Criblage de fragments covalents à l’aide du test quantitatif de liaison irréversible

Summary

Le test qIT (quantitative irreversible tethering) est une méthode basée sur la fluorescence permettant d’identifier des fragments covalents qui s’engagent sélectivement avec une protéine cible. Ici, un protocole détaillé est décrit pour décrire le test qIT, avec des exemples de résultats inclus.

Abstract

Les composés qui forment des liaisons covalentes avec des protéines cibles spécifiques offrent une variété d’avantages en tant que sondes chimiques et agents thérapeutiques. Le plus souvent, de petites molécules électrophiles légèrement réactives sont utilisées pour former des liaisons covalentes avec des chaînes latérales de cystéine sélectionnées dans des protéines spécifiques. Les approches électrophiles de découverte de ligands, qui consistent à cribler une bibliothèque de petites molécules électrophiles contre une cible protéique, sont devenues populaires car elles évitent la nécessité d’installer en aval une ogive électrophile. Un tel criblage est toutefois compliqué, car les ligands électrophiles peuvent présenter une large gamme de taux différents de réaction spontanée avec les cystéines. Le partage de connexion quantitatif irréversible (qIT) offre une méthode basée sur la fluorescence pour l’identification et le développement des coups qui normalise les données pour ces différences de réactivité intrinsèque des composés. Les vitesses de réaction des composés individuels avec une protéine cible sont déterminées et comparées à la réactivité du composé avec le glutathion, un tripeptide non structuré (qui est un indicateur de la réaction spontanée du composé), ce qui permet d’identifier les composés qui réagissent préférentiellement avec la protéine d’intérêt. Cette méthodologie a été appliquée avec succès pour identifier des fragments covalents sélectifs contre plusieurs cibles médicamenteuses, notamment la protéase principale du SRAS-CoV-2, la kinase 2 dépendante de la cycline et RAP27A. Ici, nous démontrons l’application de qIT à une protéine cible pour générer un ensemble de données quantitatives et robustes, permettant de hiérarchiser les ligands de hit pour le développement futur.

Introduction

Les ligands covalents ciblés réactifs à la cystéine (molécules qui exercent un effet biologique en réagissant avec un résidu de cystéine sélectionné sur une protéine spécifique) sont devenus de plus en plus populaires en tant qu’outils chimiques et thérapeutiques au cours des dernières décennies¹. Ceux-ci consistent généralement en un électrophile légèrement réactif (tel qu’un acrylamide, un chloroacétamide ou un vinylsulfone) ajouté à un fragment ligand ayant une forte affinité pour une cible protéique². Idéalement, l’interaction ligand-protéine se déroule via un mécanisme en deux étapes impliquant une liaison initiale du ligand non covalent, suivie de la formation d’une liaison covalente irréversible entre la cystéine cible et l’électrophile³.

Plusieurs ligands covalents ciblés précocement, y compris l’inhibiteur de la tyrosine kinase de Bruton, l’ibrutinib, ont été développés en fournissant un ligand réversible précédemment identifié avec une poignée électrophile⁴. Cependant, cette approche n’est pas toujours couronnée de succès, et d’autres tentatives ont montré que l’installation électrophile nécessitait une optimisation significative⁵. Au lieu de cela, les approches électrophiles, en particulier l’utilisation de fragments électrophiles, sont devenues plus populaires ces dernières années. Celles-ci impliquent généralement l’incubation d’une bibliothèque d’électrophiles avec une protéine, puis la sélection de composés ayant un taux de réaction accru envers une cystéine, qui est supposé être induit par des interactions non covalentes productives entre le ligand et la poche de liaison⁶. Notamment, ces méthodes ont été appliquées avec succès lors du développement de l’inhibiteur de KRAS (G12C) Sotorasib¹.

Le criblage électrophile d’abord pose plusieurs défis uniques par rapport au criblage traditionnel de ligands non covalents, principalement en raison de la grande variabilité de la réactivité au sein et entre les classes d’ogives⁷. La plupart des électrophiles réactifs à la cystéine réagiront, au fil du temps, avec tous les résidus de cystéine exposés au solvant, indépendamment de toute interaction sélective pour la protéine cible. L’occupation des ligands augmentera donc avec le temps pour presque tous les électrophiles, et sans contrôle de la réactivité, la sélection des coups sera souvent biaisée vers des fragments plus réactifs qui engagent une cible plus rapidement⁸.

De plus, les méthodes de dépistage électrophiles utilisent souvent la spectrométrie de masse pour détecter la formation d’adduits protéine-ligand, qui est limitée dans le débit⁹. Un échantillonnage réactionnel régulier est nécessaire sur une longue période (de quelques heures à quelques jours) pour caractériser correctement la cinétique réactionnelle d’une bibliothèque de composés ayant une électrophilie variée¹⁰. Un criblage de 300 fragments échantillonnés à 10 points temporels nécessitera donc la réalisation de 3000 spectres de masse, dépassant le débit de la plupart des systèmes de spectrométrie de masse protéique. Des méthodes à haut débit de surveillance de la formation d’adduits protéine-ligand sont donc souhaitables.

L’approche décrite ici, le dosage du partage de connexion irréversible quantitatif (qIT), est une méthode de criblage électrophile qui contrôle la réactivité intrinsèque et utilise une simple lecture de fluorescence⁷. Les protéines, ou glutathion (un tripeptide non structuré contenant des thiols utilisé comme contrôle de la réactivité intrinsèque) sont incubées avec une bibliothèque de fragments électrophiles, et des échantillons réguliers sont prélevés pour être trempés dans une solution de CPM (7-Diethylamino-3-(4'-Maleimidylphenyl)-4-Methylcoumarin, un agent fluorogène de quantification des thiols). La formation d’adduits entre la cystéine et le fragment électrophile réduit la quantité de thiol disponible pour la réaction avec le CPM, réduisant ainsi la fluorescence résultante lors de l’extinction. La fluorescence CPM agit donc comme un proxy pour le thiol n’ayant pas réagi, ce qui permet de déterminer la cinétique de la réaction thiol avec chaque fragment électrophile. Les fragments électrophiles présentant une réactivité protéique significativement améliorée par rapport au glutathion sont sélectionnés comme résultats positifs et prioritaires pour un développement ultérieur (Figure 1).

Figure 1 : Schéma de qIT. Un aperçu schématique du test qIT. (créé à l’aide de BioRender). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La sélection des occurrences à l’aide des valeurs REF contrôle la réactivité intrinsèque et garantit que les fragments ne sont sélectionnés comme occurrences que s’ils forment des interactions productives non covalentes avec une cible protéique. La simple lecture de fluorescence signifie également que le test qIT est hautement évolutif et ne nécessite pas de méthodes de surveillance de réaction basées sur la spectrométrie de masse.

Ici, une procédure complète pour le test qIT est décrite, avec des exemples de résultats inclus pour illustrer les performances du test et la sélection des résultats.

Protocol

1. Construction d’une bibliothèque de fragments

1. Concevez une bibliothèque de fragments électrophiles et synthétisez-les ou achetez-les. Les banques de fragments électrophiles sont généralement constituées d’électrophiles légèrement réactifs (tels que les acrylamides, les chloroacétamides et les sulfamides de vinyle) ajoutés à un large éventail d’échafaudages chimiques. Les bibliothèques de fragments électrophiles sont largement disponibles auprès des fournisseurs commerciaux, et plus de détails sur leur conception et leur construction sont examinés ailleurs ^5,11.
2. Dissoudre chaque composé dans du DMSO à une concentration de 50 mM, puis distribuer un composé différent dans chaque puits des colonnes 3 à 22 d’une plaque de réservoir de 384 puits, appelée plaque de bibliothèque de fragments.
   1. Distribuez du DMSO dans chaque puits des colonnes 1, 2, 23 et 24 pour les témoins positifs et négatifs. La disposition des plaques peut varier en fonction du nombre de composés criblés (Figure 2). Le volume ajouté à la plaque de bibliothèque dépendra du nombre de tamis à effectuer, compte tenu du fait qu’environ 1,8 μL de chaque puits est nécessaire par tamis qIT. Préparez cette Fragment Library Plate à l’avance et conservez-la à 4 °C.

Figure 2 : Disposition de la plaque. Vue d’ensemble de la disposition des plaques à 384 puits pour le test qIT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Configuration du test (Figure 3)

1. Préparez les solutions suivantes : solution protéique recombinante (protéine cible dans n’importe quel tampon), tampon de dosage qIT (150 mM de NaCl, 25 mM de Hepes (pH 8)), tampon de trempe de test qIT (150 mM de NaCl, 25 mM de Hepes (pH 7,5)) et solutions mères composées (fragment électrophile (50 mM) dans du DMSO).
   REMARQUE : Un pH de 8 est utilisé dans le tampon de réaction pour accélérer la réaction entre le résidu de cystéine cible et les fragments, ce qui permet de mesurer la vitesse de réaction même pour des fragments extrêmement légèrement réactifs. Un pH légèrement inférieur de 7,5 est utilisé dans le tampon d’extinction, car la liaison thioéther formée entre le maléimide du CPM et le thiol de cystéine est sujette à l’hydrolyse à des pH plus basiques (par exemple, des travaux antérieurs ont montré que les conjugués cystéine-maléimide sont beaucoup plus stables à un pH de 7,3 qu’à un pH de 8^{à 12}).
2. Retirer les solutions mères de fragments de DMSO de l’entrepôt et les laisser à température ambiante pendant au moins 2 h pour permettre aux stocks composés de dégeler.
3. Dégazer le tampon de dosage qIT en le faisant bouillonner avec du gaz argon pendant environ 30 min.
4. Remplacez soigneusement la solution protéique cible dans un tampon de dosage qIT dégazé. Il est crucial que les agents réducteurs tels que le DTT et le TCEP soient complètement éliminés à des concentrations < 100 nM, car ils interfèrent avec la quantification des thiols. Cette étape peut être effectuée via une série répétitive d’échanges de tampons, comme décrit ci-dessous.
   1. Diluer la solution protéique en excès de tampon de dosage qIT dégazé dans une unité de filtre de spin, concentrer par centrifugation (4000 x g, 4 °C, 15 min) et répéter. En règle générale, 4 cycles de dilutions de 1 sur 15 sont nécessaires pour éliminer suffisamment le DTT (1 mM) de 1 mL de solution mère de protéines recombinantes, bien que cette étape puisse être ajustée en fonction de la concentration d’agent réducteur dans la solution de protéines recombinantes d’origine.
      REMARQUE : Alternativement, la dialyse de la solution protéique cible contre un grand excès de tampon de test qIT dégazé peut obtenir le même résultat.
5. Diluer la solution protéique cible (produite à l’étape 2.1) jusqu’à une concentration protéique de 15 μM dans un tampon de dosage qIT dégazé. Environ 9 mL de solution protéique cible sont nécessaires pour remplir une plaque de 384 puits avec un volume mort suffisant.
6. Préparez une suspension à 1,5 % (v/v) d’agarose TCEP dans un tampon de dosage qIT dégazé. Environ 9 mL de suspension de PTCE et d’agarose sont nécessaires par plaque de criblage.
7. Distribuer 20 μL de solution de PTEP-agarose dans chaque puits de deux plaques de 384 puits.
8. Préparez un stock de glutathion de 15 μM dans un tampon de dosage qIT dégazé. Celui-ci doit être préparé immédiatement avant le placage car le glutathion s’oxyde rapidement en solution sans agent réducteur.
9. Distribuez 20 μL de tampon de dosage qIT dans les colonnes 1 et 2 des deux plaques à 384 puits.
10. Distribuer 20 μL de solution de protéine 15 μM ou de glutathion (conformément à la plaque prévue) dans les colonnes 3 à 24 de la plaque à 384 puits. Celles-ci sont appelées plaque de réaction protéique et plaque de réaction du glutathion. Laisser réduire à RT pendant 1 h.
11. Distribuez 58,2 μL de tampon d’analyse qIT dégazé dans chaque puits d’une plaque de 384 puits, puis transférez 1,8 μL de chaque puits correspondant de la plaque de bibliothèque de fragments pour créer une plaque de dilution de composé, où chaque composé est dilué à une concentration de 1,5 mM dans un tampon d’analyse qIT plus 3 % de DMSO.
    REMARQUE : Cette étape est facilitée par une station de pipetage de 384 personnes, qui permet de transférer des stocks composés pour chaque puits en une seule opération.
12. Après 1 h d’incubation de protéines et de glutathion avec du TCEP-agarose, transférez 20 μL de solution composée de chaque puits de la plaque de dilution composée dans les plaques de réaction des protéines et du glutathion pour commencer l’essai. Cette étape est également facilitée par une station de pipetage de 384 personnes. Les étapes de l’analyse sont résumées à la figure 3.
    REMARQUE : La concentration en fragments peut être modifiée au besoin, et les tests qIT peuvent être répétés pour les résultats à des concentrations plus faibles, si nécessaire, pour confirmer que l’affinité protéique n’est pas un artefact de la concentration élevée en fragments. La concentration relativement élevée de fragments est utilisée pour élever le k_pro et le k_GSH afin de garantir que des taux précis sont déterminables pour les composés légèrement réactifs (qui peuvent afficher t_1/2 (GSH) > 24 h dans les conditions de dosage). De plus, bien qu’une concentration de fragments de 500 μM soit élevée, des concentrations de μM élevées à faibles mM ont été utilisées dans le criblage de fragments, par exemple¹³.
13. Démarrez une minuterie - le test a commencé et les trempes doivent être effectuées à des moments réguliers conformément à la section ci-dessous.

Figure 3 : Résumé du test qIT. Un résumé illustrant les étapes clés de la configuration d’un puits de réaction de test qIT. (créé à l’aide de BioRender). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Trempe CPM

REMARQUE : Des trempes CPM sont effectuées pour quantifier la quantité de thiol n’ayant pas réagi restant dans les plaques de réaction des protéines et du glutathion. Celles-ci doivent être effectuées à des points temporels discrets (par exemple, les points temporels suivants sont généralement utilisés : 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 et 1440 min) pour permettre de surveiller la cinétique de réaction.

1. Préparez des solutions mères de MPC (500 μM) dans du DMSO, distribuez-les dans des aliquotes de 111,2 μL dans des tubes de microcentrifugation et stockez-les à -20 °C. Ces stocks de CPM peuvent être préparés à l’avance, et 1 aliquote sera nécessaire par point de temps de trempe.
2. Préparez une solution d’extinction de CPM (1,4 μM) en décongelant une solution mère de CPM congelée (500 μM) et en l’ajoutant à 40 mL de tampon d’extinction de test qIT.
3. Versez 27 μL de solution de trempe CPM dans chaque puits de deux plaques de 384 puits - deux sont nécessaires pour tremper les plaques de réaction des protéines et du glutathion. Celles-ci sont appelées plaques de trempe CPM, préparez-les au maximum 30 min avant utilisation.
4. Centrifuger la plaque de réaction protéique à 200 x g pendant 3 min pour s’assurer que l’agarose TCEP est granulée.
5. À des moments prédéterminés, transférez 3 μL d’échantillon de chaque puits de la plaque de réaction protéique vers une plaque de trempe CPM préremplie. Cette étape est également simplifiée grâce à une station de pipetage de 384 personnes.
6. Mélangez la plaque de trempe CPM en aspirant et en distribuant 3 x 25 μL. Il est important de retirer l’échantillon par le haut du puits pour éviter d’aspirer l’agarose TCEP par le bas, ce qui interférerait avec la trempe CPM.
7. Répétez les étapes 3.4 à 3.6 avec la plaque de réaction au glutathion.
8. Incuber les plaques de trempe CPM (préparées en 3.4-3.6) à température ambiante pendant 1 h.
9. Mesurer l’intensité de fluorescence de la plaque de trempe CPM (excitation à 384 nm et émission à 470 nm).

4. Analyse des données et sélection des résultats

1. Pour chaque trempe, calculez Z' comme mesure de la qualité du dosage. Toute transition du CPM avec Z' < 0,5 ne doit pas être prise en compte.
   Z' = 1 - ((3σ_{contrôle positif} + 3σ_{contrôle négatif}) / (μ_{contrôle positif} - μ_{contrôle négatif}))
   où σ = écart-type de l’intensité de fluorescence et μ = moyenne de l’intensité de fluorescence
2. Calculer les valeurs moyennes de fluorescence pour les puits témoins négatifs et positifs (colonnes 1 et 2, et 23 et 24, respectivement).
3. Normalisez bien chaque réaction en fonction des valeurs moyennes de fluorescence des témoins positifs et négatifs :
   % modifié = 100 x (fluorescence de puits composé - fluorescence de contrôle négatif) / (fluorescence de contrôle positif - fluorescence de contrôle négatif)
4. Tracer séparément le pourcentage modifié en fonction du temps pour chaque composé réagissant avec le glutathion et avec la protéine cible.
5. Ajustez les données normalisées en fonction du pourcentage modifié en fonction du temps à un modèle de décroissance exponentielle monophasée pour la réaction avec les protéines et avec le glutathion à l’aide de l’équation :
   % modifié = ae ^{- kt + c}
   Où a = l’intervalle des valeurs modifiées en %, k = vitesse de réaction, t = temps, c = valeur en % modifié à l’infini. L’ajustement de la courbe et la détermination des paramètres peuvent être effectués à l’aide d’un logiciel commercial (tel que Graphpad).
6. Utilisez la vitesse à laquelle les fragments réagissent avec la protéine (k_pro) et le glutathion (k_GSH) pour calculer la valeur du facteur d’augmentation du taux (REF) pour chaque fragment :
   REF = k_pro / k_GSH
7. Utilisez les valeurs REF pour sélectionner les fragments d’accès. Cela peut être fait en fixant un seuil REF (par exemple, REF > 3), un taux de réussite arbitraire (par exemple, les 2 % supérieurs) ou en sélectionnant des fragments dont les écarts-types REF 3 sont supérieurs à la moyenne géométrique.

Results

Le test qIT est utilisé ici pour identifier les occurrences de fragments covalents pour une protéine cystéine unique sans nom. MgCl₂ (10 mM) a été ajouté aux tampons de réaction, car la protéine cible est connue pour se lier aux ions Mg²⁺ . Le criblage a été effectué en trois exemplaires, et la vitesse à laquelle chaque fragment a réagi avec la protéine cible (k_pro) et le glutathion (k_GSH) a été déterminée. Les valeurs de Z étaient supérieures à 0,5 pour toutes les plaques de trempe et étaient en moyenne de 0,75 pour les trempes protéiques et de 0,79 pour les trempes au glutathion, ce qui indique une excellente performance de dosage. Les valeurs REF ont ensuite été calculées pour chaque fragment, et les résultats ont été sélectionnés où REF > 3.

Les résultats représentatifs (Figure 4) fournissent un exemple de sélection de hit à l’aide du test qIT. Le composé 1 a réagi à un taux 6,0 fois plus élevé avec le résidu cystéine sur la protéine cible qu’avec le glutathion et, en utilisant un critère de REF > 3, a été sélectionné comme résultat positif (figure 4B). Cette accélération de vitesse indique la présence d’un effet de modèle, par lequel les interactions non covalentes positionnent 1 dans l’orientation correcte de la cystéine sur la protéine cible pour réagir avec l’ogive du chloroacétamide. En revanche, 2 est un exemple de fragment non touché car la réaction entre 2 et le résidu cystéine cible n’est pas accélérée par rapport à la réaction entre 2 et le glutathion. L’absence d’accélération de la vitesse indique qu’il n’y a pas d’interactions non covalentes productives, positionnant 2 dans la bonne orientation pour réagir avec le résidu cystéine cible.

Figure 4 : Résultats représentatifs. Les résultats montrent une surveillance des réactions des protéines et du glutathion par qIT pour (A) une réactivité intrinsèque élevée, un fragment de hit possiblement faussement positif et (B) un fragment de hit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le test qIT fournit une plate-forme efficace et pratique pour le criblage de fragments électrophiles réactifs à la cystéine contre une protéine cible. Cependant, il existe des considérations critiques qui peuvent entraver la performance du test si elles ne sont pas correctement prises en compte. Plus particulièrement, les protéines cibles ne doivent inclure qu’une seule cystéine exposée en surface pour convenir au criblage qIT, car d’autres résidus de cystéine réagiront avec la CPM et interféreront avec les mesures de fluorescence. Dans les cas précédents où les protéines cibles contiennent plusieurs cystéines exposées à la surface (comme pour la protéase principale du SRAS-CoV-2, la petite GTPase RAP27A et la kinase dépendante des cyclines 2), des constructions de criblage avec les résidus interférents éliminés ont déjà été utilisées avec succès. Cependant, l’efficacité de cette stratégie variera en fonction de la protéine 10,14,15.

De plus, comme le test qIT mesure la diminution des thiols disponibles pour réagir avec le CPM au fil du temps, tout facteur qui réduit la proportion de thiols disponibles, tel que l’oxydation des thiols ou l’agrégation des protéines, peut entraver les performances du test. Le dégazage tampon et l’utilisation d’un agent réducteur immobilisé (TCEP-agarose) garantissent que l’oxydation des thiols est lente, et toute oxydation restante doit être atténuée en normalisant les mesures de fluorescence à celles des puits de contrôle positif. Cependant, des problèmes peuvent survenir lorsqu’une distribution inégale de l’agarose TCEP entre les puits provoque une oxydation non uniforme des thiols. Un placage uniforme de l’agarose TCEP est donc essentiel pour les performances de l’essai, ce qui peut être difficile car les particules d’agarose TCEP coulent dans les réservoirs de pipetage.

L’agrégation des protéines peut également poser problème, car les conditions de dosage (24 h d’incubation à température ambiante) sont relativement difficiles. Des stratégies de dépannage telles que la fusion de protéines cibles à des marqueurs solubilisants, la modification de tampons de réaction ou la réalisation du test à des températures plus basses peuvent réduire l’agrégation et résoudre les problèmes de stabilité des protéines. Certains fragments peuvent également induire une agrégation de protéines, ce qui réduit à nouveau la proportion de thiol disponible pour réagir avec le CPM et crée des résultats faussement positifs. La validation des résultats orthogonaux à l’aide de la spectrométrie de masse à protéines intactes est une méthode efficace pour détecter ces cas, car les résultats faussement positifs créeront une population petite ou inexistante d’espèces marquées lorsqu’elles sont incubées avec une protéine cible.

Lorsque ces considérations sont prises en compte, le test qIT présente des avantages évidents par rapport aux autres méthodes de criblage de fragments covalents. La sélection des résultats à l’aide de REF garantit que les résultats ne sont sélectionnés que s’ils forment des interactions productives non covalentes avec la protéine cible. L’électrophilie des fragments varie sur de larges plages, à la fois entre différentes ogives et à l’intérieur des classes d’ogives ; Par exemple, des travaux antérieurs ont révélé des variations de plusieurs centaines de fois dans le taux de réactivité du glutathion entre les acrylamides¹⁰. Cette large gamme d’électrophilie peut rendre difficile la distinction des fragments avec des valeurs k_pro élevées en raison d’un effet de modèle de ceux qui sont simplement très réactifs, ce qui peut conduire à ce que des fragments hautement réactifs soient sélectionnés comme résultats faussement positifs. Par exemple, 2 a réagi avec le résidu cystéine cible plus rapidement que 1 et, sans tenir compte de la réactivité intrinsèque, peut être sélectionné comme un succès. Cependant, 2 ne réagit pas avec le résidu cystéine cible à un rythme plus élevé qu’avec le glutathion, ce qui indique que le k_pro plus grand de 2 par rapport à 1 est dû à une plus grande réactivité intrinsèque du fragment, et non à un effet de modèle.

La simple lecture de fluorescence utilisée par le test qIT pour quantifier le thiol restant est également très avantageuse. D’autres méthodes de criblage de fragments covalents utilisent la spectrométrie de masse à protéines intactes pour déterminer la vitesse à laquelle les fragments réagissent avec une protéine cible et la LC-MS pour déterminer la vitesse à laquelle le glutathion réagit avec les fragments - qui nécessitent toutes deux un équipement spécialisé et manquent de débit ^8,16. La lecture pratique de la fluorescence rend le test qIT hautement évolutif et ne nécessite que des équipements de laboratoire courants.

Combinées, ces innovations créent une méthode robuste et évolutive de criblage de fragments covalents, qui élimine le besoin d’équipement de spectrométrie de masse.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gaz argon	BOC	I1149
Corning 384 puits, à bride basse, à fond plat Plaques	d’essai Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
TCEP-agarose	immobilisé Pierce	77712
Lecteur de microplaques	CLARIOstar
Scellement de plaque PCR	BioRad	MSA5001
L-glutathion réduit	Sigma-Aldrich	G4251
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hepes	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7