Article de méthode

Préparation de banques d’ADNc ultrasensibles pour le séquençage de nouvelle génération de microARN à partir de petites vésicules extracellulaires

DOI :

10.3791/67154

⸱

13 juin 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (VE) contiennent des microARN spécifiques aux cellules qui régulent les cellules réceptrices, dont l’identification peut faire la lumière sur leur fonction et leur rôle en tant que biomarqueurs. Notre protocole optimisé de préparation de banques d’ADNc introduit des codes-barres uniques qui permettent le multiplexage d’échantillons et le traitement amélioré des VE à faible entrée, tout en utilisant des codes-barres à double index appariés pour la compatibilité avec les séquenceurs Illumina.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des études récentes démontrent que les petites vésicules extracellulaires (sEV), que l’on trouve dans tous les biofluides, jouent un rôle essentiel dans la communication intercellulaire en canalisant les protéines, l’ADN et les ARN. Les microARN (miARN) qui sont emballés dans les sEV sont apparus comme des régulateurs critiques dans les cellules réceptrices. Étant donné que les sEV sécrétés par les cellules normales et malades portent différentes cargaisons de miARN, des études récentes de profilage sEV-miARN suggèrent qu’elles pourraient aider à identifier de nouveaux biomarqueurs circulants. Cependant, les sEV spécifiques aux cellules/maladies circulant dans divers biofluides, une fois isolés, fournissent de faibles quantités de miARN, qui sont généralement difficiles à quantifier à l’aide des méthodologies spectrométriques conventionnelles. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) de petits ARN non codants, qui permet l’amplification de séquences de miARN clonées, offre une occasion précieuse d’évaluer les cargaisons de miARN des sEV. Malheureusement, les procédures commerciales de préparation de banques d’ADNc nécessitent souvent des entrées d’ARN bien supérieures aux quantités non quantifiables disponibles à partir de sEV isolés.

Ainsi, compte tenu de la robustesse et des capacités de multiplexage de notre procédure de préparation de banque d’ADNc existante (c’est-à-dire initialement optimisée pour l’analyse d’ARN à faible entrée, hautement dégradé et inclus dans la paraffine fixée au formol (FFPE), nous avons cherché à évaluer son applicabilité pour l’analyse des miARN sEV. Il est important de noter que, compte tenu des récentes améliorations techniques du regroupement des puces de séquençage, nous avons cherché à adapter notre approche de codage à barres de transcription dans le cadre d’un flux de travail de préparation de banques d’ADNc à deux extrémités et à double indice compatible avec l’appariement afin d’améliorer nos capacités de séquençage et de multiplexage. À l’aide d’ARN extraits de 8,4 × 109 sEV dans 16 répétitions, et de quantités décroissantes de sEV de 10à 10 sEV à aussi bas que 2,5 × 107 sEV, nous avons évalué la reproductibilité et la sensibilité de cette méthodologie. Les données démontrent que les codes-barres de l’ADN adénylé de 16 3' permettent une détection hautement reproductible et sensible des profils de miARN sEV à travers des répétitions en utilisant aussi peu que 3,15 pg de petits ARN non codants totaux ou 1,35 pg de miARN.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des particules dérivées de cellules de taille nanométrique (~30-200 nm de diamètre) enveloppées d’une membrane bicouche phospholipidique, héritée de leur cellule d’origine et qui protège robustement leurs cargaisons moléculaires 1,2. Il est bien admis que pratiquement toutes les cellules produisent et libèrent des sEV dans le compartiment intercellulaire, qui peuvent à leur tour être détectés dans la plupart des biofluides (c.-à-d. le sang, l’urine, la salive, etc)2,3,4. Des études récentes ont démontré que les cargaisons moléculaires encapsulées de manière stable (c’est-à-dire l’ADN, l’ARN, les protéines, les lipides, etc.)5,6,7 des sEVs, une fois en contact ou livrées aux cellules réceptrices, interviennent dans la communication intercellulaire8. Les efforts de recherche actuels se sont concentrés sur l’amélioration de l’isolement des sEV spécifiques aux cellules à partir de divers biofluides, afin d’identifier et de surveiller précisément ces cargaisons moléculaires 9,10. Étant donné que les sEV contiennent de petits ARN non codants et en particulier des microARN (miARN), qui conservent leur fonction régulatrice lors de l’administration cellulaire, de nombreuses études se sont concentrées sur l’évaluation de l’utilité des miARN en tant que biomarqueurs pouvant révéler l’état de leur cellule d’origine 11,12,13.

Les microARN (miARN) représentent une grande classe (~2 000 connus chez l’homme) de petits ARN non codants d’une taille variant entre 19 et 25 nucléotides (nt), qui se lient à des sites complémentaires imparfaits dans les régions non traduites 3' de leurs cibles d’ARNm et dirigent leur dégradation et/ou leur répression post-transcriptionnelle14,15. Sur le plan fonctionnel, les miARN ont été décrits pour contrôler de nombreux processus biologiques, et la dérégulation de leur expression a été associée à des altérations des processus moléculaires, biochimiques et physiologiques qui contribuent à l’initiation et au développement de maladies, y compris le cancer 16,17,18. Il est important de noter que des études ont montré que les cellules malades, et en particulier les cellules cancéreuses, expriment non seulement différemment les miARN par rapport aux cellules normales18, mais que leur empaquetage en sEV diffère également19,20.

Alors que plusieurs études se concentrent sur l’établissement des processus moléculaires et des voies qui dirigent l’emballage des sEV dans les cellules normales et malades 19,21,22, les études sur les biomarqueurs se concentrent actuellement sur l’identification de petites signatures d’ARN et/ou de miARN non codants distinctes qui sont emballées et sécrétées par des cellules malades/cancéreuses spécifiques via les sEV. L’isolement ciblé de sEV spécifiques de cellules malades à partir de divers biofluides humains et l’évaluation de leurs cargaisons moléculaires multi-omiques peuvent ainsi permettre le développement de tests diagnostiques et pronostiques pour la détection non invasive de diverses maladies et cancers humains 23,24,25,26. Bien que les miARN sEV soient les transcrits non codants les plus étudiés, d’autres petites espèces d’ARN non codants (c’est-à-dire les isoformes de miARN (isomiRs), les piwiARN, les fragments d’ARN de transfert (tRF), les ARNr, les ARN non codants orphelins (oncRNAs)...) sont également évaluées pour leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs sEV circulants, avec un accent particulier sur la détection de différents cancers 27,28,29,30,31,32.

Avantageusement, l’analyse par séquençage de nouvelle génération (NGS) de petits transcrits d’ARN non codants (y compris les miARN), après leur codage à barres et la préparation de leur banque d’ADNc, est idéale pour l’exploration de petites espèces d’ARN non codants connues et/ou inconnues contenues dans les sEV circulants, qui peuvent être associées à des maladies27. En effet, le NGS à petit ARN sEV offre une approche à haut débit pour la découverte de petits transcrits d’ARN non codants spécifiques à une cellule qui resteraient autrement inconnus, s’ils étaient évalués à l’échelle mondiale avec des technologies spécifiques à la cible (c’est-à-dire PCR multiplexe, microréseaux, panels personnalisés, etc.)32, 33, 34. Considérant que nous avons précédemment optimisé un protocole de préparation de banque d’ADNc ultra-sensible et hautement reproductible, que nous avons développé pour l’analyse d’ARN35,36 fortement dégradés et à faible concentration fixés au formol (FFPE), nous avons cherché à l’adapter pour l’analyse de petits ARN non codants et de miARN encapsulés dans des sEV 37,38,39,40.

Avec l’arrêt de l’instrument Illumina HiSeq2500, qui nous a fourni des années d’analyse de miARN à double index unique de haute qualité des cargaisons sEV37,40, nous avons cherché à explorer la reproductibilité et la sensibilité de notre protocole lorsqu’il est adapté à des instruments de séquençage mis à jour en utilisant une chimie à double indice désormais appariée. Dans le but de conserver les capacités de multiplexage du protocole original, nous avons conservé les 16 codes-barres existants pour la préparation de transcrits d’ADNc à petit ARN avant de les intégrer dans la chimie à double indice apparié. En utilisant uniquement une paire de codes-barres i5 et i7, nous permettons la préparation d’une banque d’ADNc robuste en laboratoire où le traitement et l’analyse simultanés d’un maximum de 16 échantillons individuels améliorent la reproductibilité analytique de l’ARN sEV à faible entrée. Ainsi, nous présentons les processus biochimiques, les codes-barres mis à jour, les amorces de PCR et de marqueur de taille, ainsi que les étapes d’isolement nécessaires pour générer des banques d’ADNc hautement reproductibles en utilisant des quantités ultra-faibles de miARN isolés à partir de sEVs plasmatiques humains.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tous les réactifs et oligonucléotides sont préparés comme suit :

REMARQUE : Tous les nucléotides utilisés dans ce protocole sont décrits à la figure 1 et dans le fichier supplémentaire 1 aux concentrations utilisées pour la mise en œuvre de ce protocole. Voir le fichier supplémentaire 2 pour les séquences d’amorces.

  1. Préparez une solution mère de cocktail de calibrateur, qui sera utilisée dans chaque ligature individuelle comme contrôle pour les différentes réactions enzymatiques :
    1. Remettre en suspension l’oligonucléotide porteur (0,5 μM) (Fichier supplémentaire 1) avec de l’eau exempte de RNase.
    2. Combinez les 10 calibrateurs (10 μL chacun, lime supplémentaire 1) dans un seul tube de 1,5 mL pour obtenir un stock de 100 μM, diluez-le à l’aide de l’oligonucléotide porteur pour atteindre la solution de 0,0052 nM et stockez-le à -20 °C.
  2. Remettre en suspension chacun des 17 adaptateurs adénylés 3' uniques (16 adaptateurs expérimentaux et 1 adaptateur à code-barres d’essai) (figure 1A) avec de l’eau exempte de nucléases à une concentration de 50 μM.
    REMARQUE : Chaque adaptateur est aliquote dans des tubes individuels contenant 2,5 μL pour un stockage à -80 °C jusqu’à 2 ans, afin d’éviter les cycles de gel-dégel du stock plus important.
  3. Remettre en suspension les différents oligonucléotides d’ARN expérimentaux, y compris le support d’extraction d’ARN (fichier supplémentaire 1), le support de ligature de l’ARN 3' (fichier supplémentaire 1), le test de ligature de l’ARN (fichier supplémentaire 1) et la ligature 3' (fichier supplémentaire 1 ; adaptateur 19 nt-3' et adaptateur 24 nt-3') et la ligature 5' (fichier supplémentaire 1 ; adaptateur 5'-19 nt-3' et adaptateur 5'-24 nt-3'adapter), à 250 ng/μL.
  4. Diluez l’adaptateur 5' purifié HPLC à 100 μM avec de l’eau sans nucléase (Figure 1A).
  5. Remettre en suspension les amorces RT et les premières amorces RT/PCR 5' et 3' à 100 μM avec de l’eau sans nucléase (Figure 1B).
  6. Remettre en suspension les autres oligonucléotides PCR 5' et 3' PCR i7 et i5 à 100 μM avec de l’eau exempte de nucléases (figure 1B).
    REMARQUE : Aliquotez chaque amorce d’ADN pour un maximum de 10 expériences et conservez-la à -80 °C.
  7. Préparez le colorant de chargement de gel de décoloration polyacrylamide (PAA), mélangez et aliquote 1 mL dans des tubes et conservez-le à -80 °C.
    1. Préparez une solution de 0,5 M Na2H2 EDTA en ajoutant 18,6 g de Na2H2 EDTA à 50 mL d’eau exempte de nucléases. Ajouter lentement les pastilles de NaOH à la solution préparée de Na2H2 EDTA pour atteindre un pH de 8,0. Augmenter le volume jusqu’à 100 mL à l’aide de ddH2O pour obtenir une solution mère de 0,5 M Na2H2 EDTA (pH 8,0)
    2. Peser 15 mg de bleu de bromophénol dans un tube de 15 ml, remettre la poudre en suspension dans 600 μL d’eau sans nucléases, ajouter 14,25 ml de formamide désionisé. Enfin, ajouter 150 μL d’une solution de 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0. Aliquotez la solution finale de PAA dans des tubes de 1 mL et conservez-la à -80 °C.
    3. Préparez le colorant de chargement de gel d’agarose 5x.
      1. Peser et dissoudre 1,86 g de Na2H2-EDTA dans 50 mL d’eau exempte de RNase et ajuster le pH à 8,0 en ajoutant des pastilles de NaOH. Ajouter de l’eau exempte de RNase à 100 mL pour obtenir unesolution EDTA de 50 mM Na2H.
      2. À 5 ml de 50 mM de Na2H2 EDTA, ajoutez 20 mg de bleu de bromophénol, 20 mg de xylène cyanol FF et 2 g de ficoll de type 400. Vortex le tube contenant les trois colorants à mélanger et ajouter 5 mL supplémentaires de 50 mM Na2H2 EDTA. Aliquote tubes individuels de 1 mL de colorant de chargement de gel d’agarose 5x et stockage à -80°C.

2. Préparation des échantillons d’ARN EV

  1. Suite à l’isolement des sEVs, évaluer leur morphologie à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM ; Figure 2), concentration à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA ; Figure 3), et la distribution des protéines de surface à l’aide de la nano-imagerie à super-résolution (Figure 4), ou d’une technologie équivalente de quantification sEV.
  2. Aliquote un nombre équivalent de sEV dans différents tubes, ajouter de la RNase-A (12,5 μg/mL) et incuber à 37 °C pendant 1 h.
  3. Lancez l’extraction de petits ARN non codants, y compris les miARN, à partir de sEV à l’aide du kit d’extraction de petits ARN et lancez l’isolement de phase de l’ARN.
  4. Séparez la phase aqueuse inférieure du tampon de lyse de l’ARN, ajoutez-la dans un nouveau tube, puis ajoutez 4 ng d’oligonucléotide porteur d’ARN (fichier supplémentaire 1) à chaque échantillon d’ARN, avant d’effectuer l’isolement de la colonne en suivant les instructions du fabricant.
  5. Accélérez l’aspiration de chaque échantillon d’ARN à 9,5 μL pour lancer le protocole de préparation de la banque d’ADNc.

3. Configurez les ligatures de l’adaptateur à code-barres 3' avec 16 échantillons d’ARN et 1 échantillon de test

  1. Identifiez 16 échantillons individuels d’ARN-sEV, aliquotez-les dans 9,5 μL d’eau exempte de nucléases dans des tubes de microcentrifugation siliconés de 1,5 mL, et placez-les sur de la glace au moins 10 minutes avant de commencer les expériences.
  2. Préparez le tampon d’ARN ligase 10x (sans ATP) frais avant l’expérience.
    1. Dans un tube siliconé de 1,5 mL, combiner 343 μL d’eau bidistillée sans nucléase (ddH2O), 500 μL de 1 M Tris pH 7,5, 100 μL de 1 M MgCl2, 50 μL de 20 mg/mL d’albumine sérique bovine et 7 μL de 14 M de 2-mercaptoéthanol.
    2. Mélangez la solution en agitant le tube, centrifugez pendant 2 s à 2 000 × g à température ambiante (RT) sur une centrifugeuse de table, puis placez sur de la glace.
      REMARQUE : Toutes les étapes qui décrivent une « centrifugeuse pendant 2 s » sont toutes effectuées avec une microcentrifugeuse à RT avec une vitesse ne dépassant pas 2 000 × g.
  3. Décongelez le cocktail de calibre 0,0052 nM en plaçant le tube sur de la glace pendant 10 min.
  4. Préparez le Ligation Master Mix pour 18 réactions dans un tube siliconé de 1,5 mL en combinant 40 μL de tampon 10x RNA Ligase, 10 μL de cocktail de calibrateur 0,0052 nM et 40 μL de ddH2O sans nucléase.
  5. Agissez et tournez le tube de 1,5 ml et posez-le sur de la glace.
  6. Ajouter 4,5 μL du Ligation Master Mix à chacun des 16 échantillons d’ARN sEV aliquote individuellement, et la réaction de ligature du test contenant 100 ng d’oligonucléotide de test de ligature de l’ARN (fichier supplémentaire 1) préalablement aliquote et à un volume de 9,5 μL. Effleurez pour mélanger et faire tourner les tubes avant de les remettre sur de la glace.
  7. Transférez les 16 échantillons et testez la réaction dans un bloc chauffant pendant 1 min à 90 °C, puis transférez-les à nouveau dans de la glace.
  8. Transférez individuellement 4 μL de PEG à 50 % dans chaque tube, mélangez et faites tourner les tubes avant de les remettre sur de la glace.
  9. Dégivrez des aliquotes de 2,5 μL de chacun des 17 adaptateurs à code-barres de 3 pi (16 adaptateurs expérimentaux (#1 à #16) et adaptateurs d’essai (#17)) et placez-les sur de la glace pour les décongeler.
  10. Transférez 1 μL de chacun des 17 adaptateurs dans les 16 échantillons correspondants contenant de l’ARNsEV et un échantillon d’essai, avec Ligation Master Mix (c’est-à-dire 4,5 μL) et 50 % de PEG (c’est-à-dire 4 μL).
    REMARQUE : Toutes les solutions et réactions sont mélangées en secouant les tubes et en les faisant tourner, plutôt que de pipeter les solutions de haut en bas, pour éviter la perte de matière.
  11. Préparez l’enzyme de ligature K227Q tronquée de l’ARN T4 Ligase 2 diluée en ajoutant 10 μL de l’enzyme avec 10 μL de ddH2O sans nucléase dans un nouveau tube siliconé de 1,5 mL.
  12. Transférez 1 μL de l’enzyme de ligature K227Q tronquée de l’ARN T4 Ligase 2 diluée dans chacun des 17 tubes (16 échantillons d’ARN expérimentaux et 1 échantillon d’ARN test). Ne pipetez pas de haut en bas, ne changez pas d’embouts entre chaque tube, gardez les tubes sur de la glace, mélangez à l’aide d’un mélange, centrifugez et placez les tubes sur de la glace.
  13. Placez les ligatures sur de la glace fraîche dans un support de tube dans un seau à glace dans la chambre froide, pendant une nuit jusqu’à 18 h.

4. Isolement PAGE des petits ARN ligaturés de l’adaptateur 3'

  1. Placez les 17 tubes sur un bloc chauffant à 90 °C pendant 1 min pour désactiver l’ARN Ligase T4 2, et placez-les sur de la glace pendant 2 min pour refroidir.
  2. Combinez 1 μL de GlycoBlue et 26 μL de NaCl sans nucléase 5 M dans un tube frais et transférez 1,2 μL de cette solution de précipitation dans chacun des 17 tubes.
  3. Ajoutez 63 μL d’éthanol à 100 % dans chacun des 17 tubes, fermez, agissez et tournez vers le bas pendant 2 secondes avant de les remettre sur la glace.
  4. Combinez le contenu des 16 tubes d’ARN sEV en un seul tube siliconé de 1,5 ml, tout en gardant le tube de ligature de l’ARN de test séparé.
  5. Retournez le tube contenant les échantillons combinés 3 fois pour mélanger, centrifugez brièvement pendant 2 s et laissez reposer sur de la glace pendant 60 min pour précipiter.
  6. Préparez un grand (16 x 20 cm2) gel de polyacrylamide (PAGE) à 15 % comme suit :
    1. Siliconer (c’est-à-dire en utilisant une solution à base de silicone) et couler les plaques de verre courtes et longues avec des entretoises de 0,1 cm.
    2. Préparez le mélange de gel PAGE à 15 % en combinant 9 mL de diluant de système, 18 mL de concentré de système, 3 mL de tampon de système, 240 μL d’APS (9 %) et 12 μL de TEMED dans un tube conique de 50 mL.
    3. Transférez rapidement la solution entre les plaques de verre à l’aide d’une pipette de 30 ml. Avant que le gel ne polymérise, ajoutez un peigne de 14 puits (0,1 cm d’épaisseur) et placez le gel debout pendant 30 minutes à RT.
  7. Récupérez le tube avec les échantillons d’ARN combinés dans la glace et centrifugez-le à 16 000 × g pendant 60 min à 4 °C.
  8. Pendant ce temps, terminez la mise en place du PAGE à 15 % en retirant délicatement le peigne, en nettoyant les puits avec du H2O sans nucléase avec une bouteille de pulvérisation au-dessus d’un évier, avant de sécher et de mettre en place le PAGE à 15 % sur l’appareil à gel, où les réservoirs supérieur et inférieur sont remplis d’une solution de Tris-Borate EDTA (TBE) 0,5x, avant un pré-fonctionnement de 30 minutes à 450 V.
  9. Retirer le tube de la centrifugeuse (étape 4.6) et sécher soigneusement la pastille d’ARN à l’aide d’une pipette Pasteur dont l’extrémité est munie d’un embout non filtre de 10 μL reliée à un système de vide, sans déranger la pastille.
  10. Remettre en suspension la pastille d’ARN contenant les 16 ligatures d’ARN précipitées dans 20 μL de ddH2O sans nucléase et ajouter 20 μL de solution de chargement de gel PAA. Agitez le tube pour mélanger, centrifugez pendant 2 s et placez sur de la glace.
  11. Remplacez l’appareil à électrolyte à base de gel 0,5x par de l’appareil à électrolyte (TBE) frais (0,5x).
  12. Installez un tube avec une échelle de taille d’ARN de 20 pb, deux tubes avec chacun des deux marqueurs de taille d’ADN courts de ligature 3' (fichier supplémentaire 1) et un tube contenant l’oligonucléotide du test de ligature de l’ARN (c’est-à-dire ligaturé avec l’adaptateur à code-barres #17).
  13. À chacun des tubes (c.-à-d. échelle, ligature 3' d’oligos d’ADN courts et test de ligature de l’ARN), ajoutez 20 μL de solution de chargement de gel PAA.
  14. Réglez le tube d’échantillon d’ARN ligaturé 16 et le tube d’essai de ligature d’ARN 16 à 90 °C pendant 1 min et remettez-les sur de la glace.
  15. Remplacez le tampon TBE 0,5x des réservoirs inférieur et supérieur (c’est-à-dire ajoutez du tampon sous le niveau du puits afin qu’il n’y ait pas de contamination croisée entre les puits pendant le chargement) et chargez l’échelle aux extrémités du gel, la ligature du test d’ARN, les deux marqueurs de taille d’ADN courts des deux côtés du puits contenant les 16 ligatures combinées d’ARN à code-barres de 3' (voir la figure 5).
  16. Exécutez le gel PAGE à 15 % avec tous les échantillons pendant 90 min à 450 V (~35 mA) dans des conditions de refroidissement (c’est-à-dire avec des ventilateurs soufflant de l’air sur les plaques de verre).
  17. Retirez 15 % de PAGE du verre et vaporisez-le légèrement avec la solution SYBR Gold (10 μL de SYBR Gold dans 25 ml de 0,5x TBE) et laissez-le reposer incliné pendant 5 min dans l’obscurité.
  18. Placez le gel sur un transilluminateur à lumière bleue (Figure 5) et alignez l’adaptateur 19 nt-3' et les deux marqueurs de taille d’adaptateur 24 nt-3' pour courtiser les oligonucléotides d’ADN avec une règle et exciser la zone du gel contenant les constructions de miARN ligaturées (la figure 6 montre la ligature 3' et la construction résultante). Séparément, excisez la bande supérieure de la ligature du test d’ARN, qui sera également utilisée pour une ligature de test 5' le lendemain.
  19. Placer les deux morceaux de gel excisés séparés (c’est-à-dire pour 16 échantillons d’ARN et pour la ligature de test) dans différents tubes briseurs de gel de 0,5 ml placés dans des tubes siliconés de 1,5 mL, centrifuger à 16 000 × g pendant 3 min à RT, puis remettre en suspension les deux morceaux de gel fragmentés avec 300 μL de solution de NaCl à 400 mM, fermer les tubes, et scellez-les avec du parafilm.
  20. Placez les tubes sur un agitateur à 1 100 tr/min à 4 °C, pendant la nuit (16-17 h).

5. Ligature de l’adaptateur 5'

  1. Transférez deux gels fragmentés séparés et leurs solutions (16 échantillons à code-barres de 3' (codes-barres #1 à #16) et ARN de test à code-barres 3' (code-barres #17)) sur deux tubes filtrants séparés de 5 μm, chacun placé dans des tubes siliconés de 1,5 mL, scellez-les avec un parafilm et centrifugez pendant 5 min à 2 300 × g à RT.
  2. Ajouter 950 μL d’éthanol à 100 % dans chaque solution filtrée, fermer les tubes, retourner pour mélanger, tourner pendant 2 s, sceller les tubes avec du parafilm et les placer sur de la glace pendant 1 h.
  3. Préparez fraîchement un bouillon aqueux à 50 % de DMSO en combinant 1 ml d’eau sans nucléase avec 1 ml de DMSO, enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et conservez-le à RT dans l’obscurité.
  4. Préparez un gel PAGE à 15 % et pré-exécutez-le en suivant les étapes décrites à la section 4.6.
  5. Centrifuger les tubes contenant les 16 échantillons d’ARN ligaturés 3' et la ligature d’ARN test à 16 000 × g pendant 60 min à 4 °C pour précipiter les ARN ligaturés.
  6. Retirez délicatement le surnageant sans toucher les pastilles d’ARN et séchez-le sous vide.
  7. Remettez en suspension la pastille ligaturée de 3' de 16 échantillons d’ARN et testez l’ARN chacun dans 8 μL de ddH2O sans nucléase sans pipetage de haut en bas. Agitez légèrement les tubes pour mélanger, centrifugez pendant 2 s (2 000 × g) à RT et placez les tubes sur de la glace.
  8. Préparez le tampon d’ARN ligase 10x (avec ATP) en mélangeant 500 μL de 1 M Tris (pH 7,5), 100 μL de 1 M MgCl2, 50 μL de BSA acétylé de 20 mg/mL, 200 μL de 10 mM d’ATP, 7 μL de 2-mercaptoéthanol 14 M et 143 μL d’eau sans RNase dans un tube de 1,5 mL.
  9. Ajouter 2 μL de tampon 10x ARN ligase (c’est-à-dire avec ATP), 1 μL d’adaptateur 100 μM 5' et 4 μL de DMSO aqueux à 50 % dans chaque tube. Effleurez pour mélanger, tournez pendant 2 s à RT, puis installez le tube à 90 °C pendant 1 min pour dénaturer l’ARN et remettez-le sur de la glace.
  10. Ajouter 3 μL de DMSO à 50 %, mélanger en tournant, tourner en granule, ajouter 3 L d’ARN Ligase T4 dans chaque tube, agiter les tubes, centrifuger pendant 2 s à RT et régler les tubes sur l’agitateur à 37 °C pendant 75 min.
    REMARQUE : Ne pipetez pas de haut en bas.
  11. Préparez l’échelle d’ADN de 20 nt et deux tubes séparés contenant les oligonucléotides d’ADN longs marqueurs de ligature 5' (fichier supplémentaire 1 ; adaptateur 5'-adaptateur 19 nt-3' et adaptateur 5'-24 nt-3'adapter), et ajoutez 20 μL de PAA dans chacun des tubes.
  12. Une fois la ligature de l’adaptateur 5' terminée, ajoutez 20 μL de PAA à chacune des deux ligatures (c’est-à-dire 16 échantillons d’ARN et l’ARN de test), mélangez en effleurant, tournez vers le bas et réglez à 90 °C pendant 1 min, après quoi remettez les tubes sur de la glace.
  13. Videz les réservoirs supérieur et inférieur de l’appareil de gel et ajoutez une solution fraîche de TBE 0,5x sous le niveau des puits du réservoir supérieur.
  14. Chargez l’échelle à l’extrémité du gel, l’échantillon d’ARN de test ligaturé de 5', les deux oligonucléotides d’ADN longs marqueurs de taille (c’est-à-dire l’adaptateur 5'-adaptateur 19 nt-3' et l’adaptateur 5'-adaptateur 24 nt-3') dans les puits entourant le puits où les échantillons d’ARN 16 ligaturés 5' seront chargés (la figure 6 montre la ligature 5' et la construction résultante). Faites fonctionner le gel pendant 90 minutes à 450 volts.
  15. Une fois l’essai terminé, retirez le gel de l’appareil et du verre et vaporisez-le avec une solution de SYBR Gold (c’est-à-dire 10 μL de SYBR Gold dans 25 mL de 0,5x TBE), et laissez-le reposer dans l’obscurité pendant 5 min.
  16. À l’aide de l’adaptateur 5'-19 nt-3' et des deux marqueurs de taille de l’adaptateur 5'-24 nt-3' comme guides de taille, excisez directement la section du gel contenant les 16 échantillons d’ARN ligaturés 5' (Figure 7).
    REMARQUE : La ligature de l’ARN de test est évaluée sur le gel pour démontrer que la ligature de l’adaptateur 5' permet un décalage de taille équivalent aux marqueurs de taille. La ligature de l’ARN de test n’est pas excisée du gel ; seulement les 16 échantillons d’ARN combinés ligaturés.
  17. Transvasez le morceau de gel excisé contenant les 16 échantillons d’ARN ligaturé dans un tube briseur de gel de 0,5 mL placé dans un tube de 1,5 mL, faites tourner à 16 000 × g pendant 3 min à RT, puis ajoutez 300 μL de NaCl 300 mM et 1 μL d’amorce RT/PCR 3' de 100 μM (Figure 1B) aux morceaux de gel broyés dans le tube.
  18. Scellez le tube avec du parafilm et placez-le sur un agitateur en agitant à 1 100 tr/min à 4 °C, pendant une nuit (17-18 h) dans une chambre froide.

6. Transcription inverse des petits ARN non codants et miARN ligaturés 5' et 3'

  1. Pipeter la solution du tube contenant le gel broyé sur un tube filtrant de 5 μm inséré dans un tube sans RNase siliconé de 1,5 mL et tourner brièvement pour permettre à la solution de passer à travers le filtre.
  2. Ajoutez 950 μL d’éthanol à 100 % à cette solution filtrée, retournez le tube pour mélanger, tournez pendant 2 s et laissez reposer sur de la glace pendant 60 min.
  3. Précipiter la pastille d’ARN par centrifugation du tube à 16 000 × g à 4 °C pendant 1 h.
  4. Récupérez le tube, retirez soigneusement le surnageant sans toucher la pastille et séchez-la sous vide avant de la remettre en suspension dans 5,6 μL de H2O sans nucléase.
  5. Configurez la réaction RT en ajoutant 3 μL de tampon 5x premier brin, 4,2 μL de 10x dNTP (chacun à 2 mM) et 1,5 μL de Dithiothreitol (DTT) dans le tube. Effleurez pour mélanger et tournez pendant 2 s.
  6. Réglez la réaction à 90 °C pendant 30 s exactement, puis transférez le tube dans un bloc à 50 °C pendant 2 min.
  7. Amorcez la réaction RT en ajoutant 0,75 μL d’enzyme transcriptase inverse dans la solution, agitez pour mélanger et réglez à 50 °C pendant 35 min.
  8. Transférez le tube à 95 °C pendant 1 min pour dénaturer l’enzyme et les brins d’ADNc/ARN, puis ajoutez 95 μL de H2O sans RNase, agissez le tube pour mélanger et posez-le sur de la glace pendant 2 min. Ce tube contient de l’ADNc généré à partir des 16 échantillons d’ARN, chacun codé séparément en 3'.

7. Effectuer le test PCR et amplification à grande échelle

  1. Préparez un tampon PCR 10x frais en combinant 304 μL de H2O sans nucléase, 125 μL de 2 M KCl, 50 μL de 1 M Tris pH 8,0, 10 μL de 1 M MgCl2, 5 μL de Triton X-100 à 1 % et 6 μL de 1 M de 2-mercaptoéthanol dans un tube qui peut être stocké sur de la glace.
  2. Assemblez une réaction PCR pilote/test pour l’ADNc produit à l’étape 6.8 (ci-dessus) en combinant 67 μL de H2O sans nucléase avec 10 μL de tampon PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 0,5 μL d’amorce PCR 5' 100 μM, 0,5 μL d’amorce PCR 3' 100 μM, 10 μL de banque stock d’ADNc, et 2 μL de polymérase 50x Taq dans un tube PCR frais.
    REMARQUE : Avant d’effectuer les amplifications PCR, configurez l’instrument en établissant deux fichiers différents comme suit : Pour le fichier #1 : 94 °C pendant 45 s, 50 °C pendant 85 s et 72 °C pendant 60 s pendant 12 cycles, et 4 °C ; et pour le Fichier #2 : 94 °C pendant 45 s, 50 °C pendant 85 s et 72 °C pendant 60 s pendant 2 cycles et 4 °C.
  3. Pour la réaction PCR pilote/test, placez le tube PCR contenant les 100 μL de la réaction PCR dans le thermocycleur et exécutez le fichier #1.
  4. Une fois le fichier #1 terminé, ouvrez le tube PCR et transférez 12 μL de la réaction dans une microcentrifugeuse de 1,5 ml contenant 3 μL de colorant de chargement de gel 5x. Fermez le tube et écrivez « 12 cycles » sur le bouchon.
  5. Prenez le tube PCR, placez-le dans le thermocycleur et lancez le Fichier #2.
  6. Une fois le fichier #2 terminé, transférez 12 μL de la réaction PCR dans un tube de 1,5 ml contenant 3 μL de colorant de chargement 5x gel, et écrivez « 14 cycles » sur son bouchon.
  7. Répéter les amplifications de la PCR quatre fois de suite (c.-à-d. deux cycles de PCR chacun), tout en transférant 12 μL de produit de PCR à la fin de chaque amplification, et obtenir à leur tour quatre tubes différents, étiquetés 16, 18, 20 et 22 cycles.
  8. Chargez l’échelle de taille 20 nt et chacun des produits amplifiés par PCR sur un agarose à 2,5 % et faites fonctionner le gel dans 0,5x TBE pendant 30 min à 120 V.
  9. Identifier le cycle optimal d’amplification de la PCR (Figure 8A), en fonction du rapport et de la présence de dimères d’amorce (bande inférieure) et d’ADNc amplifié (bande supérieure).
    NOTE Étant donné que l’apport total d’ARN avec 16 échantillons peut être inférieur à 1 ng, on s’attend à ce que les dimères d’amorce génèrent un produit plus rapidement et en plus grandes quantités que l’ADNc purifié. Ainsi, le cycle de PCR adéquat est généralement sélectionné entre 18 et 22 cycles. Dans la figure 8A, le cycle de PCR adéquat pour cette banque est de 20. La figure 8B détaille la taille de la construction de la PCR.
  10. Une fois que le cycle d’amplification de PCR adéquat est identifié, réglez une PCR négative (pas d’ADNc) et quatre réactions PCR positives de 100 μL (c’est-à-dire contenant chacune 12 μL d’ADNc).
    1. Pour simplifier la préparation des réactions de PCR, mettez en place un Master Mix PCR (c’est-à-dire pour 4,5 réactions) dans un tube de 1,5 mL en combinant 292,5 μL de H2O sans nucléase, 45 μL de tampon PCR 10x, 45 μL de 10x dNTPs, 3,25 μL d’amorce RT/PCR 3' (Figure 1B) et 2,25 μL d’amorce PCR 5' (Figure 1B). Retournez ce tube pour le mélanger et tournez-le pour le recueillir au fond du tube.
    2. Transférez 86 μL du PCR Master Mix dans chacun des quatre tubes PCR de 0,5 mL.
    3. Ajoutez 12 μL de banque d’ADNc (stocké sur de la glace), puis 2 μL de Taq polymérase de titane 50x dans chacun des 4 tubes PCR, et mélangez en pipetant de haut en bas.
    4. Préparez le tube de réaction PCR sans matrice en ajoutant 77 μL de H2O sans nucléase, 10 μL de tampon PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 0,5 μL d’amorce PCR 5', 0,5 μL d’amorce PCR 3' et 2 μL de polymérase 50x Taq dans un tube PCR séparé et en pipetant de haut en bas pour mélanger.
    5. Installez les tubes PCR dans le thermocycleur à l’aide du cycle PCR identifié à l’étape 7.9 et définissez un nouveau programme sur le thermocycleur pour l’amplifier si nécessaire.
  11. Préparez un gel d’agarose à 2,5 % avec 0,5 x TBE et bromure d’éthidium, et transférez 12 μL de chaque tube PCR dans des tubes individuels contenant 3 μL de colorant de chargement de gel 5x.
  12. Préparez l’échelle de 20 nt en combinant 3 μL d’échelle avec 9 μL de H2O sans nucléase et 3 μL de colorant de chargement de gel.
  13. Chargez le gel, faites-le fonctionner pendant 30 minutes à 120 V et vérifiez que l’amplification de la PCR est similaire entre les quatre réactions différentes et que le contrôle sans matrice est vide (Figure 8C).
  14. Combinez les quatre réactions de PCR entre deux tubes de microcentrifugation siliconés de 1,5 mL (c.-à-d. deux tubes contenant chacun 90 μL de produit) et ajoutez 18 μL de 5 M de NaCl et 800 μL d’éthanol à 100 % dans chacun des deux tubes.
    1. Retournez les tubes pour les mélanger et conservez-les à -20 °C pour précipiter toute la nuit.

8. Purification de la bibliothèque amplifiée par PCR

  1. Centrifuger les deux tubes contenant les réactions positives mixtes de PCR à 16 000 × g pendant 60 min à 4 °C.
  2. Après 60 min, retirez le surnageant, séchez les pastilles d’ADN sous vide et mettez-les en suspension dans 19,5 μL de 1x tampon, puis ajoutez 0,5 μL d’enzyme PmeI.
  3. Configurer les digestions de l’ImeI à 37 °C pendant 2 h pour éliminer tous les marqueurs de taille de l’ADN qui se trouvaient dans les puits adjacents (c.-à-d. l’adaptateur 19 nt-3', l’adaptateur 24 nt-3') ou les transporteurs d’ARN (c.-à-d. le support d’extraction d’ARN, le support de ligature de l’ARN post-3') Les contaminants potentiels (c.-à-d. voir les sites de l’ImeP inclus dans les amorces d’ARN et d’ADN dans le fichier supplémentaire 1)
  4. Exécutez les deux digestions dans trois puits différents d’un gel d’agarose à 2,5 % en utilisant 0,5 fois TBE pour éviter d’accumuler un excès de dimères d’amorce dans un seul puits et de créer un frottis.
    1. Ajoutez 3 μL de colorant de chargement de gel 5x à chacune des digestions, combinez les deux digestions, puis chargez 16,5 μL dans trois puits adjacents distincts.
    2. Chargez l’échelle de taille d’ADN de 20 nt au niveau des puits d’extrémité du gel et faites fonctionner le gel pendant 90 min à 150 V (Figure 8D).
  5. Pour purifier les banques d’ADN, excisez les bandes PCR supérieures des trois voies adjacentes du gel et transférez-les dans un tube frais de 1,5 ml.
  6. Purifier la bibliothèque amplifiée par PCR à l’aide d’un kit d’extraction de gel, en suivant les instructions du fabricant, et quantifier le produit d’ADN purifié à l’aide d’un fluorimètre, en suivant les instructions du fabricant.

9. Amplification PCR finale pour ajouter des codes-barres compatibles avec le séquenceur

  1. Préparez un nouveau mélange de tampon PCR 10x comme celui décrit à l’étape 7.1.
  2. Configurez les réactions PCR en incluant un témoin négatif (pas d’amplicons) et trois réactions PCR en utilisant 0,75 ng du produit PCR purifié à partir de la première amplification PCR dans chacun des trois tubes, comme suit :
    1. Mettre en place trois réactions PCR individuelles en mélangeant 75 μL de ddH2O, 10 μL de tampon PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 1 μL d’amorce PCR 5' 2nd (c’est-à-dire l’amorce i503 (Figure 1B)), 1 μL de 2ème amorce PCR 3' (c’est-à-dire l’amorce i702 (Figure 1B)), 1 μL de produit PCR (c’est-à-dire 0,75 ng de 1er produit PCR purifié au gel) et 2 μL de titane Taq polymérase.
    2. Mettre en place le contrôle PCR négatif (c’est-à-dire pas de matrice d’ADN) en mélangeant 76 μL de ddH2O, 10 μL de tampon PCR 10x, 10 μL de 10x dNTPs, 1 μL d’amorce PCR 5' 2nd (c’est-à-dire l’amorce i503 (Figure 1B)), 1 μL d’amorce PCR 3' 2nd (c’est-à-dire l’amorce i702 (Figure 1B)), et 2 μL de Taq polymérase.
    3. Configurez les quatre réactions de PCR (c’est-à-dire un contrôle négatif, trois positifs) sur un thermocycleur programmé comme suit : 72 °C pendant 3 min, 95 °C pendant 30 s et 95 °C pendant 10 s, 55 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s pendant 9 cycles, puis 72 °C pendant 5 min, et un maintien final à 10 °C.
  3. Une fois les cycles de PCR terminés, prélever 10 μL du mélange réactionnel et ajouter 3 μL de colorant de chargement, et évaluer les produits sur un gel d’agarose à 2,5 %, comme le montre la figure 9A, avec l’échelle de 20 nt.
  4. Après validation de la taille du produit de PCR (c.-à-d. la bande supérieure de PCR à 164 pb, comme le montrent la figure 9B et la figure 6 pour la taille et les détails de la construction finale) et de la distribution de la bande, combiner les produits de PCR dans deux tubes en ajoutant à chaque 135 μL de produit de PCR (c.-à-d. 90 μL + 45 μL), 13,5 μL de 5 M de NaCl, et 650 μL d’éthanol à 100 %, et précipiter à -20 °C pendant la nuit.
  5. Le lendemain, faites tourner les deux tubes PCR à 16 000 × g pendant 60 min à 4 °C.
  6. Séchez chaque pastille, mettez-la en suspension avec 19,5 μL de tampon 1x PmeI et ajoutez 0,5 μL de PmeI pendant 2 h à 37 °C sur un agitateur pour éliminer davantage les marqueurs de taille qui se trouvaient dans les puits adjacents (c’est-à-dire 19 nt-3' adaptateur, 24 nt-3' adaptateur) ou les contaminants porteurs d’ARN (c’est-à-dire support d’extraction d’ARN, support d’ARN post-3' ligature).
  7. Installer les produits digérés dans trois puits d’un gel d’agarose à 2,5 % et séparer à 150 V pendant 90 min.
  8. Exciser la bande supérieure, qui tourne à 164 pb (figure 9C), purifier le produit ADN à l’aide d’un kit d’isolement d’ADN et quantifier avec un fluorimètre.
  9. Exécutez le produit PCR final sur une puce à ADN pour valider la taille, la concentration et la pureté de la banque avant les dilutions et l’analyse à l’aide d’un séquenceur.
  10. Transférer le fichier de données FASTQ dans le pipeline RNAworld pour le découpage de l’adaptateur, le démultiplexage, l’alignement sur le génome humain, avant les analyses de miARN, comme décrit précédemment41. Alternativement, à l’aide du script présenté dans le fichier supplémentaire 3, démultiplexez les lectures du fichier FASTQ et procédez au traitement à l’aide d’un pipeline analytique de petits ARN de votre choix.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comme détaillé dans le protocole ci-dessus, nous décrivons le traitement simultané d’un maximum de 16 échantillons d’ARN individuels de petites vésicules extracellulaires (sEV) (c’est-à-dire pour l’analyse de petits ARN non codants et de miARN), qui sont analysés ensemble au sein d’une seule bibliothèque, après avoir subi un codage à barres de 3'. Les sEVs sélectionnées pour nos analyses ont été isolées par ultracentrifugation, comme décrit précédemment 37,40, à ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons développé un protocole de préparation de banque d’ADNc pour le séquençage de nouvelle génération (NGS) reproductible et sensible d’ARN non codants, y compris les microARN (miARN) isolés efficacement à partir de petites vésicules extracellulaires (sEV). Considérant qu’une quantité limitée de petits ARN non codants et de miARN peut être récupérée à partir de sEVs isolés globalement ou sélectivement, nous avons cherché à optimiser notre procédure de préparation de banques d’ADNc ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. est un fondateur non employé d’EValuate Diagnostics, Inc avec un petit pourcentage d’actions dans la société. Les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier le laboratoire du Dr Thomas Tuschl pour son soutien et pour nous avoir donné accès à la technologie originale développée dans leur laboratoire, ainsi que pour nous avoir accordé l’accès au pipeline RNAworld.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 % Triton X-100  ;InvitrogenHFH10
10 mM ATP  ;AmbionAM8110G
10x dNTPs  ;AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MercaptoethanolSigmaO3445I-100  ;
Échelle de 20 nts  ;Jena BioscienceM-232S
20 mg/mL Albumine sérique bovineSigmaB8894-5ML  ;
50x Titane Taq  ;Laboratoires Clontech  ;
639208 Persulfate d’ammoniumFisher Scientific  ;7727-54-0
Transilluminateur de lumière bleue - Safe Imager 2.0  ;ThermofisherG6600
BRL Système d’électrophorèse vertical sur gel avec plaques de verre et peignesGIBCOV16
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)SigmaD9170-5VL
Microcentrifugeuse Eppendorf 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Tube filtrant avec Filtre 5mmIST Engineering Inc.5388-50
Fisherbrand Tubes de microcentrifugation siliconés à faible rétention 1,5 mLFisher Scientific02-681-320
Tube briseur de gel 0,5 mLIST Engineering Inc.3388-100
Appareil d’électrophorèse sur gel 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT avec plateaux de gel et peignesBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Séquenceur Illumina NextSeq 1000/2000 ;Illumina20047256
Jersey-Cote (solution à base de silicium)LabScientific, Inc  ;1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge centrifugeuse personnelle à double rotorUSA scientific2641-0016
Modèle V16 Appareil d’électrophorèse en gel de polyacrylamide, lunettes, peignes et entretoisesCiore Life Science21070010
OligonucléotidesIDTDéfini lors de la commande
Owl EasyCast B2 mini système d’électrophorèse - avec plateaux de gel et peignesThermofisher ScientificB2
Qiaquick Kit d’extraction de gel  ;Qiagen28704
Fluorimètre QubitThermofisher ScientificQ33238
Enzyme de restriction PmeI et 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Transcriptase inverse - Exposant IIIThermoFisher12574026
Eau sans RNase  ;AmbionAM9932
Shaker- Eppendorf ThermomixeurEppendorf5385000024
SeaKem LE agarose  ;Lonza50002
Superscript III kit de transcription inverse  ;Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies  ;S11494
Titane Taq PolyméraseTakara639208
T4 ARN Ligase 1  ;NEBM0204S
T4 ARN Ligase 2 Tronquée K227Q  ;NEB0351L
TEMEDFisher Scientific  ;O3446I-100
Thermocycleur avec couvercle chauffantApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7,5  ;Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8,0AmbionAM9855G
Système Sequagel UltraPure concentré, diluant et tamponNational DiagnosticsEC-833

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  4. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  5. Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. J Clin Invest. 126 (4), 1139-1143 (2016).
  6. Raposo, G., Stahl, P. D. Extracellular vesicles: a new communication paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (9), 509-510 (2019).
  7. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  8. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell Commun Signal. 19 (1), 104(2021).
  9. Shami-Shah, A., Travis, B. G., Walt, D. R. Advances in extracellular vesicle isolation methods: a path towards cell-type specific EV isolation. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 4, 447-460 (2023).
  10. Jiang, C., Fu, Y., Liu, G., Shu, B., Davis, J., Tofaris, G. K. Multiplexed profiling of extracellular vesicles for biomarker development. Nanomicro Lett. 14 (1), 3(2021).
  11. O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., Breakefield, X. O. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 585-606 (2020).
  12. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandão, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: from biomarkers to mediators of physiology and disease. Cell Metab. 30 (4), 656-673 (2019).
  13. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  14. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  15. O'Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., Peng, C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 402(2018).
  16. Ardekani, A. M., Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2 (4), 161-179 (2010).
  17. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am J Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  18. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  19. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  20. Lee, Y. J., Shin, K. J., Chae, Y. C. Regulation of cargo selection in exosome biogenesis and its biomedical applications in cancer. Exp Mol Med. 56 (4), 877-889 (2024).
  21. Barman, B., et al. VAP-A and its binding partner CERT drive biogenesis of RNA-containing extracellular vesicles at ER membrane contact sites. Dev Cell. 57 (8), 974-994.e8 (2022).
  22. Oka, Y., Tanaka, K., Kawasaki, Y. A novel sorting signal for RNA packaging into small extracellular vesicles. Sci Rep. 13 (1), 17436(2023).
  23. Wang, X., Tian, L., Lu, J., Ng, I. O. Exosomes and cancer - diagnostic and prognostic biomarkers and therapeutic vehicle. Oncogenesis. 11 (1), 54(2022).
  24. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  25. Chatterjee, M., et al. Circulating extracellular vesicles: an effective biomarker for cancer progression. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (11), 375(2024).
  26. Asleh, K., et al. Extracellular vesicle-based liquid biopsy biomarkers and their application in precision immuno-oncology. Biomark Res. 11 (1), 99(2023).
  27. Wang, J., et al. Systematic assessment of small RNA profiling in human extracellular vesicles. Cancers (Basel). 15 (13), 3446(2023).
  28. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  29. Avendaño-Vázquez, S. E., Flores-Jasso, C. F. Stumbling on elusive cargo: how isomiRs challenge microRNA detection and quantification, the case of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1784617(2020).
  30. Goh, T. X., Tan, S. L., Roebuck, M. M., Teo, S. H., Kamarul, T. A systematic review of extracellular vesicle-derived Piwi-interacting RNA in human body fluid and its role in disease progression. Tissue Eng Part C Methods. 28 (10), 511-528 (2022).
  31. Liu, D. S. K., Yang, Q. Z. C., Asim, M., Krell, J., Frampton, A. E. The clinical significance of transfer RNAs present in extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (7), 3692(2022).
  32. Teng, M., Liu, L. Y., Hua, J. T., Chen, S., He, H. H. Orphan noncoding RNAs: novel regulators and cancer biomarkers. Ann Transl Med. 7 (Suppl 1), S21(2021).
  33. von Felden, J., et al. Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellular vesicles detect early stage liver cancer. Gut. , (2021).
  34. Dogra, N., et al. Extracellular vesicles carry transcriptional 'dark matter' revealing tissue-specific information. J Extracell Vesicles. 13 (8), 12481(2024).
  35. Loudig, O., et al. Evaluation and adaptation of a laboratory-based cDNA library preparation protocol for retrospective sequencing of archived microRNAs from up to 35-year-old clinical FFPE specimens. Int J Mol Sci. 18 (3), 627(2017).
  36. Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective microRNA sequencing: complementary DNA library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded RNA specimens. J Vis Exp. (135), e57471(2018).
  37. Mitchell, M. I., et al. Extracellular vesicle capture by antibody of choice and enzymatic release (EV-CATCHER): a customizable purification assay designed for small-RNA biomarker identification and evaluation of circulating small-EVs. J Extracell Vesicles. 10 (8), e12110(2021).
  38. Mitchell, M. I., et al. Customizing EV-CATCHER to purify placental extracellular vesicles from maternal plasma to detect placental pathologies. Int J Mol Sci. 25 (10), 5102(2024).
  39. Mitchell, M. I., et al. Non-invasive detection of orthotopic human lung tumors by microRNA expression profiling of mouse exhaled breath condensates and exhaled extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 5 (1), 138-164 (2024).
  40. Mitchell, M. I., et al. Exhaled breath condensate contains extracellular vesicles (EVs) that carry miRNA cargos of lung tissue origin that can be selectively purified and analyzed. J Extracell Vesicles. 13 (4), e12440(2024).
  41. Farazi, T. A., et al. Bioinformatic analysis of barcoded cDNA libraries for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 171-187 (2012).
  42. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  43. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  44. Llorens-Revull, M., et al. Comparison of extracellular vesicle isolation methods for miRNA sequencing. Int J Mol Sci. 24 (15), 12183(2023).
  45. Crossland, R. E., et al. MicroRNA profiling of low concentration extracellular vesicle RNA utilizing NanoString nCounter technology. J Extracell Biol. 2 (1), e72(2023).
  46. Miceli, R. T., et al. Extracellular vesicles, RNA sequencing, and bioinformatic analyses: challenges, solutions, and recommendations. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70005(2024).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

S quen age des micro ARNprofilage des miARN des sEVcodage barres de l ARNs quen age double indexARN faible quantitbiomarqueurs circulantscommunication intercellulaire
Vidéo bientôt disponible

Articles connexes