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Article de méthode

Production de collagène à motifs nanofibrillaires pour l’ingénierie tissulaire

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DOI :

10.3791/67165

⸱

20 septembre 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le protocole suivant présente une méthode d’extrusion basée sur le cisaillement pour la fabrication d’hydrogels de collagène avec des fibrilles à motifs nanométriques, qui peut être appliquée à un large éventail d’applications d’ingénierie tissulaire.

Résumé

Les biomatériaux régénératifs sont conçus pour faciliter les interactions cellule-matériau afin de guider la réparation des tissus et des organes endommagés. Ces matériaux sont conçus pour imiter les propriétés biophysiques des tissus natifs, fournissant des conseils phénotypiques et morphologiques cellulaires qui contribuent à la restauration de la niche tissulaire régénérative. Le collagène, une protéine de la matrice extracellulaire prévalente, est un composant commun de ces biomatériaux régénératifs en raison de sa biocompatibilité et d’autres propriétés favorables. L’étude actuelle décrit une méthode nouvelle et simple pour la fabrication de collagène nanofibrillaire modifié avec un motif de fibrilles dirigées. Grâce à la manipulation de la contrainte de cisaillement, de la température et du pH, la fibrillogenèse et l’alignement du collagène sont contrôlés avec précision sans nécessiter d’équipement spécialisé. Cette approche permet de créer des biomatériaux de collagène nanofibrillaires qui imitent la structure native des tissus présentant des caractéristiques anisotropes ou isotropes. La flexibilité de la structuration des nanofibrilles de collagène facilite non seulement l’étude de la structuration à l’échelle nanométrique du comportement cellulaire, mais offre également diverses possibilités pour les applications d’ingénierie tissulaire à motifs.

Introduction

L’objectif de la médecine régénérative est d’améliorer la régénération et la guérison des tissus grâce à l’application de thérapies modifiées. L’une d’entre elles consiste à fabriquer des matériaux biomatériaux qui imitent étroitement la composition et la structure des tissus natifs. Lors de la conception de ces constructions, une considération essentielle est la matrice extracellulaire sous-jacente (MEC) native, qui fournit des indices pédagogiques pour la prolifération, la migration et la différenciation cellulaires, conduisant finalement à la régénération des tissus 1,2. L’ECM native est principalement composée de collagène fibrillaire 3,4. Dans les tissus hautement organisés tels que les muscles squelettiques et les tendons, ces ECM présentent un motif aligné, qui est essentiel pour soutenir la transmission de la force à travers les tissus ainsi que la fonction motrice 5,6.

L’utilité du collagène en tant que biomatériau pour les applications d’ingénierie tissulaire va au-delà de sa prévalence extensive dans les tissus natifs, car il présente également une bonne biocompatibilité, une biodégradabilité et une affinité cellulaire 7,8,9. Les progrès récents dans le développement de biomatériaux à base de collagène ont mis l’accent sur le raffinement des propriétés biophysiques afin de mieux guider les signaux mécaniques et biochimiques essentiels à la régénération de tissus spécifiques. La création de biomatériaux de collagène avec une structure fibrillaire in vitro est relativement simple, car les molécules de collagène solubles dans l’acide sont capables de s’auto-assembler en nanofibrilles lorsqu’elles sont exposées à des températures chaudes et à un pH neutrede 10,11. Cependant, sans manipulation guidée, ces fibrilles se formeront en réseaux aléatoires, ce qui les rendra inadaptées aux applications d’ingénierie tissulaire anisotrope. Les techniques capables de produire des fibrilles alignées comprennent l’électrofilage et le filage humide, ainsi que d’autres techniques d’extrusion en solution12,13, la lyophilisation14, la fabrication électrochimique ou magnétique15,16, le dépôt d’écoulement par cisaillement17, la cristallisation induite par l’écoulement18, l’extrusion de gel19, l’alignement induit par la déformation20 et l’alignement guidé par la force par la manipulation du fluide débit 21,22. Cependant, bon nombre de ces méthodes ne sont pas hautement compatibles avec le collagène, produisent un alignement à l’échelle microscopique mais pas à l’échelle nanométrique, nécessitent des étapes de post-traitement supplémentaires pour induire l’alignement et la stabilité, ou nécessitent des équipements et des réactifs hautement spécialisés, ce qui rend leur adoption généralisée difficile.

La présente étude présente une méthode facile basée sur le cisaillement pour la fabrication de collagène nanofibrillaire, avec un motif de fibrilles aligné ou orienté de manière aléatoire, sans avoir besoin d’équipements spécialisés tels que des pousse-seringues ou des électrospinners. Cette technique capitalise sur la dépendance du pH de la fibrillogenèse du collagène. L’application d’une force de cisaillement au collagène monomère acide dans un tampon neutralisant favorise la fibrillogenèse alignée dans la direction du cisaillement. De même, le collagène peut être amené à subir une fibrillogenèse en l’absence de cisaillement, ce qui produit des fibrilles aux motifs aléatoires. Les bandes de collagène 3D qui en résultent, composées de collagène nanofibrillaire aligné ou aléatoire, peuvent servir d’outils pour étudier les effets de la structuration à l’échelle nanométrique sur le comportement cellulaire. De plus, ils offrent diverses possibilités pour les applications d’ingénierie tissulaire anisotrope et isotrope 23,24,25,26,27. Le motif peut être personnalisé pour correspondre à la structure du tissu natif d’intérêt. Les bandes de collagène peuvent également être combinées en faisceaux de différentes tailles pour servir de thérapie transplantée dans diverses tailles et formes de blessures.

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Protocole

1. Préparation du collagène dialysé (Figure 1)

  1. Coupez le tube de dialyse à une longueur d’environ 3 pouces. Utilisez des tubes avec les spécifications suivantes : largeur à plat de 32 mm, diamètre gonflé de 20 mm et taille de pores de 4,8 nm.
  2. Réhydratez la tubulure de dialyse dans de l’eau ultra-pure.
  3. Fixez une extrémité de la tubulure à l’aide d’une pince de tubulure de dialyse.
  4. Transvaser 5 à 6 mL de collagène de queue de rat de type I (concentration : 9 à 10 mg/mL dans de l’acide acétique 0,02 N) dans la tubulure à l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’une aiguille de 18 G. Coupez l’autre extrémité du tube pour le fermer.
  5. Placez une couche de flocons de polyéthylène glycol (PEG) de 0,5 à 1 cm d’épaisseur au fond d’un plat en verre, puis placez le tube de dialyse rempli de collagène sur la couche de PEG.
    REMARQUE : Un plat en verre de 13 pouces x 9 pouces x 2 pouces peut généralement accueillir une rangée de 4 à 5 tubes remplis de collagène. La taille de la parabole peut être ajustée en fonction du volume de collagène nécessaire.
  6. Ajoutez plus de flocons de PEG pour couvrir complètement le tube et placez le plateau dans un réfrigérateur à 4 °C.
  7. Toutes les 10 à 15 minutes, retirez les flocons de PEG humides de la surface de la tubulure de dialyse et recouvrez la tubulure d’une nouvelle couche de PEG sec. Remettez le plat dans le réfrigérateur à 4 °C.
  8. Répétez l’étape 1.7 deux fois de plus, et après 30-35 min, rincez les flocons de PEG humides à l’eau du robinet.
  9. Rincez à nouveau le tube à l’eau ultra-pure et séchez-le avec un mouchoir en papier.
  10. Déclipsez une extrémité du tube et transférez le collagène dialysé (concentration finale : ~30 mg/mL) dans des tubes de microcentrifugation. Faites tourner brièvement les bulles d’air dans le collagène à l’aide d’une mini-centrifugeuse (2 000 x g, ≤30 s, température ambiante [RT]) et stockez-les à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
  11. Un jour avant l’utilisation, chargez le collagène dans des seringues.
    1. À l’aide d’une aiguille de calibre 16, prélevez ~1 ml de collagène dialysé dans une seringue de 1 ml.
      REMARQUE : Le collagène est une substance visqueuse. La tête de l’aiguille peut avoir besoin d’être préchargée avec du collagène avant d’aspirer plus de collagène. Retirez la tête de l’aiguille et expulsez les grandes poches d’air si nécessaire
    2. Retirez l’aiguille et enveloppez la tête de la seringue avec du parafilm.
    3. Conservez la seringue remplie de collagène à la verticale à 4°C pendant la nuit pour permettre aux petites bulles d’air d’éclater.

2. Préparation des copeaux de verre (Figure 1)

ATTENTION : Utilisez une protection oculaire pour cette partie du protocole.

REMARQUE : Des lames de verre hydrophobe à revêtement spécial sont utilisées pour les expériences de culture cellulaire. Les lames doivent être manipulées par les bords pour éviter l’enlèvement du revêtement de surface. Effectuez la procédure de découpe du verre sur une surface de coupe appropriée.

  1. Mesurez et marquez les dimensions souhaitées de l’éclat de verre à l’aide d’un marqueur permanent
    1. Si vous créez des échafaudages à 8 bandes, tracez des incréments d’environ 1 cm le long du bord long de la glissière. Ajustez les dimensions si nécessaire en fonction de la taille d’échafaudage souhaitée.
  2. À l’aide d’une règle droite (c’est-à-dire un bord de plaque à 6 puits), faites glisser le coupe-verre sur la longueur de la première mesure pour marquer le verre.
  3. La lame se brisera d’elle-même le long de la ligne entaillée ou retournera la lame sur un mouchoir (côté hydrophobe vers le bas) et appliquera manuellement une pression sur la région entaillée.
  4. Marquez le côté enduit de la lame de verre hydrophobe à l’aide d’un marqueur à l’éthanol.
  5. Rincez l’éclat de verre à l’eau ultra-pure pour éliminer la poussière de verre résiduelle.
  6. Séchez les éclats de verre soit à l’aide d’une buse de paillasse pour l’air sous pression, soit en les empilant en biais dans la hotte.
  7. Répétez l’opération au besoin pour le nombre requis de jetons. Stockez les jetons chez RT. Pour de meilleurs résultats de culture cellulaire, utilisez des puces préparées dans les 7 jours.

3. Préparation de solution saline tamponnée au phosphate 10x (PBS)

  1. Remplissez une bouteille en verre avec 500 ml d’eau ultra-pure.
  2. Ajoutez 10 comprimés de PBS dans la bouteille.
    REMARQUE : Ce protocole suppose que le rapport de comprimés pour 1x PBS est de 1 comprimé par 500 ml. Ajustez le nombre de tablettes selon vos besoins si vous utilisez une taille ou une marque de tablette différente.
  3. Ajoutez une barre d’agitation dans la bouteille et placez-la sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que les comprimés soient dissous.
  4. Le jour de la fabrication de l’hydrogel, transférez le volume nécessaire de 10 fois PBS dans des tubes coniques de 50 ml.
  5. Placez les tubes remplis de PBS dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 15 minutes avant la fabrication du collagène.

4. Fabrication de nanofibrilles de collagène alignées (Figure 2)

  1. Sortez une seringue de collagène du réfrigérateur et fixez-y une aiguille émoussée de 22 G.
  2. Placez une lame de verre dans le couvercle d’une assiette à 4 puits.
  3. Couvrez la lame avec suffisamment de 37 °C 10x PBS chauffé pour l’immerger (30-50 ml).
  4. En tenant la seringue à un angle d’environ 30-45°, extrudez manuellement de fines bandes de collagène sur la puce de verre en utilisant une vitesse de ~340 mm/s et un débit de ~3,2 mL/min.
    REMARQUE : Terminez l’extrusion de collagène dans les 30 à 60 s suivant l’ajout du PBS réchauffé pour vous assurer que le PBS ne refroidit pas excessivement.
  5. Attendez 1 à 2 minutes pour permettre au collagène de terminer la fibrillogenèse ou jusqu’à ce que le collagène prenne une couleur blanche opaque.
  6. Utilisez une pince pour couper les bandes de collagène à la longueur voulue. Assurez-vous que les bandes sont suffisamment longues pour que 3 à 5 mm puissent être pliés sous l’une ou l’autre des extrémités de la puce.
  7. Une à la fois, drapez doucement les bandes de collagène dans le sens de la longueur (parallèlement à la région entaillée) sur un éclat de verre préparé. Rentrez les bords sous la puce.
  8. Continuez à placer les bandes de collagène jusqu’à ce que les dimensions souhaitées soient atteintes.
  9. Positionnez l’hydrogel de collagène nouvellement formé sur deux puits d’une plaque à 12 puits. Cela permet à l’air de circuler pendant le processus de séchage et empêche les extrémités inférieures du collagène d’adhérer aux surfaces indésirables.
  10. Laissez sécher les hydrogels sur la paillasse pendant 1 à 3 h ou jusqu’à ce que les cristaux de sel PBS recouvrent 50 à 90 % de la surface de l’hydrogel.
    REMARQUE : Le temps de séchage variera en fonction de la taille de l’hydrogel et de la présence d’un excès de liquide.
  11. Immergez chaque hydrogel dans 1 PBS pendant environ 30 à 60 s ou jusqu’à ce que les cristaux de sel soient dissous.
  12. Tamponnez doucement l’excès de PBS avec un mouchoir en papier.
  13. Remettez les hydrogels sur la plaque du puits et laissez-les sécher dans une hotte pendant la nuit.
  14. Conservez les hydrogels séchés chez RT pendant environ 1 semaine.

5. Fabrication de nanofibrilles de collagène aléatoires (Figure 3)

  1. Sortez une seringue de collagène du réfrigérateur et fixez-y une aiguille émoussée de 22 G.
  2. Extruder le collagène à ~3,2 mL/min sur un éclat de verre sec. Extrudez suffisamment de collagène pour obtenir des dimensions similaires à celles des hydrogels de collagène alignés. Évitez l’accumulation de bulles d’air si nécessaire.
  3. Extrudez du collagène supplémentaire pour l’enrouler autour des bords de la puce de verre. Cela minimise le risque de détachement accidentel.
  4. À l’aide d’une pince, plongez le collagène extrudé dans un tube de 50 ml de PBS 10x réchauffé.
  5. Attendez 45 à 60 s pour que le collagène termine la fibrillogenèse ou jusqu’à ce que le collagène prenne une couleur blanche opaque.
  6. Tamponnez doucement l’excès de PBS avec un mouchoir en papier.
  7. Effectuez les étapes 4.9 à 4.14 pour rincer et sécher les hydrogels

6. Stérilisation et réhydratation

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes dans une enceinte de biosécurité

  1. Stérilisez les hydrogels de collagène et la plaque de puits environnante dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 min.
    1. Élevez brièvement les hydrogels à mi-chemin de la stérilisation à l’aide d’une pince pour vous assurer que le dessous de la puce de verre et l’hydrogel sont en contact avec l’éthanol.
  2. Retirez l’éthanol et laissez les hydrogels sécher à l’air libre pendant 10 min.
  3. Laver les hydrogels 3 fois dans du PBS stérile, pendant 10 minutes chacune, pour éliminer l’éthanol résiduel et réhydrater les hydrogels. Les hydrogels sont désormais prêts à l’emploi (culture cellulaire, etc.). Les hydrogels peuvent être brièvement laissés dans le PBS après l’étape de lavage finale s’ils ne sont pas immédiatement prêts à l’emploi.

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Résultats

Ce protocole décrit une technique d’extrusion simple basée sur le cisaillement pour la fabrication d’hydrogels de collagène composés de nanofibrilles alignées (Figure 2) ou orientées de manière aléatoire (Figure 3). La structuration des nanofibrilles repose sur le contrôle précis des forces de cisaillement, qui est obtenu grâce à la modulation combinée de la vitesse de la seringue et du taux d’extrusion du collagène. Les valeurs optimales pour induire l’aligneme...

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Discussion

Les étapes critiques du protocole peuvent être distillées en trois parties principales : 1) la fibrillogenèse du collagène, 2) le montage de l’hydrogel et 3) le lavage. Le processus de fibrillogenèse du collagène se produit spontanément dans des conditions neutralisantes et repose sur l’auto-assemblage de molécules de collagène individuelles en structures fibrillaires stabilisées plus grandes10,11. Ceci est réalisé grâce à l’appl...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette recherche a été financée en partie par l’Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training, MTF Biologics, l’Oregon Health & Science University Foundation et le Collins Medical Trust. K.M.H. a été soutenu par la bourse de recherche supérieure de la National Science Foundation (DGE-1937961) et la bourse de recherche sur l’apprentissage et l’expérience des étudiants de l’Oregon (OSLER) (5TL1TR2371-8). K.H.N. a été soutenu par des subventions du NIH/NHLBI (R00HL136701) et du NIH/NIAMS (R01AR080150).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagène I, haute concentration, queue de ratCorningCB354249
Eclipse TE-2000-U microscopeNikonTE-2000-U  ;Microscope inversé
Lames de microscope extra épaissesFisher Scientific22-267-005Fonctionne bien pour la surface d’extrusion de collagène
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/AMicroscope électronique à balayage
Ensemble d’outils de coupe de verre 2mm-20mm Style crayon Alimentation en huile Pointe en carbure Amazon/MOARMORB07Y1D243HOption pour un coupe-verre
Hamilton Kel-F Hub Aiguilles à pointe émoussée (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Aiguilles pour l’extrusion de collagène
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819Lames hydrophobes Comprimés
PBSThermo Fisher Scientific18912014
Polyéthylène glycol 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Tube de dialyse cellulosique sans soudure  ;Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin Pinces de dialyseThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Coupe-verreSynthware31-501-927Option pour un coupe-verre

Références

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