront préparés.
  12. Grille ouverte, sélectionnez Macromolécule, choisissez 1nmk, puis sélectionnez Molécule. Un avertissement apparaîtra ; cliquez sur OK, comme montré dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 13). Naviguez jusqu’au dossier 1, tapez le nom du fichier 1nmk.pdbqt, cliquez sur Enregistrer, et lorsqu’une fenêtre de remplacement s’ouvre, cliquez sur Oui, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 14).
  13. Ouvrez la grille, puis définissez les types de cartes, choisissez Ligand, cliquez sur 1, puis sélectionnez Ligand, comme indiqué dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 15).
  14. Préparez le fichier des sites de coordonnées actifs du récepteur GPF comme indiqué dans le tableau 1.
    REMARQUE : Le fichier GPF représente le site de coordonnées actif du récepteur (Tableau 1).
  15. Cliquez sur Grille, puis allez dans la boîte Grille, choisissez Centre, choisissez un atome, et entrez la case Centre de la grille (Fichier supplémentaire 1, capture d’écran 16).
    1. Choisissez Fichier, puis Fermer, en enregistrant les paramètres actuels.
    2. Choisissez Grille, puis Sortie, et enregistrez en GPF. Allez dans le dossier 1 et tapez le nom du fichier 1nmk.gpf.
    3. Choisissez Docking > Macromolecule > définissez le nom du fichier rigide, naviguez jusqu’au dossier 1, puis cliquez sur 1nmk.pdbqt, puis Ouvrir, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 17).
    4. Choisissez Docking, trouvez 1, et sélectionnez Ligand (Fichier supplémentaire 1, capture d’écran 18). Une fenêtre avec les paramètres par défaut s’ouvre. Accepter les paramètres par défaut, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 19).
    5. Ensuite, choisissez Docking, allez dans Paramètres de recherche, sélectionnez Algorithme génétique, ce qui ouvre une fenêtre avec les paramètres par défaut, puis choisissez Accepter, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 20).
    6. Choisissez Docking, puis Output, Lamarckienne AG, comme montré dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 21).
    7. Allez dans le dossier 1, tapez le nom du fichier « 1nmk.dpf », puis cliquez sur Enregistrer, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 22).
      REMARQUE : Fermez la fenêtre logicielle AutoDock 4.2.6, rouvrez-la, et répétez le processus pour la molécule suivante. De plus, le 1nmk.pdbqt, le 1nmk.gpf et le 1nmk.dpf seront prêts pour l’étape du processus d’amarrage.

4. Cygwin-I (Processus d’amarrage)

REMARQUE : Pour créer des fichiers GLG et DLG , exécutez l’algorithme. L’algorithme (AutoGrid) s’exécute dans ce terminal Cygwin. Dans Cygwin, allez jusqu’au dossier. Par exemple, si le dossier 1 se trouve sur le disque C, il devrait contenir un dossier nommé « projet », suivi d’un autre dossier nommé « molécules », puis tous les dossiers qu’il contient. Suivez ces étapes.

  1. Ouvre le terminal Cygwin .
  2. Tapez cd c :/ et appuyez sur Entrée. Ensuite, tape CD project et appuie sur Entrée.
  3. Tipez les molécules cd et appuyez sur Entrée, puis sur CD 1 et appuyez sur Entrée. Maintenant, le dossier 1 se trouve dans le terminal Cygwin.
  4. Tapez ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & et appuyez sur Entrée, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 23).
    REMARQUE : Dans « ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & », -l est un minuscule l.
  5. Tapez tail -f 1nmk.glg et appuyez sur Entrée, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 4).
  6. Si AutoGrid réussit à être terminé, fermez cette fenêtre Cygwin, ouvrez une nouvelle fenêtre Cygwin, et répétez le processus ci-dessus pour la molécule 2.
  7. Répétez cette étape pour toutes les molécules et exécutez l’algorithme (AutoDock 4.2.6).
    REMARQUE : Pour AutoDock 4.2.6, répétez le processus de navigation vers le dossier, et lorsque le dossier est consulté, tapez et appuyez sur Entrée pour AutoDock 4.2.6.
  8. Tapez ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & et appuyez sur Entrée, comme montré dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 24).
    REMARQUE : Dans l’étape ci-dessus, « -l » est une lettre minuscule « L » avec un signe négatif.
  9. Type de queue -f 1nmk.dlg
    REMARQUE : Si l’AutoDock 4.2.6 est terminé, fermez la fenêtre Cygwin et répétez le processus pour la molécule 2.
  10. Suivez cette procédure Cygwin pour toutes les molécules.
  11. Après avoir créé des fichiers DLG pour les molécules, allez dans le dossier 1 et ouvrez le fichier DLG dans WordPad. Appuyez sur Ctrl + F, tapez, puis appuyez sur Entrée trois fois pour atteindre la table RMSD, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 25).
  12. Ouvrez une fenêtre Microsoft Excel ou notez la page et créez trois colonnes : N°, Énergie de liaison minimale , et Courir.
  13. Notez les données selon la table RMSD dans le fichier journal. L’énergie de liaison se trouve en haut de la table, ainsi que la course dans laquelle elle a été observée. Faites cela pour toutes les molécules.
    REMARQUE : La molécule avec la plus faible énergie de liaison est considérée comme meilleure que les autres.
  14. Créez un autre tableau avec les détails (numéro de série, énergie de liaison minimale et parcours) des 20 principales molécules.
    REMARQUE : La procédure suivante sera réalisée uniquement pour les 20 molécules principales.

5. Cygwin-ii

  1. Ouvre le terminal Cygwin, tape cd c :/ et appuie sur Entrée.
  2. Tape cd project et appuie sur Entrée, tape les molécules cd et appuie sur Entrée.
  3. Tapez cd (numéro de dossier de la molécule du dessus sélectionnée) et appuyez sur Entrée.
    REMARQUE : Le numéro doit correspondre au dossier dans le terminal Cygwin.
  4. Type grep '^docked' 1nmk.dlg |cut -c9- > 1nmk_run.pdbqt et appuie sur Entrée. Contrairement à AutoGrid et AutoDock, aucun message de réussite n’apparaîtra pour ce message et appuyez sur Entrée, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 26).
  5. Appuyez sur Entrée, et le fichier sera créé.
  6. Tapez -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb et appuyez sur Entrée. Le fichier sera créé, comme indiqué dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 27).
  7. Ferme la fenêtre du Cygwin.
    REMARQUE : Visualiser l’interaction des ligands et récepteurs après l’amarrage avec le logiciel PyMOL 2.5
    1. Ouvre le logiciel PyMOL 2.5, puis ouvre le fichier, puis sélectionne récepteur.
    2. Ouvrez le fichier, puis sélectionnez la configuration de ligands choisie, comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 28).
    3. Dans PyMOL 2.5, sélectionnez Masquer la molécule et cacher le récepteur. Dans le menu Récepteur , sélectionnez Afficher la surface, comme illustré à la Figure 1A.
      REMARQUE : Pour visualiser la liaison hydrogène dans le complexe récepteur ligand-1nmk, un logiciel de chimère UCSF sera utilisé dans 20 ligands à faible énergie de liaison.

6. Logiciel UCSF Chimera pour la visualisation de la liaison hydrogène et l’analyse des résultats

  1. Ouvre UCSF Chimera, puis sélectionne Fichier, puis Ouvre, et navigue jusqu’au lecteur c :/, puis Projet, Molécules), sélectionne 1nmk.pdb, et ouvre-le.
  2. Sélectionnez le lecteur où se trouvent les molécules, puis ouvrez la protéine dans le programme UCSF.
  3. Sélectionnez Résidu, puis choisissez UNL Zoom.
  4. Sélectionnez Zone, puis appuyez sur OK, puis sélectionnez Action, puis choisissez Étiquette, sélectionnez Résidu, et choisissez Nom + Spécificateur.
  5. Sélectionnez Outils, puis sélectionnez Analyse de structure, puis choisissez Trouver H-Bond, comme montré dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 29).
  6. Ouvrez la fenêtre par défaut et cochez les cases pour les liaisons H de couleur qui ne répondent pas aux critères précis, et ne trouvez que les liaisons H sélectionnées.
  7. Sélectionnez Effacer la sélection pour lancer un nouveau sondage, puis zoomez et recherchez les lignes bleue/orange, qui représentent les liaisons H, comme montré à la Figure 3.
  8. Vérifiez combien d’obligations doivent être comptées.
    REMARQUE : Le zoom doit montrer les interactions des liaisons H avec Arg55, Asn149, Gly150, Lys151, Thr 152, Lys54, Lys155, isoleucine 15623, Histidine 5424, Phénylalanine (Phe)53, cystéine (Cys)52, Gly72, Asn71 et Hid70, et indiquer s’ils se trouvent dans le site actif de la protéine, comme montré à la Figure 3A - D.
  9. Notez le nombre de liaisons H et le nombre de molécules.
  10. Placez la souris sur la ligne montrant la liaison H, indiquant les interactions avec Arg55 et Methionine, Gln, Gly et Thr.
  11. Appuyez sur la touche Imprimer l’écran .
  12. Ouvrez l’application Peinture , collez la figure complémentaire, et enregistrez-la dans le dossier nommé.
    REMARQUE : Pour montrer clairement les liaisons H et les acides aminés du site actif, la structure 2D des ligands et récepteurs choisis doit être la suivante :

7. Préparation du diagramme d’interaction des ligands pour confirmation d’amarrage et affichage de la liaison H

  1. Ouvre le logiciel AutoDock 4.2.6.
    1. Sélectionnez Analyse et ouvrez Macromolécule, puis sélectionnez 1nmk, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 30).
    2. Sélectionnez Analyse et ouvrez Docking, puis choisissez Ouvrir, allez au fichier dlg.pdb, et sélectionnez-le, comme indiqué dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 31).
    3. Sélectionnez Analyse et ouvrez le Docking, puis choisissez d’écrire le ligand d’écran virtuel AutoDock et de l’enregistrer en fichier PDB, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 32).
  2. Ouvrez le logiciel PyMOL 2.5 comme montré dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 33).
    1. Ouvre le fichier dlg.pdb sauvegardé, puis ouvre le fichier 1nmk.pdb.
    2. Ouvrir un fichier, sélectionner Exporter la molécule, puis Enregistrer, comme montré dans le Fichier Supplémentaire 1 (capture d’écran 34).
    3. Ouvrez le logiciel Maestro, ouvrez Fichier, puis choisissez Structure d’importation comme indiqué dans le Fichier Supplémentaire 1 (Capture d’écran 35).
    4. Importez le diagramme d’interaction des ligands, enregistrez la structure 2D, comme montré dans le fichier supplémentaire 2.

8. Simulation MD

REMARQUE : Pour ouvrir GROMACS sous Linux, suivez ces étapes

  1. Téléchargez Ubuntu 20.04.6.
    1. Activez l’application Fonctionnalités de Windows sur le PC. Puis choisissez le sous-système Windows pour Linux et appuyez sur OK.
    2. Suivez-les et appuyez sur Entrée pour installer GROMACS :
      1. Tape sudo apt-get update et appuie sur Entrée, puis sur sudo apt-get upgrade et appuie sur Entrée.
      2. Tapez sudo apt-get install gcc et appuyez sur Entrée, puis sur sudo apt-get install cmake et appuyez sur Entrée.
      3. Tapez sudo apt-get install built-essential , appuyez sur Entrée, puis tapez sudo apt-get install liDevfftwtw3-d et appuyez sur Entrée.
      4. Tapez sudo apt-get install GROMACS et appuyez sur Entrée, puis appuyez sur shift + Ctrl + T.
    3. Ouvrez le dossier sur l’ordinateur personnel et nommez-le GROMACS, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (capture d’écran 36).
    4. Ouvrez le dossier GROMACS et appuyez sur Maj + Ctrl + Droite pour entrer dans Linux.
      REMARQUE : Les simulations utilisaient le modèle d’eau et la version 4.0 de GROMACS, version multicœur Win64, qui incorporait le champ de force CHARMM 36. L’écart de temps a été fixé à 2 fs, la distance de coupure de 1,0 à 1,2 nm a été choisie.

9. Création de topologie de ligands à l’aide des modules pdb2gmx de GROMACS (Fichier supplémentaire 1, capture d’écran 37)

  1. Créez un fichier lig.gro, extrayez le ligand de la structure protéique en tapant grep UNL 135_clean.pdb > lig.pdb et en appuyant sur Entrée, puis en renommant « UNL » en « LIG » dans le fichier.
  2. Ouvre lig.pdb dans PyMOL 2.5, enlève les atomes indésirables en appuyant sur sélectionner les atomes et en appuyant sur supprimer l’atome. Cliquez sur enregistrer pour enregistrer la version nettoyée sous lig_clean.pdb.
  3. Ouvrez le fichier nettoyé dans Avogadro pour ajouter de l’hydrogène avec l’outil Build et enregistrez-le en lig.mol2. Modifiez le haut du fichier dans un éditeur de texte pour vous assurer que le nom du résidu est défini sur LIG.
  4. Tapez perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2 et appuyez sur Entrée.
  5. Générez la topologie des ligands à l’aide de CGenFF : téléchargez lig_fix. mol2, traitez l’entrée et téléchargez lig_fix.pdb. Activez l’environnement Python et exécutez Python cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff et appuyez sur Entrée.
    REMARQUE : Cette étape générera quatre fichiers de ligands (lig.prm, lig.itp, lig.top et lig_ini.pdb).
  6. Générez le fichier ligand.gro , tapez gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro et appuyez sur Entrée.
  7. Séparez la protéine en ne conservant que les atomes non ligands dans prot_clean.pdb et assurez-vous que les atomes UNL soient listés en haut du complexe combiné.

10. Création de topologie protéique dans les modules pdb2gmx de GROMACS (Fichier supplémentaire 1, capture d’écran 38).

  1. Préparez la topologie des protéines, type gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter et appuyez sur Entrée .
  2. Créez le complexe protéine et ligand après avoir ajouté le fichier lig.gro à la fin du fichier pro.gro . Ensuite, tapez gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic et appuyez sur Entrée.
  3. Générez solvat en utilisant le modèle de charge ponctuelle spécifique de l’eau pour maintenir l’équilibre, type gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top et appuyez sur Entrée.
  4. Créer des fichiers ions, taper gmx grompp -f ions.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr et appuyer sur Entrée. Typez gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutre, puis appuyez sur Entrée, puis choisissez le groupe 15 pour ajouter des ions.
  5. Générez une réduction d’énergie em.gro.
  6. Tape gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr et appuie sur Entrée, et tape gmx mdrun -v -deffnm em et appuie sur Entrée.
    REMARQUE : Le système solvaté sera réduit en énergie à un maximum de 50 000 étapes avec un critère de convergence de force de 1 000,0 kJ/mol/nm.
  7. Créez les fichiers index, tapez gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx, appuyez sur Entrée.
  8. Tapez gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 et appuyez sur Entrée.
  9. Générez le fichier index.ndx , tapez gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx et appuyez sur Entrée.
  10. Générez un fichier d’équilibrage NVT nvt.gro , tapez gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr et appuyez sur Entrée. Ensuite, tapez gmx mdrun -deffnm nvt et appuyez sur Entrée.
    REMARQUE : L’équilibrage du système a été effectué à une température de 27,35 °C (300,5 K) pour l’ensemble du nombre d’atomes (N), de volume (V) et de température (V) (NVT) du système pendant 100 ps.
  11. Mettez à jour le fichier topologique topol.top pour inclure la topologie des ligands et les paramètres permettant de produire la NPT.
  12. Générer l’équilibre NPT.
  13. Créer une équilibration NPT de deuxième phase, taper gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr et appuyer sur Entrée, puis taper gmx mdrun -deffnm npt et appuyer sur Entrée.
    REMARQUE : La NVT équilibrée fait référence au nombre de particules, au volume et à la température, tandis que la TNP équilibrée fait référence à la stabilité pour le nombre de particules, la pression et la température. Les fichiers NVT.mdp et NPT.mdp sont nécessaires pour produire les résultats de la simulation MD comme suit.

11. Libérer les contraintes de position et exécuter la simulation de dynamique moléculaire de production pour collecter les données

  1. Tapez gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr et appuyez sur Entrée. Ensuite, tapez gmx mdrun -deffnm md_0_10 et appuyez sur Entrée.
  2. Soumettez le système à une simulation MD de 1 ns pour tester la stabilité du complexe.
    REMARQUE : L’écart quadratique moyen de la racine (RMSD) quantifie la déviation structurelle moyenne des atomes par rapport à une structure de référence, et l’écart quadratique moyen des fluctuations (FMSD) mesure les fluctuations atomiques moyennes dans le temps autour de leur position moyenne. Les deux valeurs sont nécessaires pour finaliser les simulations MD.
  3. Effectuer des analyses structurelles, incluant RMSD, FMSD, liaisons hydrogènes et énergie libre.
  4. Dessinez les graphiques d’analyse avec qtgrace_v026_win7 logiciel et le fichier md_0_10.gro pour afficher la boîte de trajectoire avec le logiciel VMD.

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Résultats

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Comme mentionné dans l’introduction, des études in vivo et in vitro démontrent l’importance des inhibiteurs de la cyclophiline pour simplifier la structure de la Sanglifehrine, réduisant ainsi la prolifération de la rate de souris en interférant avec le cycle cellulaire5 de la souris. De plus, la cyclophiline A, ainsi que les dérivés du ganodériol F, joue un rôle vital dans le repliement des protéines, les réponses immunitaires et la signalisatio...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une nouvelle substance naturelle immunosuppressive appelée SFA ou récepteur moléculaire 1nmk a été extraite de Streptomyces. L’analyse du docking moléculaire a été utilisée pour déterminer les énergies de liaison des ligands construits avec la protéine cible. Les résultats ont montré que, parmi tous les ligands conçus, SFA diffère structurellement de CsA et présente une affinité considérable pour CypA 16. Le cyp A, qui possède une activité isomérase cis-t...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal Cygwin terminal v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorialGromacs tutorialv25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools MGL tools v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open babelOpen babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimeraUCSF chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe

Références

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