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Article de méthode

Quantification de la respiration mitochondriale dans des cellules entières de levure

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DOI :

10.3791/67186

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8 novembre 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

Dans cet article

Résumé

La respiration mitochondriale dans les cellules entières de levure est un indicateur précieux de la bioénergétique cellulaire. Nous présentons ici un protocole pour quantifier ce phénotype applicable à différentes espèces de levures.

Résumé

Le métabolisme est principalement coordonné par la disponibilité de l’énergie cellulaire et les conditions environnementales. Les tests permettant de savoir comment les cellules adaptent le métabolisme énergétique à différentes conditions nutritionnelles et environnementales fournissent des informations précieuses pour élucider les mécanismes moléculaires. La phosphorylation oxydative est la principale source d’ATP dans la plupart des cellules, et l’activité de la respiration mitochondriale est un élément clé de la phosphorylation oxydative, maintenant le potentiel de la membrane mitochondriale pour la synthèse de l’ATP. La respiration mitochondriale est souvent étudiée dans des mitochondries isolées qui n’ont pas le contexte cellulaire. Ici, nous présentons une méthode de quantification de la respiration mitochondriale dans des cellules intactes de levure. Cette méthode s’applique à toutes les espèces de levures, bien qu’elle ait été généralement utilisée pour les cellules de Saccharomyces cerevisiae. Tout d’abord, la croissance de la levure dans des conditions spécifiques est testée. Ensuite, les cellules sont lavées et remises en suspension dans de l’eau déminéralisée avec un rapport de 1:1 (p/v). Les cellules sont ensuite placées dans une chambre d’oxymètre avec une agitation constante, et une électrode Clark est utilisée pour quantifier la consommation d’oxygène. Certaines molécules sont placées séquentiellement dans la chambre et sélectionnées en fonction de cet effet sur la chaîne de transport d’électrons ou synthèse d’ATP. L’oligomycine, inhibiteur de l’ATPase, est d’abord ajoutée pour mesurer la respiration couplée à la synthèse de l’ATP. Ensuite, un découpleur est utilisé pour mesurer la capacité respiratoire maximale. Enfin, un mélange d’inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons est ajouté pour éliminer la consommation d’oxygène non liée à la respiration mitochondriale. Les données sont analysées à l’aide d’une régression linéaire pour obtenir la pente, représentant le taux de consommation d’oxygène. L’avantage de cette méthode est qu’elle est spécifique à la respiration mitochondriale des levures, en maintenant le contexte cellulaire. Il est essentiel de souligner que les inhibiteurs utilisés dans la quantification de la respiration mitochondriale peuvent varier entre les espèces de levures.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle fondamental dans la bioénergétique cellulaire car elles sont la principale source d’ATP pour la plupart des cellules, et plusieurs voies convergent et dépendent de l’activité des voies mitochondriales1. La phosphorylation oxydative est nécessaire pour la synthèse de l’ATP qui combine le transport d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons pour réduire l’activité de l’oxygène et de la F1F 0-ATPase, synthétisant l’ATP en utilisant le potentiel de membrane mitochondriale produit par le flux d’électrons2. Ainsi, la respiration mitochondriale fait partie de la phosphorylation oxydative3.

La chaîne respiratoire mitochondriale comprend quatre complexes ou, dans certains cas, un complexe de levure I déficient (par exemple, Saccharomyces cerevisiae), trois complexes et trois protéines déshydrogénases4. Les complexes respiratoires sont localisés dans la membrane mitochondriale interne ; certaines levures présentent la chaîne canonique de transport d’électrons avec le complexe I (NADH déshydrogénase) ou trois NADH déshydrogénase, l’ubiquinone (Co Q), le complexe II (succinate ubiquinone oxydoréductase), le complexe III (ubiquinone cytochrome oxydoréductase), le cytochrome c (Cyt c) et le complexe IV (cytochrome c oxydase)5,6. Le transport d’électrons à travers les complexes permet le pompage des protons de la matrice mitochondriale vers l’espace intermembranaire, formant un potentiel de membrane mitochondriale7. Les protons situés dans l’espace intermembranaire sont pompés en sens inverse, vers la matrice mitochondriale par F1F0 -ATPase pour synthétiser une molécule d’ATP pour quatre protons pompés8.

Les mesures de la respiration mitochondriale fournissent des informations précieuses sur l’intégrité mitochondriale, la bioénergie cellulaire et la capacité respiratoire mitochondriale9. La fonction respiratoire mitochondriale a pu être analysée in vitro ou in situ à l’aide de diverses techniques. Cependant, l’analyse de la respiration mitochondriale dans les cellules intactes pourrait présenter une série d’avantages puisqu’elle comprend l’ensemble du métabolisme cellulaire, car les interactions des cellules avec leur environnement et le métabolisme intracellulaire sont prises en compte lors de l’utilisation de cellules entières10. De plus, l’utilisation de cellules intactes permet d’évaluer facilement diverses conditions expérimentales et de détecter des changements minimes qui n’ont pas pu être observés dans des mitochondries isolées10,11. Un autre avantage de la quantification de la respiration mitochondriale dans les cellules intactes est que les effets de la prolifération et de la localisation mitochondriales sont conservés12.

La respiration des mitochondries de mammifères dans des cellules intactes a été décrite en détail12, sans compter l’étude d’autres organismes eucaryotes, tels que les levures. Ici, nous proposons une technique de quantification de la respiration mitochondriale adaptée aux levures à partir de protocoles de mammifères. Ainsi, des concepts de quantification de la respiration mitochondriale chez les mammifères ont été utilisés dans cette technique. Par exemple, cette technique est divisée en plusieurs étapes selon le protocole des mammifères : 1) respiration basale (dépendante du substrat), 2) respiration liée à l’ATP (par l’inhibition de l’ATP synthase), 3) capacité respiratoire maximale (utilisation d’un découpleur qui permet la perméabilité des protons à travers la membrane mitochondriale interne), 4) inhibition de la respiration mitochondriale (utilisation d’un mélange d’inhibiteurs de la chaîne respiratoire pour éliminer la consommation d’oxygène pour d’autres sources différentes de respiration mitochondriale)11,13. Par conséquent, cet article vise à présenter un protocole pour quantifier la respiration mitochondriale chez la levure.

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Protocole

1. Préparation des milieux de culture et de l’inoculum

  1. Préparez 100 ml de milieu extrait de levure-peptone-dextrose (YPD) en ajoutant 1 g d’extrait de levure, 2 g de peptone de caséine et 2 g de glucose dans 95 ml d’eau distillée. Répartissez 3 mL dans des tubes à essai en verre de 10 mL, stérilisez à 121 °C et 1,5 psi pendant 15 min.
    REMARQUE : Le milieu peut être stocké à 4 - 8 °C jusqu’à 1 mois.
  2. Inculquer un tube à essai en verre de 10 mL contenant 3 mL de milieu YPD avec 250 μL de cellules de levure préservées au glycérol à -20 °C. Incuber toute la nuit en agitant constamment à 200 tr/min et 30 °C.
    REMARQUE : La température d’incubation peut varier chez certaines espèces de levures (p. ex., Kluyveromyces marxianus a une température de croissance optimale de 37 °C).
  3. Remplissez une boîte de Pétri (60 x 15 mm2) de gélose stérile à 2 % de YPD (ajoutez 10 g d’extrait de levure, 20 g de peptone de caséine, 20 g de glucose et 20 g de gélose bactériologique à 950 ml d’eau distillée) et striez la boîte de Pétri avec les cellules de levure cultivées dans le tube à essai en verre de 10 ml à l’aide d’une boucle stérile. Incuber la boîte de Pétri à 30 °C jusqu’à l’apparition de colonies isolées.
  4. Préparez un pré-inoculum en inoculant un tube à essai en verre stérile de 10 mL contenant 3 mL de milieu YPD à 2 % de glucose avec deux ou trois colonies isolées de levure de la boîte de Pétri. Incuber toute la nuit en agitant constamment à 30 °C.

2. Conditions de croissance et conception de l’expérience

  1. inoculer un erlenmeyer de 500 mL contenant 100 mL de milieu synthétique complet stérile (milieu SC ; 0,18 g de base azotée de levure sans acides aminés, 0,5 g de sulfate d’ammonium, 0,2 g de phosphate dipotassique, 1 g de suppléments de levure synthétique et du glucose selon le plan d’expérience, dans 98,02 mL d’eau distillée) avec une culture de levure à la DO initialede 600 ~ 0,1, c’est-à-dire environ 3 mL de pré-inoculum pendant la nuit (OD600 ~ 3). Définissez les conditions environnementales ou complétez avec le test chimique à tester dans la respiration mitochondriale (par exemple, en ajoutant 100 μM de resvératrol). Préparez une commande de véhicule dans une fiole séparée pour le défi chimique. Testez au moins trois répétitions biologiques.
    REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un milieu minimal pour éliminer le bruit nutritif dans l’essai, et le milieu minimal proposé à ce stade est utilisé pour S. cerevisiae et pourrait différer pour d’autres espèces de levures. Enfin, la concentration de glucose supplémentée dans le milieu de culture est essentielle pour éviter la répression du glucose ou l’effet Crabtree qui inhibe la respiration mitochondriale ; Des concentrations inférieures à 0,5 % (p/v) ont donné de bonnes réponses dans la respiration mitochondriale accompagnée de taux de croissance élevés chez S. cerevisiae. Chez les levures négatives à Crabtree, des concentrations élevées de glucose n’ont pas affecté la respiration mitochondriale (par exemple, K. marxianus).
  2. Peser un tube conique vide de 50 mL et l’utiliser pour récolter les cellules en phase mi-log (DO600 ~ 0,5) par centrifugation à 4000 x g pendant 5 min.
    REMARQUE : La phase mi-logarithmique est recommandée pour tester la respiration mitochondriale car c’est la phase de croissance dans laquelle le métabolisme énergétique est plus actif.
  3. Jetez le surnageant et lavez la pastille 3 fois avec 25 ml d’eau déminéralisée. Pesez le tube conique avec les cellules de granulés (poids humide) et soustrayez le poids du tube conique pour obtenir le poids humide cellulaire.
  4. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL d’eau déminéralisée.
  5. Enregistrez la concentration cellulaire en divisant le poids humide par 2 pour obtenir mg de cellules/mL. Cette valeur est essentielle pour déterminer le volume à ajouter pour avoir 50 mg de cellules pour le dos.

3. Test de consommation d’oxygène (Polarographie)

  1. Utilisez une électrode d’oxygène de type Clark connectée à un moniteur YSI5300A et à un ordinateur pour l’acquisition de données.
    1. Placez 5 ml d’acide morpho-éthanolsulfonique ajusté à pH 6 avec de la triéthanolamine (tampon MES-TEA ; 10 mM) et 50 mg de cellules (poids humide) dans la chambre polarographe. Placez délicatement l’électrode en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles.
    2. Allumez le moniteur YSI5300A, l’ordinateur pour l’acquisition de données et la chambre pour l’agitation. Réglez le moniteur YSI5300A en sélectionnant le cadran de réglage du canal 1 dans AIR. Ajustez le canal 1 à 100  % avec la molette d’étalonnage du canal 1 et stabilisez le signal pendant 5 min à 100 %.
    3. Commencez à enregistrer les données dans l’ordinateur et à mesurer le temps à l’aide d’un chronomètre.
      REMARQUE : Le moniteur YSI5300A n’a pas d’ordinateur ou de programme d’acquisition de données ; Cela peut être mis en œuvre en externe par l’utilisateur.
    4. Utilisez la canalisation latérale de l’électrode dans la chambre de l’oxymètre pour ajouter le substrat oxydable, l’oligomycine, le découpleur et le mélange d’inhibiteurs de la chaîne respiratoire de manière séquentielle.
  2. Ajoutez le substrat oxydable (glucose, glycérol, L-lactate ou une autre source de carbone selon le plan d’expérience) à une concentration finale de 10 mM à l’aide d’une seringue de chromatographie. Gardez la chambre fermée en permanence et avec une agitation constante. Enregistrez le pourcentage de consommation d’air pendant 2 à 3 minutes pour déterminer la respiration basale.
    REMARQUE : Le glucose, le glycérol et le L-lactate sont utilisés pour analyser la chaîne de transport d’électrons à différents endroits de la chaîne respiratoire : le métabolisme du glucose réduit le NAD+ pour former du NADH et est utilisé pour analyser l’ensemble de la chaîne respiratoire ; le glycérol transfère des électrons à l’ubiquinone et est utilisé pour évaluer la chaîne respiratoire de l’ubiquinone ; enfin, le L-lactate cède ses électrons au cytochrome c et est utilisé pour déterminer l’effet du cytochrome c14. Ces substrats peuvent varier en fonction de la capacité enzymatique de l’espèce de levure.
  3. Ajouter de l’oligomycine pour obtenir une concentration finale de 0,01 mM dans la chambre de l’oxymètre à l’aide d’une seringue de chromatographie pour évaluer la respiration liée à l’ATP et enregistrer le pourcentage de consommation d’air pendant 2-3 min.
  4. Compléter le découpleur, le cyanure de carbonyle 3-chlorophénylhydrazone (CCCP) pour obtenir une concentration finale de 0,015 mM dans la chambre de l’oxymètre à l’aide d’une seringue de chromatographie afin de déterminer la capacité respiratoire maximale et d’enregistrer le pourcentage de consommation d’air pendant 2 à 3 minutes.
  5. À l’aide d’une seringue de chromatographie, ajoutez les inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons : d’abord, la 2-thénoyltrifluoroacétone (TTFA), puis l’antimycine A (AA) à des concentrations finales de 1 mM et 1 mg/mL, respectivement. Mesurez chaque inhibiteur pendant 2 à 3 minutes.
    REMARQUE : Les inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons peuvent différer entre les espèces de levures ; Cela doit être pris en compte dans cette étape.
  6. Tamisez chaque source de carbone indépendamment (c’est-à-dire le glucose, le glycérol ou le L-lactate). Répétez les étapes 3.3 à 3.5 pour chaque source de carbone. Lavez la chambre 3x avec de l’éthanol à 70 % et 3x avec de l’eau déminéralisée après chaque utilisation.

4. Traitement des données

  1. Utilisez des courbes de consommation d’oxygène (en fonction du pourcentage d’air en fonction du temps) pour calculer les pentes du substrat oxydable (respiration basale), de l’oligomycine (respiration liée à l’ATP), du CCCP (respiration maximale), de l’AA et du TTFA (et non de la respiration mitochondriale ; Figure 1). Calculez les pentes individuelles de chaque composé supplémenté à l’aide de la régression linéaire décrite ci-dessous.
    1. Créez un nouveau fichier de projet dans le logiciel statistique. Choisissez XY dans la section Créer. Sélectionnez l’option Saisir ou Importer des données dans une nouvelle table dans la section Table de données.
    2. Sélectionnez Numéros dans la sous-section X de la section Options. Cliquez sur Entrer 3 valeurs de réplication dans des sous-colonnes côte à côte dans la sous-section Y de la section Options.
      REMARQUE : Le format de tableau comporte une colonne X et plusieurs colonnes Y, chacune avec 3 sous-colonnes nommées A : Y1 et A : Y2.
    3. Entrez les données temporelles dans X colonnes (p. ex., 0, 2, 4, 6, 8 s ou 0, 1, 2, 3 min). Écrivez le pourcentage d’air dans les colonnes Y.
    4. Faites une régression linéaire adaptative. Cliquez sur Analyser dans la barre de menu. Dans l’option Analyse, sélectionnez Régression linéaire simple sur les analyses XY et cliquez sur OK.
    5. Obtenez la valeur de la pente à partir des tableaux Résultats dans les données dans la partie gauche de l’écran.
  2. Écrivez les valeurs de pente dans une fiche technique et soustrayez la valeur de pente obtenue à partir du mélange d’inhibiteurs respiratoires (AA et TTFA) des pentes obtenues à partir du substrat oxydable, de l’oligomycine et du CCCP pour éliminer la consommation d’oxygène provenant de sources différentes de la respiration mitochondriale.
  3. Multipliez les valeurs obtenues par 237 μM de O2. Cette valeur est considérée comme la solubilité de O2 dans un milieu mitochondrial tamponné équilibré avec l’air (20,9 % O2) à 25 °C ; Cette valeur varie en fonction de la température, de l’altitude et de la mémoire tampon utilisée.
  4. Convertir en minute ; les valeurs obtenues sont μM de O2 par temps, en fonction de la façon dont le temps est tracé, pour obtenir μM de O2/ min.
  5. Divisez par 50, c’est-à-dire le mg de cellules utilisées ; La MG cellulaire peut varier selon la conception de l’expérience. Enfin, la consommation d’oxygène est exprimée en μM de O2/mg de cellules x min

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Résultats

Cette technique de respiration mitochondriale peut être utilisée pour des espèces de levures autres que S. cerevisiae, telles que Scheffersomyces stipitis15 et K. marxianus16. Cependant, à des fins représentatives, nous ne présentons que les résultats de S. cerevisiae. Il est bien connu que S. cerevisiae présente un métabolisme respiratoire prédominant à de faibles concentrations de glucose (inférieures à 0,8 mM)

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Discussion

La phosphorylation de la respiration mitochondriale joue un rôle fondamental dans plusieurs voies qui dépendent du potentiel de la membrane mitochondriale et maintiennent les niveaux d’ATP par phosphorylation oxydative. Comprendre comment les conditions environnementales et nutritionnelles influencent la respiration mitochondriale des levures sert d’outil pour élucider les mécanismes moléculaires.

Il est essentiel de prendre en compte les étapes critiques suiv...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-) accordé à LAMP.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2- thénoyltrifluoroacétone (TTFA)MerckT27006Complexe inhibiteur
II 3-chlorophénylhydrazone cyanure carbonyle (CCCP)MerckC2759Découpleur de la respiration mitochondriale  ;   ;
Absolut ethanolMerck107017Pour dissoudre la quercétine
AgarMerckA1296Préparation de gélose YPD
Sulfate d’ammonium granulaire (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05 Préparation debouillon SC
Antimycine A (AA)MerckA8674Complexe inhibiteur III
aYSI5300A--------Monitor  ;
CentrifugeuseHermleZ 206 APour la centrifugation des cellules
Oxygène de type Clark--------électrode  ;
Ordinateur--------Pour l’acquisition de données  ;
Phosphate dipotassique K2HPO4J.T. Baker3252-05SC préparation du bouillon
GlucoseMerckG7021Préparation du bouillon YPD
GlycérolMerckG5516Supplémentation en milieu de substrat  ;
LactateMerckL1250Supplémentation en milieu de substrat  ;
Oligomycine à partir de Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Inhibition de l’ATP synthase mitochondriale
Agitateur orbitalThermo FisherSHKE6000Inoculum Incubation en verre Tubes et flacons
Peptone de caséine, digestat enzymatiqueMerck82303YPD préparation de bouillon
Quercétine  ;Merck337951Pour diminuer la respiration mitochondriale
Uracil  ;MerckU0750SC
Extrait de levureMerckY1625YPD
Base d’azote de levure sans acides aminés ni sulfate d’ammoniumMerckY1251SC
Levure synthétique Suppléments de milieu de chute sans uracileMerckY1501SC
Préparation de bouillon Préparation de bouillon Préparation de bouillon Préparation de bouillon

Références

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