Développement d’un modèle de biofilm de colonie polymicrobienne pour tester les antimicrobiens dans la mucoviscidose

Résumé

Cette méthodologie permet d’établir un modèle de biofilm polymicrobien dans la mucoviscidose pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens dans les laboratoires de recherche et cliniques. Ce modèle fournit des résultats précis et fiables sur une gamme de sorties.

Résumé

Il existe une gamme de modèles de biofilms bactériens pour les tests d’antibiotiques. Cependant, bon nombre d’entre eux sont limités à un seul résultat expérimental, comme les unités formant des colonies ou l’activité métabolique. De plus, de nombreux modèles de biofilms ne reflètent pas les propriétés biologiques et physicochimiques de l’environnement de l’hôte humain. Il s’agit d’un problème important dans de nombreuses affections, mais plus particulièrement dans la fibrose kystique (FK). Une grande proportion de personnes atteintes de mucoviscidose souffrent d’infections chroniques et intermittentes, et in vitro, les tests de sensibilité aux antibiotiques sont peu corrélés avec les résultats du traitement des patients. Certains modèles de biofilm intègrent des milieux pertinents pour les poumons de la mucoviscidose, y compris des imitations synthétiques d’expectorations, mais ne tiennent pas compte de la nature polymicrobienne de l’environnement, qui modifie l’architecture du biofilm, la physiologie et la façon dont les microbes réagissent au traitement. Le modèle de biofilm de colonie d’interface solide-air décrit ici est hautement adaptable et intègre à la fois des milieux pertinents pour la FK et un contexte polymicrobien. Ce modèle peut également être utilisé pour le dépistage à moyen débit des antimicrobiens et pour étudier leur effet sur la dynamique polymicrobienne. Les mesures de sortie du modèle peuvent être des unités formant des colonies, l’activité métabolique et l’analyse par microscopie confocale. Le modèle peut facilement être adapté à différents micro-organismes, milieux, températures et conditions d’oxygène variables et peut être utilisé pour tester une large gamme de traitements chimiques, biologiques et physiques.

Introduction

La mucoviscidose (FK) est une maladie génétique qui touche plus de 11 000 personnes au Royaume-Uni et 162 000 personnes dans le monde ^1,2. Bien que la mucoviscidose soit une maladie multiviscale, l’un des principaux symptômes ressentis par les personnes atteintes de fibrose kystique est la formation de mucus anormalement épais et déshydraté dans leurs voies respiratoires³. Ceci, associé à une réduction des battements des cils, peut améliorer la colonisation des poumons par un large éventail de bactéries, de champignons, de virus et d’archées ^4,5. Bien que le poumon de la mucoviscidose fournisse des conditions et des pressions sélectives pour limiter la croissance et la survie des micro-organismes, les bactéries telles que Pseudomonas aeruginosa sont très adaptées à ces environnements difficiles⁶. Cela permet à la fois la colonisation et la survie, ce qui entraîne la formation d’infections chroniques persistantes⁷.

De nombreux microbes à l’origine de ces infections chroniques le font en utilisant un changement phénotypique d’un style de croissance planctonique initial à un style de croissance de biofilm, soit fixé en surface, soit en agrégats⁷. Ces biofilms sont caractérisés par des communautés bactériennes étroitement regroupées enfermées dans une matrice d’exopolysaccharides (EPS) composée d’une variété de composants, notamment des polysaccharides, des protéines, des lipides et de l’ADN environnemental (ADNe)⁸. Cette matrice est une caractéristique commune entre les micro-organismes ; Cependant, sa composition peut différer. Par exemple, les principaux composants polysaccharidiques de la matrice bactérienne P. aeruginosa sont le Psl, le Pel et l’alginate, contrairement aux champignons Candida albicans, dont les principaux composants de la matrice polysaccharidique sont les mannanes et les glucanes⁹. Dans les biofilms mono-espèces, cette matrice peut grandement affecter la tolérance aux antibiotiques par rapport au planctonique en réduisant la pénétration des antibiotiques dans le biofilm, diminuant ainsi leur efficacité¹⁰. Le style de croissance du biofilm induit également la formation de cellules persistantes avec une activité métabolique réduite par rapport à leurs homologues planctoniques et, par conséquent, une sensibilité encore réduite aux antibiotiques¹¹. Ce style de croissance est également caractérisé par la régulation positive de certains mécanismes de résistance aux antibiotiques, tels que les pompes d’efflux et ceux nécessaires au transfert horizontal de gènes, permettant l’échange de gènes de résistance 11,12,13. En plus de cela, l’environnement pathologique de l’hôte influence beaucoup la physiologie microbienne et la façon dont ils réagissent aux antibiotiques. Cela comprend l’augmentation de la micro-aérobiose dans le mucus épais ainsi que la disponibilité de sources de carbone non standard telles que les acides aminés et l’ADNe, qu’elles soient dérivées de l’hôte ou provenant de la dégradation microbienne des produits pulmonaires 14,15,16.

Ces interactions spécifiques sont encore compliquées par la nature polymicrobienne des biofilms, qui introduit une couche supplémentaire de complexité avec des interactions complexes non seulement entre les bactéries, mais aussi entre les bactéries et les champignons. Par rapport aux biofilms bactériens, on sait moins de choses sur certaines des interactions entre les biofilms bactériens et fongiques, bien que C. albicans ait été isolé chez plus de 75 % des personnes atteintes de fibrose kystique¹⁵. En général, les interactions entre C. albicans et les bactéries comme P. aeruginosa sont antagonistes, mais peuvent entraîner des infections plus chroniques et plus graves¹⁸. La combinaison d’interactions microbiennes, à la fois pathogènes et commensales, ainsi que d’une gamme de facteurs environnementaux liés à la FK peut finalement entraîner une augmentation de la tolérance aux antibiotiques^19,20. Bon nombre de ces facteurs ne sont pas souvent pris en compte dans les tests antibiotiques précliniques, bien qu’ils soient attribués à une tolérance accrue aux antibiotiques dans les modèles existants²¹.

Ces conditions sont également difficiles à récapituler in vitro et, par conséquent, de nombreux modèles ne présentent pas de facteurs spécifiques induisant la tolérance présents dans la fcf, tels que ceux augmentant la production de bêta-lactamase chez P. aeruginosa²², l’induction de variantes de petites colonies chez Staphylococcus aureus et l’inhibition de la césure chez C. albicans ; il a été démontré que tous ces cas se produisent dans les expectorations^de la mucoviscidose ^23,24.

Il existe donc une grande disparité entre les conditions utilisées dans les méthodes actuelles d’analyse de sensibilité aux antibiotiques, fondées sur des cultures de planctonique ou de plaque d’agar-agar cultivées dans des milieux normalisés tels que les essais de microdilution en bouillon Mueller-Hinton avec diffusion sur disque, Astest et CLSI, et les conditions rencontrées dans l’environnement hôte²⁵. Cela ne permet souvent pas de déterminer avec précision la sensibilité aux antibiotiques²⁶. Ce problème est encore aggravé par le manque de normalisation dans les tests de biofilms antimicrobiens, ce qui rend difficile l’application précise de l’efficacité antimicrobienne du laboratoire à la clinique^27,28.

Le modèle polymicrobien que nous avons développé ici démontre une tolérance accrue de Pseudomonas aeruginosa à une gamme d’antimicrobiens, y compris le méropénème et la tobramycine. Cela illustre la grande variation entre les tests antimicrobiens actuels utilisant des biofilms monospécifiques et le modèle de biofilm polymicrobien développé dans cette étude pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices. Ce modèle maintient également un débit relativement élevé et un faible coût, ce qui est souhaitable pour les tests antimicrobiens. Le modèle peut également être utilisé pour étudier l’impact de la thérapie antimicrobienne sur la dynamique polymicrobienne et établir si un traitement particulier peut conduire à la dominance d’un agent pathogène particulier, ce qui permet de prédire d’autres complications. Bien que ce modèle permette la construction de biofilms complexes, sa configuration ne nécessite pas d’équipement de laboratoire sophistiqué et fournit une plate-forme pour un large éventail de résultats cliniques et de recherche.

Protocole

1. Préparation de la mucoviscidose synthétique media-2 (SCFM2) et des plaques

1. Fabriquez SCFM2 selon la recette décrite dans Palmer et ^coll.16 dans une bouteille en verre borosilicaté de 500 ml à une concentration de 2x avec quelques modifications.
   1. Peser et préparer les stocks comme indiqué dans le tableau 1. Préparez les stocks d’acides aminés conformément au tableau 2.
   2. Peser 5 g de mucine (d’estomac porcin (type II)) et 600 mg d’ADNe (de sperme de saumon) dans 100 ml de dH₂O dans une bouteille en verre borosilicate de 200 ml. Agiter à 4 °C pendant la nuit avant la stérilisation à l’autoclavage.
   3. Dans un flacon stérilisé de 500 ml, ajoutez 0,54 g de glucose, 6,06 g de NaCl et 2,228 g de KCl. Ajoutez 10 ml chacun des bouillons préparés à l’étape 1.1.1. Ajustez le pH à 6,9 à l’aide de 1 M de NaOH ou de HCl.
   4. Ajouter 10 mL de_dH2O suivis de 10 mL de 0,175 M de CaCl₂ et de 0,0606 M de MgCl₂. Préparez et ajoutez 10 ml d’acide L-lactique 0,93 M. Immédiatement avant l’utilisation, ajouter 10 mL de 0,36 mM Fe(III)SO₄7H₂O
   5. Filtrez et stérilisez le SCFM2 à l’aide d’une unité de filtration et d’une pompe à vide, puis ajoutez la mucine autoclavée et l’ADNe.
      REMARQUE : Le SCFM2 préparé peut être conservé à 4 °C jusqu’à 1 mois.
2. Préparez les plaques de gélose SCFM2 comme décrit ci-dessous.
   1. Préchauffer 25 mL de 2 géliers SCFM2 dans un tube de 50 mL dans un bain-marie à 55 °C avant de les mélanger avec 25 mL de gélose technique préfondue à 3 % (p/v), ce qui permet d’obtenir un mélange de 1 gélose technique SCFM2 et de gélose technique à 1,5 % (p/v).
   2. À l’aide d’une pipette sérologique, transvaser 5 mL du mélange dans chaque puits d’une plaque à 6 puits.
   3. Préparez le même nombre de disques en polycarbonate de 13 mm avec une taille de pores de 0,2 μm en les plaçant au fond d’une boîte de Pétri et en appliquant des UV-C pendant 600 s à une longueur d’onde de 254 nm et une fréquence de 60 Hz. Retournez les disques et répétez la procédure UV-C.
   4. Une fois que la gélose technique 1x SCFM2-1,5 % (p/v) a pris, utilisez une pince stérile pour ajouter un seul disque en polycarbonate à la surface de chaque puits de la plaque à 6 puits.

2. Préparation des bactéries pour l’infection

1. Avant de mettre en place le modèle, préparez une ou plusieurs plaques de gélose pour les bactéries et les souches fongiques requises conformément à la gélose standard utilisée en laboratoire pour P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 et C. albicans SC5314 (par exemple, bouillon de lysogénie avec gélose à 1,2 % (p/v) pour les bactéries et gélose au dextrose Sabouraud pour C . albicans).
   REMARQUE : Pour établir le modèle, des souches de référence spécifiques au laboratoire ont été utilisées. Cependant, ce modèle a également été utilisé avec d’autres souches, y compris les isolats cliniques, avec quelques modifications, telles que l’augmentation du temps d’établissement du biofilm avant le traitement pour les souches à croissance plus lente.
2. À l’aide d’une boucle d’inoculation de 1 μL, prélever une seule colonie de chaque microorganisme afin d’inoculer 5 mL de milieu liquide de laboratoire standard (p. ex. bouillon de lysogénie pour P. aeruginosa, S. aureus et dextrose de peptone de levure (YPD) pour C. albicans). Incuber ces cultures jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance exponentielle à 200 tr/min, 37 °C pour les bactéries, et 200 tr/min, 30 °C pour C. albicans.
   REMARQUE : L’aération variera en fonction de l’incubateur d’agitation et du rayon de rotation

3. Mise en place du modèle d’interface solide-air

REMARQUE : Une représentation schématique globale du modèle est illustrée à la figure supplémentaire 1.

1. Transférez 1 ml de chaque culture liquide dans un tube stérile séparé de 1,5 ml et centrifugez pendant 2 minutes à 8 000 x g pour granuler les bactéries/champignons. Effectuez cette étape et toutes les étapes de centrifugation suivantes à température ambiante.
2. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les granules en suspension dans 1 mL de PBS avant centrifugation, une fois de plus, pendant 2 min à 8 000 x g.
3. Retirer le surnageant comme précédemment et remettre les granules en suspension dans 1 mL de PBS. Diluer les cellules de P. aeruginosa et de S. aureus remises en suspension 1:10 dans du PBS et mesurer la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm.
4. Ajuster les échantillons lavés à 1 x 10⁸ unités formant colonies (UFC)/mL en fonction de la validation préalable qu’une DO₆₀₀ de 0,05 pour P. aeruginosa et de 0,1 pour S. aureus équivaut à 1 x 10⁸ UFC/mL.
5. Dans le cas de C. albicans, diluer les échantillons lavés à l’échelle 1:100 dans du PBS, ajouter 10 μL de chacun à deux chambres individuelles d’un hémocytomètre et utiliser les dimensions fixes de la chambre et la dilution utilisée pour calculer l’UFC/mL. À l’aide de l’hémocytomètre Neubauer amélioré, le calcul sera le suivant :
   Nombre de cellules = nombre moyen de cellules × 10 000 / (facteur de dilution)
6. Les UFC calculées représentent les UFC/mL de C. albicans dans l’échantillon pré-dilué. Ajuster l’échantillon de C. albicans à 1 x 10⁸ UFC/mL dans le PBS comme pour les cultures bactériennes.
7. Pour préparer l’inoculum à l’ajouter au biofilm, ajuster l’inoculum de P. aeruginosa à 1 x 10⁴ UFC/mL (2 dilutions 100 fois), C . albicans à 1 x 10⁵ UFC/mL (dilution 100 fois suivie d’une dilution 10 fois) et enfin S. aureus à 1 x 10⁶ UFC/mL (dilution 100 fois) à l’aide de PBS.
8. Pour les biofilms monospécifiques, ajouter 10 μL du microbe désiré dilué au centre du disque de polycarbonate préalablement placé sur les 1 plaques de gélose technique à six puits SCFM2-1,5 % et incuber statiquement à 37 °C pendant 24 h avant le traitement ou la perturbation.
9. Pour les biofilms polymicrobiens, ajoutez 10 μL de S. aureus et de C. albicans l’un sur l’autre sur le même disque. Incuber le disque inoculé de manière statique pendant 24 h à 37 °C.
   REMARQUE : L’ordre dans lequel les inoculums de S. aureus et de C. albicans sont ajoutés n’affecte pas le développement du modèle et génère les mêmes résultats.
10. Ensuite, transférez les disques en polycarbonate sur des plaques de gélose technique 1x SCFM2-1,5 % fraîches avec une pince stérile et ajoutez 10 μL de la dilution 1 x 10⁴ UFC/mL de P. aeruginosa sur le biofilm préétabli de S. aureus - C. albicans . Incuber encore 24 h à 37 °C.
    REMARQUE : P. aeruginosa est ajouté 24 h après S. aureus et C. albicans pour refléter l’ordre dans lequel ces organismes colonisent fréquemment les poumons de la FK chez les personnes atteintes de FK. Cela empêche également P. aeruginosa de dépasser les deux autres micro-organismes. Une fois que P. aeruginosa a été ajouté, le biofilm peut être cultivé pendant plus de 24 heures ; Cependant, le disque en polycarbonate avec le biofilm doit être transféré sur un support frais toutes les 24 heures. Avant la perturbation, les biofilms peuvent être utilisés pour la microscopie en utilisant des souches qui expriment des protéines fluorescentes, des colorants fluorescents ou des anticorps spécifiques à une souche ou à un microbe. Cependant, il convient de noter que certains colorants tachent le disque en polycarbonate.

4. Perturbation du biofilm

1. Ajoutez des billes de céramique d’un diamètre de 2,8 mm aux plaques et réticulez les plaques par UV, comme décrit à l’étape 1.3. Ajouter 5 billes de céramique dans un tube d’homogénéisation stérile de 2 mL à l’aide d’une pince stérilisée à la flamme. Ensuite, pipetez 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube d’homogénéisation de 2 mL.
2. Tubes vortex pendant au moins 10 s ou jusqu’à ce que le biofilm ait été retiré du disque en polycarbonate, déterminé par une inspection visuelle, après quoi retirer le disque en polycarbonate.
3. Placez les tubes avec les billes dans l’homogénéisateur et battez 2x pendant 10 s à 6 m/s avec un intervalle de 10 s entre les battements.
   REMARQUE : Cette combinaison de billes, de temps de battement et d’utilisation de l’homogénéisateur entraîne une perturbation suffisante du biofilm avec une lyse minimale, telle que déterminée par la microscopie et les unités formant des colonies. Cela peut varier en fonction du batteur de perles utilisé.
4. Verser le biofilm perturbé du tube d’homogénéisation dans un bijou de 7 mL contenant 4 mL de PBS, ce qui donne un volume final de 5 mL.
5. Assurez-vous que tout le liquide des tubes de l’homogénéisateur a été transféré dans le bijou en centrifugant les tubes à 8 000 x g pendant 2 min et en transférant le liquide restant dans le bijou de 7 ml.
   REMARQUE : À partir de ces 5 mL de biofilm perturbé, une gamme de tests peut être effectuée, mais il est essentiel de se rappeler pour tout calcul la dilution de 1 mL de PBS du biofilm dans un volume final de 5 mL.

5. Test de l’activité métabolique

1. Ajoutez 200 μL du biofilm perturbé de l’étape 4 ci-dessus dans une plaque noire à 96 puits à fond transparent. Ajouter ensuite 10 μL de solution de résazurine à 0,02 % (p/v).
2. Incuber le biofilm traité à la résazurine à l’aide d’un lecteur de plaque et lire l’activité métabolique. Incuber la plaque à 37 °C, en appliquant un agitation orbitale toutes les 30 min pendant 10 s à 200 tr/min avant de prendre des mesures fluorescentes.
3. Mesurez la fluorescence en utilisant une excitation de 540 nm et une émission de 590 nm. Répétez ce cycle de 30 minutes pendant 4 h à l’aide d’un lecteur de plaques.
   REMARQUE : Le point de temps de 4 h est utilisé car il offre des variations plus distinctes entre les échantillons traités et non traités et entre les échantillons ayant des concentrations d’antibiotiques variables.

6. Tests de sensibilité aux antimicrobiens

1. Pour tester la tolérance aux antimicrobiens des antibiotiques standard, solubilisez les antibiotiques de votre choix dans leur solvant pertinent et ajoutez-le à 1 milieu gélose technique SCFM2-1,5 % (p/v) encore liquide avant de transférer 5 mL dans chaque puits d’une plaque à six puits. Une fois pris, transférez le biofilm cultivé sur le disque de polycarbonate vers le haut du milieu contenant l’antibiotique à l’aide d’une pince stérile et ajoutez une goutte de 10 μL de la concentration d’antibiotique correspondante sur le dessus du biofilm.
   REMARQUE : Pour cette étude, une dilution en série de 2 fois entre 64 μg/mL et 0,125 μg/mL de méropénème et de tobramycine a été utilisée pour refléter les concentrations cliniquement pertinentes. L’administration d’antibiotiques ou d’autres traitements antimicrobiens/anti-virulence uniquement sur le biofilm est suffisante, car des réponses similaires ont été observées lorsqu’elles sont ajoutées à la fois au milieu et au biofilm.
2. Après 24 h d’incubation à 37 °C avec le traitement, imager les biofilms et perturber comme décrit à l’étape 4.
3. À partir des 5 mL de culture perturbée, prélever une aliquote et effectuer une dilution en série de 10 fois à l’aide de PBS. Plaquez des taches de 10 μL en trois exemplaires sur une gélose pour déterminer les unités formant des colonies à l’aide de la méthode de Miles et Misra³⁰.
   REMARQUE : Le volume ajouté aux plaques de gélose aura un impact sur la limite de détection, des volumes plus importants réduiront la limite de détection mais nécessiteront plus d’échantillons et de plaques de gélose.
4. Pour les biofilms monospécifiques, s’étendent P. aeruginosa et S. aureus sur des plaques de gélose LB et C. albicans sur une gélose SDA.
5. Pour les biofilms polymicrobiens, placez des aliquotes sur trois milieux sélectifs différents contenant des antibiotiques afin d’isoler chacune des trois espèces et de permettre la détermination des UFC. Il s’agit notamment de la gélose d’isolement Pseudomonas et de la gélose au sel de mannitol contenant de la nystatine à 10 μg/mL pour isoler P. aeruginosa et S. aureus, respectivement, et de la gélose au dextrose de Sabouraud avec de la tétracycline à 125 μg/mL pour isoler C. albicans. Incuber les plaques de S. aureus à 37 °C pendant la nuit et les plaques de P. aeruginosa et de C. albicans à 30 °C.
   REMARQUE : Incuber les plaques de P. aeruginosa à 30 °C pour minimiser la prolifération des colonies et réduire l’essaimage.

Résultats

La simplicité du modèle de biofilm d’interface solide-air permet le dépistage d’un grand nombre d’antimicrobiens dans différentes conditions cliniquement pertinentes à la fois. Ce modèle permet d’évaluer l’efficacité des antibiotiques à l’aide de numérations d’UFC et de dosages métaboliques dans des biofilms mono et polymicrobiens à réaliser en une semaine. En raison de la nature du modèle, il permet également de manipuler facilement les conditions environnementales, telles que la modification de la composition des milieux et le placement des biofilms dans des conditions réduites en oxygène et anaérobies. À l’aide de ce modèle, nous avons montré des changements de tolérance à deux antibiotiques couramment utilisés dans la fibrose kystique entre P. aeruginosa cultivé dans des biofilms mono-espèces et polymicrobiens (Figure 1). Parallèlement, nous avons pu déterminer comment le traitement antimicrobien peut avoir un impact sur la dynamique des populations au sein des biofilms polymicrobiens (Figure 2).

Pour réaliser ces expériences, l’inoculum initial a été préparé comme spécifié dans le protocole ci-dessus, conduisant à la formation de biofilms mono-espèces stables et polymicrobiens avec des UFC/mL reproductibles et de petits écarts-types déterminés par une ANOVA à un ou deux facteurs. Ce modèle a également mis en évidence une croissance constante et une récupération des UFC, tout en permettant la possibilité de combiner ces techniques de microbiologie classiques avec d’autres techniques non réalisées dans cette étude sans avoir besoin d’un traitement sophistiqué. Il s’agit notamment de l’imagerie telle que l’imagerie vivante/morte, la visualisation matricielle et l’analyse moléculaire, que d’autres modèles tridimensionnels ne sont pas en mesure d’offrir d’une manière aussi accessible (Figure 1)³¹. Il convient de noter que l’écart-type attendu pour les UFC/mL augmente lorsque les données sont affichées en pourcentage de survie par rapport aux UFC/mL (figure 1). En comparant l’efficacité du traitement antibiotique entre les biofilms mono-espèces et polymicrobiens, on a constaté une augmentation significative de toutes les concentrations d’antibiotiques nécessaires pour atteindre une destruction de 50 %. Une augmentation de 2 log de la concentration d’antibiotiques a été nécessaire pour atteindre ce niveau de destruction du méropénème et de la tobramycine (figure 1). Il y avait également une augmentation globale de la survie de P. aeruginosa en présence de S. aureus et de C. albicans dans le biofilm polymicrobien lorsqu’ils étaient traités avec 64 μg/mL de tobramycine, alors que l’inverse était vrai pour le méropénème.

La méthode utilisée pour déterminer l’activité métabolique mesure l’activité globale de l’ensemble du biofilm polymicrobien sans pouvoir distinguer la contribution individuelle de chaque espèce. Pour cette raison, seuls les changements métaboliques monospécifiques démontrent l’utilisation de tests d’activité métabolique pour ce modèle. Pour les biofilms monospécifiques, il y avait une forte relation entre la survie de P. aeruginosa et l’activité métabolique du méropénème et de la tobramycine (figure 2). L’utilisation de l’activité métabolique et du nombre d’UFC à partir des mêmes échantillons permet d’identifier facilement les effets bactériostatiques et bactéricides. Pour les biofilms polymicrobiens, la détermination de l’activité métabolique peut indiquer comment le ciblage d’une espèce peut induire une augmentation globale de l’activité métabolique du biofilm et, par conséquent, potentiellement augmenter la croissance microbienne d’autres espèces.

Bien que les UFC soient la référence en matière de tests de sensibilité aux antimicrobiens, dans les biofilms polymicrobiens, elles permettent également d’évaluer la composition des espèces au sein du biofilm. En traitant P. aeruginosa dans des biofilms polymicrobiens, nous sommes non seulement en mesure de montrer l’augmentation de MBEC50 pour cet organisme, mais aussi d’établir l’effet que cela a sur les autres espèces co-isolées (Figure 3). C’est le cas, par exemple, du méropénème (antipseudomonal), où la réduction de P. aeruginosa s’accompagne d’une augmentation de l’UFC de S. aureus et de C. albicans , ce qui fait de S. aureus l’organisme le plus répandu en cas d’exposition à certaines concentrations d’antibiotiques (figure 3A). Cela souligne l’importance de tenir compte de la nature polymicrobienne du biofilm en raison de l’augmentation potentielle de la taille de la population d’autres espèces pathogènes lors du traitement d’un agent pathogène particulier.

Figure 1 : Variation de la tolérance antimicrobienne de P. aeruginosa au méropénème et à la tobramycine entre les biofilms mono et polymicrobiens cultivés dans le modèle d’interface solide-air. Le PAO1 de P. aeruginosa cultivé dans des biofilms mono ou polymicrobiens avec S. aureus et C. albicans a été établi à l’aide des modèles d’interface solide-air pendant 24 h sur SCFM2. Les biofilms ont été traités avec une gamme de concentrations (A) de méropénème ou (B) de tobramycine de 0,125 μg/mL à 64 μg/mL, ainsi qu’un contrôle sans antibiotique. La CFU/mL de chaque biofilm a été déterminée. P. aeruginosa Les UFC ont été déterminées dans l’EFP et converties en pourcentage de survie en utilisant le témoin négatif comme survie de 100 %. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type, et chaque point de données est dérivé de 3 répétitions biologiques, chacune avec trois répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Variation de l’activité métabolique des biofilms de P. aeruginosa en présence de méropénème ou de tobramycine cultivés dans le modèle d’interface solide-air. P. aeruginosa Des biofilms de PAO1 ont été cultivés sur SCFM2 dans le modèle d’interface solide-air, et une gamme de concentrations (A) de méropénème ou (B) de tobramycine de 0,125 μg/mL à 64 μg/mL a été ajoutée avec un témoin sans antibiotique. La plaque a été lue par fluorescence à une excitation de 540 nm et une émission de 590 nm toutes les 30 min. Le pourcentage d’activité métabolique a été calculé en déterminant le pourcentage de cette activité sur chaque échantillon traité aux antibiotiques par rapport au témoin sans antibiotique. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type, et chaque point de données est dérivé de 3 répétitions biologiques, chacune avec trois répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Impact sur le nombre total d’UFC de P. aeruginosa, S. aureus et C. albicans récupérés à partir d’un modèle d’interface polymicrobienne solide-air après un traitement antimicrobien.S. aureus et C. albicans ont été cultivés sur SCFM2 sur le modèle d’interface solide-air. P. aeruginosa a été ajouté, et une gamme de concentrations de 0,125 μg/mL à 64 μg/mL de (A) méropénème ou (B) de tobramycine a été ajoutée aux biofilms avec un témoin sans antibiotique. La CFU/mL de chaque biofilm a été déterminée. Les barres d’erreur indiquent un écart-type, et chaque point de données a été dérivé de 3 répétitions biologiques, chacune avec trois répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Mise en place et déroulement du modèle d’interface solide-air. Représentation graphique de l’établissement du modèle d’interface solide-air, de la perturbation du biofilm et des sorties. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le modèle de biofilm décrit ici nous permet d’imiter certains aspects de l’environnement de l’infection pulmonaire de la mucoviscidose en incorporant une gamme d’interactions polymicrobiennes courantes d’une manière plus accessible que les méthodes d’essai antimicrobienne in vitro actuellement utilisées, telles que le réacteur CDC et le modèle de biofilm de Lubbock³¹. Cela est important lorsqu’une série de facteurs, y compris les propriétés physiques du biofilm, la disponibilité des nutriments et les interactions moléculaires entre les espèces au sein du biofilm, peuvent affecter à la fois l’activité de l’agent antimicrobien et la réponse des microbes à l’antimicrobien²¹. En intégrant ces facteurs, nous avons été en mesure de développer un modèle très polyvalent qui pourrait permettre de prédire plus précisément les résultats du traitement antimicrobien que les modèles actuels qui ne tiennent pas compte des facteurs susmentionnés.

P. aeruginosa, S. aureus et C. albicans ont été choisis comme champignons représentatifs à Gram positif, à Gram négatif et couramment isolés dans CF³². Cependant, nous avons également été en mesure de montrer que ce modèle peut être utilisé pour une gamme d’autres microbes pertinents pour la mucoviscidose, y compris Burkholderia cenocepacia, Burkholderia multivorans, Aspergillus fumigatus, et qu’il est actuellement adapté pour être utilisé avec des bactéries anaérobies telles que Prevotella melaninogenica. Cela démontre la polyvalence du modèle, car un large éventail de microbes pourrait être incorporé, ce qui met en évidence l’adaptabilité de ce modèle pour les tests antimicrobiens contre un large éventail d’agents pathogènes microbiens. Le modèle peut également être facilement adapté à une gamme de conditions environnementales pour des tests de sensibilité aux antimicrobiens plus personnalisés, y compris le remplacement de SCFM2 par des expectorations du patient.

La prise en compte de modèles de biofilms polymicrobiens pour l’essai de nouveaux antimicrobiens est également primordiale, car ils peuvent combler une lacune existante dans le pipeline de développement d’antimicrobiens avant leur utilisation dans des études animales ou humaines^33,34. Parallèlement, le modèle maintient un débit relativement élevé et permet une gamme de résultats pertinents à la fois pour l’industrie et la recherche.

Bien que nous n’ayons illustré que les UFC et l’activité métabolique dans cet article méthodologique, nous avons également démontré l’utilité du modèle dans l’analyse de l’exo-métabolome du biofilm à l’aide de la spectrométrie de masse par analyse de surface d’extraction liquide (LESA). Cela permet de sonder certains des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la tolérance aux antimicrobiens³⁵. En plus de ces autres résultats, nous avons également démontré l’utilisation de ce modèle pour tester de nouveaux systèmes d’administration d’antimicrobiens. Il s’agit notamment de conjugués polymère-ciprofloxacine pour améliorer la pénétration de cet antibiotique dans le biofilm tout en augmentant son activité et en réduisant le développement de la résistance³⁶.

Étapes et considérations critiques
Il est important de maintenir la stérilité, en particulier lors de la production de SCFM2 et de milieux, car la contamination peut entraîner l’introduction d’espèces non naturelles, ce qui peut interférer avec les résultats. Différentes souches du même microbe et différents microbes peuvent nécessiter des conditions environnementales différentes pour la croissance ou peuvent avoir des caractéristiques de croissance différentes. Par conséquent, le modèle doit être optimisé avant d’effectuer tout test de sensibilité aux antibiotiques. Nous recommandons de réaliser une petite étude pilote de 24 h et 48 h pour les espèces monospécifiques et le biofilm polymicrobien afin d’évaluer la croissance dans des conditions de modèle standard. Nous avons constaté que différentes souches de P. aeruginosa et certaines concentrations d’antibiotiques peuvent induire un essaimage sur le disque de polycarbonate. Ce problème peut être facilement surmonté en utilisant des disques de plus grande taille disponibles dans le commerce. La perturbation du biofilm peut également nécessiter une optimisation en fonction du batteur de billes et des microbes utilisés. Nous avons optimisé la méthode de perturbation en déterminant la CFU/mL d’un échantillon connu avant et après le battage des billes. Nous avons également utilisé la microscopie pour visualiser les échantillons de battement de billes afin de visualiser dans quelle mesure le biofilm a été perturbé.

L’une des limites de ce modèle de biofilm imitant la FK est la fixation à une surface solide contenant du polycarbonate, qui ne se trouve pas dans le poumon de la FK, plutôt que d’être des agrégats flottants librement dans les expectorations de la FK³⁷ . Cependant, le modèle de gélose solide présenté ici élimine la nécessité de laver les biofilms pour éliminer les microbes planctoniques et garantit que les résultats n’incluent que les microbes dérivés du biofilm par opposition à une culture mixte de biofilm planctonique. Nous avons également constaté que la pénétration de certains antibiotiques dans les zones plus profondes de ce modèle de biofilm peut être réduite, et que l’utilisation de la DNase peut être nécessaire pour modifier la rhéologie de la matrice extracellulaire et diminuer les interactions électrostatiques avec l’ADNe.

Nous pensons que le modèle est parfaitement adapté aux tests antimicrobiens en raison de sa polyvalence, de son adaptabilité et de l’inclusion de facteurs environnementaux que de nombreux modèles existants ne prennent pas en compte. Son utilisation dans la recherche fondamentale et les tests précliniques de sensibilité aux antimicrobiens peut fournir une approche plus pertinente sur le plan clinique pour l’AST d’échantillons cliniques et le développement de nouvelles thérapies.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 et micro ; L boucles d’inoculation  ;
13 mm 0,2 et micro ; Disques en polycarbonate de taille de pores M  ;	Isopore  ;	GTTP01300	Des disques plus grands sont également disponibles.
Tubes renforcés de 2 mL  ;	Thermofisher  ;
billes en céramique de 2,5 ml.	Qiagen	13114-325
500 mL verre borosilicate Duran bouteille	Sigma Aldrich  ;	Z305197	flacons plus grands disponibles en plus grands volumes sont souhaités
Plaques de culture 6 puits	Greiner	657165
7 mL Bijou	Thermofisher  ;	129B
Plaques 96 puits	Thermofisher  ;	167008	pour dilutions en série dans le dosage de l’UFC
Plaques de gélose pour la préparation de plaques de P. aerugnisa, S. aureus, et C. albicans			;LB miller pour P. aeruginosa et S. aureus et Sabouraud dextrose agar pour C. albicans  ;
Batteur à billes - adapté aux tubes de 2 mL Fisherbrand	;	15515799	Thermofisher broyeur à billes 24
centrifugeuse de table  ;			doit être capable d’au moins 8000 x g
Fond noir transparent 96 plaques de puits	Costar  ;	3603
Bec Bunsen  ;
Conteneurs pour l’élimination de l’équipement et du matériel contaminés conformément aux règlements de l’institut en matière de santé et de sécurité.
eau déminéralisée  ;
ADNe  ;	Sigma Aldrich  ;	31149
Unité de filtration  ;	Fisherbrand  ;	FB12566504	Interchangeable selon la pompe à vide utilisée mais doit avoir une taille de pores de 0,2 & micro ; m
Hémocytomètre et lamelle	Hawksley  ;	HC001	peuvent différer en taille et en volume. Vérifiez et ajustez les calculs CFU en conséquence.
Bouillon LB  ;	oxoid  ;	1.46813
Gélose au sel de mannitol  ;	Oxoïde  ;
méropénème	abcr	Ab243429
Mucine de l’estomac porcin Type II	Sigma Aldrich  ;	M2378
Nystatine	Millipore  ;
boîtes de Pétri	SLS	SLS2000
Saline tamponnée au phosphate
Gélose d’isolement de Pseudomonas	Millipore  ;	17208
Sel de sodium de résazurine  ;	Sigma Aldrich  ;
gélose au dextrose Sabouraud  ;	Oxoïde  ;	CM0041
sélection de pinces  ;			Pince à pointe fine et à tissus avec dents pour le transfert de billes de céramique
pipette
, agitation et incubateurs statiques  ;			doit être contrôlé en température
Sparks microtitre lecteur de plaque	Tecan  ;		Pour le dosage de la résazurine, le lecteur de plaque de microtitrage doit disposer des filtres appropriés ou être un monochromateur pour détecter la fluorescence.
spectrophotomètre
Gélose technique (Agar Technical No.2 )	Oxoid  ;	LP0012B
tétracycline	Sigma Aldrich  ;	T7660
;	Spectroline  ;	11-992-89
pompe à vide/flasque	Fisherbrand  ;
bain-marie  ;			Doit être capable de maintenir 55 ° ; C
Bouillon YPD  ;	Millipore  ;	Y1375  ;	Peut être acheté préfabriqué ou fabriqué à partir des ingrédients de base