Article de méthode

Isolement et caractérisation d’exosomes dérivés de tissus de rate de souris

DOI :

10.3791/67234

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20 septembre 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour isoler les exosomes dérivés de la rate de souris en utilisant une combinaison de digestion avec de la collagénase de type I et d’ultracentrifugation.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les exosomes (Exo) sont des structures bicouches lipidiques sécrétées par diverses cellules, y compris celles des animaux, des plantes et des procaryotes. Des études antérieures ont révélé que les Exo dérivés de l’humorale ou du surnageant cellulaire sont des cibles prometteuses pour de nouveaux biomarqueurs diagnostiques ou pronostiques, soulignant leur rôle significatif dans la pathogenèse de la maladie. Les Exo d’origine tissulaire (Ti-Exo) ont attiré de plus en plus d’attention en raison de leur capacité à refléter avec précision la spécificité des tissus et le microenvironnement. Ti-Exo, présent dans l’espace interstitiel, joue un rôle crucial dans la communication intercellulaire et la signalisation inter-organes. Malgré leur valeur reconnue dans l’élucidation des mécanismes pathologiques, l’isolement de Ti-Exo reste difficile en raison de la complexité des matrices tissulaires et de la variabilité des méthodes d’extraction. Dans cette étude, nous avons développé un protocole pratique pour isoler les exosomes du tissu de la rate de souris, fournissant une technique reproductible pour l’analyse d’identification ultérieure et les études fonctionnelles. Nous avons utilisé la digestion à la collagénase de type I combinée à l’ultracentrifugation différentielle pour isoler l’exo dérivé de la rate. Les caractéristiques de l’Exo isolé ont été déterminées par microscopie électronique, cytomètre en nano-flux et transfert Western. L’Exo isolé dérivé de la rate a montré la morphologie typique des vésicules bicouches lipidiques, avec des tailles de particules allant de 30 nm à 150 nm. De plus, le profil d’expression des marqueurs d’exosomes a confirmé la présence et la pureté des exosomes. Dans l’ensemble, nous avons réussi à établir un protocole pratique pour isoler l’Exo dérivé de la rate chez la souris.

Introduction

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Les exosomes (Exo) sont un sous-groupe de vésicules extracellulaires (VE), d’une taille allant de 30 à 150 nm, encapsulant un large éventail de biomolécules, notamment des protéines, des acides nucléiques et des lipides1. Ces biomolécules sont dérivées des cellules parentales et sont libérées dans l’espace extracellulaire. Exo facilite l’échange d’informations biomoléculaires entre les cellules et leur microenvironnement environnant, jouant un rôle dans les systèmes procaryotes et eucaryotes2. Les caractéristiques des exosomes, telles que le contenu, la taille, les composants membranaires et l’origine cellulaire, sont très variables et influencées par le type de cellule d’origine, l’état cellulaire et les conditions environnementales.

Les exosomes sont généralement classés en trois catégories en fonction de leur source : dérivé de la culture cellulaire, dérivé des fluides corporels et dérivé des tissus (Ti-Exo). Bien que les exosomes dérivés de cultures cellulaires aient été largement étudiés en raison de leur accessibilité et de leur rendement constant, leur utilisation est limitée par des altérations potentielles des caractéristiques cellulaires après une culture prolongée, ce qui peut dénaturer leurs fonctions biologiques 3,4,5. De plus, la plupart des cultures cellulaires sont maintenues dans des environnements bidimensionnels qui n’imitent pas les interactions intercellulaires complexes in vivo, ce qui pourrait avoir un impact sur l’interprétation des données6. À l’inverse, les exosomes isolés à partir de fluides biologiques offrent une option peu invasive pour suivre la progression de la maladie en temps réel7. Cependant, ces échantillons contiennent souvent un mélange d’exosomes d’origines diverses, ce qui complique l’identification précise de leur source primaire8. Compte tenu de ces défis, il y a un intérêt croissant pour Ti-Exo, qui réside dans l’interstitium extracellulaire et sont des médiateurs clés de la signalisation intercellulaire.

La rate joue un rôle crucial dans la fonction immunitaire et le maintien de l’homéostasie interne. Malgré les protocoles existants pour isoler Ti-Exo d’organes tels que le cerveau, le foie et les tumeurs, les méthodes pratiques pour les exosomes dérivés de la rate sont limitées 9,10. Cette étude visait à établir un protocole pratique pour isoler les exosomes du tissu de la rate chez des souris modifiées à partir d’un rapport précédent11. Nous détaillons une méthode impliquant une digestion par collagénase suivie d’une ultracentrifugation, qui minimise la perturbation de la membrane cellulaire et garantit une pureté et un rendement élevés d’Exo dérivé de la rate. Les caractéristiques de l’Exo isolé à l’aide de ce protocole établi ont été validées par microscopie électronique (MET), cytomètre en nano-flux (Nano-FCM) et transfert Western, confirmant l’efficacité du protocole pour d’autres recherches expérimentales.

Protocole

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Les échantillons ont été obtenus à partir de souris, avec l’approbation éthique accordée par le Comité d’éthique de l’Université de médecine du Guangdong. Des descriptions détaillées des matériaux, de l’équipement et des logiciels utilisés dans ce protocole sont fournies dans la Table des matériaux. Les détails de la préparation avant l’extraction sont illustrés à la figure 1, tandis que le processus d’extraction et d’enrichissement de Spleen-Exo est décrit à la figure 2.

1. Préparation

  1. Pré-refroidissez les centrifugeuses à grande vitesse et à ultra-haute vitesse à 4 °C et réglez la température d’un agitateur de bureau à 37 °C.
  2. Préparez des boîtes de culture cellulaire (figure-protocol-1100 mm), des tubes à centrifuger stériles de 50 ml, de la glace et une passoire à cellules stériles (figure-protocol-270 μm) comme illustré aux figures 1A et B.
  3. Stérilisez les ciseaux et les pinces à l’aide d’un spray d’alcool à 75 %, suivi d’une stérilisation à haute température. Ces outils sont illustrés à la figure 1C.
  4. Placez le tissu de la rate dans une boîte de Pétri stérile figure-protocol-3de 100 mm sur de la glace et lavez le sang de surface avec 1 solution saline stérile glacée tamponnée au phosphate (PBS). Séchez les tissus de la rate avec de la gaze stérile et pesez-les après séchage.
    REMARQUE : Si le tissu est congelé, décongelez-le dans un plat pendant 15 minutes sur de la glace avant de continuer.
  5. Hydratez la crépine cellulaire (figure-protocol-470 μm) en déposant 1 mL de PBS stérile dans la passoire à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
  6. Préparez le tampon digestif (0,1 % de collagénase de type I) à l’aide de 1x PBS avec un mélangeur vortex.
    REMARQUE : Utiliser 10 ml de tampon digestif pour 100 mg de tissu de la rate. La concentration de collagénase a été choisie dans cette étude sur la base des instructions du produit. Pour d’autres types de tissus, les chercheurs peuvent avoir besoin d’ajuster ces paramètres en fonction de la densité et de la composition des tissus. Des expériences préliminaires avec des concentrations et des temps de digestion variables sont recommandées pour déterminer les conditions optimales pour chaque type de tissu.

2. Digestion des tissus

  1. Coupez le tissu en petits morceaux uniformes à l’aide de ciseaux dans une boîte de culture sur de la glace (figure 3A) et transférez-le dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
  2. Ajouter le tampon de digestion dans le tube en fonction du poids du tissu de la rate comme indiqué ci-dessus (figure 3B), puis agiter le tube avec un angle de 45° sur un agitateur horizontal à 37 °C. Surveillez la progression de la digestion et arrêtez la digestion lorsque les morceaux de tissu se sont dispersés et que la plupart ont perdu leur forme. Le temps de digestion doit varier entre les tissus. Dans les conditions expérimentales de cette étude, le temps de digestion est d’environ 30 min.
  3. Transférez le mélange digéré dans une passoire cellulaire (Ф70 μm) à température ambiante (RT) pour éliminer les débris tissulaires fibreux et plus gros.
    REMARQUE : Terminer la filtration immédiatement après la digestion.
  4. Recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger neuf de 50 ml.

3. Isolement des exosomes par centrifugation différentielle

  1. Filtrats de centrifugation à 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Une pastille contenant des cellules résiduelles, des débris cellulaires et des noyaux peut être observée après centrifugation, comme le montre la figure 3C.
  2. Transvasez le surnageant dans un nouveau tube et centrifugez-le à 3000 x g pendant 20 min à 4 °C. Une pastille contenant des corps apoptotiques et des microsomes peut être observée après centrifugation, comme le montre la figure 3D.
  3. Transvasez le surnageant dans un tube neuf et centrifugez-le à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Des pastilles contenant des microvésicules et une membrane plasmique peuvent être observées après centrifugation, comme le montre la figure 3E.
  4. Ultracentrifuger le surnageant résultant à 120 000 x g pendant 2 h à 4 °C. Une pastille peut être vue au fond du tube après centrifugation, comme le montre la figure 3F.
  5. Jetez le surnageant, lavez la pastille avec du PBS et ultracentrifugez-la à nouveau à 120 000 x g pendant 2 h à 4 °C pour obtenir des exosomes. Une pastille peut être vue au fond du tube après centrifugation, comme le montre la figure 3G.
  6. Dissoudre les exosomes isolés avec du PBS stérile (200 μL par rate) et stocker les exosomes isolés dans un tube à centrifuger neuf de 2 mL à -80 °C.

4. Caractérisation des exosomes par microscopie électronique à transmission (MET)

REMARQUE : La MET a été utilisée pour déterminer si l’Exo extrait présentait des caractéristiques vésiculaires. Les échantillons Exo identifiés par microscopie électronique doivent être des échantillons frais ou stockés brièvement à 4 °C pendant une courte période.

  1. Fixer les exosomes (2-6 μg/μL) avec du paraformaldéhyde de qualité microscopie électronique (EM) à 2 % à RT pendant 2 h.
  2. Déposer 10 μL de solution d’exosomes sur un treillis de cuivre, incuber à RT pendant 10 min, rincer à l’eau distillée stérile et éponger l’excès de liquide avec du papier absorbant.
  3. Teignez le treillis de cuivre avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 1 min, épongez l’excès de liquide avec du papier filtre et séchez-le sous une lampe à incandescence pendant 2 min.
  4. Observez l’échantillon préparé au microscope électronique à transmission à 80 kV.

5. Mesure de la distribution granulométrique et de la concentration en particules des exosomes

  1. Chargez les nanoparticules de polystyrène standard (250 nm) sur le cytomètre en nanoflux.
  2. Mesurez la concentration en protéines des échantillons d’Exo à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA. Diluez l’échantillon Exo avec du PBS selon les résultats du dosage des protéines BCA (diluez les exosomes à 1-10 ng/μL), puis chargez les échantillons Exo dans le nano-flux pour mesurer l’intensité de la diffusion latérale (SSI).
  3. Calculer la concentration d’Exo en fonction du rapport entre le SSI et la concentration de particules dans les nanoparticules de polystyrène standard.
    REMARQUE : Pour la mesure de la taille, une courbe standard est générée en chargeant des nanoparticules de silice standard avec des tailles de gradient (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) dans le nanocytomètre en flux. Le chargement de l’échantillon Exo s’ensuit ainsi. La distribution granulométrique d’Exo a été calculée selon la polymérisation standard.

6. Confirmation par lyse et immunoblot des protéines d’exosomes

  1. Ajouter 100 μL de tampon de lyse par dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA) à la pastille d’exosome pour l’analyse des protéines.
  2. Vortex vigoureusement, couvrir de parafilm, basculer pendant 20 min à RT, puis vortex à nouveau.
  3. Centrifuger brièvement à 1000 x g pendant 30 à 60 s pour recueillir l’échantillon, le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL et le stocker à -20 °C à -80 °C jusqu’à l’analyse.
  4. Pour l’immunoblot, mélanger les échantillons avec un tampon de charge 5x pour obtenir une concentration de 1x et se préparer à l’électrophorèse sur gel.
  5. Si l’on souhaite des contrôles d’homogénat de tissu entier, utilisez un tampon de lyse puissant avec un inhibiteur de protéase pour lyser le tissu, comme indiqué ci-dessus. Ensuite, centrifugez les échantillons à 10 000 x g pendant 10 min et jetez la matrice extracellulaire restante, les cellules entières ou les débris cellulaires intacts.
  6. Faire bouillir le tampon d’échantillon contenant des exosomes ou l’homogénat de tissu à 95 °C pendant 5 à 10 min. Chargez une quantité égale de protéines par voie dans un gel SDS-PAGE à 10 %. Charge égale de protéine de l’homogénat de tissu comme témoin.
  7. Procéder à l’électrophorèse sur gel sous une tension de 80 V pendant environ 2 h à l’aide du tampon d’électrophorèse classique. Effectuer une analyse par transfert Western pour confirmer l’expression de la protéine Exo dans les lysats purifiés et comparer l’abondance relative d’Exo en fractions.

Résultats

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Isolement et purification d’exosomes dérivés de la rate
Pour isoler les exosomes du tissu de la rate de souris, nous avons utilisé une combinaison de digestion de la collagénase et d’ultracentrifugation différentielle (Figure 2). Les premières étapes consistaient à prétraiter le tissu de la rate pour éliminer le sang de surface, suivi d’une digestion avec de la collagénase de type I. Ce traitement enzymatique a facilité la dégradation des composants de la matrice extracellulaire, libérant ainsi les exosomes tout en préservant leur intégrité. Après la digestion, une série d’étapes de centrifugation a été utilisée pour éliminer séquentiellement les débris cellulaires, les corps apoptotiques et les vésicules plus grandes, aboutissant à l’ultracentrifugation du surnageant à 120 000 x g pour granuler les exosomes. Les procédures d’isolement ultérieures ont permis d’obtenir des pastilles solubles dans le PBS enrichies en Exo dérivé de la rate, comme le montre la figure 3G.

Résultats de la GDT
La morphologie des exosomes isolés a été examinée à l’aide de la microscopie électronique à transmission, une méthode de référence pour étudier la caractérisation des exosomes. La MET est couramment utilisée pour valider la présence d’exosomes, évaluer la qualité des exosomes et observer la morphologie des exosomes. Les images TEM (Figure 4A) ont révélé la présence de vésicules en forme de coupe, caractéristiques des exosomes. Ces vésicules présentaient une structure bicouche lipidique claire, confirmant l’isolement réussi des exosomes du tissu de la rate.

Distribution granulométrique de Spleen-Exo
La distribution de taille et la concentration des exosomes ont été déterminées à l’aide d’un cytomètre en nano-flux. Les résultats (figure 4B) ont indiqué que le diamètre des exosomes isolés variait de 30 à 150 nm, avec une concentration maximale à environ 60 nm. Le diamètre des particules isolées était principalement de 50 à 80 nm, avec une concentration moyenne de particules de 4,6 x 109 particules/mL. Cette gamme de tailles est cohérente avec les caractéristiques des exosomes précédemment rapportées, ce qui valide davantage le protocole d’isolement.

Analyse par transfert Western
Pour confirmer la présence de marqueurs exosomaux, nous avons effectué une analyse par western blot. Les marqueurs exosomaux TSG101 et CD9 ont été détectés dans les échantillons de Spleen-Exo, tandis que GM130, une protéine de la matrice de Golgi utilisée comme contrôle négatif, n’a pas été détectée (Figure 4C). En comparaison, la protéine de ces marqueurs était exprimée dans les tissus de la rate de souris (Spleen-T). Cela indique la grande pureté des exosomes isolés, car ils étaient dépourvus de contaminants cellulaires.

figure-results-1
Figure 1 : Préparation de l’approvisionnement. (A) Des tubes à centrifuger de 50 ml, des boîtes de culture, de la glace et des outils chirurgicaux ont été placés dans une enceinte de biosécurité. (B) Une crépine à cellules stériles (figure-results-270 μm). (C) Outils chirurgicaux stérilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 2 : Procédure d’isolement de Spleen-Exo. Préparez le tissu de la rate et coupez-le en petits morceaux dans du PBS glacé, suivi d’une digestion avec de la collagénase de type I et d’une centrifugation comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 3 : Images représentatives de l’isolement de Spleen-Exo. (A) Petits blocs de rate prêts pour la digestion ultérieure. (B) Blocs de tissu de la rate avec tampon de digestion. (C) Granulés après centrifugation de 500 x g. (D) Granulés après centrifugation de 3 000 x g. (E) Granulés après centrifugation de 10 000 x g. (F) Granulés après centrifugation de 120 000 x g. (G) Pastilles d’exosomes après centrifugation de 120 000 x g. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 4 : Identification de la rate-Exo. (A) Résultats de la MET montrant des particules isolées sous forme de vésicules membraneuses rondes ou ovales avec une morphologie en forme de coupe. Barre d’échelle = 200 nm et 50 nm, respectivement. (B) L’analyse de la distribution granulométrique par Flow Nano Analyzer a montré que le diamètre de Spleen-Exo variait principalement de 50 nm à 80 nm, avec une concentration moyenne de particules de 4,6 × 109 particules/mL. (C) Analyse par transfert Western montrant l’expression de protéines marqueurs spécifiques de l’exosome (TSG101 et CD9) dans Spleen-Exo, avec une expression négative de GM130. Ces marqueurs étaient détectables dans des échantillons de protéines extraits de rates de souris (groupe Spleen-T). Les images représentatives du western blot ont été montrées (n = 6 tissus). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Des recherches récentes ont révélé que les exosomes dérivés de la rate (Spleen-Exo) jouent un rôle essentiel dans le traitement du cancer gastrique12. Pour élucider davantage les fonctions de Spleen-Exo, il est nécessaire d’établir une méthode reproductible et optimale pour leur extraction du tissu de la rate. Bien qu’il existe des protocoles pour isoler les exosomes du cancer du cerveau et du foie13,14, les méthodes pour d’autres tissus restent sous-développées et nécessitent une validation supplémentaire. Dans cette étude, nous avons décrit une méthode pratique pour isoler Exo du tissu de la rate.

Au cours des dernières années, diverses méthodes ont été utilisées pour extraire l’Exo dans la recherche et les applications scientifiques, notamment l’ultracentrifugation, la centrifugation par gradient de densité, l’immunoadsorption par billes magnétiques, l’ultrafiltration et la précipitation de polymères15. L’ultracentrifugation reste la méthode de référence pour extraire Exo de diverses sources. Des études antérieures se sont concentrées sur la perturbation des structures tissulaires pour obtenir des concentrations plus élevées d’Exo, qui se compose de sources intracellulaires et extracellulaires d’Exo16. La collagénase minimise l’impact sur l’intégrité de la membrane cellulaire, assurant la pureté de Ti-Exo3. La collagénase a été utilisée pour extraire les vésicules extracellulaires des tissus métastatiques humains du mélanome, du tissu adipeux, du cancer du côlon et du cancer du foie 5,10,13,17. Cependant, la concentration et le temps de digestion de la collagénase varient entre les différents tissus.

Nous avons établi un protocole spécifique pour isoler Spleen-Exo en utilisant la collagénase de type I pour la digestion, suivie d’une filtration par ultracentrifugation différentielle, afin d’obtenir une Spleen-Exo de haute qualité. L’ultracentrifugation peut éliminer efficacement les cellules résiduelles, les grandes vésicules, les débris cellulaires et les corps apoptotiques des échantillons16. Crescitelli et al. ont utilisé la collagénase D et l’ultracentrifugation en gradient pour isoler de petites vésicules extracellulaires d’une taille moyenne de 75 nm de diamètre5. Par rapport à leur protocole, notre protocole a utilisé de la collagénase de type I et une étape supplémentaire d’ultracentrifugation à 120 000 x g pour obtenir une pureté optimale des exosomes. Contrairement aux rapports précédents utilisant l’homogénéisation tissulaire pour obtenir une suspension tissulaire14,18, notre approche préserve l’intégrité membranaire des cellules dans les tissus. De plus, Vella et al. ont appliqué la centrifugation à gradient de densité (un triple gradient de saccharose) pour générer trois groupes de particules, ce qui a nécessité plus de temps pour l’opération10. Cette approche a produit de grandes vésicules d’une taille supérieure à 200 nm, une population hétérogène de vésicules d’une taille allant de 50 nm à 200 nm et de petites vésicules d’une taille d’environ 20 nm. Le protocole décrit dans ce protocole d’étude implique une série d’étapes d’ultracentrifugation pour éliminer méthodiquement les cellules résiduelles, les débris cellulaires, les corps apoptotiques et les vésicules plus grandes, améliorant ainsi la pureté de l’Exo obtenu. Nous mettons l’accent sur une manipulation soigneuse lors de la collecte des surnageants afin d’éviter de perturber les granulés sédimentés.

Nous évaluons la morphologie et la pureté de la Spleen-Exo isolée par l’analyse TEM et l’analyse de suivi des nanoparticules. Les deux tests ont révélé que les particules dérivées de la rate isolées par ce protocole présentaient une bicouche lipidique et des vésicules en forme de coupe avec des tailles allant de 30 nm à 150 nm, qui sont les caractéristiques typiques des exosomes19. CD9 et TSG101 sont des marqueurs d’exosomes19, et GM130, une protéine de Golgi, est utilisée comme marqueur négatif pour l’identification des exosomes20. Les résultats ont montré que Spleen-Exo était positif pour CD9 et TSG101, tandis que GM130 n’a pas été détecté, confirmant l’isolement réussi d’Exo de haute qualité, dérivé de tissus, de la rate.

Pour obtenir un Ti-Exo de haute qualité, il est essentiel de sélectionner le type d’enzyme, la concentration et la durée de digestion appropriés, ainsi qu’un stockage approprié des tissus. Nous n’avons observé aucune différence significative dans les concentrations en protéines entre Exo dérivé de tissus de rate frais et congelés (données non présentées), ce qui indique la faisabilité de traiter de grandes quantités de tissus congelés pour réduire le flux de travail. L’isolement de Ti-Exo nécessite une longue durée de fonctionnement pour l’ultracentrifugeuse, ce qui rend impossible la réalisation de l’ensemble du protocole dans un délai approprié lors de l’utilisation de tissus frais dans des applications cliniques. Ainsi, l’utilisation de tissus congelés pour l’isolement des exosomes serait une meilleure option. La décongélation à 37 °C ne convient pas aux tissus congelés en raison de la pénétration incomplète des agents cryoprotecteurs dans les tissus. Il a été rapporté que lors de l’isolement d’exosomes à l’aide de tissus congelés dégelés sur de la glace, le rendement en exosomes ne montrait aucune signification en termes de contenu par rapport aux tissus frais21. Ainsi, nous avons décongelé les tissus de la rate congelés sur de la glace pour effectuer l’isolement des exosomes lors de l’utilisation des échantillons de stockage à -80 °C.

Cependant, le protocole décrit dans cette étude présente plusieurs limites. Les longues étapes de l’extraction et de l’identification prennent beaucoup de temps. Étant donné l’objectif ultime d’appliquer la recherche d’Exo au traitement clinique des maladies, des méthodes plus rapides et plus rentables deviennent de plus en plus essentielles. De plus, bien que les résultats soient basés sur des échantillons de tissus de souris, l’applicabilité aux tissus humains reste à déterminer.

En conclusion, le protocole fournit une méthode d’extraction d’Exo hautement pur du tissu de la rate, adaptée à une analyse détaillée en aval. L’Exo dérivé des tissus reflète plus précisément le microenvironnement de leur origine et présente un potentiel important pour élucider les processus physiologiques et pathologiques des organismes vivants. Des études futures pourraient adapter ce protocole aux tissus humains, permettant l’extraction d’exosomes cliniquement pertinents à des fins diagnostiques et thérapeutiques. Cette technique pourrait être particulièrement utile pour étudier le rôle des exosomes dans les réponses immunitaires, compte tenu de la fonction critique de la rate dans le système immunitaire. De plus, le protocole pourrait être modifié pour isoler les exosomes d’autres tissus, ce qui pourrait contribuer au développement de biomarqueurs spécifiques aux tissus et de thérapies ciblées. En améliorant notre compréhension de la biologie des exosomes, ce protocole peut contribuer aux progrès de la médecine de précision et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82370281, 81870222), la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (2022A1515012103), et le projet d’allocation compétitive du Fonds spécial pour la science, le développement technologique de la ville de Zhanjiang (2021A05086), et la Fondation des startups du deuxième hôpital affilié de l’Université médicale du Guangdong (23H03).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
70 et micro ; m Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anticorps anti CD9Cell Signaling Technology, Inc (CST), États-Unis983275
Anticorps anti GM130Proteintech Group, Inc.China  ;66662-1-lg
Anticorps anti TSG101Abcam Plc, Royaume-Uni125011
Plat de culture cellulaireWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Chine704001
Tube à centrifugerWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Chine788211
Collagénase Type ISigma-Aldrich Corp., USAC2674
Agitateurthermostatique de bureauShanghai bluepard instruments Co., Ltd., ChineTHZ-100
Tampon d’électrophorèseWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Chine  ;G2081-1L
Kit amélioré de dosage des protéines BCAShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine  ;P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., ChineN30E
Système d’imagerie par fluorescence/chimiluminescence  ;Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ChineGelView 6000Plus
HRP Chèvre anti-IgG deProteintech Group, Inc.Chine  ;15014
HRP Chèvre anti-Lapin IgGProteintech Group, Inc.Chine  ;15015
lecteur de microplaquesMolecular Devices, USACMax Plus
MicroscissorsShanghai  ; Médical  ; Instruments (groupe)  ;Co., Ltd.,ChineWA1010
Pince à épiler microscopiqueShanghai  ; Médical  ; Instruments (groupe)  ;Co., Ltd.,ChineWA3010
Centrifugeuse Multifuge X1R ProThermo Fisher Scientific, USA75009750
Ciseaux ophtalmiquesShanghai  ; Médical  ; Instruments (groupe)  ;Co., Ltd.,ChinaY00030
Pince à épiler ophtalmiqueShanghai  ; Médical  ; Instruments (Groupe)  ;Co., Ltd., Chine  ;JD1060
Optima XPN-100 Centrifugeuse d’ultrafiltrationBeckman Coulter, USAA94469
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., ChineP1003
Tampon de lyse RIPA (fort, sans inhibiteurs)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine  ;P0013K
RègleDeli  ; Fabrication  ; Société, Chine
Tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine  ;P0015
Pipette de transfertBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Microscope électronique à transmissionHitachi, JaponH-7650
Tube d’ultracentrifugationBeckman Coulter, États-Unis355618
Western Transfer Buffer  ;Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Chine  ;Référence G2028-1L
souris

Références

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