Polarisation et caractérisation de macrophages dérivés de monocytes humains M1 et M2 sur des surfaces d’implants

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé d’évaluation du potentiel immunomodulateur des surfaces d’implants in vitro, dans le but d’améliorer la fiabilité et la reproductibilité des protocoles actuels et de promouvoir la poursuite des recherches. Les profils de cytokines sécrétoires, l’expression de l’ARNm et les marqueurs de surface cellulaire ont été surveillés à l’aide de macrophages dérivés de monocytes sanguins pour étudier la polarisation des macrophages cultivés sur du titane.

Résumé

La réaction à un corps étranger (FBR), un processus de cicatrisation complexe à médiation immunitaire, joue un rôle crucial dans l’intégration des implants dans le corps. Les macrophages, en tant que première ligne d’interaction du système immunitaire avec les surfaces de l’implant, jouent un rôle bidirectionnel dans la modulation de l’équilibre inflammation-régénération. Pour une compréhension approfondie et l’évaluation des réactions entre les matériaux d’implants et les réponses immunitaires, des méthodes et des protocoles in vitro fiables sont essentiels. Parmi les différents modèles in vitro , les macrophages primaires dérivés de monocytes (MDM) présentent un excellent modèle pour étudier les interactions macrophages-implants. Nous avons mis en place un protocole expérimental pour évaluer la polarisation des MDM en macrophages M1 (activés classiquement) et M2 (activés alternativement) sur les surfaces des implants. Nous avons isolé des monocytes sanguins de donneurs sains et les avons différenciés en macrophages à l’aide du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Des macrophages différenciés ont été cultivés sur les surfaces de l’implant et polarisés en sous-types M1 et M2. La polarisation M1 a été obtenue en présence d’interféron (IFN)-γ et de lipopolysaccharide (LPS), tandis que la polarisation M2 a été réalisée dans un milieu contenant de l’interleukine (IL)-4 et de l’IL-13. Nous avons évalué les phénotypes des macrophages par immuno-enzymatique (ELISA), microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) sur la base de panels de cytokines sécrétées, de marqueurs de surface cellulaire et de gènes exprimés. L’ARN extrait a été transformé en ADN complémentaire (ADNc), et la qRT-PCR a été utilisée pour quantifier l’ARNm lié aux macrophages M1 et M2. En conséquence, les macrophages M1 ont été caractérisés par une expression plus élevée de la cytokine pro-inflammatoire du facteur de nécrose tumorale (TNF-α) et du marqueur de surface CCR7 par rapport aux macrophages M2, qui présentaient des niveaux plus élevés de CD209 et CCL13. Par conséquent, CCR7 et CD209 ont été identifiés comme des marqueurs spécifiques et fiables des sous-types de macrophages M1 et M2 par immunomarquage et visualisation par CLSM. Une confirmation supplémentaire a été obtenue par ELISA détectant un taux élevé de TNF-ɑ dans M1 et une augmentation du CCL13 dans les cellules M2. Les marqueurs proposés et le dispositif expérimental peuvent être utilisés efficacement pour évaluer le potentiel immunomodulateur des implants.

Introduction

Les biomatériaux implantables sont devenus une solution conventionnelle pour diverses maladies humaines et jouent un grand rôle dans la recherche biomédicale, y compris l’ingénierie tissulaire, les systèmes d’administration de médicaments et les implants ^1,2. Il existe une large gamme d’implants fabriqués à partir de divers matériaux avec différentes structures et fonctionnalités, tels que des prothèses de hanche, des stents, des mailles, des valves cardiaques ou des implants dentaires. Lors de l’implantation, le contact tissu-implant provoque une réponse immunitaire, suivie d’une résolution, d’un remodelage tissulaire et d’une homéostasie. Ces processus sont influencés par les caractéristiques physiques, chimiques et bioactives des biomatériaux utilisés. Ces caractéristiques peuvent affecter l’intensité et le spectre des réponses pro- et anti-inflammatoires, la formation de capsules fibrotiques, la dégradation des tissus et la phase^de cicatrisation ^3,4. Afin de soutenir et d’optimiser le processus de cicatrisation et l’intégration à long terme des implants, l’un des aspects émergents de la recherche actuelle consiste à étudier et à arbitrer l’interaction entre les surfaces des implants et les cellules immunitaires.

Parmi les autres cellules immunitaires, les macrophages, que l’on trouve dans tout le corps, sont des acteurs clés de l’inflammation et de la défense antipathogène, ainsi que des processus de guérison et du maintien de l’homéostasie tissulaire ^5,6. Sur la base de leur plasticité et des stimuli microenvironnementaux tissulaires locaux, les macrophages sont capables de se polariser en phénotypes fonctionnels distincts, qui présentent de grandes différences dans le métabolisme cellulaire, les fonctions cellulaires et les profils de sécrétion de cytokines. Le phénotype M1 classiquement activé se distingue par la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-1β, l’IL-6 et le TNF-α, et est impliqué dans la réponse inflammatoire initiale et chronique aux traumatismes et aux biomatériaux étrangers. En revanche, les macrophages M2 activés, qui sont déclenchés par des cytokines telles que l’IL-4 et l’IL-13, présentent des caractéristiques telles que la résolution de l’inflammation et la promotion de la cicatrisation des tissus. Les macrophages polarisés M2 peuvent être identifiés par l’expression de marqueurs de surface cellulaire tels que CD206 et la production de cytokines comme IL-10 et IL-4⁷. De même, les macrophages qui ont déjà été polarisés peuvent se reprogrammer dans un nouveau microenvironnement.

De nombreuses études sur les interactions cellule-biomatériaux ont montré l’importance des macrophages dans la cascade des réponses immunologiques envers les biomatériaux implantables et dans l’orchestration des processus impliqués dans la guérison des complications liées aux implants ^8,9,10. Même si l’ingénierie biomédicale a fait des progrès significatifs ces dernières années, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre comment les implants modulent le comportement et la polarisation des macrophages 11,12,13.

En culture cellulaire, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) dérivées de monocytes peuvent être différenciées en macrophages M0 adhérents, suivies d’une polarisation induite vers les phénotypes M1 ou M2 en utilisant respectivement le LPS et l’IFN-γ ou l’IL-4. Après l’incubation in vitro avec de nouveaux échantillons de biomatériaux, il est possible d’utiliser les différents récepteurs de surface cellulaire et les profils cytokiniques des macrophages M1 et M2 pour détecter le potentiel immunomodulateur des biomatériaux in vitro^14,15. Cette étude visait à développer un protocole in vitro qui peut être utilisé pour étudier la polarisation des MDM en réponse à différentes surfaces d’implants. Les analyses d’expression génique, les techniques de microscopie et l’ELISA peuvent être utilisées pour déterminer les marqueurs phénotypiques et les profils cytokiniques spécifiques des macrophages M1 et M2 modulés par le biomatériau. Par conséquent, les interactions complexes entre les macrophages et les surfaces des biomatériaux peuvent être élucidées, et des informations précieuses peuvent être obtenues pour mieux comprendre les interactions macrophages-biomatériaux. Enfin, un protocole in vitro standardisé garantit la reproductibilité, la fiabilité et la comparabilité des résultats expérimentaux en minimisant la variabilité dans le dispositif expérimental.

Protocole

Le sang périphérique humain a été obtenu à partir de donneurs de sang sains conformément au protocole approuvé par le comité d’éthique de la faculté de médecine de l’Université de Tübingen (approbation éthique : 286/2021 BO). Les PBMC humains ont été isolés à l’aide de la centrifugation à gradient de densité, comme décrit précédemment¹⁶. Le protocole suivant est décrit pour les PBMC isolés à partir de 24 mL de sang. Une représentation schématique du protocole est illustrée à la figure 1.

REMARQUE : Le volume sanguin doit être ajusté en fonction du nombre de macrophages M0 utilisés.

Au total, 35,46 ± 9,1 millions de PBMC ont été obtenus à partir de 24 ml de sang, ce qui a donné 1,97 ± 0,46 million de macrophages M0 (n = 5). Tous les réactifs, consommables et appareils sont répertoriés dans la table des matériaux. Les tampons sont répertoriés dans le Tableau 1.

1. Différenciation des monocytes sanguins humains en macrophages

1. Remettre en suspension les PBMC isolés dans 15 mL de milieu de fixation monocytaire préchauffé et les transférer dans une fiole de culture cellulaire T75.
2. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 90 min pour permettre l’adhérence.
3. Jetez le surnageant et lavez les cellules une fois avec un milieu complet préchauffé avec une légère inclinaison pour éliminer les cellules non adhérentes ou faiblement adhérentes.
   REMARQUE : Les cellules attachées sont des monocytes, qui représentent environ 10 % du total des PBMC ajoutés à l’origine dans le flacon.
4. Ajouter 15 mL de milieu complet contenant 10 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) aux cellules adhérentes et incuber pendant 6 jours pour favoriser la différenciation.
5. Remplacez le milieu par un milieu frais complet contenant 10 ng/mL DE M-CSF tous les 2 jours.

2. Culture et polarisation des MDM sur la surface de l’implant en titane

REMARQUE : Au 6e jour de différenciation, les macrophages M0 ont été ensemencés à la surface du biomatériau avec différents stimuli pendant 48 h pour obtenir des macrophages M1 ou M2 entièrement polarisés. Pour chaque surface examinée, trois disques ont été utilisés pour ensemencer les macrophages M0, M1 et M2. Des lamelles en plastique traitées par culture cellulaire ont été utilisées comme surfaces de contrôle.

1. Retirer le milieu de culture des flacons T75 et laver les cellules avec 10 mL de PBS pendant 5 min.
2. Détacher les cellules adhérentes en les incubant avec 10 mL de solution de détachement cellulaire préchauffée pendant 30 min.
3. Tapotez doucement les cellules et transférez-les dans un tube de 50 ml. Détachez les cellules restantes en les grattant doucement dans 10 mL de PBS.
4. Transférez les cellules détachées dans le tube de 50 mL et centrifugez-les à 300 x g pendant 10 min.
5. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu complet préchauffé.
6. Comptez les cellules à l’aide d’une coloration au bleu de trypan et d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre et la viabilité des cellules.
7. Préparez la suspension cellulaire en ajustant le nombre de cellules à 160 000 cellules par 1 mL de milieu complet.
8. Nettoyez les disques de biomatériau par ultrasons avec de l’éthanol à 70 % pendant 5 min, suivi d’une stérilisation avec de l’éthanol à 70 % pendant 30 min.
9. Faites sécher les disques de titane pendant 1 à 2 h, puis placez-les dans des plaques non traitées à 24 puits et ajoutez 1 ml de suspension cellulaire préparée dans chaque puits.
10. Pour obtenir des macrophages polarisés M1, ajouter de l’IFN-γ et du LPS à la concentration de 50 ng/mL et 10 ng/mL, respectivement. Pour la polarisation M2, ajouter l’IL-4 et l’IL-13 à une concentration de 20 ng/mL chacune. Assurez-vous que les cellules M0 sont cultivées sans aucun agent de polarisation. Incuber les cellules pendant encore 48 h à 37 °C et 5 % de CO₂ pour induire la polarisation.

3. Caractérisation des macrophages polarisés à l’aide de l’ELISA

REMARQUE : Au jour 2 de la polarisation, des échantillons ont été préparés pour les analyses de caractérisation. La cytokine TNF-ɑ et la chimiokine CCL13 ont été mesurées pour caractériser les macrophages polarisés M1 et M2, respectivement. La concentration des protéines sécrétées a été normalisée à la concentration totale des protéines sécrétées dans le surnageant correspondant.

1. Prélever le surnageant dans un tube de 1,5 mL et le centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Transférez le surnageant dans un nouveau tube.
2. Transférez les disques sur une nouvelle plaque à 24 puits pour d’autres expériences. L’objectif est d’éliminer les cellules mortes ou faiblement attachées dans des plaques non traitées à 24 puits.
   REMARQUE : La viabilité des cellules doit être vérifiée sur les surfaces avant toute analyse. La viabilité des cellules peut être déterminée par des tests de viabilité de cellules vivantes/mortes ou indirectement par des tests de prolifération cellulaire et de cytotoxicité.
3. Mesurez les cytokines et les chimiokines selon les instructions spécifiques fournies par le fabricant. Mesurez les cytokines soit immédiatement, soit conservez les échantillons à -80 °C pour une mesure future.
   REMARQUE : Pour chaque type de kit (compte tenu de la sensibilité et des limites de détection du kit ELISA), la dilution appropriée de l’échantillon doit être déterminée. Pour le dosage de l’acide bicinchoninique (BCA), les échantillons ont été dilués 1:5. Les échantillons M1 pour TNF-ɑ ont été dilués 1:10, et les échantillons M2 pour CCL13 ont été dilués 1:12.
4. Calculez la concentration de cytokines/chimiokines sécrétées à l’aide de la courbe standard en suivant les instructions du fabricant.
5. Mesurez la quantité totale de protéines à l’aide du kit de dosage des protéines BCA.
6. Normaliser la concentration des protéines sécrétées en mg de protéines totales.

4. Caractérisation des macrophages polarisés à l’aide du CLSM

REMARQUE : Les macrophages polarisés ont été caractérisés en les colorant avec des anticorps dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire CD209 et CCR7. Les noyaux ont été contre-colorés avec DRAQ5. CD68 ou d’autres marqueurs peuvent être utilisés comme marqueurs pan-macrophages.

1. Laver les cellules 2x dans 800 μL de PBS. Incuber les disques pendant 20 min à température ambiante (RT) dans 400 μL de tampon de fixation.
2. Après avoir retiré le tampon de fixation, laver trois fois dans 400 μL de PBS. Colorer immédiatement les échantillons ou les conserver à 4 °C dans 1 mL de tampon de stockage.
   REMARQUE : Avec ce protocole de fixation et de stockage, les échantillons ont été colorés et imagés avec succès dans les 1 à 6 semaines suivant la fixation.
3. Avant l’étape suivante, lavez les disques deux fois avec 800 μL de PBS après le stockage.
4. Incuber les disques avec 400 μL de tampon de blocage pendant 30 min à RT pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.
5. Jeter le tampon de blocage et incuber les disques à RT pendant 1 h avec des anticorps primaires dilués dans 400 μL de tampon de coloration.
   1. Effectuer une procédure d’immunofluorescence à l’aide d’une double coloration pour examiner l’expression de CCR7 et CD209 dans un échantillon. Pour ce faire, combinez des anticorps primaires provenant de différentes espèces (souris et lapin) dans la même étape de coloration.
      REMARQUE : Pour obtenir un signal fort avec un bruit de fond minimal, optimisez la concentration d’anticorps. L’anticorps CCR7 a été utilisé à une concentration finale de 10 μg/mL, et l’anticorps CD209 a été dilué à 1/400.
6. Retirez les anticorps primaires et lavez 3 fois avec 400 μL de tampon de lavage.
7. Ajouter des anticorps secondaires marqués au fluorophore dilués dans un tampon de coloration et incuber pendant 1 h à RT dans l’obscurité.
   REMARQUE : La concentration des anticorps secondaires doit être optimisée pour obtenir un maximum de signaux spécifiques avec un bruit de fond minimal. Dans cette étude, des anticorps secondaires ont été utilisés à une concentration de 5 μg/mL pour la coloration.
8. Après avoir retiré le surnageant, laver les échantillons trois fois dans le tampon de lavage pendant 3 minutes chacune.
9. Ajouter 10 μM DRAQ5 dans PBS et incuber 15 min à RT, à l’abri de la lumière.
10. Retirez le surnageant et lavez les disques une fois dans du PBS.
11. Retirez le PBS restant et ajoutez 1 goutte de support de montage.
12. Après 5 minutes, appliquez les verres de protection et laissez sécher les échantillons pendant 1 h.
13. Après avoir séché les échantillons, scellez les bords avec du vernis à ongles transparent et conservez-les à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie.
14. Pour obtenir une vue d’ensemble des cellules, imagez les échantillons avec un grossissement de 25x. Pour déterminer davantage la structure et la localisation des marqueurs de surface, acquérez des images avec un grossissement de 63x.
15. Quantifiez l’intensité de fluorescence de CCR7 et CD209 à l’aide du logiciel ImageJ.
    REMARQUE : L’acquisition d’images a été effectuée à l’aide d’un photomultiplicateur (PMT) à l’aide d’un système CLSM, équipé d’un laser à argon (488 nm), d’un laser DPSS (561 nm) et d’un laser HeNe (633 nm).

5. Caractérisation des macrophages polarisés par qRT-PCR

REMARQUE : Pour l’isolement de l’ARN, deux disques par échantillon ont été utilisés afin d’obtenir suffisamment d’ARN pour la synthèse de l’ADNc.

1. Lavez les disques 2 fois avec 800 μL de PBS.
2. Ajoutez 350 μL de tampon de lyse au premier disque et lysez les cellules en pipetant de haut en bas.
3. Transférez le lysat sur le deuxième disque et répétez le processus de lyse.
4. Ajoutez 350 μL d’éthanol à 70 % dans le lysat et pipetez de haut en bas jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène.
5. Transférez le lysat dans la colonne de spin et suivez les instructions du fabricant pour l’isolement de l’ARN.
6. Quantifiez la quantité d’ARN à l’aide d’une nanogoutte ou d’un autre appareil.
7. Normalisez les concentrations d’ARN pour différents échantillons et synthétisez l’ADNc selon les instructions du fabricant à l’aide du système RT-PCR pour la synthèse de l’ADNc sur le premier brin.
8. Synthétisez l’ADNc à l’aide de 350 ng d’ARN en suivant le protocole du fabricant et stockez-le à -20 °C jusqu’à ce que l’analyse qRT-PCR soit effectuée.
   REMARQUE : Ici, 350 ng d’ARN purifié ont été utilisés pour synthétiser l’ADNc à l’aide de 4 μL de RT Mix (5x) dans 20 μL.
9. Effectuez une qRT-PCR sur un système de PCR en temps réel dans des plaques à 96 puits et des réactions individuelles de 15 μL (1x mélange maître vert Syber, 0,2 μM d’amorces directes et inverses et 4,5 μL d’ADNc dilué 1:10).
   REMARQUE : Le programme PCR commence par un couvercle chauffé (105 °C) suivi de trois étapes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, suivie de 15 s à 95 °C et de 30 s à 55 °C pendant 40 cycles.
10. Normaliser les niveaux d’expression de divers gènes au gène d’entretien GAPDH (ou à d’autres gènes d’entretien comme l’β-actine).
11. Calculer l’expression relative des gènes à l’aide de la méthode 2^−ΔΔCt en prenant comme référence les cellules M0 cultivées sur des lamelles de culture tissulaire. Le tableau 2 énumère toutes les amorces utilisées dans cette étude.

6. Analyse statistique

1. Présentez toutes les données sous forme de moyenne ± MEB. Répétez tous les essais (dans cette étude, les essais ont été répétés cinq fois) pour assurer la reproductibilité. Évaluez les différences statistiquement significatives entre des données normalement distribuées à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d’un test multiple de Tukey.
2. Utilisez le test de Friedman et le test de comparaison multiple de Dunn pour analyser des ensembles de données non paramétriques. Utilisez un logiciel d’analyse de données approprié pour analyser les données et définir la signification statistique comme une valeur p inférieure à 0,05.

Résultats

Les résultats de cette étude démontrent une différenciation et une polarisation réussies des MDM sur des surfaces en titane, suivies d’une caractérisation des macrophages polarisés M1 ou M2. Dans un premier temps, nous avons caractérisé les MDM polarisés à l’aide de CLSM. Sur la base de nos études préliminaires, CD209 et CCR7 ont été utilisés comme marqueurs spécifiques pour différencier les MDM polarisés M1 de M2. Comme le montrent les figures 2A, B, les MDM se sont polarisés avec succès en macrophages M1 et M2. À la surface du titane, CCR7 était exprimé plus fortement dans les macrophages polarisés M1 que CD209, exprimé spécifiquement dans les macrophages polarisés M2. De plus, la quantification de l’intensité relative de la fluorescence a facilité l’attribution de marqueurs aux sous-types M1 ou M2 (Figure 2C).

La figure 3 montre une analyse qRT-PCR représentative des MDM sur des surfaces en titane et sur des lamelles. Les résultats ont montré que les MDM sur les deux surfaces étaient polarisés avec succès, comme le démontre l’expression élevée des marqueurs de polarisation M1 (CCR7 et TNF-ɑ) et M2 (CD209 et CCL13). Cela a été confirmé au niveau de la protéine par l’observation de niveaux élevés de cytokines inflammatoires TNF-α (Figure 4A) et de chimiokines IL-13 (Figure 4B) dans les cellules polarisées M1 et M2, respectivement.

Figure 1 : Représentation schématique du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Caractérisation des MDM polarisés à l’aide de CLSM. L’enrichissement des macrophages polarisés M1 et M2 a été confirmé par coloration d’anticorps spécifiques et analyse CLSM à l’aide d’anticorps CCR7 et CD209 au jour 2 de l’ensemencement post-ensemencement. Selon la coloration par fluorescence et l’analyse CLSM, (A) un grossissement de 25x et (B) un grossissement de 63x, les cellules M1 ont exprimé un CCR7 plus élevé (en vert) que M0 ou M2. Les cellules M2 présentent un profil d’expression significatif de CD209 (en vert). (C) L’analyse quantitative de l’intensité relative de fluorescence de CCR7 et CD209. Les noyaux ont été colorés avec DRAQ5 (en violet). Les résultats sont représentatifs de 5 expériences similaires réalisées indépendamment. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation des MDM polarisés à l’aide de profils d’expression génique. La polymérase quantitative de transcription inverse a été utilisée pour étudier les niveaux d’ARNm de différents gènes associés à la polarisation M1 (CCR7 et TNF-ɑ) et M2 (CD209 et CCL13). GAPDH a été utilisé comme gène d’entretien ménager. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Production de cytokines par les macrophages M0, M1 et M2 cultivés sur des lamelles en titane et en plastique. (A) Le niveau de cytokines TNF-ɑ et (B) les niveaux de CCL13 dans les surnageants de culture cellulaire ont été mesurés à l’aide de l’ELISA. La sécrétion de cytokines a été normalisée en fonction de la sécrétion totale de protéines mesurée par le dosage des BCA. Les graphiques à barres représentent la moyenne ± SEM (n = 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Zone tampon/solution	Contenu
Tampon de coloration/blocage	PBS + 1 % BSA + 0,1 % Tween 20
Tampon de lavage	PBS + 0,1 % Tween 20
Tampon de fixation	3 % de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS
Tampon de stockage	1 % de pénicilline et de streptomycine dans le PBS

Tableau 1 : Liste des tampons.

Nom de base	Séquences d’amorce directe	Séquences d’amorces inversées
GAPDH	5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'	5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'
CCR7	5'- TGGTGATCGGCTTTTTCTGGTC-3'	5'- CACCTTGATGGCCTTGTTGC-3'
CD209 (en anglais)	5'- GGAGCAGAACTTCCTACAGC-3'	5'- CAACGTTGTTGGGCTCTCCT-3'
CCL13	5'-ATCTCCTTGCAGAGGCTGAA-3'	5'-ACTTCTCTCTTTGGGTCAGCA-3'
TNF-ɑ	5'- GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3'	5'- TCACTCGGGGTTCGAGAAGA-3'

Tableau 2. Séquences d’amorces utilisées dans la qRT-PCR.

Discussion

Une compréhension approfondie du comportement des macrophages est essentielle pour comprendre les propriétés immunomodulatrices des matériaux implantables. Plusieurs études ont rapporté des marqueurs hétérogènes, une variété de modèles cellulaires et des protocoles pour caractériser la polarisation des macrophages in vitro 17,18,19,20. Pour améliorer la reproductibilité, la fiabilité et la comparabilité des résultats expérimentaux, il est essentiel de disposer de protocoles standardisés et vérifiés, ainsi que d’un modèle cellulaire approprié et de marqueurs de caractérisation consensuels. Par conséquent, une simulation précise des propriétés immunomodulatrices des matériaux d’implant nécessite d’abord un modèle cellulaire approprié. Différentes études ont utilisé un large éventail de modèles cellulaires, tels que des macrophages tissulaires isolés, des macrophages différenciés dérivés de monocytes sanguins et des lignées cellulaires monocytaires immortalisées. Bien que les macrophages isolés dans les tissus puissent être considérés comme plus représentatifs des conditions in vivo, ils constituent un défi technique et éthique^21,22. Les macrophages sont également fréquemment obtenus à partir de lignées cellulaires monocytaires immortalisées établies, telles que les cellules THP1^{23, 24, 25, 26}. Bien que ces cellules puissent offrir une plus grande homogénéité de la réponse cellulaire en tant que source illimitée de cellules non sénescentes, elles sont généralement obtenues chez des patients atteints de néoplasmes hématologiques, et leurs réponses peuvent différer considérablement de celles des cellules normales. Les cellules monocytaires THP1, par exemple, sont plus sensibles aux simulateurs M1 et plus susceptibles de présenter des caractéristiques M1²². Les résultats de cette étude sont conformes à ceux de notre étude préliminaire (données non présentées ici).

De plus, comme les monocytes dérivés du sang sont considérés comme les précurseurs des macrophages résidant dans les tissus et peuvent être facilement obtenus à des rendements plus élevés, ils peuvent constituer une alternative réalisable pour les macrophages 27,28,29. Sur la base de notre étude utilisant des macrophages dérivés de monocytes sanguins, nous avons constaté que ces cellules étaient tout aussi sensibles aux stimulateurs M1 et M2 sur les lamelles traitées en titane et en culture cellulaire. De plus, ils ont présenté plusieurs marqueurs de consensus M1 et M2, dont certains sont illustrés dans les résultats représentatifs. Les résultats ont démontré que les MDM peuvent être utilisés comme modèle in vitro réalisable pour simuler les interactions implant-macrophage.

Pour faire progresser les études d’immunomodulation, des marqueurs de caractérisation constants et spécifiques sont essentiels. Des études ont introduit une variété de marqueurs pour la caractérisation des macrophages qui diffèrent non seulement entre les macrophages de différentes sources, mais aussi entre les macrophages de la même source 17,18,19,24. Un panel de marqueurs M1 et M2 caractéristiques des MDM a été déterminé et vérifié via l’évaluation de différents marqueurs rapportés. Certains des marqueurs clés les plus importants sont présentés dans cet article.

La détermination des méthodes de détection les plus appropriées est également un élément crucial du processus d’évaluation. Les techniques d’analyse couramment utilisées pour évaluer les marqueurs de surface cellulaire nécessitent généralement le retrait de cellules des biomatériaux. Cependant, il a été observé que ce processus affecte négativement les cellules en endommageant leurs marqueurs de surface et en entraînant un faible nombre de cellules détachées³⁰. Par conséquent, la cytométrie en flux, qui nécessite un détachement de cellules, n’est pas appropriée pour évaluer les macrophages étroitement attachés aux implants. Dans cette étude, la détection de marqueurs de surface cellulaire a été effectuée à l’aide de CLSM. En utilisant les marqueurs appropriés et en optimisant le processus de coloration, nous avons réussi à caractériser les sous-types M1 et M2 les uns par rapport aux autres et aux cellules M0. Il est important de noter que la coloration par fluorescence est semi-quantitative, ce qui est l’une de ses limites. Cela peut compliquer l’évaluation des cellules à l’aide de marqueurs exprimés dans tous les sous-types sans différences significatives. CCR7 et CD209 ont été sélectionnés après avoir testé différents marqueurs pour caractériser les MDM à l’aide de CLSM. Les taux CCR7 et CD209 étaient systématiquement plus élevés dans les sous-types M1 et M2, respectivement.

Dans les limites de cette étude, les résultats mettent en évidence l’utilité et l’efficacité des protocoles mis en œuvre pour polariser les macrophages sur les surfaces des implants et les caractériser avec précision en termes d’expression génique, de protéines sécrétées et de marqueurs de surface cellulaire. De plus, l’analyse des marqueurs décrits a révélé des modèles d’expression cohérents et spécifiques qui peuvent être utilisés pour distinguer différents sous-types de MDM. Ce modèle in vitro ne reflète toutefois pas pleinement la diversité phénotypique et la plasticité des macrophages humains. Plusieurs sous-types de macrophages (M2a, M2b, M2c, M2d) sont actuellement identifiés, ce qui indique la nécessité de disposer de modèles in vitro plus diversifiés pour étudier comment divers biomatériaux et leurs caractéristiques (p. ex., propriétés physicochimiques) affectent la plasticité et la polarisation des macrophages^31,32. Bien qu’il ne soit pas possible de reproduire la complexité de la situation in vivo à l’aide de modèles in vitro, de nombreux résultats peuvent être obtenus en utilisant le protocole in vitro présenté pour décrire efficacement le potentiel immunomodulateur de nouveaux biomatériaux implantables⁹. Enfin, il est nécessaire de caractériser les macrophages dans des modèles in vitro ou in vivo plus complexes impliquant le rôle d’autres acteurs dans des contextes physiologiques complexes. Dans l’ensemble, cette étude contribuera au développement et à la conception de biomatériaux immunomodulateurs pour améliorer et promouvoir les processus de régénération tissulaire favorables et l’intégration réussie des implants, ainsi que pour prévenir l’inflammation chronique associée aux implants.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 24 puits, non traitée	Corning Incorporated (Kennebunk, États-Unis)  ;	144530
Lecteur d’absorbance Infinite F50  ;	TECAN Austria GmbH (Grö ; dig, Autriche)	TCAT91000001
Accutase dans DPBS, 0,5 mM EDTA	EMD Millipore Corp. (Burlington, États-Unis)	SCR005
Milieu de montage par fluorescence anti-évanouissement -Aqueux, Fluoroshield	abcam (Cambridge, Royaume-Uni)	ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Thermocycleur Peltier	Bio-Rad / MJ Research	7212
Albumine sérique bovine (BSA)	VWR International bvba (Louvain, Belgique)	422361V
Centrifuge 5804 R	Eppendorf SE (Hambourg, Allemagne)	5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13193
Dimethyl sulfoxyde	Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)	D2438-5X10ML
DRAQ5 Staining Solution	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Allemagne)	130-117-344
Éthanol &ge ; 99,8 % pour la biologie moléculaire	Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Allemagne)	1HPH.1
IgG anti-souris de chèvre (H& L) Anticorps secondaire à adsorsion croisée , Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723TR
Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) à adsorption croisée Cyanine3	Invitrogen	A10520
GraphPad Prism	GraphPad	Version  ; 9.4.1
Anticorps CCR7 humain	R& D Systems	MAB197
Invitrogen recombinant IFN-gamma humain	(Rockford, États-Unis)	RIFNG100
IL-13	Milteny Biotec humain (Bergisch Gladbach, Allemagne)	5230901032
IL-4	Milteny Biotec humain (Bergisch Gladbach, Allemagne)	130-095-373
Humain M-CSF	Peprotech (Cranbury, États-Unis)	300-25
Leica TCS SP5	Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Allemagne)	https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolysaccharides d’Escherichia	Sigma Aldrich Co. (Missouri, États-Unis)	L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix  ;	New England Biolabs	NEB #M3003
LunaScript RT SuperMix Kit	New England Biolabs	E3010L
Milieu de séparation des lymphocytes 1077	PromoCell (Heidelberg, Allemagne)	C-44010
MCP-4/CCL13 Kit ELISA humain	Invitrogen	EHCCL13
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0,1 mL)	Applied Biosystems (Waltham, États-Unis)	4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film	Life Technologies Corporation (Carlsbad, États-Unis)	4311971
MicroAmp Splash Free 96-Well Base	Applied Biosystems (Waltham, États-Unis)	4312063
Microlitercentrifuge CD-3124R	Phoenix Instrument (Allemagne)	9013111121
Lunettes de protection de microscope, 10 mm	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne	4HX4.1
Fixation de monocytes Medium	PromoCell (Heidelberg, Allemagne)	C-28051
Multiply-Pro Gefä ; ß ; 0,5 ml, PP	Sarstedt AG & CO (Nü ; mbrecht, Allemagne)	7,27,35,100
Nanodrop One	Thermo Scientific (États-Unis)	ND-ONE-W
QuantStudio  ; 3 System	Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Allemagne)	A28567
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74007
RPMI 1640, 1x, avec L-glutamine	Mediatech, Inc. (Manassas, USA)	10-040-CV
Banc stérile, LaminarAir HB 2472  ;	Instruments Heraeus (Hanau, Allemagne)	51012197
Lamelles de culture tissulaire 13 mm (Plastique)	Sarstedt Inc. (Newton, USA)	83,18,40,002
Disques usinés en titane 12 cm  ;	Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Allemagne)	N/A
TNF alpha Human ELISA Kit	Invitrogen	KHC3011
Trypan blue solution 0,4 %	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Allemagne)	1680.1