Analyse électrophorétique de la réplication à travers des répétitions d’ADN à structure variable dans l’épisome humain basé sur SV40

Summary

Ici, nous décrivons la procédure d’analyse de la progression de la réplication à travers des répétitions pathogènes et sujettes à la structure à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Abstract

L’électrophorèse bidimensionnelle sur gel neutre/neutre (2DGE) est apparue comme une technique de référence pour analyser la réplication de l’ADN à travers des obstacles naturels. Ce protocole décrit comment analyser la progression de la fourche de réplication à travers des répétitions d’ADN expansibles et susceptibles de structuration dans l’épisome basé sur le virus simien 40 (SV40) dans les cellules humaines. En bref, lors de la transfection du plasmide dans des cellules humaines, les intermédiaires de réplication sont isolés par le protocole Hirt modifié et traités avec l’enzyme de restriction DpnI pour éliminer l’ADN non répliqué. Les intermédiaires sont ensuite digérés par des enzymes de restriction appropriées pour placer la répétition d’intérêt dans la moitié distale d’origine d’un fragment d’ADN de 3 à 5 kb de long. Les intermédiaires de réplication sont séparés en deux dimensions perpendiculaires, d’abord par la taille, puis par la forme. Après l’hybridation par transfert de Southern, cette approche permet aux chercheurs d’observer le décrochage de la fourche à diverses répétitions structurelles sur la moitié descendante de l’arc Y de réplication. De plus, ce positionnement du site de décrochage permet de visualiser divers résultats du décrochage à médiation répétée, tels que l’inversion de la fourche, l’avènement d’une fourche convergente et le redémarrage de la fourche recombinatoire.

Introduction

Les courtes répétitions en tandem (STR) sont de petites paires de 2 à 9 paires de bases (pb), des séquences répétitives d’ADN qui constituent environ 3 % du génome humain¹. Les STR jouent un rôle important dans la régulation des gènes² ; cependant, leur composition répétitive les rend sujets à la formation d’une structure secondaire de l’ADN non canonique et à l’instabilité génétique ultérieure ^3,4. Des hélices gauches aux épingles à cheveux/cruciformes, en passant par les hélices à trois et quatre brins, ces structures d’ADN alternatives posent des défis intrinsèques au réplisome. Une condition préalable naturelle à la formation d’une structure secondaire est le déroulement de l’ADN, qui est une condition préalable à la réplication de l’ADN. Cela présente une énigme unique pour le fonctionnement du génome, car bon nombre de ces structures peuvent se former pendant la réplication, entravant la progression du réplisome et provoquant finalement un blocage de la fourche^{de réplication 5,6,7} ou, dans les cas graves, un effondrement de la fourche et une rupture de l’ADN ^8,9. Il a été démontré que le redémarrage des fourches bloquées et les voies de réparation de l’ADN entraînent des instabilités répétées, telles que des expansions répétées^10,11 et des réarrangements génomiques complexes (CGR)^12,13. Ces événements peuvent entraîner le développement d’environ 60 maladies humaines connues sous le nom de troubles d’expansion répétée, y compris le syndrome de l’X fragile, la maladie de Huntington, l’ataxie de Friedreich et d’autres^14,15 ainsi que des maladies CGR, telles que le syndrome d’Emmanuel¹⁶. Par conséquent, pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie humaine entraînée par l’instabilité des répétitions, il est impératif d’étudier les détails de la progression de la fourche de réplication à travers ces répétitions.

Une technique d’étude de la progression de la réplication est apparue au milieu des années 1980 lorsque Brewer et Fangman ont cherché à fournir des preuves directes que l’initiation de la réplication chez Saccharomyces cerevisiae se produit au niveau des éléments¹⁷ de la séquence de réplication autonome (communément appelée ARS). Ce faisant, ils ont séparé les structures des intermédiaires de réplication de la levure dans l’agarose, adaptant une méthode antérieure de Bell et Byers connue sous le nom d’électrophorèse sur gel neutre/neutre en 2 dimensions (2DGE)¹⁸. Cette technique a utilisé le fait que l’ADN non linéaire se déplace différemment dans le gel d’agarose que son équivalent linéaire de la même masse. Plus précisément, dans la 2DGE, l’ADN isolé est séparé en deux dimensions perpendiculaires, d’abord principalement par taille, puis principalement par forme, pour créer une carte complète de la réplication dans une région d’intérêt particulière. Dans leur article original, Brewer et Fangman ont démontré qu’il s’agissait d’un arc composé de structures en « Y simples » ou de fourches de réplication reliant l’ADN non répliqué à leurs homologues répliqués. Ils décrivent en outre d’autres intermédiaires observés comme des « bulles » et des « doubles Y », représentant respectivement les origines de réplication et les fourches convergentes.

La 2DGE peut être utilisée pour étudier les populations relatives d’intermédiaires de réplication de l’ADN à un moment donné. Par conséquent, si une population d’intermédiaires est plus répandue qu’une autre, cela serait évident à la visualisation. Cela fait de 2DGE un outil particulièrement utile pour étudier la progression de la réplication à travers des séquences difficiles, comme les répétitions formant la structure. Par exemple, si la région analysée contient une séquence capable d’induire un blocage de la fourche de réplication, cela se présenterait comme un renflement sur l’arc (Figure 1A), indiquant une accumulation de fourches de réplication à ce locus. Cela peut être observé avec la réplication des séquences de répétition formant des épingles à cheveux dans la levure ^19,20,21 et des répétitions formant des triplex dans les cellules humaines 22,23,24. En plus du calage, la 2DGE peut être utilisée pour observer les structures de l’ADN qui ne sont pas conformes aux Y simples standard formés lors de la réplication, comme dans le cas des intermédiaires recombinants²⁵. Ces intermédiaires ont une structure en forme de X plus lourde et plus ramifiée et, par conséquent, se déplacent plus lentement dans la première et la deuxième dimension que les fourches de réplication standard. Des résultats similaires peuvent également être observés en ce qui concerne l’inversion de la fourche de réplication 20,24,26. En réponse à un fort stress de réplication, il a été démontré que les cellules eucaryotes utilisent l’inversion de la fourche de réplication pour sauver les fourches bloquées. Ces fourches inversées ont un poids moléculaire similaire à celui des fourches bloquées ; cependant, leur structure en patte de poulet entraîne une mobilité électrophorétique plus lente dans la deuxième dimension par rapport à leurs compléments en forme de Y, ce qui entraîne une extension vers le haut et vers l’extérieur de l’arc.

Figure 1 : Analyse par électrophorèse sur gel 2D de la réplication de l’ADN. (A) Schéma d’une 2DGE typique décrivant la réplication par une répétition formant une structure capable d’induire un décrochage de la fourche. La taille et la structure intermédiaires influenceront la mobilité électrophorétique. (B) Échantillon d’arc en Y avec les bras ascendant et descendant respectivement étiquetés. Abréviation : 2DGE = Électrophorèse sur gel neutre/neutre bidimensionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Naturellement, l’un des aspects les plus importants de la 2DGE concerne la qualité et la quantité des intermédiaires de réplication. Cependant, la résolution de l’analyse 2DGE de la réplication à travers des loci endogènes dans des cellules de mammifères est insuffisante pour une séquence cible à copie unique dans le génome humain diploïde de 6 × 10^{à 9} pb, bien qu’elle ait été réalisée pour des gènes à copies multiples, tels que le locus²⁷ DHFR fortement amplifié ou l’ARN ribosomique²⁸. La réplication basée sur SV40 est un moyen efficace et bien caractérisé d’étudier la réplication dans les cellules eucaryotes²⁹. Il fournit un modèle fiable de réplication eucaryote qui utilise la majeure partie de la machinerie du réplisome de l’hôte pour répliquer le génome viral, qui est divisé en nucléosomes lors de l’infection^30,31. Deux exceptions notables au réplisome des mammifères sont que l’antigène T (Tag), au lieu du complexe CMG de l’hôte, sert d’ADN hélicase réplicatif, et que l’ADN polymérase delta synthétise à la fois les brins d’ADN principaux et retardés³². Nous avons tiré parti de ce système en plaçant des tronçons pathogènes de répétitions structurantes en aval d’une origine de réplication SV40 dans un plasmide créé à l’origine dans le laboratoire de Massimo Lopes²². Il est important de noter que ce plasmide contient également le gène codant pour Tag lui-même, ce qui entraîne sa réplication constitutive et extrêmement puissante lors de la transfection dans une variété de cellules humaines cultivées. Cette caractéristique donne lieu à une grande quantité de produits, idéale pour l’analyse 2DGE des intermédiaires formés pendant et en réponse à la réplication de répétitions pathogènes dans les cellules humaines. Ici, nous décrivons une méthode détaillée de visualisation de la réplication des répétitions formant la structure dans l’épisome humain basé sur SV40 à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Protocol

REMARQUE : Le plasmide conçu pour notre analyse 2DGE décrite dans les cellules de mammifères doit contenir une origine SV40 de réplication plusieurs kb en amont des répétitions sujettes à la structure (Figure 2). Les synthèses en amont et en aval doivent être gardées à l’esprit lors du choix de l’orientation par rapport à l’origine des répétitions à cloner dans le plasmide.

Figure 2 : Digestion d’un plasmide contenant des répétitions pour l’analyse 2DGE. Les répétitions enclines à la structure sont représentées à plusieurs kb en aval de la fourche de réplication se déplaçant vers la droite. La digestion avec les couteaux uniques 1 et 2 placera la séquence répétée sur le bras descendant de l’arc en Y, étant donné que la séquence dépasse le point médian du fragment digéré. Abréviation : 2DGE = Électrophorèse sur gel neutre/neutre bidimensionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Transfection du plasmide dans des cellules de mammifères

1. Ensemencez 600 000 cellules HEK293T dans une plaque de culture tissulaire de 10 cm avant la transfection. Laissez les cellules se rétablir à 37 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : De nombreuses lignées cellulaires peuvent être utilisées pour cette expérience, bien que les cellules contenant l’étiquette SV40 soient recommandées pour des résultats optimaux. ATTENTION : HEK293T cellules sont considérées comme BSL-2 et tous les travaux de culture doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité en utilisant une technique d’asepsie appropriée et un EPI approprié.
2. Lorsque les cellules atteignent 60 % de confluence, transfectez 8 μg d’ADN plasmidique contenant des répétitions dans les cellules ensemencées à l’aide de réactifs de transfection appropriés conformément au protocole du fabricant.
3. Si vous n’isolez pas les produits intermédiaires à ce stade, aspirez les anciens milieux et remplacez-les par 10 ml de produits frais après 24 heures.
4. Commencer à prélever les cellules 24 à 48 h après la transfection.
   1. Aspirer le milieu et laver soigneusement avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Détachez et prélevez les cellules à l’aide de 0,5 mL de trypsine et abaissez à 340 × g pendant 4 min.
   2. Aspirez le surnageant et lavez les pastilles cellulaires avec du PBS. Essorez à nouveau à 340 × g pendant 4 min et aspirez le surnageant.
      REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici en congelant des pastilles de cellule à -80 °C. Nous avons trouvé la meilleure résolution en isolant les intermédiaires de réplication 48 h après la transfection ; Cependant, 24 h ont donné des résultats viables.

2. Isolement des intermédiaires de réplication

1. Remettre les cellules en suspension dans 1,5 mL de tampon de lyse Hirt modifié [10 mM de tris-HCl (pH 7,5), 10 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)] dans des tubes coniques de 50 mL et commencer la lyse cellulaire.
   1. Ajouter du dodécylsulfate de sodium (SDS) à une concentration finale de 0,6 % (environ 650 μL de SDS à 2 %) et de la protéinase K à une concentration finale de 100 μg/mL (environ 10 μL de protéinase K de 20 mg/mL) pour éliminer les nucléases.
   2. Mélangez délicatement par pipetage jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène et incubez le mélange à 37 °C pendant au moins 90 min.
2. Augmenter la concentration de NaCl à 1 M (environ 540 μL de NaCl 5 M de matière première) et mélanger doucement jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène. Incuber pendant la nuit (18-24 h) à 4 °C pour permettre la précipitation des débris cellulaires, de l’ARN et des protéines par salage.
   REMARQUE : Le mélange sera très visqueux, alors faites attention et soyez patient tout en mélangeant bien.
3. Le lendemain, séparez l’ADN des débris cellulaires, de l’ARN et des protéines.
   1. Centrifuger le mélange à 29 500 × g pendant 45 min à 4 °C.
   2. Transférez le surnageant contenant de l’ADN, ajoutez un volume de phénol :chloroforme :alcool isoamylique 25:24:1 (v/v), et mélangez brièvement jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène.
      ATTENTION : L’alcool phénol :chloroforme :isoamylique est une matière dangereuse et doit être manipulé avec un EPI approprié dans une hotte chimique.
   3. Centrifuger à nouveau à 15 000 × g pendant 5 min à température ambiante. Transférez la couche aqueuse dans un nouveau tube conique.
4. Précipitez et lavez l’ADN isolé.
   1. Ajouter un volume d’isopropanol pur et incuber à température ambiante pendant au moins 5 min. Faites tourner l’ADN à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
   2. Décantez le surnageant et lavez la pastille avec de l’éthanol à froid à 70 % pour éliminer l’excès de sel.
   3. Essorer à nouveau à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C, sécher à l’air libre et remettre doucement la pastille en suspension dans un tampon Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
      REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici et les échantillons peuvent être congelés à -20 °C ; cependant, le cycle de gel/dégel doit être évité car cela peut diminuer la qualité des intermédiaires de réplication de l’ADN.

3. Préparation d’échantillons et électrophorèse sur gel en 2 dimensions

1. Digérer les intermédiaires isolés de la réplication plasmidique.
   1. Ajoutez 100 unités des enzymes de restriction appropriées à l’échantillon pour digérer l’ADN plasmidique, en plaçant spécifiquement la séquence contenant la répétition sur la moitié distale d’origine du fragment linéaire (Figure 2). De plus, ajoutez DpnI pour couper l’ADN méthylé, éliminant ainsi tout ADN plasmidique qui n’a pas été entièrement répliqué dans les cellules humaines cultivées.
      REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, les enzymes de restriction doivent être des couteaux uniques qui produisent un fragment de 3 à 5 kb qui place la séquence sujette à la structure sur le bras descendant de l’arc en Y.
   2. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 6 à 10 h pour permettre une digestion complète du plasmide.
   3. Précipitez l’ADN avec 2,5 volumes d’éthanol pur froid et incubez à -20 °C pendant la nuit, ou ajoutez un volume d’isopropanol et incubez à température ambiante pendant 5 min.
   4. Centrifuger les échantillons digérés et précipités à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
   5. Décanter le surnageant et laver l’échantillon avec de l’éthanol à froid à 70 %. Faites tourner à nouveau à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
   6. Décanter le surnageant, le faire sécher à l’air libre pendant 10 minutes et remettre les échantillons en suspension dans 15 μL de tampon TE.
2. Préparez le gel d’agarose de première dimension à 0,4-0,5 % dans 1x Tris-borate-EDTA (TBE) (89 mM de base tris, 89 mM d’acide borique, 2 mM d’EDTA). Laisser la solution se solidifier pendant au moins 1 h.
3. Commencez à charger les échantillons dans la première dimension.
   1. Chargez l’échelle dans les 3 premiers centimètres par rapport au bord le plus à gauche du gel. Ensuite, chargez l’intégralité des échantillons préparés, en veillant à ce qu’il y ait 3 cm entre chaque paire.
   2. Faites fonctionner le gel dans 1x TBE pendant 19 à 24 h à 0,85 V/cm pour séparer les intermédiaires par rapport à leur taille. Assurez-vous que la chambre est couverte pour protéger les échantillons de la lumière, qui pourrait endommager l’ADN.
4. Le lendemain, retirez le gel du tampon et estimez l’emplacement du fragment linéaire digéré à l’aide d’une règle.
   1. Exciser les 3 premiers cm du gel contenant l’échelle et colorer le segment de gel dans 1 encéphalite à effet de serre contenant 0,3 μg/mL de bromure d’éthidium pendant 10 à 15 min. Visualisez l’échelle à l’aide d’un système de documentation en gel.
   2. Ajoutez 1,3 cm à l’emplacement estimé, ce qui donne la valeur a. Ensuite, soustrayez 7,5 cm de la valeur a, ce qui donne la valeur b. Alignez la règle contre le gel de première dimension et coupez horizontalement aux valeurs a et b. Ensuite, coupez verticalement l’espace de 3 cm réservé à chaque échantillon. Reportez-vous à la figure 3 pour un schéma visuel.
   3. Dans un nouveau plateau de coulée, faites pivoter les segments dans le sens des aiguilles d’une montre et placez-les à la position des puits d’échantillon (Figure 3).
5. Préparer le gel d’agarose de deuxième dimension à une concentration de 1 à 1,3 % dans 1 TBE à 0,3 μg/mL de bromure d’éthidium.
   1. Une fois refroidi à environ 55 °C, versez le gel de deuxième dimension sur les segments de première dimension tournés et laissez-le se solidifier pendant au moins 1 h.
   2. Transférez la deuxième dimension dans une chambre avec 1x TBE à 0,3 μg/mL de bromure d’éthidium et laissez le gel s’équilibrer pendant au moins 30 min.
   3. Faites couler le gel, à nouveau couvert, pendant 9 à 10 h à 4,23 V/cm à 4 °C pour séparer les produits intermédiaires par rapport à leur forme.

Figure 3 : Excision des intermédiaires de première dimension avant la séparation de la deuxième dimension. Après visualisation de l’échelle, la mobilité des fragments non répliqués peut être estimée. (I) Cette valeur peut ensuite être utilisée pour déterminer les sites de coupe appropriés (a et b) pour l’excision ainsi que ses homologues répliqués (II). La section du gel doit ensuite être tournée et placée dans la position des puits pour la séparation de la deuxième dimension. Abréviation : CW = dans le sens des aiguilles d’une montre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Transfert de Southern et hybridation avec sonde radiomarquée

1. Retirez le gel de deuxième dimension de la chambre et dépurinez les fragments d’ADN pendant 10 min dans une solution HCl de 0,24 M avec un léger balancement. Rincez le gel à l’eau déminéralisée et faites-le tremper dans 0,4 M de NaOH pendant 10 à 15 min.
   ATTENTION : Le HCl et le NaOH sont corrosifs et doivent être manipulés avec un EPI approprié dans une hotte chimique.
2. Commencer à assembler le transfert de Southern pour faciliter le transfert des intermédiaires séparés du gel à la membrane. Reportez-vous à la figure 4 pour un schéma complet.
   1. Remplissez un récipient de taille suffisante avec 1 L de NaOH 0,4 M.
   2. Alignez une longue feuille de verre sur le récipient et pliez (sur toute la longueur) deux longues feuilles de papier de chromatographie perpendiculairement à la feuille de verre, en s’étendant dans le récipient de NaOH.
   3. Mouillez le haut du papier avec du NaOH et retirez soigneusement toutes les bulles d’air sous sa surface.
   4. Trempez trois feuilles de papier de chromatographie avec du NaOH et placez-les sur le papier plié, en enlevant à nouveau les bulles.
   5. Retournez le gel de deuxième dimension et transférez-le sur les papiers.
   6. Mouillez une membrane en nylon chargée positivement (taille de pores de 0,45 μm) avec de l’eau DI et placez-la sur le gel.
   7. Enfin, ajoutez trois autres feuilles de papier, mouillées avec de l’eau DI, sur la membrane.
   8. Couvrez tout NaOH exposé dans le récipient inférieur avec une pellicule plastique pour éviter l’évaporation. Placez une pile de serviettes ou d’essuie-tout sur la tache, en vous assurant qu’elle mesure 0,3 à 0,5 m de haut. Placez un poids sur le dessus, en comprimant tout le blot pour faciliter l’action capillaire serrée. Attendez au moins 2 jours pour que l’ADN soit transféré à la membrane.
      REMARQUE : La longueur et la largeur du papier et de la membrane de chromatographie dépendent de la taille du gel d’agarose utilisé pour la deuxième dimension. Pour un transfert le plus efficace, utilisez du papier et une membrane ayant les mêmes dimensions que ceux du gel.
3. Après le transfert, réticuler l’ADN à la membrane à l’aide d’un réticulant UV à 120 μJ/cm² pendant 1 min.
   REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici en plaçant la membrane dans un protecteur de feuille hermétique, sec et propre à température ambiante.
4. Laver la membrane 2x pendant 5 min avec 2x citrate de sodium salin (tampon SSC) (0,3 M NaCl, 0,03 M de citrate de sodium).
5. Préhybrider la membrane avec 0,18 mL/^cm2 de tampon d’hybridation de Church & Gilbert [1 mM d’EDTA, 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,5 M de phosphate de sodium, 7 % de SDS] à 65 °C, en alternant dans un incubateur d’hybridation pendant au moins 2 h.
   REMARQUE : La membrane peut préhybrider pendant plusieurs jours.
6. Préparez la sonde radiomarquée à l’aide d’un ^α-32P dATP ou dCTP et d’un kit de marquage ADN conformément au protocole du fabricant.
   ATTENTION : Les dNTP radiomarqués sont dangereux et un EPI approprié doit être porté lors de leur manipulation. Tous les travaux radioactifs doivent être effectués derrière le blindage, et les personnes formées doivent être surveillées pour l’absorption de rayonnement à l’aide de dosimètres.
   1. Concevoir un fragment d’ADN linéaire de 400 à 900 pb complémentaire à la séquence digérée par restriction (Figure 2) et amplifier le fragment à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR).
      REMARQUE : Nous recommandons d’avoir un fragment PCR de stock de 50 à 100 ng/μL
   2. Combinez 100 ng du fragment complémentaire de PCR avec de l’ADN Pol I, un fragment de Klenow (3' 5' exo-) tampon et des oligos décanucléotidiques aléatoires.
   3. Dénaturer le fragment à 100 °C pendant 10 min.
   4. Ajoutez à l’échantillon 5 unités d’ADN Pol I, fragment de Klenow (3' 5' exo-), 50 μCi de dNTP ^α-32P et 30-50 μmol de mélange dNTP déficient en type dNTP radiomarqué.
   5. Incuber à 37 °C pendant 10 min pour permettre la polymérisation et l’incorporation de dNTP radiomarqué.
   6. Ajouter 30 à 50 μmol de type dNTP précédemment absent à l’échantillon et incuber à 37 °C pendant 10 min.
   7. Purifier le fragment radiomarqué à l’aide d’une colonne de centrifugation à 3 000 × g pendant 2 min.
7. Ajouter la sonde radiomarquée à 50 mL de tampon d’hybridation et incuber avec la membrane pendant la nuit à 65 °C en tournant dans un incubateur d’hybridation.
8. Le lendemain, retirez la sonde et lavez la membrane 2x avec le tampon de lavage 1 (0,1x SSC, 0,1% SDS) à 42 °C et 2x avec le tampon de lavage 2 (2x SSC, 0,1% SDS) à 65 °C.
   REMARQUE : Tous les lavages doivent être effectués avec des rotations rapides pendant 15 min dans l’incubateur.
9. Séchez la membrane pendant 10 min et placez-la dans un protecteur de feuille mince et transparent. Stockez la membrane scellée dans une cassette contrôlée et résistante aux radiations avec un écran sensible au phosphore. Laissez la membrane être exposée à l’écran pendant 1 à 10 jours.
10. Visualisez les résultats à l’aide d’un imageur biomoléculaire réglé sur l’imagerie au phosphore. Laver et réexposer si nécessaire.

Figure 4 : Assemblage du transfert de Southern. Schéma complet d’un appareil typique utilisé pour le transfert par transfert de Southern d’intermédiaires de la deuxième dimension sur une membrane en nylon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Results

En cas de succès, lors de la visualisation, on peut observer un arc aigu de fourches de réplication s’étendant vers le haut et vers l’extérieur à partir de l’énorme point 1n (Figure 5A). La taille d’un fragment, ou le pourcentage de réplication, détermine la mobilité du fragment dans la première dimension. Au fur et à mesure que les intermédiaires développent une structure plus articulée, ils commenceront à se déplacer plus lentement dans la deuxième dimension. Par conséquent, si un intermédiaire a voyagé lentement dans les deux dimensions, on peut affirmer qu’il s’agit d’une molécule hautement répliquée avec une variation jonctionnelle significative par rapport aux fourches de réplication conventionnelles. Dans le cas de la synthèse à brin retardé de la répétition (GAA)₁₀₀ , le blocage de la fourche est indiqué par un point défini sombre sur l’arc (I), représentant une accrétion de fourches de réplication lors de la rencontre de la répétition (Figure 5B), probablement due à la formation de triplex. Ceci s’accompagne d’intermédiaires plus lourds et plus ramifiés (II et III) au-dessus du site de stalle. Nous avons décrit la nature de ces intermédiaires plus en profondeur dans Rastokina et al. 2023²⁴. En bref, il s’agit probablement d’une combinaison de fourches qui s’inversent en réponse au décrochage (II), en plus de l’avènement de la fourche convergente (figure 5B) (III).

Une observation que l’on peut faire en visualisant est un arc large et loin d’être idéal. Au pire, cela peut se présenter comme un doublement complet de l’arc. Typiquement, cela représente une mauvaise séparation des intermédiaires dans la première dimension. Cela peut être attribué à plusieurs facteurs, dont le plus probable est la contamination par le sel ou les protéines dans l’échantillon intermédiaire de réplication. Une purification phénol :chloroforme après digestion des intermédiaires, suivie d’un lavage approfondi avec de l’éthanol à 70 %, peut minimiser ce risque. Cependant, il convient de noter qu’une exposition supplémentaire au phénol peut augmenter le risque de dénaturation des intermédiaires, qui peuvent se présenter sous la forme d’une intensité assombrie de l’ADN linéaire sous l’arc, représentant des intermédiaires de réplication effondrés (figure 5C).

Dans le pire des cas, la visualisation peut entraîner une absence totale d’intermédiaires de réplication, comme en témoigne l’absence d’arc (Figure 5D). Il est peu probable que l’absence d’arc soit attribuée à des intermédiaires de réplication dénaturés, car il n’y a pas de tache sombre sous la zone attendue de l’arc. Étant donné la présence d’une tache 1n (IV) particulièrement petite, la quantité globale d’ADN présente dans cet exemple est minime et, par conséquent, ce problème peut être causé par une sous-réplication du plasmide ou une mauvaise transfection ou isolement global de l’ADN.

Figure 5 : Résultats potentiels de l’analyse 2DGE. (A) Analyse 2DGE réussie de la réplication par la répétition de formation de structure (GAA)₁₀₀ dans HEK293T cellules. (I) fait référence aux fourches bloquées à la répétition, tandis que (II) et (III) se réfèrent à des intermédiaires plus structurés qui surgissent en réponse au décrochage. Une illustration du fragment de 2,7 kb est illustrée ci-dessus. (B) Intermédiaires représentatifs qui apparaissent lors de la réplication de la répétition (GAA)₁₀₀. À l’aide de l’inhibition par siRNA des gènes d’inversion de la fourche de réplication et de redémarrage, des contrôles génétiques ont été établis pour identifier la nature de ces intermédiaires. (C) Représentation des intermédiaires de réplication non résolus qui peuvent apparaître si les fourches sont dénaturées pendant l’isolement. (D) Une expérience 2DGE infructueuse comme le montre l’absence totale d’intermédiaires de réplication. IV représente des fragments linéaires et non répliqués du plasmide digéré. Abréviation : 2DGE = Électrophorèse sur gel neutre/neutre bidimensionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

2DGE fournit une image semi-quantitative et complète des populations relatives d’intermédiaires qui apparaissent lors de la réplication d’une séquence particulière. Étant donné que les structures moléculaires fragiles des fourches de réplication doivent être maintenues tout au long de cette procédure, une grande prudence doit être mise en œuvre pour éviter le cisaillement physique et la dénaturation chimique. Par conséquent, il est fortement recommandé d’éviter tout traitement alcalin lors de l’isolement du plasmide. Pour éviter cela, nous et d’autres avons mis en œuvre une forme modifiée de l’isolement de l’ADN de Hirt, établie par Hirt en 1967³³. Ici, l’ADN est séparé des protéines, de l’ARN et d’autres débris cellulaires en traitant le lysat cellulaire avec 1 M de NaCl à 4 °C pendant la nuit. Bien que cette méthode se soit avérée exceptionnelle pour préserver la qualité des intermédiaires de réplication, elle ne semble pas séparer complètement l’ADN plasmidique de l’ADN génomique. Il faut garder cela à l’esprit lors de la conception de la séquence pour le sondage radiomarqué, car la sonde conçue ne doit pas présenter de similitude de séquence élevée avec un ADN génomique afin d’éviter au mieux la liaison hors cible. De plus, l’intégrité des intermédiaires de réplication peut être considérablement augmentée par la réticulation UV-psoralène. Ici, les cellules peuvent être incubées avec du psoralène pendant plusieurs minutes dans l’obscurité avant d’être irradiées par UV à 366 nm³⁴, créant ainsi des liaisons covalentes entre les molécules d’ADN. En plus de renforcer la cohésion des structures intermédiaires, cela peut également atténuer toute préoccupation liée à la formation de structures pendant l’isolement plutôt qu’in vivo.

Un aspect qui doit être pris en compte lors de la conception de cette expérience est le placement répété sur l’arc final résolu. La première moitié de l’arc s’étendant à partir de la tache 1n est désignée par le bras ascendant, tandis que la seconde moitié est connue sous le nom de bras descendant (Figure 1B). Pour observer le calage de la fourche de réplication, un placement répété sur l’un ou l’autre bras de l’arc devrait suffire. Cependant, pour observer des intermédiaires plus structurés qui apparaissent au niveau des séquences répétées, telles que les jonctions postréplicatives, nous recommandons de placer la séquence répétée sur le bras descendant. Cela est dû en grande partie à la mobilité électrophorétique plus lente de ces intermédiaires dans les deux dimensions, ce qui peut entraîner une co-migration avec des structures Ys simples plus loin dans leur progression si la séquence contenant des répétitions était placée sur le bras ascendant, entravant ainsi toute analyse détaillée. Pour une résolution optimale, nous vous recommandons de placer la séquence de répétition entre 60 % et 90 % dans le fragment d’intérêt par rapport à l’origine de la réplication.

Une attention particulière aux détails doit être portée lors de l’étape de transfert d’ADN et du traitement ultérieur de la membrane. Il est extrêmement important que le transfert de Southern soit assemblé de manière à faciliter un transfert uniforme et serré de l’ADN vers la membrane. Cela signifie que tous les composants du transfert sont exempts de bulles d’air et que l’appareil est uniforme sur toute sa surface. Pour y parvenir, il est standard de retourner le gel de deuxième dimension avant de l’ajouter au transfert Southern. Le bas du gel est supposé être plus plat que le haut ; par conséquent, le retournement du gel assure le transfert le plus fluide possible de l’ADN vers la membrane.

Si un fort bruit de fond est présent dans la résolution finale du transfert, cela peut indiquer la liaison non spécifique de la sonde radiomarquée. Cela peut être atténué de plusieurs façons. Tout d’abord, il convient de vérifier que la sonde ne contient pas de similitude de séquence élevée avec un ADN génomique. Cela peut être facilement vérifié à l’aide de l’outil de recherche d’alignement local de base des nucléotides (BLAST), qui est facilement disponible sur le site Web des NIH³⁵. Sinon, les sondes non spécifiquement liées peuvent être retirées par des lavages stricts supplémentaires. Nous recommandons de commencer par deux lavages supplémentaires du tampon 1 (0,1x SSC, 0,1% SDS) à 42 °C à intervalles de 15 minutes chacun. Cependant, d’autres lavages peuvent être nécessaires. Enfin, la température à laquelle l’hybridation se produit peut également être modifiée. Pour la plupart des sondes ayant une teneur en G/C de 40 à 60 %, 65 °C ont tendance à être suffisantes, bien qu’il ne s’agisse pas d’une valeur statique. La liaison efficace de la sonde dépend de sa température de fusion et, par conséquent, peut nécessiter des modifications de la température d’hybridation.

Étant donné que la 2DGE fournit une vue d’ensemble des populations relatives d’intermédiaires de réplication à un moment donné, l’un de ses plus grands inconvénients est qu’elle ne fournit pas une mesure solide du moment de la progression de la réplication. À cette fin, nous vous recommandons d’utiliser l’analyse de molécules uniques comme le peignage de l’ADN. De plus, bien que la 2DGE permette d’analyser les intermédiaires de réplication qui se produisent en réponse au calage, des contrôles génétiques doivent être établis pour découvrir leur identité exacte, ce qui peut être opportun. Bien que coûteuse, la microscopie électronique reste supérieure pour identifier la structure exacte des molécules d’ADN.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x tampon TBE	Bio Rad	1610733
20x tampon SSC	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cellules	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol  ;	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Filtres au phosphore	Fisher Scientific	28956482
Church et le tampon d’hybridation de Gibert	Fisher Scientific	50-103-5408
Marquage ADN DecaLabel kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, haute teneur en glucides, supplément GltaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	enzymes de restriction supplémentaires devront être achetées ainsi que
EDTA 0,5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Éthanol, 70	%Fisher Scientific
sérum de veau fœtal  ;	VWR	97068-085
Solution d’acide chlorhydrique, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME Réactif de transfection d’ADN et d’ARNi avec tampon	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge Tubes de centrifugation à grande vitesse	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Tampon phosphate salin, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
Tampon phosphate salin, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Papier de chromatographie en cellulose pure	Fisher Scientific	05-714-4
Papier de chromatographie en cellulose pure	Fisher Scientific	05-714-5
Règle	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Dodécylsulfate	de sodiumMillipore Sigma	436143-25G
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Centrifugeuse super-rapide	ThermoFisher Scientific	75006580
Système d’électrophorèse horizontal sous-cellulaire	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Rotor à godet oscillant	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7,5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	ThermoFisher Scientific	25200056