Article de méthode

Élucider les altérations protéomiques spécifiques aux tissus et au plasma dans la santé et la maladie

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DOI :

10.3791/67240

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23 septembre 2025

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1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La protéomique est une évaluation à haut débit des interactions, de la fonction, de la composition et des structures des protéines et de leurs activités cellulaires. Ici, nous présentons un protocole pour évaluer les changements protéomiques totaux dans divers échantillons biologiques, y compris le plasma et les tissus. La méthodologie décrite dans le présent document s’applique à tous les échantillons biologiques contenant des protéines.

Résumé

La protéomique est l’étude à grande échelle des protéines exprimées, en se concentrant sur leur structure, leur fonction, leurs interactions, leur abondance et les modifications post-traductionnelles au sein d’un système biologique. Par exemple, la phosphoprotéomique, un sous-ensemble essentiel de la protéomique totale, est l’étude des modèles de phosphorylation et des altérations des protéines. La méthodologie décrite dans le présent document illustre une approche de protéomique totale pour élucider les altérations des profils d’expression protéique globaux, y compris les profils de phosphorylation, dans le plasma, le cerveau, les poumons, la rate et les tissus hépatiques prélevés sur des modèles animaux de recherche (c.-à-d. furets et souris). Cette technique est applicable à d’autres types de tissus, ainsi qu’à presque tous les échantillons biologiques contenant des protéines (par exemple, les cellules cultivées). Après la dissection, les tissus d’intérêt ont été congelés et conservés à -80 °C. Les tissus ont ensuite été homogénéisés à l’aide d’un mortier et d’un pilon avec de l’azote liquide pour préserver l’intégrité des protéines et les changements de phosphorylation. La protéine totale a été extraite des homogénats tissulaires à l’aide d’un tampon de lyse avec une nucléase universelle et des inhibiteurs de protéase/phosphatase. Les protéines extraites des tissus et du plasma équivalent ont été converties en peptides totaux par digestion contrôlée de la protéase à l’aide d’un kit de préparation d’échantillons par spectromètre de masse commercial. Les peptides ont été analysés directement à l’aide de la chromatographie liquide à ultra-haute performance et de la spectrométrie de masse en tandem Orbitrap-tribrid. L’identité des protéines constitutives a été reconstruite à partir des données spectrales de masse peptidique, à l’aide d’un logiciel de bio-informatique protéomique, apparié à une bibliothèque de séquences d’acides aminés spécifique à l’espèce. Par la suite, l’analyse doit inclure des critères de coupure stricts, en particulier en utilisant uniquement des identifications de protéines à haut niveau de confiance. Des différences protéomiques statistiquement significatives (variation de >2 fois ; p < 0,05) peuvent être déterminées entre le groupe témoin et le groupe expérimental.

Introduction

La protéomique, en tant que combinaison de l’expérimentation du protéome et de l’analyse des données, se concentre sur l’identification et la quantification des protéines, en les caractérisant en fonction de leur composition, de leur interaction, de leurs modifications pré-traductionnelles et post-traductionnelles (par exemple, la phosphorylation), de leur localisation subcellulaire et de leur structure dans des conditions physiologiques1. La protéomique d’expression traite des comparaisons quantitatives de protéines qui diffèrent dans des conditions biologiques changeantes2. Il revêt également une grande importance dans le profilage d’une carte des voies, des réseaux et des systèmes moléculaires complexes et interconnectés, qui contrôlent directement les principales fonctions biologiques telles que la prolifération, la différenciation, la sénescence et les mécanismes de mort cellulaire. Avec les progrès substantiels de la technologie expérimentale au cours des dernières années, les méthodes de protéomique sont passées d’approches conventionnelles, y compris l’immunohistochimie et le dosage immuno-enzymatique, à des techniques à haut débit telles que la chromatographie liquide 3,4. Les approches basées sur la protéomique gagnent du terrain dans la détermination de phénotypes et de sous-types de maladies uniques, ainsi que dans l’identification de nouvelles interactions cibles pour les médicaments thérapeutiques (pharmacoprotéomique). Par exemple, la stratification des patients s’est principalement concentrée sur des approches génomiques pour définir des groupes homogènes et guider les schémas thérapeutiques. Cependant, le statut de transcription seul ne permet pas de prédire le devenir des protéines traduites par la suite (par exemple, la stabilité ou la modification) ; Et ainsi, les mécanismes non génomiques contribuent davantage au développement, à la progression, à la gravité et à la résistance aux traitements 5,6,7.

L’un de ces domaines de recherche qui a grandement bénéficié des comparaisons quantitatives de l’expression et de l’activité des protéines est la découverte de biomarqueurs dans le domaine des maladies neurodégénératives et des lésions cérébrales traumatiques (TCC). La découverte de biomarqueurs repose sur l’élaboration de techniques de diagnostic qui facilitent la détection précoce et les cibles potentielles d’intervention. La protéomique quantitative basée sur LC/MS-MS couplée à la bio-informatique a contribué à la découverte de biomarqueurs protéiques clés, notamment la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et l’ubiquitine carboxyl-terminale hydrolase isoenzyme L1 (UCH-L1), avec un impact sévère ou pénétrant TBI 8,9. Par exemple, le personnel militaire est souvent victime d’incidents traumatismes crâniens au cours de ses missions, en raison de l’exposition à des explosions de bombes (c.-à-d. traumatismes crâniens dus à l’explosion). Cependant, la pathobiologie sous-jacente des déficits neurologiques causés par un traumatisme crânien léger induit par une explosion reste incertaine. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires et ultrastructurels des lésions cérébrales induites par les explosions nécessite une meilleure identification de substituts de biomarqueurs spécifiques. Avec l’observation des changements protéomiques, des études ont démontré que des mécanismes possibles du stress oxydatif induit par le souffle dans le cerveau sont associés à un dysfonctionnement mitochondrial, y compris une dynamique de fission-fusion altérée, une diminution de la phosphorylation oxydative et des activités enzymatiques compensées pertinentes pour la respiration10. Les connaissances sur la pathogenèse précoce de la dérégulation induite par l’explosion des modifications post-traductionnelles telles que l’acétylation, la nitrosylation, la désamination et la phosphorylation peuvent également fournir une caractérisation plus approfondie de ses effets sur la fonction protéique impliquée dans les lésions axonales, l’inflammation et la perturbation de la barrière hémato-encéphalique11,12. Avec l’avancement des approches de biologie des systèmes, la cartographie de l’information totale du protéome à partir du cerveau et des tissus périphériques chez différentes espèces animales, y compris les rongeurs et les furets, est devenue une procédure clé dans la recherche sur les lésions dues aux explosions.

Dans cet article, nous nous concentrons sur le flux de travail méthodologique pour évaluer les aspects quantitatifs de la protéomique d’expression et ses modifications post-traductionnelles à partir du tissu ou du plasma, qui a été largement utilisée pour surveiller à la fois les phénomènes physiologiques et les conditions pathologiques. L’utilisation de la méthodologie ci-dessous permet d’assurer l’uniformité et la fiabilité de la préparation des échantillons et de l’acquisition des données. Grâce à cette méthodologie normalisée, des comparaisons peuvent être faites pour déterminer les modèles protéomiques préservés entre les types de tissus et les modèles de phosphorylation uniques à des tissus spécifiques. Parallèlement à cela, l’analyse de plusieurs modèles animaux précliniques et d’échantillons cliniques humains peut être effectuée pour obtenir des modèles de phosphorylation conservés qui pourraient potentiellement servir de biomarqueurs et pour adapter les schémas thérapeutiques médicamenteux.

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Protocole

La recherche a été menée dans le cadre d’un protocole d’utilisation d’animaux approuvé par l’IACUC dans une installation accréditée par AAALAC International, dotée d’une assurance du bien-être animal des services de santé publique et conformément à la loi sur le bien-être des animaux et à d’autres lois et règlements fédéraux relatifs aux animaux de laboratoire. Toutes les fournitures nécessaires à cette procédure sont répertoriées dans la table des matériaux. La procédure est subdivisée en sept composantes.

PRUDENCE. Assurez-vous que les protocoles de sécurité appropriés sont suivis lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide pour homogénéiser les tissus. Le personnel du laboratoire portait des gants de congélation, un tablier de congélation, un masque chirurgical et un écran facial lors de l’homogénéisation des tissus congelés. Cette technique d’homogénéisation peut être utilisée pour tout type de tissu, y compris les substances extrêmement dures comme l’os, simplement en ajustant la taille du mortier et du pilon en conséquence. Voir la figure 1A pour la configuration initiale de l’établi. Reportez-vous à la table des matériaux pour les tailles utilisées lors de l’homogénéisation des tissus de souris et de furet.

1. Broyage cryogénique des tissus avec un mortier et un pilon

  1. Prenez le poids d’un tube de collecte vide et enregistrez-le. Dans le tube de prélèvement, pesez le tissu à l’aide d’une balance analytique et notez le poids dans un cahier de laboratoire. Soustrayez le poids d’un tube vide du tissu plus le poids du tube pour obtenir le mg de tissu utilisé.
    REMARQUE : Les tissus qui ont été évalués pour les études protéomiques comprennent le cerveau, les poumons, le foie et la rate. L’ensemble du tissu a été cryogénisé broyé sous forme de poudre à l’aide d’un mortier et d’un pilon.
  2. Versez de l’azote liquide dans le cryopode, mais assurez-vous qu’il est moins qu’à moitié rempli.
  3. Transférez le tube contenant l’échantillon et le(s) tube(s) de microcentrifugation de 1,5 mL vide(s) préalablement autoclavé(s) sur le support de tube situé dans le cryopode. Cela garantit que l’échantillon reste congelé tout en refroidissant le mortier et le pilon, empêchant ainsi l’échantillon de décongeler lors du transfert du tissu homogénéisé dans le(s) tube(s) de microcentrifugation vide de 1,5 ml.
  4. Versez de l’azote liquide sur le mortier et le pilon pour refroidir ces instruments avant de les utiliser. Le mortier et le pilon se trouvent à l’extérieur du cryopod (Figure 1A,B).
  5. Transférez le tissu dans le mortier refroidi contenant de l’azote liquide (figure 1B).
  6. Exercer une pression répétée sur le tissu congelé à l’aide du pilon et effectuer un mouvement de rotation et de broyage avec le pilon contre le tissu jusqu’à ce que le tissu soit broyé en une poudre fine (figure 1C).
    1. Assurez-vous qu’aucune force excessive n’est appliquée, ce qui risque de faire déborder les échantillons du mortier. Assurez-vous d’avoir un contrôle ferme sur le pilon.
    2. Ajoutez de l’azote liquide supplémentaire au mortier tout en homogénéisant les gros tissus pour réduire le risque de décongélation de l’échantillon pendant le broyage.
    3. Pendant le broyage du tissu, assurez-vous qu’il ne dégèle pas. S’il est en train de décongeler, placez de l’azote liquide supplémentaire dans le mortier.
  7. Trempez les extrémités des spatules métalliques dans l’azote liquide pour les refroidir. Cela permet de transférer facilement le tissu homogénéisé dans le tube de 1,5 ml. Cela empêche le tissu de dégeler et de coller à la spatule pendant le transfert.
  8. Une fois que le tissu est homogénéisé en une poudre fine et que les spatules métalliques sont refroidies, transférez soigneusement la poudre de tissu homogénéisée dans les nouveaux tubes de 1,5 ml.
    1. Divisez l’échantillon en aliquotes en fonction du nombre de tests à effectuer.
      REMARQUE : Par exemple, quatre tests devaient être effectués pour les échantillons de cette étude, de sorte que le tissu homogénéisé a été aliquote également dans quatre tubes de 1,5 mL.
    2. Conservez tout tissu homogénéisé supplémentaire dans un tube de prélèvement autoclavé de 5 ml.
  9. Conservez les tissus aliquotes dans un congélateur à -80 °C jusqu’à une analyse ultérieure, avec une utilisation réaliste dans un délai de 1 an pour minimiser l’air ainsi que l’oxydation légère des protéines.
  10. Pesez le tube de collecte vide.
  11. Soustrayez le poids du tube de prélèvement vide de la mesure initiale (tube de prélèvement plus échantillon) pour obtenir le poids de l’échantillon de tissu.

2. Lyse tissulaire pour l’isolement des protéines

  1. Versez de la glace sèche dans un récipient à glaçons.
  2. Placez une grille tubulaire dans la glace carbonique et laissez-la refroidir.
  3. Retirer les échantillons de tissus homogénéisés du congélateur à -80 °C et les placer dans la grille tubulaire réfrigérée. Cela empêche les échantillons de décongeler, ce qui pourrait entraîner une dégradation des protéines et/ou des modifications de la phosphorylation pendant le processus de pesée.
    1. Assurez-vous que les tubes de 1,5 mL contenant l’échantillon restent congelés sur le support de tubes dans de la glace sèche.
  4. Placez un nouveau tube canonique de 50 mL dans la glace sèche.
  5. Retirez le capuchon du tube canonique de 50 ml et placez des spatules en plastique jetables dans le tube canonique de 50 ml pour les garder au frais. Cela permet d’éviter que l’échantillon ne colle aux spatules lors de leur transfert vers les tubes d’homogénéisation.
  6. Pour la lyse tissulaire et l’isolement des protéines, utilisez des tubes de 2 mL contenant cinq billes de céramique de 2,8 mm (appelés tubes d’homogénéisation dans ce protocole).
  7. Étiquetez le capuchon et le côté du tube d’homogénéisation avec l’ID de l’échantillon à l’aide d’un marqueur à encre permanente.
  8. Placez les tubes d’homogénéisation étiquetés dans le support de tubes situé dans la glace sèche pour garder les tubes froids et empêcher la décongélation des échantillons.
  9. Placez un tube d’homogénéisation sur une balance analytique et tarez la balance.
  10. Remettez le tube d’homogénéisation dans le support de tubes sur de la glace sèche.
  11. Retirez le couvercle du tube d’homogénéisation contenant les billes et, à l’aide de l’une des spatules en plastique refroidies, transférez 5 mg à 10 mg d’échantillon de tissu en poudre dans le tube d’homogénéisation respectif.
  12. Remettez le couvercle sur le tube d’homogénéisation.
  13. Pesez le tube d’homogénéisation sur la balance d’analyse et notez la quantité d’échantillon dans le tube d’homogénéisation.
    1. Utilisez ce poids pour déterminer la quantité de tampon de lyse nécessaire pour une extraction efficace des protéines totales.
  14. Une fois le poids enregistré, replacez le tube d’homogénéisation contenant l’échantillon dans le support de tubes sur de la glace carbonique pour le garder froid.
  15. Jetez la spatule en plastique usagée.
  16. Utilisez une spatule en plastique neuve et propre pour chaque échantillon à transférer et pesé afin d’éviter la contamination croisée. Répétez les étapes 2.9 à 2.15 pour tous les échantillons.
  17. Après avoir transféré tous les échantillons dans des tubes d’homogénéisation individuels, calculez la quantité de Protein Lysis Master Mix nécessaire.
    1. Préparez le volume requis de Protein Lysis Master Mix, qui est calculé en fonction du nombre d’échantillons à traiter et du poids de chaque échantillon en poudre. Ajouter 100 μL de Protein Lysis Master Mix pour 5 mg de tissu dans chaque tube.
    2. Reportez-vous aux directives de l’entreprise pour les volumes de réactifs pour fabriquer le mélange maître de lyse des protéines (reportez-vous à la table des matériaux).
  18. Placez les tubes d’homogénéisation contenant les échantillons homogénéisés et pulvérisés dans un bloc froid à 4 °C. Les tubes d’homogénéisation ne peuvent plus rester sur de la glace carbonique. La pose des tubes d’homogénéisation sur le bloc froid empêche la solution de lyse de geler.
  19. Retirez le couvercle des tubes d’homogénéisation et transférez la quantité calculée de Protein Lysis Master Mix nécessaire dans le tube d’homogénéisation respectif à l’aide de la pipette de capacité appropriée.
    1. Remettez le couvercle sur les tubes d’homogénéisation et tournez les couvercles jusqu’à ce qu’ils soient bien en place.
  20. Placez les tubes d’échantillon dans l’homogénéisateur et réglez-le sur un programme de tissus mous (vitesse 4500 tr/min, 2 x 30 s par cycle, pause de 30 s) à 4 °C pour l’homogénéisation.
  21. Une fois le cycle d’homogénéisation terminé, retirez les tubes de l’instrument et remettez-les dans le bloc froid à 4 °C.
    1. Inspectez visuellement les tubes d’échantillon. Assurez-vous qu’aucun échantillon en poudre n’est encore visible. Si l’échantillon est toujours visualisé tout au long du Master Mix de lyse des protéines, terminez à nouveau la lyse tissulaire sur l’instrument.
    2. Optimisez les paramètres pour le type de tissu utilisé. Par exemple, les tissus en poudre dérivés d’organes fibreux (par exemple, le cœur) peuvent nécessiter des cycles supplémentaires ou un régime plus élevé.
  22. Transférez les tubes d’homogénéisation dans une centrifugeuse. Entrez les paramètres suivants sur la centrifugeuse : 16 000 g pendant 10 min à 4 °C, puis appuyez sur Start sur la centrifugeuse.
  23. Une fois la centrifugation terminée, transférez soigneusement les tubes d’homogénéisation dans le bloc froid à 4 °C.
  24. Étiquetez les nouveaux tubes de 1,5 mL sur le couvercle et le côté avec le numéro d’identification de l’échantillon et toute autre information pertinente. Une fois étiquetés, placez ces tubes de 1,5 ml dans un bloc froid à 4 °C.
    REMARQUE : Les tubes ont été étiquetés avec au moins les éléments suivants : identification de l’animal, point temporel de l’étude, type d’animal et type de tissu.
  25. Transférez le lysat de protéines correspondant des tubes d’homogénéisation dans les tubes de 1,5 mL marqués respectifs, conservés sur un bloc froid à 4 °C.
  26. Conservez les échantillons à -80 °C pour une analyse plus approfondie. C’est un point d’arrêt sûr.

3. Quantification des protéines totales

  1. Sortez les échantillons du congélateur à -80 °C et décongelez-les sur de la glace humide dans un seau à glace.
  2. Une fois décongelés, vortex tous les échantillons et étalons du kit de quantification des protéines pendant au moins 3 s.
  3. Ajouter 10 μL de chaque répétition d’étalon, d’échantillons et de blancs appropriés dans une plaque de microtitration à 96 puits selon la disposition schématique (figure 2A).
    REMARQUE : Pour chaque échantillon de tissu, une dilution de 1:100 du lysat de protéine dans une solution saline tamponnée au phosphate de préférence est utilisée dans l’analyse du dosage des protéines. La disposition schématique peut être modifiée en fonction du nombre d’échantillons utilisés dans le dosage des protéines. Les échantillons, les étalons et les blancs appropriés sont chargés en trois exemplaires dans une plaque de microtitration de 96 puits pour évaluer la précision de la concentration en protéines, mais si de nombreux échantillons doivent tenir sur une plaque, des doublons sont acceptables.
    1. Pour les échantillons contenant une faible quantité de tissu de départ (c.-à-d. moins de 5 mg), n’utilisez qu’une seule répétition ou des duplicatas pour l’essai protéique afin de maximiser la quantité de lysat de protéine disponible pour la digestion ultérieure des protéines.
    2. Assurez-vous que le pipetage est précis et que des pipettes calibrées sont utilisées.
  4. Retournez plusieurs fois la bouteille de réactif de dosage des protéines pour bien mélanger, puis versez-la dans un réservoir de réactif de 10 ml.
  5. À l’aide d’une pipette multicanaux d’une capacité maximale de 200 μL, ajoutez 150 μL du réactif d’analyse des protéines dans la colonne 1.
  6. Pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger le réactif de dosage des protéines avec les 10 μL de contenu déjà dans le puits afin d’aider à réduire le précipité dans les puits.
  7. Jetez les pointes de la pipette et placez-en de nouvelles sur la pipette multicanaux d’une capacité maximale de 200 μL.
  8. Répétez les étapes 3.5 à 3.7 jusqu’à ce que le réactif de dosage des protéines soit ajouté à l’ensemble de la plaque à 96 puits.
    1. Utilisez des pointes de pipette neuves pour chaque colonne de puits afin d’éviter la contamination croisée.
    2. S’assurer qu’au moins un puits est laissé vide sans réactif ni échantillon ajouté à utiliser comme valeur d’absorbance à blanc pour la quantification des protéines.
  9. Une fois que le réactif de dosage des protéines a été ajouté à tous les puits nécessaires, couvrez la plaque de 96 puits avec un joint de plaque en papier d’aluminium.
  10. Vortex la plaque de 96 puits sur un instrument vortex pendant 1 min à vitesse moyenne, puis incubez-la à température ambiante (RT) pendant 5 min avant de lire la plaque.
  11. Inspectez la plaque à 96 puits et le joint d’aluminium en aluminium. Si le réactif reste collé au joint de la feuille d’aluminium, placez-le avec une balance appropriée à l’intérieur d’une centrifugeuse.
    1. Appuyez et maintenez l’essorage rapide jusqu’à ce qu’il atteigne environ 200 g.
    2. Retirez la plaque à 96 puits et inspectez visuellement le joint de la feuille d’aluminium pour vous assurer qu’aucun liquide ne reste sur la feuille.
  12. Retirez lentement le joint d’étanchéité en aluminium et remettez le couvercle transparent sur la plaque à 96 puits (Figure 2B).
  13. Lire la plaque à 96 puits sur un spectrophotomètre à 660 nm, après avoir laissé la réaction colorimétrique se développer pendant 5 min.
    REMARQUE : Les lectures d’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre UV/Visible sont mesurées à température ambiante. Le dosage des protéines à 660 nm est basé sur la liaison d’un complexe colorant-métal exclusif à la protéine dans des conditions acides qui provoque un décalage du maximum d’absorption du colorant, qui est mesuré à 660 nm.
  14. Utilisez les lectures d’absorbance des étalons connus pour créer la courbe standard à l’aide d’un logiciel graphique (figure 2C-E), qui est ensuite utilisé pour calculer les concentrations en protéines de tous les échantillons.

4. Digestion des protéines

PRUDENCE. Assurez-vous que les protocoles de sécurité appropriés sont suivis lorsque vous travaillez avec les produits chimiques dangereux utilisés dans le protocole ci-dessous. Le personnel du laboratoire portait un équipement de protection individuelle (EPI) et a effectué ces étapes dans une hotte chimique. Passez en revue toutes les fiches de données de sécurité avant de travailler avec ces produits chimiques.

  1. Étiquetez un nouvel ensemble de tubes de microcentrifugation de 1,5 mL avec les ID de l’échantillon sur le couvercle et le côté des tubes à l’encre permanente. Incluez toute autre information pertinente.
    1. Sur la base de l’équation de la courbe standard, des lectures d’absorbance de l’échantillon et du facteur de dilution, calculez la concentration en protéines de chaque échantillon en microgrammes par microlitre (μg/μL). Utilisez cette valeur pour calculer le volume requis de lysat d’échantillon contenant 100 μg de protéines (figure 2C-E). Transférez ce volume calculé de lysat d’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
  2. Compléter le volume final à 100 μL avec le tampon de lyse ; Il s’agit du volume de départ nécessaire pour le protocole de digestion.
    REMARQUE : Le volume final de l’échantillon de protéines et du tampon de lyse doit être égal à 100 μL.
  3. Selon la littérature publiée précédemment, utilisez 1,5 μL de plasma pour la digestion, ce qui équivaut à peu près à 100 μg de protéines.
  4. Ajouter 50 μL de solution de réduction (10 mM de dithiothréitol) dans chaque tube de microcentrifugation de 1,5 mL, fermer les sommets et agiter brièvement pendant 3 s. Ajouter ensuite 50 μL de solution d’alkylation (30 mM d’iodoacétamide dans chaque échantillon, fermer les sommets et agiter pendant 3 s.
  5. Incuber les échantillons à 95 °C à l’aide d’un bloc de chaleur pendant 11 min pour réduire et alkyler, respectivement, l’échantillon de protéines. Cela clive tous les ponts disulfures et les recouvre d’un groupe acétamide, empêchant ainsi leur reformation, et dénature ainsi la protéine dans un état complètement déplié et maximise l’exposition des sites de digestion peptidique.
  6. Après l’incubation, retirez les échantillons du bloc chauffant et laissez-les refroidir en RT.
  7. En attendant que les échantillons refroidissent, reconstituer le mélange de trypsine et de protéase Lys-C lyophilisé (rapport 1:1, 50 μg chacun) avec la solution de reconstitution enzymatique en ajoutant 515 μL de liquide à 1 flacon de réactif solide, c’est-à-dire 0,1 μg/μL chacun. Évitez tout contact direct de la peau avec la solution de protéase et toutes les étapes suivantes, car la trypsine peut être un irritant et un allergène grave.
  8. Une fois les échantillons refroidis à RT, ajoutez 50 μL de mélange de trypsine / protéase Lys-C reconstitué (2,5 μg chacun) à la solution d’échantillon de protéines réduites et alkylées et agitez brièvement.
  9. Incuber sur un thermomélangeur à 37 °C et réglé à 1000 tr/min pendant 3 h pour digérer l’échantillon de protéines.
    REMARQUE : La protéase Lys-C est incluse pour aider à cliver tous les sites résistants à la digestion par la trypsine, en raison du repliement ou de la séquence d’acides aminés (par exemple, les liaisons Lys-Pro). Cela permet non seulement de réduire chaque protéine en de nombreux peptides connaissables d’une taille raisonnablement petite et d’une charge totale, mais aussi de manière hautement reproductible si les mêmes conditions de digestion sont suivies de près. Le temps d’incubation de 3 h pendant la digestion est le temps minimum que nous recommandons pour assurer le clivage complet de toutes les protéines.
  10. Après les 3 h d’incubation, retirer du thermomixeur à l’aide d’une pince pour éviter de se brûler les doigts.
  11. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt de digestion (acide trifluoroacétique à 6 % ou acide formique dans l’eau) à l’échantillon et agiter brièvement.
    REMARQUE : Cela inhibe la réaction, car les deux protéases ont une activité maximale à un pH neutre de 7-8.
  12. Conservez les échantillons dans un congélateur à -80 °C, car cela permet également d’arrêter toute activité résiduelle de la protéase. C’est un point d’arrêt sûr.

5. Nettoyage, séchage et remise en suspension des peptides

REMARQUE : Cette procédure consiste principalement à éliminer les réactifs de digestion, en particulier les sels non volatils, qui peuvent facilement endommager l’instrument LC/MS-MS, ainsi qu’à aider à isoler et à concentrer les peptides produits. Le nettoyage des peptides est effectué à l’aide de colonnes de dessalage fournies par le kit, qui sont pré-emballées avec une résine d’exclusion stérique (filtration sur gel) qui capture d’abord les peptides et permet ensuite de laver les sels. Transfert complet des réactifs du kit vers les colonnes de centrifugation d’une hotte chimique, car ils contiennent des solvants organiques toxiques.

PRUDENCE. Assurez-vous que les procédures de sécurité appropriées, y compris le port d’EPI et les réglementations sur le confinement des déchets dangereux, sont respectées lorsque vous travaillez avec des produits chimiques dangereux dans le protocole ci-dessous. Effectuez ces étapes dans une hotte chimique et passez en revue toutes les fiches de données de sécurité avant de travailler avec ces produits chimiques.

  1. Retirez les échantillons du congélateur à -80 °C et laissez-les parvenir à la RT.
  2. Retirez le capuchon blanc au bas de la colonne de nettoyage des peptides, desserrez le capuchon supérieur vert et placez-le dans un tube de collecte de 2 ml.
  3. Placez-les dans la centrifugeuse, fermez le couvercle, appuyez sur start et centrifugez à 3000 g pendant 2 min pour éliminer tout le liquide de conditionnement avant expédition.
  4. Jetez le flux dans un contenant de déchets dangereux et placez la colonne de nettoyage des peptides dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
  5. Étiquetez les couvercles verts de la colonne de nettoyage des peptides avec les ID d’échantillon, à l’aide d’un marqueur à encre permanent.
  6. Transférez délicatement la préparation de digestion des protéines, d’un volume d’environ 300 μL, dans la colonne de nettoyage des peptides secs, à l’aide d’une pipette de 200 μL (par exemple, 150 μL deux fois).
    1. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est observée au sommet de la résine de la colonne de rotation. Si des bulles sont observées, retirez-les en tapotant doucement la colonne ou en utilisant une pointe de pipette propre de 10 μL pour disperser la ou les bulles.
      REMARQUE : Les bulles d’air piégées peuvent entraver la transition en douceur de l’échantillon dans la résine et, par conséquent, affecter négativement l’efficacité du nettoyage et du rendement des peptides.
  7. Placez-les dans la centrifugeuse, fermez le couvercle, appuyez sur Start et centrifugez à 1 500 g pendant 2 min.
  8. Jetez le flux dans un contenant de déchets dangereux et placez la colonne de nettoyage des peptides dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
  9. Ajoutez 300 μL de la solution de lavage A (eau, 0,1 % d’acide trifluoroacétique / TFA) sur la résine de la colonne, à l’aide d’une pipette de 200 μL.
    1. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est observée au sommet de la résine de la colonne de rotation. Si des bulles sont observées, retirez-les en tapotant doucement la colonne ou utilisez une pointe de pipette propre de 10 μL pour disperser la ou les bulles.
  10. Placez-les dans la centrifugeuse, fermez le couvercle, appuyez sur Démarrer et centrifugez à 1 500 g pendant 2 min.
  11. Jetez le flux dans un contenant de déchets dangereux et placez la colonne de nettoyage des peptides dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
  12. Ajouter 300 μL de solution de lavage B (5 % de méthanol, 0,1 % d’AGF) sur la résine de la colonne, à l’aide d’une pipette de 200 μL.
    1. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est observée au sommet de la résine de la colonne de rotation. Si des bulles sont observées, retirez-les en tapotant doucement la colonne ou utilisez une pointe de pipette propre de 10 μL pour disperser la ou les bulles.
  13. Placez-les dans la centrifugeuse, fermez le couvercle, appuyez sur Start et centrifugez à 1 500 g pendant 2 min.
  14. Jetez le flux dans un contenant de déchets dangereux et placez la colonne de nettoyage des peptides dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
  15. Répétez les étapes 5.12 à 5.14 une fois de plus afin que la colonne soit lavée deux fois avec la solution de lavage B.
  16. Transférez la colonne de nettoyage des peptides dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2 ml.
    1. Assurez-vous que les tubes de microcentrifugation de 2 mL utilisés dans cette étape sont les tubes de collecte à faible liaison protéique fournis par le kit.
    2. Pour conserver la quantité disponible de tubes de prélèvement à faible liaison aux protéines, utilisez des tubes de laboratoire standard pour les étapes de lavage précédentes.
  17. Ajouter 300 μL de solution d’élution (50 % d’acétonitrile, 0,1 % d’AFT) sur la résine de la colonne, à l’aide d’une pipette de 200 μL.
    1. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est observée au sommet de la résine de la colonne de rotation. Si des bulles sont observées, retirez-les en tapotant doucement la colonne ou utilisez une pointe de pipette propre de 10 μL pour disperser la ou les bulles.
  18. Placez-les dans la centrifugeuse, fermez le couvercle, appuyez sur Démarrer et centrifugez à 1 500 g pendant 3 minutes pour recueillir l’échantillon de peptide propre dans le nouveau tube de collecte de 2 ml à faible liaison protéique.
    1. Si vous le souhaitez, transférez 125 μL (environ la moitié) de la solution de peptide propre élué dans un flacon en verre de 1 mL, à l’aide d’une pipette de 200 μL, et conservez-la à -80 °C.
      REMARQUE : Cette aliquote peut être utilisée ultérieurement pour des analyses supplémentaires, telles que le marquage de masse en tandem (TMT) des peptides, comme le fait un kit disponible dans le commerce, pour une quantification plus précise des échantillons, en particulier des ensembles préparés indépendamment.
  19. Conserver le reste de l’échantillon, d’environ 175 μL, à -30 °C dans les tubes de 2 mL à faible liaison protéique jusqu’au moment de procéder au séchage et à la reconstitution. C’est un point d’arrêt sûr.
  20. Pour sécher l’échantillon, décongelez l’échantillon peptidique de -30 °C à RT. Si vous procédez au séchage et à la reconstitution juste après le nettoyage des peptides, ignorez cette étape.
  21. Ouvrez les tubes de microcentrifugation de 2 ml et placez-les dans un concentrateur de centrifugeuse sous vide.
    1. Assurez-vous d’équilibrer le concentrateur de centrifugeuse sous vide si un nombre impair d’échantillons est analysé en même temps.
    2. Fermez le couvercle du concentrateur de centrifugeuse à vide et appuyez sur Start.
    3. Laissez les échantillons fonctionner sur le concentrateur de centrifugeuse sous vide pendant 3 h, sans application de chauffage.
    4. Inspectez périodiquement les tubes pour vous assurer qu’il ne reste pas de liquide à l’intérieur, car cela peut interférer avec la liaison des peptides à la colonne de séparation de l’instrument LC/MS-MS.
    5. Si du liquide est toujours observé, continuez à faire tourner les échantillons pendant plus de temps.
    6. Vérifiez entre 30 min et 1 h s’il reste du liquide dans le tube.
      REMARQUE : Les peptides sont très stables au cours de ce processus car ils sont sous vide et ne seront pas détériorés par une courte période de sécheresse ou une chaleur modérée générée par le seul fonctionnement du concentrateur de centrifugeuse à vide.
  22. Une fois sec, remettre immédiatement l’échantillon en suspension dans 50 μL d’acide formique à 0,1 % dans de l’eau de qualité MS (p. ex., 5 μL d’acide formique à 100 % dans 5 mL d’eau).
    1. À l’aide d’une pipette de 200 μL, ajouter 50 μL d’acide formique à 0,1 % au fond du tube de 2 mL contenant l’échantillon de peptide séché.
  23. Fermez les capuchons, puis faites un vortex pendant 15 s.
  24. Transférez les échantillons reconstitués dans les flacons en verre de 1 ml respectifs à l’aide d’une pipette de 200 μL.
  25. Conservez les flacons en verre contenant les échantillons reconstitués à -30 °C et analysez-les par approche basée sur LC-MS/MS dès que possible.
    REMARQUE : Les échantillons de peptides congelés sont stables à -30 °C pour un stockage à court terme et à -80 °C pour un stockage plus long.

6. Acquisition de données d’échantillons peptidiques sur un instrument UHPLC/MS-MS

PRUDENCE. Assurez-vous que les protocoles de sécurité appropriés sont respectés lorsque vous travaillez avec un système de spectromètre de masse en tandem tribride de chromatographie liquide à ultra haute performance/Orbitrap. Le personnel de laboratoire portait l’EPI et a suivi une formation formelle et pratique sur les instruments dispensée par le fabricant de l’UHPLC/MS-MS. Les principales précautions sont la manipulation correcte des phases mobiles de solvant acide et organique pour l’UHPLC et la source d’ionisation haute tension pour le MS.

  1. Effectuez des séparations peptidiques à l’aide d’un système de chromatographie liquide à ultra haute performance (UHPLC). La colonne LC est une version en phase inverse C18, séparation rapide (RSLC) capable d’être électronébulisée, de dimensions 2 μm, 100 Å, 50 μm x 15 cm, telle qu’elle est placée en ligne après une pré-colonne de protection du même matériau.
  2. Utilisez les phases mobiles UHPLC suivantes : 0,1 % d’acide formique dans l’eau (solvant A), 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrile (solvant B) et 0,1 % d’acide formique dans 90 % d’eau et 10 % de méthanol (solvant C).
    REMARQUE : Tous les solvants ainsi que l’acide formique, utilisés pour la préparation des phases mobiles sont certifiés LC / MS et fabriqués uniquement au besoin. L’UHPLC dispose d’une unité de filtration et de dégazage avant les pompes, de sorte que les phases mobiles ne sont pas filtrées manuellement et purgées de l’air.
  3. Fixer les injections programmées de peptides totaux préparés pour les échantillons de plasma et de tissus à 3 μL pour commencer, ce qui équivaut à ~3 μg de matériel peptidique déterminé par la quantité initiale de protéines utilisées.
    REMARQUE : Cela devrait produire une intensité de signal MS idéale pour une identification maximale des protéines. Le volume d’injection peut être augmenté jusqu’à 15 μL pour augmenter encore la sortie du signal ou réduit à 1 μL si une surcharge est apparente.
  4. Maintenez la colonne et l’échantillonneur automatique à 40 °C et 10 °C, respectivement.
  5. Régler le débit de solvant pour l’acquisition protéomique à une constante de 0,3 μL/min, à l’aide des nano-pompes UHPLC, avec un gradient de séparation linéaire des phases mobiles de l’eau (A) à l’acétonitrile (B).
  6. Effectuez les lavages de la seringue d’injection et de la boucle d’échantillonnage (capacité de 20 μL) à l’aide de la phase mobile d’eau et de méthanol (C), avec la pompe de chargement UHPLC initialement réglée à 5 μL/min.
  7. Pendant la séparation de l’échantillon sur 80 min au total, réglez le gradient LC (courbes linéaires) comme suit : Initial - 5 % B ; 0-60 min - 32 % B ; 60-61 min - 95 % B ; 61-65 min - 95 % B ; 65 à 66 min - 2 % B ; et 66-80 min - 2 % B. De même, faire fonctionner la pompe de charge à une fréquence constante de 100 % de A, mais ajuster le débit linéairement comme suit : Initial - 5 μL/min ; 0-5 min - 1 μL/min ; 5-61 min - 5 μL/min ; et 61-80 min - 5 μL/min (figure 3A).
  8. Injectez des échantillons de peptides inconnus sous forme de doublons séquentiels.
  9. Pour éviter la rémanence, effectuer au moins deux injections séquentielles à blanc d’acide formique à 0,1 % dans l’eau entre les échantillons en utilisant un gradient LC tronqué (courbes linéaires) sur 35 minutes au total, comme suit : Initial - 5 % B ; 0-23 min - 32 % B ; 23-24 min - 95 % B ; 24 à 30 min - 95 % B ; 30-31 min - 2 % B ; et 31-35 min - 2 % B (figure 3B).
    1. Assurez-vous que les paramètres de la pente LC de la pompe de chargement restent inchangés.
    2. Pour les échantillons de peptides présentant des niveaux élevés de contaminants endogènes, tels que le foie (p. ex., les acides biliaires), inclure un troisième blanc tous les 3 à 5 échantillons et à la fin de l’essai pour aider à nettoyer la colonne LC. Cela consiste à injecter 1 à 2 μL de solution contenant 25 % d’acétonitrile, d’isopropanol, de méthanol et d’eau.
    3. Alternativement, ou en combinaison avec l’étape ci-dessus, effectuer un gradient LC amélioré à variation de pourcentage (c’est-à-dire en balançoire) sur un total de 35 minutes en tant que lavage du système comme suit : Initial - 2 % B ; 0-3 min - 2 % B ; 3-4 min - 95 % B ; 4-10 min - 95 % B ; 10 à 11 min - 2 % B ; et 11-15 min - 2 % B ; 15 à 16 min - 95 % B ; 16-20 min - 95 % B ; 20-21 min - 2 % B ; 21 à 25 min - 2 % B ; 25-26 min - 95 % B ; 26 à 30 min - 95 % B ; 30-31 min - 2 % B ; et 31-35 min - 2 % B (figure 3C).
  10. Effectuer la détection des peptides, c’est-à-dire des masses moléculaires correspondantes, lorsqu’ils sont séparés et élués de la colonne LC, à l’aide d’un système de spectromètre de masse quadripolaire en tandem (MS-MS) combiné à un Orbitrap et à un piège à ions.
    1. Avant d’effectuer les analyses, branchez la colonne LC directement sur la face de la source interchangeable de nano-ionisation par pulvérisation (NSI) de l’instrument MS, qui se trouve dans le coin supérieur gauche avant de l’appareil.
      REMARQUE : Cela expose l’aiguille d’électronébulisation intégrée de la colonne LC qui délivre les peptides, en suspension à l’intérieur de micro-gouttelettes chargées de solvant de phase mobile LC, dans l’entrée du tube de transfert d’ions du détecteur.
    2. De plus, pour améliorer l’efficacité de la volatilisation par électronébulisation, allumez l’unité de chauffage intégrée de la source NSI et réglez-la à 40 °C.
  11. De plus, avant l’analyse de l’échantillon, vérifiez qu’il y a une entrée externe satisfaisante d’azote comprimé et d’hélium gazeux dans l’instrument MS. Pour ce faire, utilisez des réservoirs de bouteilles en acier de taille 300 de chaque gaz, de qualité ultra-élevée, dont les jauges de régulateur sont réglées à des pressions d’écoulement statiques de 60 et 40 psi, respectivement.
  12. Si l’instrument MS émet des avertissements concernant l’instabilité de l’apport d’azote gazeux, augmentez la pression jusqu’à un maximum de 100 psi. Assurez-vous que les réservoirs sont remplis d’au moins 10 à 20 %, ce qui correspond à une lecture de la jauge supérieure de la soupape de ~250 à 500 psi ; Et si ce n’est pas le cas, remplacez-les par des nouveaux. Tomber en dessous de 10 % de la pleine capacité risque d’attirer des contaminants dans l’instrument MS, qui peuvent se déposer au fond des réservoirs de gaz.
  13. Effectuez la méthode du spectromètre de masse au préalable à l’aide d’un modèle fourni par un logiciel de contrôle conçu pour la détection optimale des peptides et de leurs modifications post-traductionnelles (Figure 3D-H), et entrez les conditions standard suivantes :
    1. Réglez la période de détection totale sur 80 min.
    2. Réglez le mode de détection général sur peptides.
    3. Réglez la source NSI sur le mode positif (c’est-à-dire la charge des ions peptidiques).
    4. Réglez la tension de l’aiguille de nanopulvérisation sur 2000 V et maintenez-la statique.
    5. Réglez l’entrée d’azote gazeux sur l’INS et réglez les détecteurs sur statique.
    6. Réglez la température du tube de transfert d’ions sur 275 °C.
    7. Détecter les masses des peptides entiers (c’est-à-dire les ions parents ; MS1) en réglant la plage de balayage sur 350-2000 m/z, l’objectif RF sur 30 %, le temps d’injection maximal sur Auto et l’analyseur de masse orbitrap sur une résolution de 120 000.
      REMARQUE : La capacité alternative de piège à ions de l’instrument n’est pas utilisée ici pour détecter les masses peptidiques, car il est moins sensible pour la surveillance de ce type de molécule par rapport à l’orbitrap.
    8. Réglez les filtres ioniques pour faire la distinction entre les peptides ayant plusieurs états de charge dans une plage de 2 à 7. Cela permet à l’instrument, tout en enregistrant les données, de convertir automatiquement les rapports de masse sur charge (m/z) des molécules détectés de manière inhérente en leurs masses exactes. De même, un peptide avec un seul état de charge (m/z = 1) n’a besoin d’aucun facteur de conversion pour obtenir sa masse exacte.
    9. Réglez les portes d’exclusion dynamique pour les ions à 1 passage à une durée de 60 s, une tolérance de masse de ±10 ppm, et pour éliminer toutes les molécules avec des atomes isotopiques naturels présents (par exemple, 14C).
    10. Détecter les masses de fragments de confirmation d’identité générés pour les peptides (c’est-à-dire les ions filles ; MS2) en réglant l’instrument sur l’acquisition dépendante des données (mode DDA).
    11. Capturez les peptides entiers (c’est-à-dire les ions parents) par isolement quadripolaire, en utilisant un réglage pour la fenêtre de tolérance de variabilité de masse de m/z = 1,6.
    12. Effectuez la fragmentation des peptides capturés en réglant le mode d’impact des électrons sur HCD (c’est-à-dire la dissociation collisionnelle à plus haute énergie en utilisant l’azote et l’hélium gazeux comme agent de transfert d’électrons), l’énergie de collision à 30 %, la plage de balayage sur Auto, le temps d’injection maximal sur Auto et l’analyseur de masse Orbitrap sur une résolution de 30 000.
    13. Acquérez les données finales (ions MS1 et MS2) en définissant la forme du pic du signal sur un format de centroïde.
  14. Maintenez des déterminations de masse précises pour les peptides détectés en étalonnant régulièrement l’instrument, généralement avant chaque lot d’échantillons, comme décrit ci-dessous.
    1. Placez l’instrument MS dans l’état de mise hors tension d’une source d’ions, à l’aide du logiciel de contrôle, et basculez la source NSI vers la source alternative d’ionisation par électronébulisation chauffée en interne (HESI) de l’appareil. C’est la source utilisée pour les applications qui peuvent nécessiter de très grands volumes d’injection d’échantillons et un débit élevé correspondant (1-2500 μL/min) pour la pompe LC, par exemple, les expériences de métabolomique et de pharmacocinétique des médicaments.
    2. Sélectionnez l’option de vérification complète de l’étalonnage sur le logiciel de contrôle.
    3. Remplissez une seringue en verre de 500 μL dotée d’un piston recouvert de téflon et d’une aiguille émoussée en acier inoxydable avec une solution standard MS disponible dans le commerce, puis connectez la conduite du tube capillaire en PTFE à la source HSEI (hors tension).
      REMARQUE : L’étalon utilisé ici contient un mélange de molécules naturelles et synthétiques (16 au total, par exemple la caféine) qui couvrent une gamme de masse de m/z = 50-2800 et couvrent un large éventail de types de liaisons chimiques possibles, en particulier celles qui sont associées aux peptides (par exemple, les groupes amides).
    4. Amorcez une perfusion constante de l’étalon MS dans la source HSEI (sous tension), en utilisant un débit de 3 à 5 μL/min, comme cela se fait à l’aide d’un pousse-seringue. Une fois qu’un modèle stable de pics standard est noté sur la fenêtre de visualisation en direct du logiciel de contrôle, activez la vérification automatique de l’étalonnage.
      REMARQUE : Si aucun problème n’est détecté avec la sensibilité et l’exactitude des déterminations de masse pour l’étalon, un étalonnage complet réussi prend généralement < 40 min. De même, ce n’est que si l’instrument satisfait à tous les paramètres matériels MS vérifiés qu’il est considéré comme fiable pour l’exécution d’échantillons.
    5. Confirmez le succès de l’étalonnage en remettant en place la source NSI et la colonne LC, puis en analysant une solution étalon de [Glu 1]-fibrinopeptide B humain (Glu-Fib) à des quantités totales injectées couvrant 1 à 10 ng (par exemple, 1, 2, 6 et 10 ng). Utiliser les mêmes méthodes de séparation LC et de détection MS que celles décrites ci-dessus pour les échantillons inconnus.
    6. Vérifiez l’étalon Glu-Fib pour connaître le temps de rétention LC approprié (~20 min), la présence d’ions MS1 et MS2 (m/z = 1285,54, 813,39, 785,84, 445,12, 333,19 et 175,12) et la linéarité des zones de pics croissantes avec la quantité injectée.
    7. Générez ensuite des tables de séquences, à l’aide du logiciel de contrôle et de capture de données, pour exécuter le peptide inconnu et les échantillons blancs qui contiennent des colonnes permettant de saisir le type d’échantillon, le nom de fichier, l’ID de l’échantillon, le chemin d’accès, la méthode de l’instrument LC/MS, la position du flacon et le volume d’injection (Figure 3D-E).
    8. Enregistrez les fichiers de données MS résultants (extension : RAW ; 500 à 800 Go chacun) dans le dossier de chemin désigné sur le disque dur de l’ordinateur de l’instrument. Transférez ensuite ces fichiers vers un ordinateur de poste de travail suffisamment puissant pour piloter le logiciel de bio-informatique, comme décrit plus loin, qui convertit les données spectrales de masse peptidique extrêmement étendues et complexes (c’est-à-dire les signaux MS1 et MS2) en profils de composition protéique totale correspondants.

7. Conversion des données MS brutes en résultats représentatifs du protéome total

REMARQUE : Les données MS brutes capturées pour les échantillons de peptides sont transformées en profils de composition protéique totale (protéome), à l’aide d’un logiciel de bio-informatique. En bref, le logiciel bio-informatique reconstruit les protéines d’origine dans l’échantillon en faisant correspondre les données MS brutes à leurs spectres peptidiques MS1 et MS2 connus trouvés dans une bibliothèque de référence de protéome spécifique à l’espèce basée sur le Web, grâce à une couverture étendue et unique de la séquence d’acides aminés de la protéine. Les abondances relatives de chaque protéine identifiée sont déterminées par le programme à l’aide des intensités du signal MS1 de ses peptides uniques appariés. Les abondances déterminées peuvent être comparées de manière fiable entre les échantillons, mais seulement s’ils sont analysés dans le même lot de préparation et en utilisant des paramètres LC et MS identiques. Sinon, il faudra utiliser des techniques quantitatives absolues mentionnées précédemment et basées sur la récupération interne des ions standard/rapporteurs, comme le marquage TMT sélectif des peptides dans chaque échantillon.

  1. Téléchargez sur le disque dur de l’ordinateur du poste de travail le fichier de référence protéome à partir de la bibliothèque Web.
    1. Pour le trouver, utilisez la base de données située sur le site Web d’Uniprot pour l’échantillon d’espèces d’intérêt (par exemple, furets / Mustela furo). C’est ce qu’on appelle un fichier FATA. Utilisez l’outil de recherche de protéomes et la vue Tableau pour localiser puis télécharger le fichier de référence du protéome.
    2. Pour maximiser le nombre possible d’identifications de protéines générées, sélectionnez à la fois les entrées examinées par les pairs (Swiss-Prot) et non examinées (TrEMBL) dans la base de données Uniprot lors de la création du fichier FATA. De même, choisissez l’option pour inclure toutes les isoformes examinées pour les protéines.
  2. Ouvrez le logiciel bio-informatique, c’est-à-dire Proteome Discoverer, dans l’onglet Page d’accueil , puis sélectionnez l’onglet Administration .
  3. Allez dans le sous-onglet Gérer les fichiers FATA, puis téléchargez dans le programme le fichier FASTA spécifique à l’espèce ci-dessus, généré pour vos expériences.
  4. Retournez à l’onglet Page d’accueil et cliquez sur Nouvelle étude/analyse, puis dans la boîte de dialogue, tapez un nom d’étude dans le champ Nom de l’étude et sélectionnez un dossier de fichiers pour enregistrer l’étude dans le champ Répertoire racine de l’étude.
  5. Laissez les champs Workflow de traitement et Workflow de consensus vides pour l’instant, car ils seront sélectionnés pour plus tard.
  6. Cliquez sur OK pour enregistrer et quitter la boîte de dialogue, qui fera alors apparaître la page Définition de l’étude .
  7. Allez dans l’onglet Définition de l’étude et saisissez les détails du projet dans la zone Description de l’étude située au milieu à gauche.
  8. Allez dans l’onglet Fichiers d’entrée et cliquez sur Ajouter des fichiers.
    1. Cela fera apparaître une boîte de dialogue dans laquelle les fichiers de données brutes requis à traiter dans les résultats du profil de composition protéique totale (protéome) peuvent être sélectionnés et téléchargés à partir du disque dur de l’ordinateur.
  9. Cliquez sur les fichiers de données MS bruts qui sont maintenant répertoriés sous l’onglet Fichiers d’entrée , qui peuvent être sélectionnés et mis en surbrillance individuellement ou en une seule fois.
  10. Faites-les glisser et déposez-les dans la section Fichiers pour analyse de la boîte Analyse située au milieu à droite dans le cadre de la sous-zone Étape de traitement .
  11. Allez dans l’onglet Flux de travail et cliquez sur Modifier, qui se trouve à côté de l’en-tête Étape de traitement de la boîte d’analyse située au milieu à droite.
  12. Cliquez sur Ouvrir commun et, dans le dossier ProcessingWF_Tribrid , sélectionnez le fichier de flux de travail de traitement spécifiquement désigné pour les sous-identifications de phosphoprotéines, comme obtenu dans le cadre de la détection MS basée sur la fragmentation HCD (Figure 4A).
    REMARQUE : Un diagramme d’étapes de traitement contenant des nœuds modifiables apparaîtra alors dans la boîte Arbre du flux de travail . Il y aura deux nœuds, comme décrit ci-dessous, qui sont marqués de points d’exclamation indiquant qu’il est nécessaire que l’utilisateur saisisse des informations spécifiques à l’expérience.
  13. Dans l’arborescence du flux de travail de traitement, cliquez sur et ouvrez le nœud Spectrum Files RC .
    1. Dans la catégorie Paramètres des fichiers de spectre RC , recherchez et sélectionnez sous le paramètre Base de données de protéines le fichier FATA, qui était précédemment généré à l’aide du site Web Uniprot, pour la bibliothèque de référence spécifique à l’espèce de spectres MS peptidiques qui seront recherchés pour identifier les protéines d’intérêt expérimental.
  14. Cliquez sur et ouvrez le nœud Sequest HT et apportez les trois modifications suivantes :
    1. Sous le paramètre Base de données de protéines , sélectionnez le même fichier FASTA que celui décrit ci-dessus.
    2. Sous le paramètre Nom de l’enzyme , sélectionnez Trypsine (complète) ou Lys-C, qui sont les protéases principales et de secours utilisées pour préparer la digestion originale du peptide.
    3. Sous le paramètre Modifications dynamiques , assurez-vous qu’au moins Phospho / +79,966 Da (S, T, Y) a été sélectionné.
      1. Utilisez ce dernier paramètre pour révéler les peptides associés à des protéines qui sont modifiées post-traductionnellement par la phosphorylation, en recherchant les pertes spectrales MS correspondantes d’un ou plusieurs groupes phosphate (m/z = 79,97).
      2. Trouvez les sites d’acides aminés occupés par le phosphate (c’est-à-dire la sérine, la thréonine ou la tyrosine) par les altérations attendues de leurs modèles de fragmentation MS2.
      3. Ajouter d’autres modifications post-traductionnelles protéiques d’intérêt courant de la même manière au nœud Sequest HT à ce stade, par exemple, méthylation, acétylation, myristylation, si la perte de masse exacte des groupes apparentés est connue. De même, élargissez la recherche des sites de phosphorylation à d’autres acides aminés moins fréquemment signalés, par exemple l’histidine.
        REMARQUE : Les nœuds Spectrum Files RC et Sequest HT de l’arborescence du flux de travail pour l’étape de traitement sont les deux seuls qui nécessitent l’ajustement de paramètres.
    4. Laissez le reste comme paramètres par défaut, car ceux-ci ont déjà été optimisés par le fabricant pour produire le plus grand nombre d’identifications de protéines désignées d’intérêt. De même, cela s’applique à tous les autres nœuds de l’arborescence du flux de travail.
    5. Assurez-vous que les nœuds Percolator et IMP-ptmRS sont inclus à la fin de l’arborescence du flux de travail.
      REMARQUE : Le percolateur utilise un ajustement réitératif pour affiner considérablement les résultats finaux. IMP-ptmRS est essentiel pour rapporter l’identification appropriée et la localisation du site de toutes les modifications post-traductionnelles des protéines, y compris celle de la phosphorylation.
  15. Retournez à l’onglet Flux de travail et cliquez sur Modifier situé à côté de l’en-tête Étape de consensus de la boîte d’analyse située en haut à droite. Cela fera apparaître le diagramme de l’arborescence du flux de travail pour l’étape de consensus.
  16. Cliquez sur Ouvrir commun et, dans le dossier ConsensusWF , sélectionnez le fichier de flux de travail de consensus qui produira le format de sortie souhaité pour les résultats du profil de composition protéique (protéome) (Figure 4B).
    REMARQUE : Un diagramme d’étapes de consensus contenant des nœuds modifiables s’ouvrira dans la boîte de dialogue Arborescence du flux de travail . Le diagramme utilisé pour le traitement des données est généré par la modification du flux de travail de consensus de base, où les nœuds en ligne Feature Mapper et Precursor Ions Quantifier ont été ajoutés en tant que branche à partir du nœud initial MSF Files , afin de faciliter la quantification des abondances relatives des protéines. Bien que tous les nœuds du flux de travail contiennent déjà des paramètres optimisés établis par le fabricant, certains contiennent des entrées très importantes pour vérifier la bonne sélection, comme décrit ci-dessous.
  17. Dans l’arborescence du flux de travail, cliquez sur le nœud Precursor Ions Quantifier et ouvrez-le. C’est le nœud essentiel pour quantifier les abondances relatives de chaque protéine identifiée.
    1. Dans la catégorie Paramètres généraux de quantification , recherchez et sélectionnez, sous le paramètre Peptides à utiliser , l’option Unique + Rasoir .
      REMARQUE : Les peptides uniques sont ceux qui contiennent des séquences d’acides aminés exclusives à une seule protéine ; et sont donc utilisés pour déterminer spécifiquement sa quantité en fonction de l’intensité du signal MS. Les peptides de rasoir sont ceux partagés entre les groupes de protéines ; et ainsi, sont utilisés pour mettre en accord les abondances relatives calculées.
    2. Dans la catégorie Normalisation et mise à l’échelle , remplacez les paramètres Mode de normalisation et Mode de mise à l’échelle par l’option Aucun , car ce type d’ajustement est trop restreint pour une application fiable sur l’ensemble du protéome.
      REMARQUE : Ces paramètres ne sont activés que lorsqu’il est souhaité de normaliser les abondances relatives calculées de protéines d’intérêt sélectionnées par rapport à celles qui sont intrinsèques de manière stable à la cellule, par exemple, les gènes de nettoyage, puis d’exprimer les valeurs résultantes sous forme de rapport échelonné.
    3. Ensuite, cliquez sur et ouvrez le nœud Filtre peptidique et protéique et, sous la catégorie Filtres peptidiques , modifiez les paramètres PSM Confiance peptidique Au moins et Maintenir un niveau de confiance inférieur en options Élevé et Faux , respectivement. Cela permet de définir les correspondances peptidiques utilisées pour identifier les protéines au plus haut niveau de signification de l’ajustement (c’est-à-dire ≥ 95 %).
      REMARQUE : Alternativement, le premier paramètre peut être réglé sur Medium pour détendre la rigueur des correspondances peptidiques et ainsi augmenter considérablement la production de coups de protéines ; Mais cela conduit à l’inverse à un risque très élevé de générer de nombreuses fausses identifications. De même, il ne devrait jamais être le cas qu’une valeur « Low » soit utilisée comme une option acceptable pour les deux paramètres.
    4. Ce sont les seuls nœuds de l’étape de consensus qui doivent avoir des paramètres ajustés, laissant le reste tel quel en utilisant leurs paramètres par défaut.
      REMARQUE : Dans l’ensemble, le flux de travail de l’étape consensuelle gère toute l’analyse post-hoc, c’est-à-dire la détermination des abondances relatives aux protéines, les confidences d’identification (c’est-à-dire les taux de fausses découvertes et les scores de correspondance spectrale des peptides) et la couverture peptidique cartographiée. Les statistiques de résultats et les distributions de données sont également fournies sous forme de tables de fin.
  18. Une fois que les flux de travail des étapes de traitement et de consensus ci-dessus sont en place, enregistrez l’intégralité de l’étude, puis cliquez sur l’icône Exécuter (engrenages) située en haut de la boîte d’analyse . Si plusieurs fichiers de données MS brutes sont traités en même temps, avant de commencer le traitement, cliquez sur l’icône Par fichier (carré) et cochez-la.
    REMARQUE : Le traitement d’un fichier de données brutes MS en un fichier de résultats de protéome total prend généralement de 20 à 40 minutes, mais il peut produire une liste de plusieurs milliers d’identifications de protéines allant de correspondances de confiance faible, moyenne à élevée (c’est-à-dire avec une pondération vers des résultats élevés), ainsi que les modifications de phosphate présentes dans chaque entité (Figure 4C). Les principaux paramètres de sortie des résultats pour les protéines identifiées sont FDR (confiance), Master (si le fichier FASTA / l’entrée de la bibliothèque a été examiné), Accession #, Description, Coverage %, Coverage Coverage, Sequence Matches, Peptides Spectral Matches (par exemple, nombre de peptides uniques), Caractéristiques physiques (par exemple, MW en kDa), Abundants Relative et Modifications (i.e., Groupes de phosphorylation).
    1. Organisez les résultats du protéome total dans l’ordre croissant ou décroissant ou entièrement filtrés, à l’aide de l’icône de l’entonnoir sur la barre d’outils (figure 4C), en fonction des intérêts de recherche, par exemple, ne montrez que ceux avec une identification de confiance élevée (protéine FDR) ou un degré élevé de correspondance peptidique (par exemple, par % de couverture et/ou nombre d’uniques trouvés).
    2. Si des informations de modification post-traductionnelle sont spécifiquement souhaitées, filtrez les protéines identifiées présentant une phosphorylation pour une analyse plus approfondie.
    3. Enregistrez les résultats filtrés, sans changement de nom de fichier, car ils peuvent être restaurés à la sortie d’origine en supprimant simplement les filtres appliqués et en actualisant la fenêtre.

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Résultats

Visualisation des résultats du protéome total par traitement facultatif dans les tracés des volcans
Les résultats totaux du protéome pour chaque échantillon peuvent être facilement recherchés par # d’accession ou description pour des protéines spécifiques d’intérêt pour la recherche, et les abondances relatives associées sont moyennées, puis comparées entre les groupes de traitement pour les différences significatives (p. ex., par exemple, par les valeurs p dérivées du test t). Alternativement, il peu...

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Discussion

La méthode ci-dessus a utilisé des tissus qui ont été congelés dans de l’azote liquide pour arrêter immédiatement toute activité biologique avant de les transférer à -80 °C pour un stockage à long terme. Une fois tous les échantillons prélevés, il y a eu homogénéisation des tissus. Lors de l’homogénéisation, il est essentiel de garder tous les tissus et outils froids pour éviter la réactivation ou la dégradation des protéines. De plus, lors de l’extraction initiale des protéines à partir...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce projet a été soutenu en partie par une nomination au programme d’association du Conseil national de recherches du Canada administré par le Bureau des bourses des académies nationales des sciences, de l’ingénierie et de la médecine et le programme de l’Institut des sciences et de l’éducation d’Oak Ridge de l’Institut de recherche de l’armée Walter Reed.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de dosage des protéines 660 nmPierce / Thermo Scientific22662Pour que BCA puisse déterminer les concentrations en protéines des échantillons, contient le réactif de dosage des protéines Pierce 660nm et les étalons de dosage des protéines pré-dilués
Acétonitrile, grade Optima LC/MSThermo Fisher ScientificRéférence 047138.K2Acétonitrile ultra-pur utilisé pour la chromatographie liquide/spectrométrie de masse
Plaque d’aluminiumBeckman Coulter538619Joint utilisé lors de la mise au point d’une plaque de dosage des protéines
BioTek Synergy Neo2 Lecteur multimode / Spectromètre UV-VisAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195Spectrophotomètre/lecteur de plaque de dosage utilisé pour effectuer des lectures d’absorbance de 660 nm afin de déterminer les concentrations de protéines.
Solution de rinçage d’instrument ChromaCare LC-MSThermo Fisher ScientificT111101000Solution contenant 25 % d’acétonitrile, d’isopropranol, de méthanol et d’eau pour aider à nettoyer le système LC après l’analyse des échantillons
Tube Precellys CK28Bertin Corp / TechnologiesP000911LYSK0A.0Des tissus homogénéisés sont placés dans ces tubes pour la lyse tissulaire et l’isolement des protéines à l’aide de l’instrument Precellyis. Il s’agit des tubes utilisés par notre laboratoire, appelés « tubes d’homogénéisation » dans le protocole.
CryopodeBrooks / Azenta Sciences de la viehttps://www.azenta.com/products/cryopod-carrierRécipient utilisé pour stocker de l’azote liquide pour refroidir le mortier pendant l’homogénéisation de la tisuse
Kit de préparation d’échantillons EasyPep Mini MSThermo Fisher ScientificA40006Un kit peut traiter 20 échantillons, dont le contenu comprend la solution de lyse pour l’extraction des protéines, les nucléases universelles complétées dans la solution d’extraction et les réactifs nécessaires aux étapes 1.4 et 1.5
Colonne EASY-Spray C18 LC (15 cm L, 50 & micro ; m Dia, et 2 µ ; m taille des particules)Thermo Fisher ScientificES901Colonne LC par électronébulisation utilisée pour la séparation des peptides avant la détection de la MS
Solution d’étalonnage FlexMixPierce / Thermo ScientificN° A39239Mélange de 16 molécules étalons utilisé pour calibrer la précision et la sensibilité du détecteur de l’instrument MS avant les prélèvements
Acide formique, grade LC/MSThermo Fisher Scientific85178Acide formique ultra-pur utilisé pour acifier toutes les solutions et échantillons de LC à une concentration finale de 0,1 % (v/v)
Arrêter la protéase & Cocktail d’inhibiteurs de phosphotase à usage unique (100x)Thermo Fisher Scientific78442Complété dans le tampon d’extraction pour éviter la dégradation des protéines et des phosphoprotéines dans l’échantillon
Méthanol, grade Optima LC/MSThermo Fisher ScientificRéférence 047192.K2Méthanol ultra-pur utilisé pour la chromatographie liquide/spectrométrie de masse
Mortier de porcelaine, 150 mLThermo Fisher ScientificRéférence FB961CCapacité de 150 ml, utilisée pour homogénéiser les petits tissus du furet (c.-à-d. le cerveau)
Mortier de porcelaine, 275 mLThermo Fisher ScientificRéférence FB961DCapacité de 275 ml, utilisée pour homogénéiser les tissus de grands furets (c.-à-d. le foie)
Mortier de porcelaine, 50 mLThermo Fisher ScientificFB961ACapacité de 50 ml, utilisée pour l’homogénéisation des tissus de souris
Porcelaine Pestl, 50 mLThermo Fisher ScientificRéférence FB961KÀ utiliser avec un mortier de 50 ml
Pilons en porcelaine, 150 mLThermo Fisher ScientificFB961MÀ utiliser avec un mortier de 150 mL
Pilons en porcelaine, 275 mLThermo Fisher ScientificFB961NÀ utiliser avec un mortier de 275 mL
PrecellysBertin Corp / Technologieshttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/Instrument utilisé pour homogénéiser des échantillons de tissus. Les réglages suivants ont été utilisés : 4500 tr/min, 2 x 30 s par cycle, 30 s de pause.
Réactif de dosage des protéinesPierce / Thermo Scientific22662Réactif de dosage des protéines utilisé aux étapes 3.4&ndash ; 3.8
Découvreur de protéomeThermo Fisher ScientificCSW0064764Logiciel bio-informatique pour l’analyse de données de protéomique/phosphoprotéomique
Flacons d’injection LC à bouchon à vis SureSTART MSCERT (0,02 po ; Capacité de 1,5 ml)Thermo Fisher Scientific18 HEURESCK39TRFlacons en verre à bouchon à vis (PTFE, septa pré-fendus) certifiés pour les applications contenant des échantillons à injecter sur l’instrument LC/MS.   ;   ;
Système Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS)Thermo Fisher ScientificLC : à prix réduit / MS : FETD2-10002, sur demande spécialeInstrument de chromatographie liquide/spectrométrie de masse (LC/MS) à ultra-haute performance utilisé pour séparer puis détecter en fonction de la masse moléculaire les peptides dans les échantillons
Nucléase universelle pour lyse cellulaire, 100kU, 400 & micro ; LPierce / Thermo Scientific88702Des nucléases universelles supplémentaires ont été achetées.
Vacufuge PlusEppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748Vacufuge avait l’habitude de sécher les échantillons de peptides avant de les reconstituer.
Eau, grade Optima LC/MSThermo Fisher ScientificRéférence 047146.K2Eau ultra-pure utilisée pour la chromatographie liquide/spectrométrie de masse

Références

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