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Article de méthode

Isolement et caractérisation d’exosomes dérivés de tissus de rate de souris

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DOI :

10.3791/67234

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20 septembre 2024

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1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour isoler les exosomes dérivés de la rate de souris en utilisant une combinaison de digestion avec de la collagénase de type I et d’ultracentrifugation.

Résumé

Les exosomes (Exo) sont des structures bicouches lipidiques sécrétées par diverses cellules, y compris celles des animaux, des plantes et des procaryotes. Des études antérieures ont révélé que les Exo dérivés de l’humorale ou du surnageant cellulaire sont des cibles prometteuses pour de nouveaux biomarqueurs diagnostiques ou pronostiques, soulignant leur rôle significatif dans la pathogenèse de la maladie. Les Exo d’origine tissulaire (Ti-Exo) ont attiré de plus en plus d’attention en raison de leur capacité à refléter avec précision la spécificité des tissus et le microenvironnement. Ti-Exo, présent dans l’espace interstitiel, joue un rôle crucial dans la communication intercellulaire et la signalisation inter-organes. Malgré leur valeur reconnue dans l’élucidation des mécanismes pathologiques, l’isolement de Ti-Exo reste difficile en raison de la complexité des matrices tissulaires et de la variabilité des méthodes d’extraction. Dans cette étude, nous avons développé un protocole pratique pour isoler les exosomes du tissu de la rate de souris, fournissant une technique reproductible pour l’analyse d’identification ultérieure et les études fonctionnelles. Nous avons utilisé la digestion à la collagénase de type I combinée à l’ultracentrifugation différentielle pour isoler l’exo dérivé de la rate. Les caractéristiques de l’Exo isolé ont été déterminées par microscopie électronique, cytomètre en nano-flux et transfert Western. L’Exo isolé dérivé de la rate a montré la morphologie typique des vésicules bicouches lipidiques, avec des tailles de particules allant de 30 nm à 150 nm. De plus, le profil d’expression des marqueurs d’exosomes a confirmé la présence et la pureté des exosomes. Dans l’ensemble, nous avons réussi à établir un protocole pratique pour isoler l’Exo dérivé de la rate chez la souris.

Introduction

Les exosomes (Exo) sont un sous-groupe de vésicules extracellulaires (VE), d’une taille allant de 30 à 150 nm, encapsulant un large éventail de biomolécules, notamment des protéines, des acides nucléiques et des lipides1. Ces biomolécules sont dérivées des cellules parentales et sont libérées dans l’espace extracellulaire. Exo facilite l’échange d’informations biomoléculaires entre les cellules et leur microenvironnement environnant, jouant un rôle dans les systèmes procaryotes et eucaryotes2. Les caractéristiques des exosomes, telles que le contenu, la taille, les composants membranaires et l’origine cellulaire, sont très variables et influencées par le type de cellule d’origine, l’état cellulaire et les conditions environnementales.

Les exosomes sont généralement classés en trois catégories en fonction de leur source : dérivé de la culture cellulaire, dérivé des fluides corporels et dérivé des tissus (Ti-Exo). Bien que les exosomes dérivés de cultures cellulaires aient été largement étudiés en raison de leur accessibilité et de leur rendement constant, leur utilisation est limitée par des altérations potentielles des caractéristiques cellulaires après une culture prolongée, ce qui peut dénaturer leurs fonctions biologiques 3,4,5. De plus, la plupart des cultures cellulaires sont maintenues dans des environnements bidimensionnels qui n’imitent pas les interactions intercellulaires complexes in vivo, ce qui pourrait avoir un impact sur l’interprétation des données6. À l’inverse, les exosomes isolés à partir de fluides biologiques offrent une option peu invasive pour suivre la progression de la maladie en temps réel7. Cependant, ces échantillons contiennent souvent un mélange d’exosomes d’origines diverses, ce qui complique l’identification précise de leur source primaire8. Compte tenu de ces défis, il y a un intérêt croissant pour Ti-Exo, qui réside dans l’interstitium extracellulaire et sont des médiateurs clés de la signalisation intercellulaire.

La rate joue un rôle crucial dans la fonction immunitaire et le maintien de l’homéostasie interne. Malgré les protocoles existants pour isoler Ti-Exo d’organes tels que le cerveau, le foie et les tumeurs, les méthodes pratiques pour les exosomes dérivés de la rate sont limitées 9,10. Cette étude visait à établir un protocole pratique pour isoler les exosomes du tissu de la rate chez des souris modifiées à partir d’un rapport précédent11. Nous détaillons une méthode impliquant une digestion par collagénase suivie d’une ultracentrifugation, qui minimise la perturbation de la membrane cellulaire et garantit une pureté et un rendement élevés d’Exo dérivé de la rate. Les caractéristiques de l’Exo isolé à l’aide de ce protocole établi ont été validées par microscopie électronique (MET), cytomètre en nano-flux (Nano-FCM) et transfert Western, confirmant l’efficacité du protocole pour d’autres recherches expérimentales.

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Protocole

Les échantillons ont été obtenus à partir de souris, avec l’approbation éthique accordée par le Comité d’éthique de l’Université de médecine du Guangdong. Des descriptions détaillées des matériaux, de l’équipement et des logiciels utilisés dans ce protocole sont fournies dans la Table des matériaux. Les détails de la préparation avant l’extraction sont illustrés à la figure 1, tandis que le processus d’extraction et d’enrichissement de Spleen-Exo est décrit à la figure 2.

1. Préparation

  1. Pré-refroidissez les centrifugeuses à grande vitesse et à ultra-haute vitesse à 4 °C et réglez la température d’un agitateur de bureau à 37 °C.
  2. Préparez des boîtes de culture cellulaire (figure-protocol-1100 mm), des tubes à centrifuger stériles de 50 ml, de la glace et une passoire à cellules stériles (figure-protocol-270 μm) comme illustré aux figures 1A et B.
  3. Stérilisez les ciseaux et les pinces à l’aide d’un spray d’alcool à 75 %, suivi d’une stérilisation à haute température. Ces outils sont illustrés à la figure 1C.
  4. Placez le tissu de la rate dans une boîte de Pétri stérile figure-protocol-3de 100 mm sur de la glace et lavez le sang de surface avec 1 solution saline stérile glacée tamponnée au phosphate (PBS). Séchez les tissus de la rate avec de la gaze stérile et pesez-les après séchage.
    REMARQUE : Si le tissu est congelé, décongelez-le dans un plat pendant 15 minutes sur de la glace avant de continuer.
  5. Hydratez la crépine cellulaire (figure-protocol-470 μm) en déposant 1 mL de PBS stérile dans la passoire à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
  6. Préparez le tampon digestif (0,1 % de collagénase de type I) à l’aide de 1x PBS avec un mélangeur vortex.
    REMARQUE : Utiliser 10 ml de tampon digestif pour 100 mg de tissu de la rate. La concentration de collagénase a été choisie dans cette étude sur la base des instructions du produit. Pour d’autres types de tissus, les chercheurs peuvent avoir besoin d’ajuster ces paramètres en fonction de la densité et de la composition des tissus. Des expériences préliminaires avec des concentrations et des temps de digestion variables sont recommandées pour déterminer les conditions optimales pour chaque type de tissu.

2. Digestion des tissus

  1. Coupez le tissu en petits morceaux uniformes à l’aide de ciseaux dans une boîte de culture sur de la glace (figure 3A) et transférez-le dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
  2. Ajouter le tampon de digestion dans le tube en fonction du poids du tissu de la rate comme indiqué ci-dessus (figure 3B), puis agiter le tube avec un angle de 45° sur un agitateur horizontal à 37 °C. Surveillez la progression de la digestion et arrêtez la digestion lorsque les morceaux de tissu se sont dispersés et que la plupart ont perdu leur forme. Le temps de digestion doit varier entre les tissus. Dans les conditions expérimentales de cette étude, le temps de digestion est d’environ 30 min.
  3. Transférez le mélange digéré dans une passoire cellulaire (Ф70 μm) à température ambiante (RT) pour éliminer les débris tissulaires fibreux et plus gros.
    REMARQUE : Terminer la filtration immédiatement après la digestion.
  4. Recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger neuf de 50 ml.

3. Isolement des exosomes par centrifugation différentielle

  1. Filtrats de centrifugation à 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Une pastille contenant des cellules résiduelles, des débris cellulaires et des noyaux peut être observée après centrifugation, comme le montre la figure 3C.
  2. Transvasez le surnageant dans un nouveau tube et centrifugez-le à 3000 x g pendant 20 min à 4 °C. Une pastille contenant des corps apoptotiques et des microsomes peut être observée après centrifugation, comme le montre la figure 3D.
  3. Transvasez le surnageant dans un tube neuf et centrifugez-le à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Des pastilles contenant des microvésicules et une membrane plasmique peuvent être observées après centrifugation, comme le montre la figure 3E.
  4. Ultracentrifuger le surnageant résultant à 120 000 x g pendant 2 h à 4 °C. Une pastille peut être vue au fond du tube après centrifugation, comme le montre la figure 3F.
  5. Jetez le surnageant, lavez la pastille avec du PBS et ultracentrifugez-la à nouveau à 120 000 x g pendant 2 h à 4 °C pour obtenir des exosomes. Une pastille peut être vue au fond du tube après centrifugation, comme le montre la figure 3G.
  6. Dissoudre les exosomes isolés avec du PBS stérile (200 μL par rate) et stocker les exosomes isolés dans un tube à centrifuger neuf de 2 mL à -80 °C.

4. Caractérisation des exosomes par microscopie électronique à transmission (MET)

REMARQUE : La MET a été utilisée pour déterminer si l’Exo extrait présentait des caractéristiques vésiculaires. Les échantillons Exo identifiés par microscopie électronique doivent être des échantillons frais ou stockés brièvement à 4 °C pendant une courte période.

  1. Fixer les exosomes (2-6 μg/μL) avec du paraformaldéhyde de qualité microscopie électronique (EM) à 2 % à RT pendant 2 h.
  2. Déposer 10 μL de solution d’exosomes sur un treillis de cuivre, incuber à RT pendant 10 min, rincer à l’eau distillée stérile et éponger l’excès de liquide avec du papier absorbant.
  3. Teignez le treillis de cuivre avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 1 min, épongez l’excès de liquide avec du papier filtre et séchez-le sous une lampe à incandescence pendant 2 min.
  4. Observez l’échantillon préparé au microscope électronique à transmission à 80 kV.

5. Mesure de la distribution granulométrique et de la concentration en particules des exosomes

  1. Chargez les nanoparticules de polystyrène standard (250 nm) sur le cytomètre en nanoflux.
  2. Mesurez la concentration en protéines des échantillons d’Exo à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA. Diluez l’échantillon Exo avec du PBS selon les résultats du dosage des protéines BCA (diluez les exosomes à 1-10 ng/μL), puis chargez les échantillons Exo dans le nano-flux pour mesurer l’intensité de la diffusion latérale (SSI).
  3. Calculer la concentration d’Exo en fonction du rapport entre le SSI et la concentration de particules dans les nanoparticules de polystyrène standard.
    REMARQUE : Pour la mesure de la taille, une courbe standard est générée en chargeant des nanoparticules de silice standard avec des tailles de gradient (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) dans le nanocytomètre en flux. Le chargement de l’échantillon Exo s’ensuit ainsi. La distribution granulométrique d’Exo a été calculée selon la polymérisation standard.

6. Confirmation par lyse et immunoblot des protéines d’exosomes

  1. Ajouter 100 μL de tampon de lyse par dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA) à la pastille d’exosome pour l’analyse des protéines.
  2. Vortex vigoureusement, couvrir de parafilm, basculer pendant 20 min à RT, puis vortex à nouveau.
  3. Centrifuger brièvement à 1000 x g pendant 30 à 60 s pour recueillir l’échantillon, le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL et le stocker à -20 °C à -80 °C jusqu’à l’analyse.
  4. Pour l’immunoblot, mélanger les échantillons avec un tampon de charge 5x pour obtenir une concentration de 1x et se préparer à l’électrophorèse sur gel.
  5. Si l’on souhaite des contrôles d’homogénat de tissu entier, utilisez un tampon de lyse puissant avec un inhibiteur de protéase pour lyser le tissu, comme indiqué ci-dessus. Ensuite, centrifugez les échantillons à 10 000 x g pendant 10 min et jetez la matrice extracellulaire restante, les cellules entières ou les débris cellulaires intacts.
  6. Faire bouillir le tampon d’échantillon contenant des exosomes ou l’homogénat de tissu à 95 °C pendant 5 à 10 min. Chargez une quantité égale de protéines par voie dans un gel SDS-PAGE à 10 %. Charge égale de protéine de l’homogénat de tissu comme témoin.
  7. Procéder à l’électrophorèse sur gel sous une tension de 80 V pendant environ 2 h à l’aide du tampon d’électrophorèse classique. Effectuer une analyse par transfert Western pour confirmer l’expression de la protéine Exo dans les lysats purifiés et comparer l’abondance relative d’Exo en fractions.

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Résultats

Isolement et purification d’exosomes dérivés de la rate
Pour isoler les exosomes du tissu de la rate de souris, nous avons utilisé une combinaison de digestion de la collagénase et d’ultracentrifugation différentielle (Figure 2). Les premières étapes consistaient à prétraiter le tissu de la rate pour éliminer le sang de surface, suivi d’une digestion avec de la collagénase de type I. Ce traitement enzymatique a facilité la dégradation des composants de la matrice extracel...

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Discussion

Des recherches récentes ont révélé que les exosomes dérivés de la rate (Spleen-Exo) jouent un rôle essentiel dans le traitement du cancer gastrique12. Pour élucider davantage les fonctions de Spleen-Exo, il est nécessaire d’établir une méthode reproductible et optimale pour leur extraction du tissu de la rate. Bien qu’il existe des protocoles pour isoler les exosomes du cancer du cerveau et du foie13,14, l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82370281, 81870222), la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (2022A1515012103), et le projet d’allocation compétitive du Fonds spécial pour la science, le développement technologique de la ville de Zhanjiang (2021A05086), et la Fondation des startups du deuxième hôpital affilié de l’Université médicale du Guangdong (23H03).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
70 et micro ; m Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anticorps anti CD9Cell Signaling Technology, Inc (CST), États-Unis983275
Anticorps anti GM130Proteintech Group, Inc.China  ;66662-1-lg
Anticorps anti TSG101Abcam Plc, Royaume-Uni125011
Plat de culture cellulaireWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Chine704001
Tube à centrifugerWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Chine788211
Collagénase Type ISigma-Aldrich Corp., USAC2674
Agitateurthermostatique de bureauShanghai bluepard instruments Co., Ltd., ChineTHZ-100
Tampon d’électrophorèseWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Chine  ;G2081-1L
Kit amélioré de dosage des protéines BCAShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine  ;P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., ChineN30E
Système d’imagerie par fluorescence/chimiluminescence  ;Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ChineGelView 6000Plus
HRP Chèvre anti-IgG deProteintech Group, Inc.Chine  ;15014
HRP Chèvre anti-Lapin IgGProteintech Group, Inc.Chine  ;15015
lecteur de microplaquesMolecular Devices, USACMax Plus
MicroscissorsShanghai  ; Médical  ; Instruments (groupe)  ;Co., Ltd.,ChineWA1010
Pince à épiler microscopiqueShanghai  ; Médical  ; Instruments (groupe)  ;Co., Ltd.,ChineWA3010
Centrifugeuse Multifuge X1R ProThermo Fisher Scientific, USA75009750
Ciseaux ophtalmiquesShanghai  ; Médical  ; Instruments (groupe)  ;Co., Ltd.,ChinaY00030
Pince à épiler ophtalmiqueShanghai  ; Médical  ; Instruments (Groupe)  ;Co., Ltd., Chine  ;JD1060
Optima XPN-100 Centrifugeuse d’ultrafiltrationBeckman Coulter, USAA94469
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., ChineP1003
Tampon de lyse RIPA (fort, sans inhibiteurs)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine  ;P0013K
RègleDeli  ; Fabrication  ; Société, Chine
Tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine  ;P0015
Pipette de transfertBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Microscope électronique à transmissionHitachi, JaponH-7650
Tube d’ultracentrifugationBeckman Coulter, États-Unis355618
Western Transfer Buffer  ;Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Chine  ;Référence G2028-1L
souris

Références

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