Article de méthode

Standardisation d’un nouveau logiciel semi-automatique pour la mesure de l’excroissance des neurites

DOI :

10.3791/67163

⸱

9 août 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les tests de croissance des neurites fournissent une valeur quantitative sur les processus neuronaux régénératifs. L’avantage de ce logiciel semi-automatique est qu’il segmente les corps cellulaires et les neurites séparément en créant un masque et mesure divers paramètres tels que la longueur des neurites, le nombre de points de branchement, la surface des grappes de corps cellulaires et le nombre de grappes de cellules.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des techniques efficaces d’imagerie en direct sont cruciales pour évaluer la morphologie neuronale afin de mesurer la croissance des neurites en temps réel. La mesure correcte de la croissance des neurites a été un défi de longue date au fil des ans dans le domaine de la recherche en neurosciences. Ce paramètre sert de pierre angulaire dans de nombreux montages expérimentaux in vitro , allant des cultures dissociées et des cultures organotypiques aux lignées cellulaires. En quantifiant la longueur des neurites, il est possible de déterminer si un traitement spécifique a fonctionné ou si la régénération axonale est améliorée dans différents groupes expérimentaux. Dans cette étude, l’objectif est de démontrer la robustesse et la précision du logiciel d’analyse de l’excroissance des neurites Incucyte Neurotrack. Ce logiciel semi-automatique est disponible dans un système de microscopie time-lapse qui offre plusieurs avantages par rapport aux méthodologies couramment utilisées dans la quantification de la longueur du neurite dans les images en contraste de phase. L’algorithme masque et quantifie plusieurs paramètres dans chaque image et renvoie des métriques cellulaires neuronales, notamment la longueur des neurites, les points de branchement, les amas de corps cellulaires et les zones d’amas de corps cellulaires. Tout d’abord, nous avons validé la robustesse et la précision du logiciel en corrélant ses valeurs avec celles du manuel NeuronJ, un plug-in fidjien. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé l’algorithme qui est capable de travailler à la fois sur des images en contraste de phase et sur des images d’immunocytochimie. À l’aide de marqueurs neuronaux spécifiques, nous avons validé la faisabilité de l’analyse de la croissance des neurites basée sur la fluorescence sur des neurones sensoriels dans des cultures in vitro . De plus, ce logiciel peut mesurer la longueur des neurites dans diverses conditions d’ensemencement, allant de cellules individuelles à des réseaux neuronaux complexes. En conclusion, le logiciel fournit une plate-forme innovante et rapide pour les tests de croissance des neurites, ouvrant la voie à des quantifications plus rapides et plus fiables.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans les nerfs sciatiques, il est possible de mesurer la régénération axonale1. De plus, des études in vitro ont montré la faisabilité de la surveillance de la croissance axonale 2,3 pour comprendre ses différentes phases, de la germination axonale à la dégénérescence axonale, dans les neurones sains et blessés. En suivant ces processus, il est possible de mesurer des paramètres tels que la polarité axonale, l’initiation, la stabilité et la ramification. Le dernier paramètre est crucial pour comprendre la perception de la douleur neuropathique 4,5,6. De même, la dégénérescence axonale peut être surveillée in vivo7 ou in vitro 8,9. Au cours de la croissance des neurites, les réseaux cytosquelettiques d’actine et de microtubules se stabilisent ou changent en fonction des besoins de la cellule10. Le cytosquelette d’actine se réorganise pour permettre la formation du cône de croissance axonale, et les microtubules se réalignent en faisceaux pour stabiliser le neurite11 en croissance. Afin d’étudier in vitro la croissance des neurites centrales et périphériques, trois paramètres communs sont quantifiés : la longueur axonale totale, la distance maximale et les points de branche. Ces paramètres sont utilisés pour étudier la réponse de l’excroissance neuronale au traitement (c.-à-d. neurotrophines, composés, inhibiteurs, acide rétinoïque, siRNA, shRNA) ou chez les animaux génétiquement modifiés 12,13,14. Afin d’évaluer si les neurones ont des neurites plus allongés et/ou plus ramifiés, ces trois paramètres nous permettent d’évaluer la morphologie d’un neurone. La mesure de la longueur des neurites est le paramètre d’intérêt majeur dans plusieurs montages expérimentaux in vitro. À partir des ganglions de la racine dorsale, principalement deux types de cultures sont réalisés : la culture in vitro dissociée ou la culture organotypique d’explants entiers de DRG. Dans les deux cas, la longueur des neurites est un paramètre d’or pour évaluer le résultat de l’expérience. Dans une lignée cellulaire de type motoneurone (NSC-34), la croissance axonale et la ramification sont mesurées après différenciation induite par l’acide rétinoïque15,16. En fait, en mesurant la croissance des neurites, il est possible de déterminer si un traitement spécifique a fonctionné17, le taux de croissance18 ou la capacité de régénération après une procédure de blessure19.

La façon d’évaluer correctement la croissance des neurites a posé un nombre important de défis au fil des ans dans le domaine de la recherche. Cependant, il n’y a pas de normalisation des mesures de longueur des neurites. Certaines des méthodes les plus utilisées pour les cultures cellulaires in vitro sont, par exemple, le plug-in manuel NeuronJ sur Fiji18,20 ou MetaMorph21,23 et le semi-automatique Neurolucida23,24. Outre les méthodologies manuelles, il existe également des méthodes automatiques, telles que le plug-in NeuriteTracer sur Fiji25, le logiciel HCA Vision26,27 ou WIS-NeuroMath 2,28. D’autres méthodologies moins précises reposent sur la mesure de la dimension globale des neurones. Ces méthodes comprennent la mesure de la distance du vecteur entre le corps cellulaire et l’extrémité de l’axone le plus long29 ou l’analyse de Sholl30. Cependant, ces méthodes de mesure sont adaptées aux cultures de très faible densité ou aux neurones uniques. De plus, toutes ces méthodologies sont principalement utilisées sur des neurones colorés ou des neurones exprimant des fluorophores génétiquement codés (c’est-à-dire GFP, Venus, mCherry). Le type de neurone et la densité de la culture cellulaire influencent profondément le choix de la méthodologie de mesure. Par exemple, segmenter manuellement des neurones aux morphologies très complexes et compliquées, tels que les neurones DRG, peut facilement devenir une tâche impossible. Si les neurones alambiqués sont déjà un défi à segmenter, les réseaux neuronaux sont complètement hors de portée pour les approches manuelles en raison de leur organisation très complexe.

D’une part, la segmentation manuelle est très précise car elle est effectuée par l’œil humain et l’intelligence ; D’un autre côté, cela prend vraiment du temps. Le temps élevé consacré aux méthodes manuelles est le principal inconvénient. Pour cette raison, seuls quelques neurones sont acquis pour l’analyse, ce qui le rend moins précis et moins coûteux en termes de temps. Les approches automatiques ou semi-automatiques, en revanche, réduisent partiellement la perte de temps. Cependant, ils présentent également quelques inconvénients. Les méthodes automatiques ont besoin d’être entraînées pour fonctionner correctement, et si le logiciel n’est pas assez interactif avec l’utilisateur, la segmentation peut être erronée.

Outre la mesure de l’excroissance des neurites, le nombre de points de branche est également une information précieuse. Avec la segmentation manuelle, le nombre de points de branche peut être calculé, alors que cela n’est pas possible avec une distance vectorielle. Avec les méthodes automatiques, le nombre de points de branche est généralement fourni, tandis qu’avec l’analyse Sholl, il doit être calculé à l’aide d’une formule mathématique.

Dans cet article méthodologique, nous visons à décrire la fonctionnalité et l’efficacité de ce logiciel semi-automatique dans la mesure de la longueur axonale totale et d’autres paramètres. La machine permet l’acquisition automatique d’images à des points temporels définis ou la réalisation d’études à long terme (jours, semaines, mois), en préservant un environnement physiologique pour les cellules vivantes. La mesure de la croissance des neurites à l’aide de l’imagerie time-lapse à contraste de phase présente l’avantage de permettre une surveillance continue de la cinétique et de la croissance des neurites. De plus, il est également possible de surveiller la mort cellulaire par l’ajout dans le milieu de colorants spécifiques qui ciblent les cellules mortes 31,32,33. Bien que le logiciel ait été publié en 2012, nous sommes les premiers à standardiser cette méthodologie de manière reproductible et impartiale pour la quantification précise de la croissance des neurites. Cependant, il est important de noter que le logiciel n’est pas inclus avec l’achat de la machine. Malgré cette dépense supplémentaire, son utilisation offre des avantages significatifs dans la mesure de la longueur axonale totale et d’autres paramètres, contribuant ainsi à la recherche dans le domaine des neurosciences.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Balayage du récipient sur la machine

REMARQUE : La détection est effectuée par la caméra Basler Ace 1920-155 μm intégrée.

  1. Ouvrez le programme en cliquant sur Se connecter à l’appareil et en sélectionnant Planifier - À acquérir. Cliquez ensuite sur le signe + .
  2. Spécifiez si le navire sera scanné à plusieurs reprises ou seulement 1x en choisissant l’option Scanner selon le calendrier ou Scanner une fois maintenant, respectivement.
  3. Sélectionnez Nouveau pour créer un tout nouveau navire à numériser. Si aucun nouveau navire n’est ajouté, créez un nouveau balayage à l’aide de l’une des options décrites ci-dessous.
    1. Sélectionnez Copier le cours actuel pour créer un nouveau navire en copiant un navire à partir de l’horaire actuel. Sélectionnez Copier précédent pour créer un nouveau navire en copiant un navire précédemment numérisé.
    2. Sélectionnez Ajouter une analyse pour restaurer un récipient précédemment analysé pour des analyses supplémentaires.
  4. Sélectionnez le type de balayage en fonction du test et de l’application. Pour l’analyse, sélectionnez Standard.
  5. Spécifiez les paramètres d’analyse. Choisissez l’une des options Cellule par cellule, soit Aucune, Adhérente cellule par cellule ou Cellule par cellule non adhérente, et spécifiez les canaux d’image en fonction des molécules fluorescentes utilisées. Sélectionnez l’option Aucun pour les cultures de neurones sensoriels adultes et embryonnaires. Pour les lignées cellulaires, sélectionnez les options Aucun ou Adhérent cellule par cellule .
  6. Sélectionnez l’objectif du microscope (4x, 10x, 20x). Acquérir avec le grossissement le plus élevé (20x) dans les cultures primaires, tandis que dans les lignées cellulaires, 10x est suffisant.
  7. Sélectionnez le type de navire à scanner parmi les options proposées. Indiquez l’emplacement du récipient dans le tiroir en sélectionnant sa position sur la carte virtuelle du tiroir.
  8. Spécifiez le modèle de balayage pour l’acquisition de l’image en sélectionnant les puits à balayer. Sélectionnez le nombre d’images souhaité par cadre. Une estimation de la durée de l’analyse apparaîtra.
  9. Fournissez des informations sur le navire en tapant le nom et spécifiez la carte de la plaque en cliquant sur le signe + .
  10. Cliquez sur Suivant. Choisissez le type d’analyse, puis cliquez sur Suivant. Un écran récapitulatif des options sélectionnées apparaîtra. Si c’est le cas, cliquez sur Analyser maintenant et l’analyse commencera.

2. Configuration pour l’analyse d’image en contraste de phase

REMARQUE : L’analyse Neurotrack ne peut être effectuée que sur des images précédemment acquises par la machine.

  1. Sélectionnez le récipient numérisé à analyser. Sélectionnez Lancer l’analyse. Sélectionnez Créer une nouvelle définition d’analyse.
  2. Sélectionnez Neurotrack. Sélectionnez Couches d’image. Sélectionnez un ensemble représentatif d’images sur lesquelles effectuer l’analyse. Sélectionnez toutes les images de chaque puits pour entraîner l’algorithme.
  3. Affinez les paramètres de définition d’analyse en ajustant les paramètres suivants.
    REMARQUE : Par défaut, les neurites sont segmentés en magenta, tandis que les corps cellulaires en jaune. Il est possible de modifier les couleurs à volonté.
    1. Pour la segmentation des clusters de corps de cellule, ajustez les éléments suivants comme décrit ci-dessous.
      1. Mode de segmentation : La segmentation des images est effectuée pour distinguer les corps cellulaires de l’arrière-plan et des neurites. Choisissez entre la luminosité et la texture. Pour les cultures primaires et les lignées cellulaires, sélectionnez le mode Luminosité.
      2. Réglage de la segmentation : utilisez le curseur pour ajuster la sensibilité de la segmentation vers plus d’arrière-plan ou plus de cellules. Il est compris entre 0 (arrière-plan) et 2 (cellules). Il augmente ou diminue la taille du masque jaune. Déplacez le curseur vers 0 (Arrière-plan) afin que la taille du masque jaune diminue progressivement, laissant de l’espace pour le masque magenta. L’inverse se produit si le curseur est déplacé vers 2 (Cellules).
    2. Pour le nettoyage, ajustez les éléments suivants comme décrit ci-dessous.
      1. Remplissage du trou (μm2) : Ajustez-le pour supprimer tout trou dans le masque corporel de la cellule plus petit que la zone spécifiée par l’utilisateur.
      2. Ajuster la taille (pixels) : Augmentez (si positif) ou réduisez (si négatif) le masque jaune du nombre de pixels spécifié. Il varie de -10 à +10. Ajustez-le pour ajouter ou supprimer la segmentation jaune sur les objets à contraste élevé tels que les cellules mortes et les débris cellulaires.
      3. Largeur minimale de la cellule (μm) : choisissez une valeur pour définir la taille à laquelle les corps cellulaires seront considérés comme des neurites.
    3. Pour les filtres de cluster de corps de cellule, ajustez les éléments suivants comme décrit ci-dessous.
      1. Aire (μm2) : Définissez une valeur minimale et une valeur maximale de la surface du corps cellulaire. Les valeurs supérieures et inférieures aux valeurs définies ne seront pas considérées comme des corps de cellule.
    4. Pour les paramètres neurite, ajustez les éléments suivants comme décrit ci-dessous.
      1. Filtrage : Il réduit le masquage des imperfections des petits vaisseaux et des débris. Choisissez entre les options Aucun, Mieux et Meilleur. Choisissez Aucun uniquement pour les cultures et les récipients très propres. Choisissez Better pour un traitement plus rapide au détriment de la perte de détection des neurites très fines. Cela peut être suffisant pour les cellules avec des neurites épais ou à contraste élevé ; En outre, il peut être utile pour les récipients présentant de nombreuses imperfections ou débris. Choisissez le meilleur pour un temps de traitement plus long, mais c’est le paramètre de filtre le plus sensible pour garantir la détection des névrites très fines.
      2. Sensibilité des neurites : permet d’ajuster la sensibilité de détection. Augmenter la sensibilité pour détecter les névrites plus fines. Il varie de 0,25 (moins) à 0,75 (plus).
        REMARQUE : Il augmente ou diminue la sensibilité du logiciel pour reconnaître les neurites. Si le curseur est déplacé vers 0,25 (Moins), le logiciel sera plus strict dans sa reconnaissance des neurites. Au lieu de cela, si le curseur est déplacé vers 0,75 (Plus), le logiciel sera moins strict dans cette détection, et par conséquent, plus d’imperfections (c’est-à-dire des débris cellulaires, de la saleté) seront considérées comme des neurites.
      3. Largeur des neurites (μm) : Utilisez-le pour ajuster la détection à la taille des neurones. Il peut s’agir de 1, 2 ou 4. En l’augmentant, les neurites les plus minces ne seront pas considérés. Réglez-le à 1 pour les cultures de neurones sensoriels adultes primaires et à 2 pour les lignées cellulaires et les cultures de neurones sensoriels embryonnaires.
  4. Cliquez sur Aperçu actuel pour visualiser l’image segmentée. Les mesures suivantes seront fournies pour chaque image : longueur du neurite (mm/mm2), points de branche du neurite (par mm2), amas de corps cellulaires (par mm2) et surface de l’amas de corps cellulaires (mm2/mm2).
  5. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 pour toutes les images sélectionnées. Cliquez sur Suivant.
  6. Sélectionnez le temps et le puits de balayage à analyser. Attribuez un nom de définition et, si nécessaire, des notes d’analyse. Cliquez sur Suivant > terminer.

3. Configuration pour l’analyse d’images d’immunocytochimie (ICC)

  1. Suivez les mêmes étapes que celles illustrées de la section 2.1 à la section 2.4. Sélectionnez les canaux d’image pour les neurites et les noyaux. Sélectionnez l’ensemble d’images ; Sélectionnez Toutes les images de chaque puits pour entraîner l’algorithme.
  2. Affinez les paramètres de définition d’analyse en ajustant les paramètres suivants, comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Par défaut, les neurites sont segmentés en bleu, tandis que les corps cellulaires sont violets. Cependant, les couleurs peuvent être modifiées à volonté.
    1. Segmentation de l’agrégat de corps de cellule : utilisez cette option pour segmenter l’image en objets d’intérêt. Estimez la luminosité de l’arrière-plan à chaque pixel de l’image. Une fois l’arrière-plan trouvé, effectuez l’une des options suivantes.
      1. Pas de soustraction d’arrière-plan : utilisez cette option pour segmenter sans modifier l’image d’origine. Choisissez entre Seuil adaptatif ou Seuil fixe. Adaptatif : l’arrière-plan est utilisé pour trouver des objets mais n’est pas explicitement soustrait ; avec cette option, il est possible de définir l’ajustement du seuil (CGU). Seuil fixe : les objets plus lumineux que ce seuil sont détectés dans l’image d’origine ; avec cette option, il est possible de définir le Seuil (CGU).
      2. Soustraction de l’arrière-plan : utilisez cette option pour soustraire l’arrière-plan de l’image à l’aide d’une transformation Top-Hat, puis appliquez-lui un seuil. Avec cette option, définissez Rayon et Seuil. Rayon : on utilise un disque de ce rayon ; Le disque doit être suffisamment grand pour ne pas tenir entièrement dans un objet de l’image. Seuil : les objets qui sont plus clairs que ce seuil sont détectés dans l’image soustraite en arrière-plan.
    2. Nettoyage : utilisez l’option suivante pour effectuer cette opération.
      1. Remplissage des trous (μm2) : utilisez-le pour supprimer tous les trous dans le masque corporel des cellules qui sont plus petits que la zone spécifiée.
      2. Ajuster la taille (pixels) : utilisez cette option pour augmenter (si positif) ou réduire (si négatif) le masque violet du nombre de pixels spécifié. La plage est de -10 à +10. Il ajoute ou enlève du violet sur les objets à contraste élevé tels que les cellules mortes et les débris cellulaires.
      3. Largeur minimale de la cellule (μm) : utilisez cette option pour définir la taille à laquelle les corps cellulaires seront considérés comme des neurites.
    3. Filtres de cluster de corps de cellule : utilisez l’option suivante pour appliquer les filtres.
      1. Aire (μm2) : Définissez une valeur minimale et une valeur maximale de la surface du corps cellulaire. Les valeurs supérieures et inférieures aux valeurs définies ne seront pas considérées comme des corps de cellule.
    4. Paramètres Neurite : utilisez l’option suivante pour les définir.
      1. Sensibilité grossière du neurite : utilisez cette option pour ajuster la luminosité du neurite. La sensibilité doit être augmentée si l’intensité de fluorescence des névrites est faible. Il est compris entre 0 (moins) et 10 (plus). Il augmente ou diminue la sensibilité du logiciel pour reconnaître les neurites moins brillantes. Les valeurs optimales vont de 7 à 10 ; Notez que s’il est défini sur 10, il est très probable que le bruit de fond sera également pris en compte dans la mesure du neurite.
      2. Sensibilité fine Neurite : utilisez cette option pour régler la sensibilité de détection. La sensibilité doit être augmentée pour détecter les névrites plus fins. Il varie de 0,25 (moins) à 0,75 (plus). Il augmente ou diminue la sensibilité du logiciel pour reconnaître les névrites fins et moins brillantes. Si le curseur est déplacé vers 0,25 (Moins), le logiciel ne prendra pas en compte les névrites faibles. Au lieu de cela, si le curseur est déplacé vers 0,75 (Plus), le logiciel détectera également des névrites très faibles (presque en arrière-plan).
      3. Largeur des neurites (μm) : utilisez-le pour ajuster la détection à la taille des neurones. Il peut s’agir de 1, 2 ou 4. En l’augmentant, les neurites les plus minces ne seront pas considérés. Réglez-le sur 1 pour les cultures de neurones sensoriels adultes primaires, sur 2 pour les lignées cellulaires et les cultures de neurones sensoriels embryonnaires.

4. Exportation des données

  1. Ouvrez l’analyse. Cliquez sur Métriques graphiques.
  2. Sélectionnez la métrique, les points temporels et les puits qui vous intéressent.
  3. Sélectionnez l’option de regroupement entre Tous, Aucun, Colonnes, Lignes et Répliques de carte de plaques.
  4. Cliquez sur Exporter les données et sélectionnez le dossier de destination et, si nécessaire, d’autres options. Un fichier .txt sera créé.
    REMARQUE : La machine fournira une seule valeur moyenne de la métrique choisie pour chaque puits. Une annotation manuelle est nécessaire pendant l’analyse pour récupérer les valeurs d’une seule image.

5. Exportation d’images

  1. Ouvrez le récipient. Cliquez sur Exporter les images et les films.
  2. Sélectionnez le type d’exportation des images.
    1. Sélectionnez Tel qu’affiché pour exporter les images telles qu’elles sont affichées. Cliquez sur Suivant et sélectionnez les images qui vous intéressent pour l’exportation . Cliquez sur Suivant.
      1. Sélectionnez le type de séquence entre un seul film ou une série d’images et les points temporels qui vous intéressent. Cliquez sur Suivant.
      2. Ajustez les options d’exportation selon vos besoins et cliquez sur Suivant. Définissez le dossier de sortie, le format de fichier et le nom du fichier, puis cliquez sur Exporter.
    2. Sélectionnez Comme stocké pour exporter les images au format brut. Sélectionnez le type d’image.
      1. Sélectionnez les points temporels et les puits qui vous intéressent. Cliquez sur Suivant. Définissez le dossier de sortie, le format de fichier et le nom du fichier, puis cliquez sur Exporter.
  3. Exportation d’images avec les masques de segmentation
    1. Ouvrez l’analyse. Cliquez sur l’icône des calques d’image. Sélectionnez les masques de canaux souhaités (Phase Neurite et Phase Cell-Body Cluster). Suivez l’étape 5.2.

Résultats

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L’algorithme de mesure de la croissance des neurites est capable de détecter les neurites à la fois dans les réseaux neuronaux et les neurones uniques. Il génère un masque jaune qui segmente les objets avec un contraste élevé, tels que les corps cellulaires, les débris cellulaires, les cellules mortes, les explants de tissus et les ombres. De plus, un masque magenta apparaît sur les neurites de différentes épaisseurs. Les valeurs de longueur des neurites sont fournies en mm/mm2, indiquant que la longueur axonale a été divisée par la surface de l’image, qui est de 0,282739 mm2 et constante pour chaque condition de balayage. Par conséquent, afin d’obtenir des valeurs pures de longueur de neurite en mm, les nombres fournis par le logiciel doivent être multipliés par la surface de l’image.

Méthode semi-automatique ou manuelle
Le logiciel utilisé est une méthodologie semi-automatique pour mesurer la longueur axonale totale. Pour évaluer la précision du logiciel, nous avons effectué des mesures sur les mêmes neurones en utilisant la méthode manuelle avec le plug-in NeuronJ également. Comme le montre la figure 1, le masque de segmentation sur les neurones est très similaire entre les deux méthodes (Figure 1A).

De plus, nous avons effectué une analyse statistique des valeurs obtenues afin d’examiner leur corrélation. L’analyse de corrélation de Spearman a donné un coefficient r élevé de 0,8526, fournissant ainsi des preuves solides de l’exactitude et de la précision de l’algorithme (Figure 1B). La mesure automatique nécessite des normes élevées de qualité de culture basées sur sa propreté, sa densité et sa pureté. Les résultats obtenus avec la segmentation semi-automatique sont reproductibles et ne sont pas affectés par le jugement individuel. La reproductibilité impartiale est un problème pour les méthodologies manuelles.

Parfois, des erreurs de segmentation semi-automatiques peuvent se produire pour différentes raisons. Dans les images en contraste de phase, la saleté dans la culture a pu être détectée comme des neurites par la segmentation semi-automatique. De plus, la présence de différents types de cellules peut perturber le processus de segmentation. De tels problèmes ne se posent pas avec la segmentation manuelle, car elle est effectuée par des yeux humains. Néanmoins, si de tels problèmes surviennent, ils peuvent être surmontés en utilisant des images d’immunocytochimie comme contrôle.

Segmentation des neurites
Pour les cultures primaires de neurones DRG adultes, le point de départ optimal pour une analyse de phase fiable est d’avoir des neurones uniformément plaqués dans la culture bien et propre. Si des erreurs se produisent lors de l’ensemencement et que les cellules se concentrent en un seul endroit, comme illustré à la figure 2A-B, les valeurs seront plus une estimation qu’un reflet fidèle de la réalité. Dans de telles situations, le masque jaune couvrira la plupart des neurites entre les cellules (Figure 2A-B), entraînant ainsi la perte de longueur des neurites. De plus, le logiciel sera significativement biaisé dans la reconnaissance des neurites, et il est très probable qu’un masque magenta apparaisse sur des objets qui ne sont pas des neurites (Figure 2D). Dans une image optimale, il devrait y avoir jusqu’à 15 neurones à un grossissement de 20x.

Lorsque les neurones sont correctement mis en plaque et que la culture est propre, comme illustré sur la figure 3A-B, il est conseillé d’ajuster le curseur de segmentation vers l’arrière-plan (0,5 - 0,7 ; Figure 3C). Cela permet de réduire la composante jaune qui apparaîtra sur les objets à contraste élevé de l’image, tels que les points de ramification qui doivent être en magenta. De plus, si les neurites sont gras, une sensibilité des neurites comprise entre 0,4 et 0,5 devrait suffire à couvrir la plupart d’entre eux (Figure 3C-D).

Une autre situation courante qui peut survenir est une culture sale avec de nombreux débris cellulaires et cellules mortes, comme le montre la figure 4A-B. Dans de telles conditions, il y a beaucoup d’objets à contraste élevé. Par conséquent, il est conseillé d’augmenter la taille du masque jaune en ajustant le curseur de segmentation vers la cellule ou en augmentant le paramètre d’ajustement de la taille (+1, +2, etc.) ; Figure 4C). Néanmoins, il serait également utile de diminuer légèrement la sensibilité des neurites pour éviter que le logiciel n’identifie à tort comme neurites des objets qui ne sont pas des neurites en tant que tels. (Figure 4C-D).

Parfois, les neurites peuvent apparaître très minces et pâles, comme le montre la figure 5A-B, ce qui pose des défis au logiciel pour les segmenter avec précision (figure 5D). Dans ce cas, il est conseillé d’augmenter la sensibilité des neurites à au moins 0,6 (Figure 5C). Cependant, gardez à l’esprit que plus la sensibilité est élevée, plus la probabilité que le logiciel marque incorrectement des objets qui ne sont pas des neurites en tant que tels est grande (Figure 5D). Certaines précautions peuvent être prises pour éviter que le biais de sensibilité n’augmente trop, par exemple en ajustant le curseur de segmentation vers les cellules. Cependant, si les neurites sont trop minces pour être détectées par le logiciel, les valeurs de longueur des neurites seront biaisées de toute façon.

Dans le cas des images d’immunocytochimie, le principal problème se situe en arrière-plan. Outre les conditions d’ensemencement pour lesquelles les règles susmentionnées s’appliquent, la principale source de biais est la fluorescence elle-même. Le logiciel reconnaît efficacement les neurites très brillants tandis que des neurites plus minces et moins intenses sont laissés derrière (Figure 6A-B). Pour éviter la perte de longueur des neurites, la sensibilité fine des neurites peut être augmentée jusqu’à 0,75 (Figure 6C). Cependant, il est fortement conseillé de réduire la sensibilité grossière des neurites à au moins 8-9 pour éviter un biais de détection excessif en considérant les neurites en arrière-plan (Figure 6C-D). Si ce dernier n’est pas réduit, tout l’arrière-plan sera segmenté, comme le montre la figure 7.

Un problème courant avec l’acquisition de fluorescence est la diffusion de la lumière. Souvent, les images d’immunocytochimie présentent des lampes de poche dans l’image, ce qui affecte considérablement la qualité et la précision de l’analyse (Figure 8A-B). Dans une telle situation, il n’y a pas grand-chose à faire pour améliorer l’analyse, et les valeurs seront plus une estimation. La diffusion de la lumière interfère avec la reconnaissance des neurites, de sorte que seuls les neurites très brillants seront détectés (Figure 8C-D). Un autre problème dans les images d’immunocytochimie est la qualité de la coloration en soi. Fréquemment, en raison d’erreurs humaines, les axones peuvent être brisés (Figure 9A) et les corps cellulaires peuvent être arrachés pendant les lavages (Figure 9B). Ces erreurs posent un problème critique car les valeurs de longueur des neurites perdent en précision et en exactitude. Par conséquent, l’interprétation des données biologiques est altérée, ce qui conduit à des conclusions erronées.

Pour les cultures embryonnaires, la situation est différente. Dans ce type de culture, la présence de cellules gliales est prédominante. Par conséquent, les erreurs augmentent considérablement car le logiciel détecte également les parois des cellules gliales (Figure 10A-B). Pour minimiser ce problème, le curseur de segmentation doit être déplacé vers les cellules, généralement autour des valeurs 1,7-2 (Figure 10C-D). Cette approche garantit que la plupart des cellules gliales sont couvertes par le masque jaune et ne sont donc pas prises en compte dans la mesure de la longueur des neurites. Une autre astuce utile est de maintenir la largeur des neurites à 2, car les neurones embryonnaires en culture présentent généralement des formes bipolaires ou unipolaires avec des neurites épaisses (Figure 10C-D). Cette précaution filtre la plupart des parois des cellules gliales qui sont généralement très minces. Enfin, veillez à ne pas trop augmenter la sensibilité des neurites ; Sinon, ce qui a été filtré par le paramètre Largeur du neurite sera à nouveau inclus dans la mesure de la longueur du neurite.

Dans le cas des cultures embryonnaires, où le composant des cellules gliales est prédominant, l’immunocytochimie pourrait être la meilleure option. En colorant spécifiquement les neurones, le problème de la segmentation de la glie est résolu puisque la glie ne sera pas colorée, ce qui rend l’analyse beaucoup plus facile et plus précise (Figure 11).

Enfin, le logiciel peut également être exploité pour évaluer le programme de différenciation de lignées cellulaires et/ou d’iPSC afin d’évaluer leur état de croissance. Ainsi, l’application de paramètres et de précautions similaires peut être utilisée à des fins différentes.

En ce qui concerne le processus de différenciation, la robustesse du logiciel a été prouvée dans la lignée cellulaire NSC-34 (lignée cellulaire hybride constituée de cellules de neuroblastome de souris et de motoneurones dérivés de la moelle épinière d’embryons de souris) au cours de la maturation en cellules de type motoneurones. En ce qui concerne les cultures primaires DRG, le point de départ optimal pour une bonne analyse est l’ensemencement cellulaire uniforme. Les cellules indifférenciées et différenciées, lors d’un traitement à l’acide rétinoïque, peuvent être suivies à l’aide d’acquisitions pendant toute la période de culture ou, comme le montre la figure 12, au dernier point temporel.

En effet, en plus de la longueur du neurite, l’algorithme fournit également le paramètre de point de branchement. Cependant, il est important de noter que le paramètre de point de branche ne représente pas le nombre exact de points de branche ; Il indique plutôt la densité de ramification dans l’image telle qu’elle est exprimée en mm/mm2. Cette mesure est considérablement influencée par les débris dans la culture et la concentration de l’ensemencement. Par conséquent, la densité de neurones dans l’image et la propreté de la culture sont des facteurs cruciaux pour obtenir des valeurs fiables. Si la culture présente de nombreux débris cellulaires, non filtrés par le masque jaune, ils seront inclus dans la longueur des neurites ainsi que dans la mesure du point de branchement.

Par conséquent, il est recommandé de normaliser ces valeurs pour le nombre de cellules, car le nombre de neurones dans l’image influence les mesures de la longueur des neurites et des points de branchement.

Segmentation des corps cellulaires
Parmi tous les paramètres fournis par le système, il y a l’amas de corps cellulaire et l’aire d’amas de corps cellulaire. Cependant, ces deux paramètres ne sont pas fiables à utiliser comme valeurs pour le comptage des cellules. Comme l’illustre la figure 4, le logiciel segmente les objets à contraste élevé dans le masque jaune, y compris les ombres causées par un mouvement moyen dans le puits. De plus, il segmente également les cellules mortes et les débris cellulaires (Figure 4). Pour obtenir un comptage cellulaire fiable des neurones en croissance, une méthode manuelle, telle que l’outil Cell Counter aux Fidji (Figure 13), peut être utilisée.

Un résumé des paramètres d’analyse suggérés, classés par type de culture, est fourni dans le tableau 1 pour les images de phase et le tableau 2 pour les images d’immunocytochimie. De plus, le tableau 3 présente un résumé des paramètres d’analyse suggérés pour résoudre des problèmes spécifiques.

figure-results-1
Figure 1 : Analyse de corrélation entre la segmentation manuelle et semi-automatique des neurites. (A) À gauche, une image de phase représentative d’un neurone segmenté avec le plug-in NeuronJ aux Fidji. À droite, une image de phase représentative d’un neurone est segmentée à l’aide du logiciel semi-automatique. (B) Une régression linéaire simple exécutée sur 20 neurones a été analysée avec des méthodes manuelles et semi-automatiques. coefficient de corrélation de Spearman r = 0,8526, p**** < 0,0001. Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Erreur d’ensemencement dans la culture de neurones sensoriels adultes. (A) Image représentative de la phase de l’erreur d’ensemencement. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque jaune segmente les corps cellulaires, le masque magenta segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Panneau supérieur : zoom sur l’erreur de segmentation du corps cellulaire (masque jaune) due au regroupement des corps cellulaires. Panneau inférieur : zoom sur l’erreur de segmentation des neurites (masque magenta) due aux débris cellulaires. Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Culture de neurones sensoriels adultes idéale pour l’analyse de l’excroissance des neurites. (A) Image de phase représentative d’une condition d’ensemencement idéale pour l’analyse de la croissance des neurites. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque jaune segmente les corps cellulaires, le masque magenta segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Zoom sur la segmentation du corps cellulaire (masque jaune) et sur la segmentation des neurites (masque magenta). Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Éléments perturbateurs dans l’analyse de l’excroissance des neurites dans la culture des neurones sensoriels adultes. (A) Image de phase représentative des débris cellulaires et des ombres dues aux mouvements du milieu. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque jaune segmente les corps cellulaires, le masque magenta segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Zoom sur l’erreur de segmentation du corps cellulaire (masque jaune) et de segmentation des neurites (masque magenta) due aux débris cellulaires et aux ombres du milieu en mouvement. Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Neurites minces dans l’analyse de l’excroissance des neurites dans la culture de neurones sensoriels adultes. (A) Image de phase représentative des neurones caractérisée par des neurites très minces. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque jaune segmente les corps cellulaires, le masque magenta segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Panneau supérieur : zoom sur la perte de longueur des neurites due aux limites de détection de la segmentation des neurites (masque magenta). Panneau inférieur : zoom sur l’erreur de segmentation des neurites (masque magenta) sur les objets étrangers. Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Luminosité des neurites dans l’analyse de l’excroissance des neurites dans la culture des neurones sensoriels adultes. (A) Image immunocytochimique représentative (marqueur neuronal Tuj1) de neurones caractérisée par des neurites très brillants et épais. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque violet segmente les corps cellulaires, le masque bleu segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Panneau supérieur : zoom sur l’erreur de segmentation du corps cellulaire (masque violet) due à l’épaisseur des neurites. Panneau inférieur : zoom sur la perte de longueur des neurites due à la luminosité intense de la fluorescence des neurites épaisses. Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Fluorescence de fond dans l’analyse de l’excroissance des neurites dans la culture de neurones sensoriels adultes. (A) Image immunocytochimique représentative (marqueur neuronal Tuj1) d’un bruit de fond élevé. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque violet segmente les corps cellulaires, le masque bleu segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Zoom sur l’erreur de segmentation du neurite (masque bleu) due à l’interférence de la fluorescence de fond. Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 8 : Diffusion de la lumière dans l’analyse de l’excroissance des neurites de la culture des neurones sensoriels adultes. (A) Image immunocytochimique représentative (marqueur neuronal Tuj1) de la diffusion de la lumière. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque violet segmente les corps cellulaires, le masque bleu segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Panneau supérieur : zoom sur la perte de longueur de neurite due à l’interférence de la diffusion de la lumière. Panneau inférieur : zoom sur l’erreur de segmentation du corps de la cellule (masque violet). Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 9 : Erreurs affectant la qualité de la procédure de coloration interférant avec l’analyse de la croissance des neurites de la culture des neurones sensoriels adultes. (A) À gauche, une image de phase représentative des neurones sensoriels adultes. À droite, une image immunochimique représentative (marqueur neuronal Tuj1) de neurites cassés dues au lavage dans la procédure de coloration. (B) À gauche, une image de phase représentative des neurones sensoriels adultes. À droite, une image immunochimique représentative (marqueur neuronal Tuj1) de l’élimination du corps cellulaire due aux lavages de la procédure de coloration. Les images ont été acquises 48 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 10 : Culture sensorielle de neurones embryonnaires (E13.5) idéale pour l’analyse de l’excroissance des neurites. (A) Image de phase représentative d’une condition d’ensemencement idéale pour l’analyse de la croissance des neurites dans la culture de neurones sensoriels embryonnaires. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque jaune segmente les corps cellulaires, le masque magenta segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Zoom sur la segmentation du corps cellulaire (masque jaune) et sur la segmentation des neurites (masque magenta). Les images ont été acquises 24 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 11 : Culture de neurones sensoriels embryonnaires (E13.5) idéale pour l’analyse de l’excroissance des neurites. (A) Image immunocytochimique représentative (marqueur neuronal Tuj1) d’une culture idéale de neurones sensoriels embryonnaires pour l’analyse de l’excroissance des neurites. (B) Image représentative automatiquement segmentée. Le masque violet segmente les corps cellulaires, le masque bleu segmente les neurites. (C) Illustration des paramètres de définition de l’analyse de l’excroissance des neurites. (D) Zoom sur la segmentation du corps cellulaire (masque violet) et sur la segmentation des neurites (masque bleu). Les images ont été acquises 24 h après l’ensemencement. Grossissement 20x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 12 : Les cellules NSC-34 différenciées ont une augmentation des neurites et des ramifications par rapport aux témoins indifférenciés. Images représentatives des cellules NSC-34. Panneau supérieur : cellules NSC-34 indifférenciées (contrôle). Panneau inférieur : cellules NSC-34 différenciées après 96 heures de traitement à l’acide rétinoïque. Sur le côté gauche des deux panneaux, des images en contraste de phase, tandis que sur le côté droit des deux panneaux, des images automatiquement segmentées (soma en jaune, neurites en magenta). Les images ont été acquises 96 h après l’ensemencement. Grossissement 10x. Barre d’échelle, 50 μm. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-13
Figure 13 : Outil de lutte contre les cellules aux Fidji. Comptage manuel des cellules effectué sur une image de phase d’une condition d’ensemencement idéale pour l’analyse de la croissance des neurites. Grossissement 20x. La figurine a été créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Type de cultureCulture de DRG adultes (phase)Culture embryonnaire de DRG (phase)NSC-34 (Phase)
Grossissement20 fois20 fois10 fois
Segmentation ModeLuminositéLuminositéLuminosité
Ajustement de la segmentation0.5 - 0.71.7 - 21
Ajuster la taille (pixels)0, +1, +20, +10
FiltrageMeilleurMeilleurMeilleur
Sensibilité des neurites0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
Largeur du neurite122

Tableau 1 : Résumé des paramètres de définition d’analyse suggérés pour les cultures de neurones sensoriels adultes, les cultures de neurones sensoriels embryonnaires (E13.5) et les cultures de NSC-34 dans les images à contraste de phase.

Type de cultureCulture DRG adulte (ICC)Culture embryonnaire de DRG (ICC)
Grossissement20 fois20 fois
Segmentation ModeLuminositéLuminosité
Ajustement de la segmentation0.5 - 0.71.7 - 2
Ajuster la taille (pixels)0, +1, +20, +1
FiltrageMeilleurMeilleur
Sensibilité grossière de la neurite8 - 98 - 9
Neurite Fine Sensibilitéjusqu’à 0,750.5 - 0.75
Largeur du neurite12

Tableau 2 : Résumé des paramètres de définition d’analyse suggérés pour les cultures de neurones sensoriels adultes, les cultures de neurones sensoriels embryonnaires (E13.5) et les cultures de NSC-34 dans les images d’immunocytochimie.

ÉMETTRESUGGESTIONS
Culture saleAjuster le curseur de segmentation vers les cellules
Augmenter le paramètre d’ajustement de la taille (+1,+2...)
Diminution légère de la sensibilité aux neurites
Neurites pâles/mincesAugmenter la sensibilité des neurites (au moins 0,6)
Ajustez le curseur de segmentation vers les cellules.
Neurites minces dans l’ICCAugmenter la sensibilité aux neurites fines (jusqu’à 0,75)
Réduire la sensibilité grossière des neurites (au moins à 8-9)
Cellules glialesAjuster le curseur de segmentation vers les cellules (1.7-2)
Largeur de la neurite à 2

Tableau 3 : Résumé des paramètres de définition d’analyse suggérés pour résoudre des problèmes spécifiques dans différents types de cultures.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesurer avec précision la croissance des neurones dans des conditions saines, blessées et malades est un paramètre essentiel dans de nombreuses configurations expérimentales dans le domaine des neurosciences. Qu’il s’agisse de travailler avec des cultures organotypiques d’explants de DRG entiers ou de cultures dissociées, la mesure correcte de l’excroissance axonale a été un défi de taille au cours des 20 dernières années. Sans une quantification fiable et précise de la croissance des neurites, il est impossible d’évaluer si un traitement spécifique, tel que l’acide rétinoïque (pendant 4 jours) pour les cellules NSC-3434 ou les neurotrophines (pendant 1 à 2 jours) pour les neurones DRG embryonnaires 14,35, a été efficace. Les neurones présentent généralement une croissance continue lorsqu’ils sont en bonne santé ; Cependant, après une blessure, le taux de croissance axonale augmentede 12,13. Le timing est crucial pour mesurer la croissance axonale ; Par conséquent, avant de commencer une expérience, il est essentiel d’effectuer un test d’essai pour déterminer le moment optimal pour fixer les cellules en fonction de leur courbe de plateau de taux de croissance.

Le choix de la méthode, manuelle ou automatique, marque un tournant en termes de temps et de précision. Parmi les méthodes manuelles les plus courantes, citons NeuronJ18,20 et Metamorph (Visitron)2,22,28. Les méthodes manuelles obligent les utilisateurs à tracer manuellement les neurites, ce qui prend beaucoup de temps et nécessite des images unicellulaires. Avec la segmentation manuelle des neurites, les réseaux de neurones sont complètement hors de portée. En règle générale, ces méthodologies ne mesurent que l’axone le plus long ou utilisent la mesure de la distance vectorielle, perdant ainsi des informations importantes telles que le nombre de points de branche et la longueur axonale totale. Une certaine amélioration est apportée par l’analyse de Sholl30, qui est de toute façon limitée aux conditions unicellulaires. L’analyse de cellules uniques présente plusieurs défis, à commencer par l’ensemencement des cellules. Les neurones doivent être placés à une très faible concentration, ce qui n’est peut-être pas la condition de croissance la plus appropriée pour chaque type de cellule. Un autre problème se pose lors de l’acquisition d’images. Habituellement, le microscope confocal est utilisé pour l’imagerie, ce qui nécessite des utilisateurs formés et des neurones fluorescents et n’est ni rapide ni rentable. Avec le microscope confocal, des images à haute résolution sont obtenues, mais très peu de neurones sont imagés à partir de chaque expérience. Cela représente une limitation, car davantage de réplicats biologiques sont nécessaires pour atteindre un nombre adéquat de neurones.

Certaines méthodologies automatiques telles que NeuroMath 2,28 résolvent le problème de la segmentation chronophage des neurites qui est effectuée de manière automatique.

Cependant, en raison de contraintes de temps, ce module de mesure de l’excroissance des neurites fournit des résultats plus rapides lors de l’acquisition d’images sur la machine de microscopie à intervalle de temps. Ce dernier, associé à ce logiciel, améliore considérablement le temps et la rentabilité pour les étudiants et les chercheurs principaux.

La machine d’acquisition permet de créer une carte assez complète du puits, en acquérant un nombre variable d’images en fonction du diamètre du puits. Cela représente un avantage non négligeable car plusieurs neurones sont imagés en même temps. Cependant, atteindre seulement un grossissement de 20x est suffisant et adapté pour analyser les images avec le logiciel. Sa puissance repose sur sa capacité à s’entraîner sur un ensemble d’images et à effectuer une mesure semi-automatique de la longueur axonale totale. De plus, le logiciel peut fonctionner à la fois sur des neurones uniques et sur des réseaux neuronaux. Le logiciel est capable de segmenter les neurites et les corps cellulaires avec deux masques différents. Un masque jaune segmente tous les objets à contraste élevé de l’image, tels que les corps cellulaires, les débris cellulaires et les ombres. Un masque magenta, en revanche, segmente les névrites. La précision et l’exactitude du logiciel ont été prouvées par la segmentation des mêmes neurones avec le logiciel et NeuronJ. Du point de vue de l’analyse statistique, les valeurs des longueurs des neurites étaient bien corrélées avec un coefficient de corrélation de Spearman élevé.

Après avoir évalué la fiabilité de la méthode, nous sommes passés à l’analyse de différentes conditions d’essai. Pour une analyse optimale, quelques précautions sont nécessaires. Tout d’abord, les neurones doivent être uniformément ensemencés dans le puits, en évitant les endroits à forte concentration cellulaire. Le regroupement des neurones fait perdre au logiciel sa précision dans la détection des neurites. Une autre variable qui influence l’exactitude et la précision de l’analyse est la propreté de la culture. Une culture propre avec peu de débris cellulaires et de cellules mortes est préférable. Cependant, le logiciel est capable de compenser de tels problèmes en modulant la sensibilité des neurites et le masque de segmentation du corps cellulaire. Comme mentionné ci-dessus, le masque jaune segmente les objets à fort contraste, parmi lesquels il y a aussi des ombres causées par le mouvement du support dans le puits. Les ombres peuvent couvrir les névrites, entraînant ainsi la perte de longueur des neurites. Cependant, un tel problème est facilement résolu en laissant le support se stabiliser avant l’acquisition de l’image.

L’algorithme est capable d’effectuer une quantification de la longueur des neurites sur des images à contraste de phase et des images d’immunocytochimie. Lorsqu’il s’agit d’une fluorescence, d’autres précautions doivent être prises afin d’obtenir une analyse fiable. Tout d’abord, la qualité de la coloration influence profondément le résultat de l’analyse. Si les neurites sont cassés ou segmentés et que les corps cellulaires sont arrachés pendant les lavages, l’analyse perd en force et en fiabilité. De plus, la fluorescence elle-même représente un élément potentiellement perturbant pour l’analyse. Étant donné que la mise au point est effectuée automatiquement par la machine, l’objectif met au point des objets très brillants tels que des artefacts, des corps cellulaires ou des neurites épais. En conséquence, des neurites plus minces et moins brillantes sont laissées derrière, ce qui rend difficile pour l’utilisateur de mesurer correctement la longueur des neurites.

En conséquence, l’analyse des images de phase pourrait être plus fondée que l’analyse des images d’immunocytochimie. Le logiciel est capable de travailler sur de nombreuses morphologies neuronales différentes, des plus complexes et élaborées aux plus simples, soit en tant que cellules uniques, soit en réseaux neuronaux. Par conséquent, il est utilisable dans de nombreux domaines de recherche différents, allant des cultures primaires de neurones provenant du système nerveux central ou périphérique de divers stades de développement aux neurones dérivés d’iPSC et aux lignées cellulaires telles que NSC-34.

Malgré le potentiel important du logiciel, certaines limitations peuvent être notées. Tout d’abord, la précision de la segmentation du corps cellulaire n’est pas optimale. Par conséquent, des paramètres tels que l’amas de corps cellulaires et la surface de l’amas de corps cellulaire ne peuvent pas être utilisés de manière fiable pour le comptage des cellules. Deuxièmement, en plus des précautions nécessaires pour une segmentation optimale des neurites, les axones insuffisamment épais peuvent être exclus de la mesure de la longueur des neurites, entraînant ainsi une perte de données.

Le paramètre de point de branche rencontre des problèmes liés aux deux types de segmentation. Les ombres, les cellules mortes ou les débris de la culture qui se localisent sur les points de branche les obscurcissent car ils sont recouverts par la segmentation du corps cellulaire. De plus, dans le cas des névrites minces, la fiabilité du paramètre du point de branche est à nouveau gravement compromise.

De plus, la mise au point automatique lors de l’acquisition d’images peut parfois être sous-optimale. Le grossissement maximal de la machine est limité à 20x, ce qui peut être insuffisant pour observer des détails plus fins ou la fluorescence dans des structures minces telles que les neurites. De plus, la machine fonctionne mieux avec des substrats plastiques homogènes. Si une lamelle en verre est insérée dans le puits, la mise au point sur le verre peut échouer, ce qui entraîne des images partiellement floues. Cependant, ce logiciel ne s’applique pas seulement aux neurones, mais aussi à des domaines de recherche complètement différents, tels que la croissance fongique36.

Tout bien considéré, nous pensons que ce module de mesure de l’excroissance des neurites est un outil fiable pour mesurer les neurites rapidement, de manière impartiale et efficace.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée sans aucune relation commerciale ou financière susceptible de créer un conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Alessandro Vercelli pour les commentaires critiques et le soutien technique de Sartorius pour l’aide. Nos recherches sur ces sujets ont été généreusement soutenues par la bourse Rita-Levi Montalcini 2021 (MIUR, Italie). Cette recherche a été financée par le Ministero dell’Istruzione dell’Università e della Ricerca MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 au Département de neurosciences Rita Levi Montalcini. Les recherches de D.M.R. ont été menées pendant et avec le soutien du cours de doctorat national interuniversitaire italien en développement durable et changement climatique (lien : www.phd-sdc.it).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagénase AMerck / Roche10103586001
Dispase II (protéase neutre, grade II)Merck / Roche 4942078001
Dulbecco’s modified eagle’s mediumMerck / SigmaD5796
Sérum de bovin fœtal  ;Merck / SigmaF7524
Mélange de nutriments F-12 de Ham (1X)ThermoFisher Scientific21765029
F12 avec L-GlutamineEurocloneECM0135L
solution saline équilibrée de HanksEuroclone
HBSS (10X), sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénolThermoFisher Scientific14185045
Sérum fœtal bovin caractérisé HyClone (États-Unis)CytivaSH30071.03
Incucyte, logiciel d’analyse Neurotrack  ;Sartorius9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Laminine Souris Protein, ThermoFisherScientific23017015
L-CysteineMerck / SigmaC7352
Leibovitz’s L-15 medium sans L-glutamineEurocloneECB0020L
souris NGF 2.5S (>95 %)Alomone LabsN-100
Milieu neurobasal [-] GlutamineThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)CLU140
Papaïne à partir de latex de papayeSigmaP4762
Pénicilline-streptomycine (5 000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll ( Densité 1,130 g/mL)Cytiva17089101
Solution de Poly-D-Lysine (1mg/mL)EMD Millipore/MerckA-003-E
Solution de Poly-L-Lysine (0-01 %)SigmaP4832
Recombinant Human NT-3PeproTech450-03
Acide rétinoïqueMerck / SigmaR2625
Solution de trypsine-EDTASigmaAnticorps T3924
&beta ;-Tubulin III (Tuj1)Merck / SigmaT8660
ECM0507L

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Ramification des neuritesmorphologie neuronalemicroscopie en acc l rimagerie contraste de phaseimages d immunocytochimiecultures de neurones sensorielsr g n ration axonaledouleur neuropathique

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