Article de méthode

Identification de cellules infectées par EcoHIV chez des souris transgéniques manipulées par la microglie

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DOI :

10.3791/67150

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20 décembre 2024

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1Cognitive and Neural Sciences, Department of Psychology, University of South Carolina, 2Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment la combinaison de l’infection EcoHIV avec des souris Tmem119-EGFP offre un système biologique précieux pour l’étude des altérations microgliales et des réservoirs viraux dans des modèles de rongeurs de troubles neurocognitifs associés au VIH.

Résumé

La thérapie antirétrovirale combinée (cART) a considérablement amélioré la qualité de vie des personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Cependant, plus de 4 millions de personnes vivant avec le VIH ont plus de cinquante ans et souffrent de troubles neurocognitifs associés au VIH. Pour comprendre l’impact du VIH sur le système nerveux central, il est nécessaire de disposer d’un modèle fiable et réalisable du VIH. Auparavant, un nouveau système biologique utilisant l’inoculation chimérique du VIH (EcoHIV) a été développé dans un modèle de rat pour étudier les troubles neurocognitifs et le dysfonctionnement synaptique. Néanmoins, il reste un défi important à relever pour clarifier la distribution neuroanatomique d’EcoHIV, en particulier son expression différentielle dans divers types de cellules du cerveau. Dans la présente étude, EcoHIV avec marquage par fluorescence mScarlet a été modifié et injecté rétro-orbitalement chez des souris knock-in Tmem119-EGFP (qui expriment la protéine de fluorescence verte améliorée principalement dans la microglie) afin de déterminer si la microglie est le principal type de cellule responsable de l’expression virale et des réservoirs de VIH dans le cerveau. Les données actuelles montrent que : (1) in vitro, les signaux de fluorescence EcoHIV-mScarlet étaient principalement localisés dans les cellules de type microglie parmi les cellules cérébrales primaires des rongeurs ; (2) in vivo, l’injection d’EcoHIV-mScarlet chez des souris Tmem119-EGFP a induit une expression significative du VIH dans le cerveau de la souris. La co-localisation des signaux mScarlet et EGFP suggère que la microglie est le principal type de cellule hébergeant le VIH dans le cerveau. Dans l’ensemble, EcoHIV chez les rongeurs offre un système biologique précieux pour étudier les altérations microgliales, les réservoirs viraux dans le cerveau et les mécanismes neurologiques des troubles neurocognitifs associés au VIH.

Introduction

Malgré les avantages considérables de la thérapie antirétrovirale, les personnes vivant avec le VIH (PVVIH) souffrent toujours de troubles neurocognitifs. Pour mieux comprendre les mécanismes neuronaux du trouble neurocognitif associé au VIH (HAND), il est essentiel de disposer de modèles du VIH pour élucider davantage l’implication spécifique du type cellulaire dans NeuroHIV.

Le rat transgénique VIH-1, qui a une exposition constitutive aux protéines virales du VIH-1, est un modèle de rongeur populaire utilisé pour étudier les troubles neurocognitifs 1,2,3,4 et les altérations neuroanatomiques 5,6,7 associés à HAND. La délétion fonctionnelle des domaines gag et pol empêche la réplication virale, ce qui rend le rat transgénique VIH-1 non infectieux 8,9. Récemment, un modèle d’infection chimérique par le VIH (EcoHIV) chez la souris a d’abord été signalé par Potash et coll.10 et plus tard étendu à des rats, ce qui pourrait être avantageux pour d’autres études sur les troubles liés à la main et à l’utilisation desubstances11. Dans ce nouveau système biologique, l’infection systémique par le VIH-1 a été observée ainsi que de nombreuses caractéristiques cliniques du VIH-1 chez l’homme, notamment l’atteinte des lymphocytes et des macrophages, les réponses immunitaires antivirales, le caractère neuro-invasif et l’inflammation cérébrale.

Les microglies jouent un rôle essentiel en tant que macrophages spécialisés résidant dans le cerveau dans le maintien de la fonction cérébrale et de l’homéostasie. Pour distinguer la microglie des types cellulaires étroitement apparentés (par exemple, les monocytes sanguins, les macrophages périvasculaires, les macrophages méningés), la présente étude a utilisé la lignée de souris knock-in Tmem119-EGFP. Des études antérieures ont rapporté que la protéine transmembranaire 119 (Tmem119) présente un modèle d’expression exclusivement spécifique à la microglie dans le tissu cérébral des rongeurs et des humains 12,13,14,15. Le signal EGFP chez les souris knock-in Tmem119-EGFP a été observé dans tout le cerveau et localisé spécifiquement dans les cellules microgliales.

Dans la présente étude, des souris knock-in Tmem119-EGFP ont été inoculées avec le virus EcoHIV-mScarlet, et des cellules positives pour EcoHIV dans le système nerveux central ont été identifiées. Ici, nous présentons un protocole pour l’inoculation EcoHIV-mScarlet chez des souris knock-in Tmem119-EGFP , fournissant un modèle fiable pour cibler thérapeutiquement les altérations microgliales dans le VIH.

Protocole

Le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud a approuvé tous les protocoles relatifs aux animaux (numéro d’assurance fédéral : D16-00028). Toutes les expériences ont strictement suivi les directives établies par les National Institutes of Health dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris knock-in Tmem119-EGFP (mâles âgés de 30 jours, pesant de 23 à 26 g) ont été obtenues d’une source commerciale et hébergées en groupe dans des installations accréditées par l’AAALAC. Tous les animaux ont été logés sous un cycle lumière-obscurité de 12/12 h avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les détails des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Emballage EcoHIV-mScarlet dans des cellules de 293FT

  1. Incuber les cellules de 293 pieds dans une fiole de75 cm 2 pré-enduite de gélatine. Maintenir la croissance des cellules jusqu’à 30 % confluentes à la transfection.
  2. Effectuer la transfection de l’ADN plasmidique (15 μg) d’EcoHIV-mScarlet (Fichier supplémentaire 1) à l’aide de Lipofectamine 3000 (22,5 μL) en suivant les instructions du fabricant (voir le Tableau des matières).
  3. Cultivez les cellules dans un milieu DMEM avec 10 % de sérum FBS pendant 3 jours à 37 °C.
  4. Prélever le milieu conditionnel avec la suspension virale. Centrifugeuse à 500 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférez le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL dans un tube stérile de 50 mL.
  5. Ajouter une certaine quantité de concentrateur Lenti-x (rapport 1:3) au mélange viral (par exemple, 8 mL de concentrateur avec 24 mL de mélange viral). Retournez doucement le tube cinq fois.
  6. Maintenir le mélange de concentrateur virus-Lenti à 4 °C pendant 2 jours. Centrifugeuse à 1 500 × g, 45 min, 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant autant que possible à l’aide d’une pipette.
  7. Remettre la pastille en suspension avec 200 μL pré-refroidis de 100 mM PBS. Conservez le virus à -80 °C.
    REMARQUE : Les détails de l’emballage EcoHIV-mScarlet dans les cellules de 293FT ont été décrits dans notre étude précédente16. Ne pas vortex ou introduire de bulles d’air dans la solution virale.

2. ÉcoVIH-mInfection écarlate dans les cellules cérébrales primaires du rat

  1. Effectuer l’isolement primaire des cellules cérébrales chez les fœtus de rat (18 jours) conformément au rapport16 publié précédemment.
  2. Transférer les cellules dissociées sur des plaques à 12 puits pré-revêtues de poly-L-Lysine avec des inserts en verre contenant 1 mL de milieu DMEM/F12 plus 10 % de FBS. Remplacez le milieu le lendemain par le milieu neurobasal avec un supplément de B27.
  3. Cultivez des cellules cérébrales fœtales primaires dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 3 semaines.
  4. Ajouter EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU/mL) dans le milieu de culture. Incuber les cellules cérébrales cultivées avec EcoHIV-mScarlet pendant 6 jours.
  5. Fixer les cellules avec 4 % de PFA et effectuer une immunocoloration sur les cellules cérébrales infectées à l’aide d’anticorps primaires spécifiques (CD11b/c, Iba1).
  6. Obtenez des images à l’aide d’un objectif de 40× sous un système de microscopie confocale.

3. Infection par le virus EcoHIV-mScarlet dans les cellules gliales primaires de souris adultes

  1. Anesthésier des souris adultes avec du sévoflurane à 5 % pendant 5 minutes (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Stérilisez la peau de la tête avec 70 % d’EtOH.
  2. Après avoir confirmé que la souris ne répond plus aux stimuli nocifs, utilisez des ciseaux aiguisés stérilisés pour effectuer la décapitation. Transférez la tête dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de 5 ml de HBSS.
  3. Ouvrez le cuir chevelu et transférez le tissu cérébral dans une autre boîte de Pétri contenant 5 ml de HBSS stérilisé. Décollez les méninges et transférez le cortex frontal dans 2 ml de HBSS.
  4. Ajouter 20 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans le mélange. Incuber 15 min à température ambiante ; Faites tourner doucement le tube toutes les quelques minutes.
  5. Transférez les cellules dissociées dans une fiole de75 cm 2 pré-enduite de poly-L-Lysine contenant 10 mL de milieu DMEM/F12 et 10 % de FBS.
  6. Cellules de culture à 37 °C, incubateur à 5 % de CO2, jusqu’à 90 % de confluence. Digérez les cellules cérébrales avec 2 ml de trypsine-EDTA à 0,25 %.
  7. Sous-cultiver des cellules cérébrales dans des boîtes à fond de verre de 35 mm contenant 5 mL de milieu de croissance DMEM/F12 jusqu’à ce que la confluence soit de 80 %.
  8. Ajouter EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU/mL) dans le milieu de culture. Incuber des cellules gliales de souris pendant 2 jours.
  9. Vérifiez quotidiennement les signaux de fluorescence rouges (mScarlet) au microscope fluorescent.

4. Injection rétroorbitaire du virus EcoHIV-mScarlet chez des souris Tmem119-EGFP

  1. Utilisez du sévoflurane à 3 % pour anesthésier les souris Tmem119-EGFP (souris mâles et femelles à l’âge de 30 jours) jusqu’à ce qu’elles ne répondent plus aux stimuli nocifs.
  2. Fixez les souris en position latérale avec l’œil d’injection vers le haut et la respiration par le cône nasal, qui est lié à un système d’anesthésie. Utilisez une taille de cône nasal appropriée pour fournir une anesthésie continue.
  3. Décongelez l’EcoHIV-mScarlet sur de la glace. Versez la solution virale dans une seringue d’injection intraoculaire à l’aide d’une aiguille émoussée de 33 G.
  4. Placez la souris dans la position latérale droite et gardez sa tête tournée vers la gauche. Identifiez l’emplacement du canthus médial comme site d’injection.
  5. Après avoir étalé l’œil, insérez lentement et doucement une aiguille (angle de 45 degrés) dans le canthus médial de l’œil. Insérez soigneusement l’aiguille vers l’avant dans les vaisseaux situés derrière le globe oculaire (sinus rétro-orbitaire).
  6. Injecter doucement 6,5 μL d’EcoHIV-mScarlet (1,26 × 106 TU/mL, inoculation bilatérale à l’œil) dans le sinus rétro-orbitaire. Retirez délicatement l’aiguille du sinus rétro-orbitaire et appliquez doucement une pression sur les paupières pour fournir une hémostase.
  7. Appliquez du lubrifiant sur l’œil pour éviter que la cornée ne se dessèche ou ne se blesse.
  8. Laissez les souris récupérer dans une chambre de récupération avec un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elles se réveillent.
    REMARQUE : Le biseau de l’aiguille ne doit pas être positionné trop profondément afin que les artères ne soient pas rompues ou que les os ne soient pas fracturés. La durée de la perfusion virale dépend de plusieurs facteurs (p. ex., volume d’injection, titre, taille de l’animal). Pour la perfusion virale EcoHIV, une expression significative a été observée une semaine après les injections rétro-orbitaires 11,16,17.

5. Visualisation de coupes de tissu cérébral

  1. Anesthésie profondément les souris à l’aide de 5 % de sévoflurane. Passez à l’étape 5.2 lorsque les souris ne montrent aucune réponse aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.
  2. Gardez les souris en position couchée à l’intérieur d’une hotte chimique.
  3. Ouvrez la peau le long de la ligne médiane thoracique. Séparez le diaphragme et ouvrez la poitrine avec des ciseaux.
  4. Insérez une aiguille 22 G1 1/2 dans le ventricule gauche. Ouvrez l’oreillette droite avec des ciseaux.
  5. Perfuse 50 mL de PBS 100 mM pré-réfrigéré. Perfuser 100 mL de tampon de paraformaldéhyde à 4 %16 pré-refroidi.
  6. Retirez tout le cerveau de la souris16.
  7. Fixer pendant la nuit avec 4 % de paraformaldéhyde.
  8. Fixez le tissu cérébral à l’aide d’un adhésif tissulaire sur la plate-forme métallique du Vibratome. Coupez des sections coronales de 50 μm d’épaisseur avec des lames en acier au carbone.
  9. Placez les tranches de cerveau sur des lames de verre à l’aide d’un pinceau. Ajoutez immédiatement 0,1 ml de produit de montage anti-décoloration à chaque section.
  10. Placez une lamelle de 22 mm x 50 mm sur les sections de cerveau. Faites sécher les lames super-frost dans l’obscurité pendant 1 jour.
  11. Configurez le système de microscope confocal sur un grossissement de 60× (A/1,4, huile) et réglez un intervalle dans le plan Z de 0,15 μm, avec une taille de sténopé de 30 μm et un rayon de sténopé rétroprojeté de 167 nm.
  12. Utilisez les longueurs d’onde de 488 nm et 594 nm pour acquérir des images multicanaux des régions cérébrales d’intérêt.

Résultats

Un fragment de mScarlet (1858 bp) contenant les sites enzymatiques « Cla1 » à l’extrémité 3' et « Not1 » à l’extrémité 5' a été inséré dans le vecteur lentiviral pNL4-3-EcoHIV (figure 1). Pour valider l’expression d’EcoHIV-mScarlet, des cellules cérébrales primaires isolées du cortex d’embryons de rat E18 ont été traitées avec EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU/mL) pendant 6 jours in vitro. Les données de la figure 2 ont montré que les signaux fluorescents rouges de mScarlet étaient principalement localisés dans les types de cellules gliales en fonction des différentes morphologies cellulaires. De plus, le marquage CD11b/c et Iba1 (marqueurs cellulaires de la microglie) a montré que les signaux mScarlet étaient co-localisés avec les cellules CD11b/c + et/ou Iba1 +. Les données ont indiqué que la microglie était le principal type de cellule de la distribution EcoHIV-mScarlet in vitro. Il n’y a pas eu d’infection neuronale significative dans les cellules cultivées (figure supplémentaire 1).

Ensuite, l’infection par EcoHIV-mScarlet a été testée sur des cellules gliales primaires mixtes de souris adultes. Pour ce faire, des cellules gliales mixtes ont d’abord été isolées et purifiées à partir de souris adultes (2 mois) et infectées par EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU/mL) pendant 2 jours. Les images de la figure 3 ont montré qu’EcoHIV-mScarlet a réussi à infecter la glie de souris adulte.

Afin d’examiner davantage le profil de distribution d’EcoHIV-mScarlet dans le cerveau de la souris, en particulier pour identifier le type de cellule infectée, EcoHIV-mScarlet a été injecté rétro-orbitale dans la lignée de souris knock-in Tmem119-EGFP dans laquelle les microglies ont été spécifiquement marquées avec des signaux EGFP sans aucun autre type de conflit de macrophages5. Les résultats de la figure 4 (également dans la figure supplémentaire 2) montrent que des signaux de fluorescence rouge écarlate ont été observés dans les cellules positives à l’EGFP, suggérant que la microglie est le principal type cellulaire d’expression d’EcoHIV dans le cerveau des souris.

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Figure 1 : La carte vectorielle d’EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : L’infection EcoHIV-mScarlet dans les cellules cérébrales primaires du rat. (A,E) Images représentatives de la coloration CD11b/c dans les cellules cérébrales primaires. Les cellules cérébrales ont été isolées à partir d’embryons de rat E18 et infectées par le virus EcoHIV-mScarlet pendant 6 jours. (B,F) Images représentatives de signaux fluorescents mScarlet provenant de cellules cérébrales in vitro. (C, G) Images représentatives de la coloration d’Iba1 au niveau des cellules cérébrales primaires. (D,H) Images fusionnées du triple étiquetage de CD11b/c, mScarlet et Iba1. Barres d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Infection EcoHIV-mScarlet dans les cellules gliales mixtes primaires de souris. (A,B) Images confocales représentatives de la distribution de mScarlet in vitro. Les cellules gliales mixtes primaires ont été isolées de souris C57BL6 adultes (âgées de 2 mois) et cultivées pendant 2 semaines avant l’infection virale. L’EcoHIV-mScarlet a été ajouté au milieu de culture pendant deux jours et a capturé les images sous l’objectif de 60× du microscope confocal. Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Distribution EcoHIV-mScarlet dans la lignée de souris knock-in Tmem119-EGFP. (A,B) Images fusionnées des signaux mScarlet/EGFP/ToPro3 dans des sections de cerveau. Le cadre jaune indique la zone cible de (B). Barre d’échelle : 300 μm. (C) Image représentative de la distribution de mScarlet dans la couche plexiforme externe de la région olfactive de la ligne de souris knock-in Tmem119-EGFP. (D) Image représentative de la répartition de l’EGFP. Les signaux fluorescents ont été localisés dans les cellules microgliales de la lignée de souris knock-in Tmem119-EGFP. (E) Image représentative de la coloration du noyau TO-PRO-3. Barres d’échelle : 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Coloration MAP2 et MOG des cellules cérébrales primaires de rat infectées par le virus EcoHIV-mScarlet. Barres d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Images confocales de l’infection EcoHIV-mScarlet dans la lignée de souris knock-in Tmem119-EGFP . Barres d’échelle : 75 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Séquence d’ADN plasmidique EcoHIV-mScarlet. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans la présente étude, il a été constaté que (1) le nouveau EcoHIV-mScarlet a réussi à infecter des cellules cérébrales primaires de rat in vitro ; (2) le triple marquage de mScarlet, CD11b/c et Iba1 a identifié la microglie comme le type de cellule prédominant pour l’expression de cet EcoHIV dans les cellules cérébrales de rat in vitro ; (3) des cellules cérébrales primaires de souris provenant d’adultes in vitro prouvent davantage l’infection EcoHIV-mScarlet ; (4) la distribution EcoHIV-mScarlet dans la lignée de souris knock-in Tmem119-EGFP a démontré un modèle de distribution spécifique de la microglie de l’infection par EcoHIV.

De nouvelles études suggèrent que divers types de cellules cérébrales identifiées dans le système nerveux central (neurones, astrocytes, microglies, oligodendrocytes, etc.) présentent une altération fonctionnelle et transcriptomique au cours du VIH et des troubles neurocognitifs associés au VIH18,19. Par exemple, les astrocytes contribuent à 30 à 70 % du cerveau et effectuent une surveillance pour maintenir l’homéostasie cérébrale20. Les astrocytes modulent également la fonction immunitaire et régulent la sécrétion de multicytokines et de chimiokines, en particulier dans la situation de l’inflammation cérébrale et de la neurodégénérescence dans le VIH21,22. L’infection par le VIH de la microglie entraîne non seulement une libération continue de protéines virales et de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, mais fournit également des sources prédominantes de réservoirs viraux du VIH 23,24,25,26. De plus, la microglie activée joue un rôle immunologique essentiel dans le SNC ; cependant, une activation prolongée peut également exacerber la neurodégénérescence dans la progression du VIH10,27. Les oligodendrocytes jouent également un rôle important, notamment la libération de plusieurs neurotrophines (telles que le facteur de croissance nerveuse, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau, etc.)28. Une étude antérieure a révélé que le nombre d’oligodendrocytes diminuait considérablement dans le cerveau des patients atteints du SIDA, ce qui pourrait indiquer des dommages directs aux oligodendrocytes causés par les protéines virales du VIH29. Par conséquent, un type spécifique de modèle d’infection du VIH manipulé par les cellules devrait fournir des moyens fondamentaux d’identifier les fonctions différentielles des différentes cellules cérébrales après l’infection. Dans la présente étude, un système biologique a été mis au point pour imiter les caractéristiques du VIH-1 par l’inoculation chimérique du VIH (EcoHIV). Cette inoculation du VIH a également été combinée à la lignée de souris knock-in Tmem119-EGFP pour générer et valider un modèle de rongeur du VIH manipulé par la microglie.

Cependant, les limites de la présente étude doivent être reconnues. Il y avait quelques cellules négatives Iba1/CD11b/c qui présentaient des signaux fluorescents mScarlet in vitro. D’autres types de cellules cérébrales, comme les macrophages ou les péricytes cérébraux, peuvent être impliqués dans l’infection par l’éco-VIH, ou encore, l’environnement de culture cellulaire peut favoriser des modèles d’infection aberrants par rapport à l’inoculation in vivo . De futures études sur l’ensemble de l’animal devraient clarifier davantage la fonction de la microglie mScarlet+ dans le processus d’infection par l’EcoHIV, et définir davantage la distribution régionale de la microglie mScarlet+EcoHIV dans le cerveau. De plus, les altérations neurocognitives résultant d’infections microgliales peuvent également être abordées dans ce modèle de rongeurs. Collectivement, l’inoculation EcoHIV-mScarlet de souris knock-in Tmem119-EGFP fournit un nouveau modèle et une stratégie de recherche pour étudier les mécanismes microgliaux des troubles neurocognitifs associés au VIH.

Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été financé par des subventions des NIH DA059310, DA058586, AG082539 et GM109091. Nous apprécions le généreux don de l’EcoHIV-NL4-3-EGFP de la Dre Potash de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules 293FTThermoFisher ScientificR70007
33 G, petite aiguille RN à moyeu, (Style de point : 3, Longueur de l’aiguille : 19,25 mm)Hamilton7803-05
Solution antibiotique-antimycosiqueCellgro30004CI100x
C57BL/6-Tmem119em2Gfng/Jlaboratoire Jackson# :031823
Corning BioCoat Gélatine 75cm² ; Fiole de culture cellulaire rectangulaire à col incliné avec capuchon ventiléLife Technologies354488
Corning  ; DMEM avec L-Glutamine, 4,5 g/L de glucose et de Pyruvate de sodium LifeTechnologies10013CV
Verre de couvertureVWR637-137
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362
Eppendorf  ; Microcentrifugeuse à capuchon instantané Biopur Safe-Lock TubesLife Technologies22600028
Feather Double Edge Lames en acier au carboneTed Pella, inc.121-9
Fisher BioReagents  ; Milieux de microbiologie : LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426-500
Anticorps recombinant humain anti-CD11bMiltenyi Biotec130-120-214Dilution 1:50
Seringue d’injecteur intraoculaire (6.5 µ ; L), aiguille amovibleHamilton6609071-01
Invitrogen  ; Réactif de transfection Lipofectamine 3000  ;Technologies de la vieL3000015
Invitrogen  ; One Shot TOP10 Electrocomp  ;E. coliFisher ScientificC404052
Pince à irisWorld Precision Instruments15914
Ciseaux à irisWorld Precision Instruments500216
Kit ELISA p24 associé aux lentivirusCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Concentrateur Lenti-XTakaraPT4421-2
Opti-MEM I Sérum Réduit TechnologiesMoyenne Durée de Vie11058021
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127-500G
Paraformaldéhyde  ;SigmaP6148
PELCO easiSlicer  ; Trancheuse à tissus vibrantsTed Pella, inc.11000
PELCO  ; Adhésif tissu Pro CA44Ted Pella, inc.10033
PELCO  ; Pro Specimen RetrieversTed Pella, inc.101-33
ProLong GoldFisher ScientificP36930
Rabbit monoclonal anti-Iba1anticorps Abcamab178847dilution 1:500
RN Compression Fitting 1 mmHamilton55750-01
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Sprague Dawley rat enceinteInotiv
Lames SuperFrost PlusFisher Scientific12-550-154 %  ;
To-Pro-3ThermoFisher ScientificT3605Kit de coloration du noyau
Trypsine-EDTA (0.25 %), rouge de phénolThermoFisher Scientific25200-056
Vannas ScissorsWorld Precision Instruments500086
La souche de de

Références

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Infection par l EcoHIVmanipulation de la microgliesouris Tmem119 EGFPtroubles neurocognitifs li s au VIHr servoirs viraux c r brauxmicroscopie confocaleimmunomarquage des cellules c r bralesfluorescence mScarletculture de cellules c r bralesalt rations microgliales
Identification de cellules infectées par EcoHIV chez des souris transgéniques manipulées par la microglie
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