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Modélisation du glycocalyx endothélial post-pneumonectomie dans une puce fluidique 3D - une approche de fabrication d’un système d’organe sur puce vasculaire

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DOI :

10.3791/67246

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16 septembre 2025

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1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la construction d’un système d’organe sur puce (OOC) conçu pour imiter la pneumonectomie. Ce système étudie la corrélation potentielle entre l’altération du glycocalyx et les complications après une pneumonectomie.

Résumé

Le glycocalyx endothélial (GCX), une couche riche en glucides recouvrant la surface luminale des cellules endothéliales, joue un rôle central dans la régulation des réponses cellulaires aux stimuli. Il est composé de protéines transmembranaires servant de mécanotransducteurs pour les réponses cellulaires. Bien qu’il conserve naturellement sa structure et sa stabilité dans des conditions homéostatiques, l’exposition à des contraintes de cisaillement élevées peut induire des dommages aux nombreuses conséquences. Les effets généraux du stress de cisaillement sur les cellules endothéliales ont été explorés, mais l’étendue et l’impact du stress de cisaillement sur les systèmes vasculaires, en particulier après une pneumonectomie, n’ont pas été bien étudiés. Pour étudier cette question, une approche globale a été entreprise, impliquant la création d’un modèle CAD de la vascularisation pulmonaire avant et après la pneumonectomie. À l’aide de la simulation numérique des fluides, les régions clés de contrainte et de pression de cisaillement élevées ont été identifiées et reproduites dans un système d’organe sur puce (OOC). Des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HLMVEC) ont été ensemencées sur un moule en forme des sections sélectionnées pour caractériser les effets d’une contrainte de cisaillement élevée in vitro. À la suite de l’expérimentation, les HLMVECs ont été immunomarqués pour évaluer qualitativement la santé des GCX dans des conditions normales et accrues de stress induites par la pneumonectomie. L’intégration de la modélisation informatique et de l’analyse expérimentale améliore notre compréhension de la façon dont les changements de contrainte de cisaillement affectent GCX, clarifiant leurs effets sur la fonction vasculaire et les complications post-chirurgicales.

Introduction

Une pneumonectomie est une intervention chirurgicale invasive et à haut risque réalisée pour extraire le poumon droit ou gauche1. Cette procédure est généralement utilisée comme option de traitement pour diverses affections graves telles que le cancer du poumon, la tuberculose pulmonaire et les lésions pulmonaires traumatiques2. Bien que la procédure soit prometteuse, elle présente des risques importants, mis en évidence par des taux accrus de complications postopératoires allant des arythmies aux œdèmes pulmonaires1.

Les pneumonectomies ont un impact profond sur la dynamique cardiovasculaire en dirigeant l’ensemble du débit cardiaque du cœur vers le poumon restant3. Cette redirection du flux sanguin est connue pour augmenter les contraintes de pression et de cisaillement dans le système vasculaire pulmonaire restant4. Avec ces vastes altérations des schémas de flux sanguins, le glycocalyx endothélial (GCX) joue un rôle central dans la détection de ces changements dans les schémas de flux sanguin5.

Le GCX est une couche semblable à un gel qui régule les activités biochimiques en réponse aux changements de son environnement 6,7. Il a été démontré que son expression augmente avec une exposition prolongée à un écoulement uniforme et diminue avec l’exposition à un écoulement perturbé par rapport à la culture statique 8,9. Le GCX présente une épaisseur variable allant de 0,1 à 1 μm sur l’ensemble du système vasculaire et fonctionne comme une couche essentielle de mécanotransduction recouvrant les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins10. Le réseau est composé d’une couche dense de sucres, de lipides et de protéines, comme le montre la figure 1. Ces sucres se lient pour former des glycanes, qui peuvent exister soit librement dans la circulation sanguine, soit attachés à des protéines ou à des lipides, entraînant la formation de protéoglycanes, de glycoprotéines ou de glycolipides 7,11. Les protéoglycanes sont composés de chaînes de glycosaminoglycanes (GAG), qui se lient à la membrane cellulaire par l’intermédiaire de protéines plasmatiques ou de récepteurs. Ces GAG comprennent le sulfate d’héparane (HS), l’acide hyaluronique (HA), le sulfate de chondroïtine (CS), le sulfate de dermatane et le sulfate de kératan12. Le sulfate d’héparane est le GAG prédominant, représentant plus de 50 % du total des GAG trouvés dans le GCX. Ces chaînes latérales peuvent se fixer à des protéines centrales intégrées, qui comprennent des glypicanes (ancrés par le glycosylphosphatidylinositol) et des syndéciques (avec un domaine couvrant la membrane), ainsi que CD44 (un récepteur d’adhésion de surface). Les complexes décrits ci-dessus jouent un rôle crucial dans la régulation des facteurs de croissance, les réactions anti-inflammatoires, la facilitation de la dilatation des vaisseaux et le contrôle de la perméabilité vasculaire13.

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Figure 1 : Schéma des composants GCX. Schéma représentant les composants du glycocalyx endothélial. Ce schéma montre le glycocalyx apical, qui se trouve sur la lumière du vaisseau, montrant ses protéoglycanes et glycoprotéines liés à la membrane. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Bien que le lien précis entre les pneumonectomies et les lésions de la GCX ne soit pas bien étudié, il existe une corrélation plausible entre la modification du flux sanguin induite par les pneumonectomies et l’intégrité de la GCX. La perturbation du flux sanguin dans le système vasculaire est connue pour infliger des dommages au GCX6. Nous avons émis l’hypothèse que l’augmentation de l’écoulement perturbé et les changements dans la contrainte de cisaillement dans le système vasculaire restant après une pneumonectomie peuvent infliger des dommages au GCX au fil du temps. Cette détérioration accélérée peut catalyser les complications et les morbidités postopératoires, augmentant ainsi les risques inhérents pour la santé globale du patient13.

Ce protocole visait à modéliser la vascularisation pulmonaire après pneumonectomie, en suivant la procédure générale décrite à la figure 2. Des simulations de fluides ont été réalisées sur un modèle de conception assistée par ordinateur reproduisant le système vasculaire pulmonaire humain avec et sans pneumonectomie. Les modèles de pneumonectomie ont été créés en concevant des systèmes vasculaires pulmonaires en 3D dans un logiciel de modélisation 3D, sur la base de dimensions dérivées de tomodensitogrammes et de données de la littérature, puis en les simplifiant davantage pour les simulations d’écoulement dans un logiciel de dynamique des fluides numérique (CFD). Les simulations ont permis d’identifier des zones d’intérêt spécifiques, choisies par des zones où la contrainte de cisaillement était accrue dans les modèles de pneumonectomie par rapport au témoin. Ces zones d’intérêt ont été choisies pour être reproduites dans le cadre de la construction d’un modèle in vitro . Le modèle in vitro a utilisé une conception de chambre fluidique pour simuler plusieurs sections de système vasculaire avec une géométrie normale et une géométrie de pneumonectomie pour simuler la différence dans les conditions d’écoulement.

Des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HLMVEC) ont été cultivées sur des substrats de polydiméthylsiloxane (PDMS) enrobés de fibronectine, façonnés pour imiter une région de bifurcation sélectionnée. Un milieu de culture de cellules endothéliales microvasculaires a été perfusé à travers le système à l’aide d’une pompe péristaltique. Enfin, les cellules et GCX ont été fixées, immunomarquées avec un anticorps de coloration GCX et visualisées à l’aide d’un microscope fluorescent pour évaluer leur état après exposition à un écoulement de fluide. Une chronologie générale du protocole se trouve dans le tableau 1.

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Figure 2 : Séquence de développement OOC. Séquence de développement d’un nouveau système OOC pour étudier les effets de la pneumonectomie pulmonaire (1) TDM générée sur le système vasculaire pulmonaire humain. (2) Géométrie de tomodensitométrie utilisée pour identifier les régions d’intérêt pour le modèle CAO 3D. (3) Simulations d’écoulement de fluides pour déterminer des géométries d’intérêt pour un modèle in vitro. (4) Moule PDMS modélisé contenant des zones d’intérêt à partir des résultats de simulation (5) Moule inséré dans un boîtier en acrylique pour fixer le moule pour la perfusion (6) Configuration complète de la chambre d’écoulement (7) Configuration complète de la chambre d’écoulement transférée dans l’incubateur (8) Images en fond clair et fluorescentes prises après exposition à la contrainte de cisaillement. Créé avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Chronologie générale du protocole. Séquence d’exécution des étapes dans le protocole avec la durée moyenne (h) de chaque étape. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Protocole

Cette étude a utilisé des données d’imagerie par tomodensitométrie (TDM) tirées de la littérature antérieure14 qui ont été recueillies conformément aux normes éthiques institutionnelles et fédérales. Toutes les données d’imagerie référencées avaient le consentement éclairé des participants, après approbation par le comité d’examen institutionnel (IRB) afin d’assurer la protection des droits et de la vie privée des participants.

1. Modélisation du système vasculaire pulmonaire dans un logiciel de CAO

  1. Rechercher les géométries physiologiques des vaisseaux primaires à modéliser.
  2. Utilisez les images TDM des patients des vaisseaux à modéliser pour choisir des géométries spécifiques à reproduire, comme le montre la figure 2.
    REMARQUE : Pour ce protocole, des tomodensitogrammes pulmonaires de l’état clinique tirés de la littérature antérieure ont été utilisés14. Ce protocole permet également d’utiliser toutes les données de tomodensitométrie pour générer des modèles in vitro .
    1. Ouvrez une visionneuse DICOM et importez les images CT. Naviguez à travers les tranches pour identifier les récipients d’intérêt. Enregistrez les images pertinentes pour une analyse plus approfondie.
      REMARQUE : Le vaisseau répliqué pour ce protocole était le système vasculaire pulmonaire, car l’application de ce protocole consiste à modéliser le glycocalyx endothélial dans des conditions saines et post-pneumonectomie. D’autres emplacements peuvent être utilisés pour différentes applications.
  3. À l’aide d’ImageJ FIJI v1.54f15, mesurez les diamètres des récipients à partir d’images CT ou de valeurs littératures.
    1. Ouvrir ImageJ FIJI et Importer les images CT enregistrées : sélectionnez Fichier > Ouvrir.
    2. Sélectionnez l’outil Ligne dans la barre d’outils pour tracer une ligne couvrant la longueur de la barre d’échelle sur l’image CT.
    3. Sélectionnez ensuite Analyser > Définir l’échelle. Entrez la distance connue (par exemple, si la barre d’échelle de l’image est de 10 mm, entrez 10 comme distance connue). Entrez l’unité de longueur (par exemple, mm). Cliquez sur OK.
  4. Utilisez l’outil de ligne pour mesurer les diamètres. Pour ce faire, sélectionnez l’outil Ligne dans la barre d’outils et tracez une ligne couvrant le diamètre du récipient. Sélectionnez ensuite Analyser > mesurer pour obtenir la valeur du diamètre.
  5. Répétez les étapes 1.3 et 1.4 pour tous les récipients d’intérêt et notez les mesures.
  6. Compilez les mesures des navires en types de segments pour faciliter la modélisation.
    1. Créez une feuille de calcul pour catégoriser les mesures du vaisseau et étiquetez chaque ligne avec le nom du vaisseau, la mesure et le type de segment (par exemple, artère, veine).
  7. Créez un tableau de référence pour les longueurs et les diamètres des segments vasculaires à partir de la littérature et des mesures radiographiques.
  8. Générez un modèle 3D à l’aide d’un logiciel de modélisation 3D pour reproduire la géométrie et les dimensions des images CT.
    1. Ouvrez le logiciel et créez un nouveau fichier pièce : sélectionnez Fichier > Nouvelle pièce > , sélectionnez Esquisse > Créer une esquisse et dessinez le profil à l’aide des dimensions d’ImageJ.
    2. Utilisez les balayages de surface et le lissage pour la géométrie 3D : pour les balayages, sélectionnez Caractéristiques > Swept Boss/Base. Pour les lissages, sélectionnez Fonctions > Bossage/Base de lissage.
    3. Affinez le modèle pour qu’il corresponde aux mesures exactes.
  9. Identifier les variantes de modèles à développer, telles qu’un modèle de contrôle et un modèle de pneumonectomie.
    1. Décrivez les différentes affections (p. ex., pneumonectomie normale ou pneumonectomie) et énumérez les changements structurels nécessaires pour chaque variante.
  10. Dupliquez le modèle original pour le modifier afin de créer les modèles expérimentaux selon vos paramètres (c’est-à-dire pneumonectomie droite et gauche).
    1. Enregistrez le modèle d’origine, puis sélectionnez Fichier > Enregistrer en tant que copie pour créer des copies pour chaque condition expérimentale.
    2. Modifiez chaque copie en fonction des paramètres définis (par exemple, pneumonectomie droite et gauche).
  11. Convertissez le modèle d’un fichier pièce en fichier Parasolid pour les simulations de dynamique des fluides numérique (CFD).
    1. Sélectionnez Fichier > Enregistrer sous. Choisissez Parasolid (*.x_t) dans la liste déroulante du type de fichier, puis enregistrez le fichier dans le répertoire de votre choix.

2. Simulation de l’écoulement des fluides

REMARQUE : Cette étape est utile pour localiser les régions de contrainte de cisaillement modifiée après une pneumonectomie afin de sélectionner la géométrie vasculaire à répliquer pour le système in vitro . De plus, la licence du logiciel doit prendre en charge le module d’importation.

  1. Mettre en place une nouvelle étude d’écoulement laminaire en régime permanent.
    1. Sélectionnez Assistant Modèle > 3D (dimension spatiale) > écoulement de fluide > écoulement monophasique > écoulement laminaire (spf) > sélectionnez Ajouter pour ajouter une interface de physique de l’écoulement laminaire > sélectionnez Étude > choisissez Stationnaire sous Étude générale > sélectionnez Terminé.
  2. Ajouter la géométrie à partir du modèle CAO.
    1. Importez le fichier Parasolid. Sélectionnez Faces de capuchon et, dans la fenêtre graphique, sélectionnez la circonférence de la paroi intérieure du récipient à chaque entrée et sortie ouvertes. Il s’agira des bords limites des faces du capuchon. Sélectionnez Former l’union et Construire tout.
    2. Sélectionnez Supprimer les détails et assurez-vous que toutes les options sont sélectionnées sous Détails à supprimer, puis sélectionnez Tout générer pour supprimer la géométrie inutile.
  3. Création du maillage 1 (paroi du vaisseau maillée + domaine fluide maillé).
    1. Réglez la taille sur prédéfinie : extra fine, calibrez pour la dynamique des fluides.
    2. Réglez la taille 1 sur prédéfinie : extra fine, calibrez pour la dynamique des fluides, pour la sélection d’entités géométriques, spécifiez Limite et Manuel. Dans la fenêtre graphique, sélectionnez toutes les faces extérieures visibles du domaine de la paroi du navire, y compris la face en forme d’anneau autour de la face du couvercle. Ne sélectionnez pas les faces du capuchon à l’entrée et à la sortie.
      REMARQUE : Sélectionnez la face du capuchon à l’extrémité de la section retirée à droite et à gauche des modèles de pneumonectomie, car elle est considérée comme des limites géométriques après une pneumonectomie.
    3. Sous Affinement des coins, sélectionnez Domaine et Manuel. Dans la fenêtre graphique, sélectionnez [Domaine] 1 (paroi du récipient) et [Domaine] 2 (fluide).
    4. Sous Sélection de limites, assurez-vous que les limites sont les mêmes que celles spécifiées dans la « Sélection d’entités géométriques » à partir de la « Taille 1 ».
    5. Sous Tétraédrique libre 1, sélectionnez Restant pour le niveau d’entité géométrique sous Sélection de domaine.
    6. Sous Couches limites 1 et Sélection d’entités géométriques, spécifiez Domaine, puis Manuel, dans la fenêtre graphique [Domaine] 1 et [Domaine] 2. Les propriétés de la couche limite seront la même sélection que celle spécifiée dans Taille 1.
    7. Construisez le maillage en sélectionnant Tout construire sous Maillage 1.
  4. Création du maillage 2 (domaine fluide maillé uniquement).
    1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Maillage 1, sélectionnez Importer pour créer « Maillage 2 » et supprimez Importer 2.
    2. Sous Importer 1, sélectionnez Séquence de maillage pour sélectionner automatiquement Maillage 1. Assurez-vous que les options Générer automatiquement le maillage source, Importer les éléments de domaine et Importer les domaines non maillés sont cochées , puis sélectionnez Importer. Tous les paramètres définis dans le maillage 1 seront reportés sur le maillage 2.
    3. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Maillage 2 et sélectionnez Supprimer les entités. Pour Supprimer les entités 1, sous Sélection d’entités géométriques , sélectionnez Domaine, sélectionnez Manuel, dans la fenêtre graphique, sélectionnez [Domaine] 1 (paroi du navire), puis sélectionnez Tout construire pour ne laisser que la géométrie du fluide, car la surface du maillage du domaine du fluide se trouvera à l’interface entre l’écoulement du fluide et la paroi interne des récipients.
  5. Ajouter du matériel d’écoulement : Créez un nouveau matériau en utilisant les propriétés du sang de la littérature. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Matériaux et sélectionnez Matériau vierge. Sélectionnez Domaine dans la sélection au niveau de l’entité géométrique, sélectionnez Tous les domaines. Sélectionnez Non solide pour Type de matériau, ajoutez les propriétés du matériau du sang, y compris la viscosité et la densité.
  6. Configurez les conditions limites et les paramètres de l’étude d’écoulement laminaire.
    1. Sélectionnez Flux laminaire (spf), sous Sélection de domaine, sélectionnez Tous les domaines. Seul [Domaine] 1 sera répertorié. Le domaine 1 dans ce cas est la géométrie du fluide, et non la paroi du récipient. Les propriétés du fluide 1 sont automatiquement remplies à partir du matériau défini à l’étape 5.
    2. Réglez les valeurs initiales 1 pression sur la pression artérielle physiologique. Définissez la condition aux limites du mur 1 sur non-glissement.
    3. Sélectionnez Entrée 1 dans la fenêtre graphique et définissez la condition aux limites sur Flux entièrement développé. Assurez-vous que l’option Appliquer la condition à chaque sélection disjointe séparément est cochée.
    4. Sous Flux entièrement développé, sélectionnez Débit et entrez la vitesse.
    5. Pour Sortie 1, sélectionnez toutes les sorties dans la fenêtre graphique et assurez-vous que la condition aux limites est définie sur Pression.
    6. Sous Conditions de pression, sélectionnez Total et entrez la pression. Sélectionnez Moyenne et Supprimer le reflux.
  7. Configurez et exécutez l’étude.
    1. Pour l’étape 1 : Stationnaire à l’étude, assurez-vous que la section Physique et variables correspond à l’étude prévue et que le composant de sélection de maillage 1 est défini sur Maillage 2. Sélectionnez Calculer.
  8. Analysez les résultats des contraintes de cisaillement.
    1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Pression (spf) et sélectionnez Dupliquer. Renommer en Contrainte de cisaillement.
    2. Sous Contrainte de cisaillement, sélectionnez Surface et remplacez le jeu de données par Étude 1/Solution 1 (sol1).
    3. Sous Expression, tapez spf.sr*spf.mu et définissez units sur Pa.
      REMARQUE : Cela signifie « taux de cisaillement d’écoulement monophasé * viscosité d’écoulement monophasique ».
    4. Ensuite, sélectionnez Tracer et faites un clic droit sur Transparence 1 et sélectionnez Désactiver.
    5. Faites un clic droit sur Contrainte de cisaillement et sélectionnez Volume pour changer l’ensemble de données en Étude 1/Solution 1 (sol1).
    6. Sous Expression, tapez spf.sr*spf.mu et définissez units sur Pa.
    7. Sélectionnez Tracé, cliquez avec le bouton droit de la souris sur Surface, puis sélectionnez Désactiver pour analyser visuellement le « Volume 1 » afin de déterminer les zones d’intérêt du navire à étudier dans le modèle OOC

3. Préparation des moules PDMS

  1. À l’aide des résultats de la simulation de fluides, choisissez des géométries pour le contrôle et la pneumonectomie en sélectionnant des zones qui présentent des différences significatives de contrainte de cisaillement entre les modèles de contrôle et de pneumonectomie et en les reproduisant sous forme de moules négatifs dans la CAO. Les dimensions des modèles CAO de vasculature de contrôle et de pneumonectomie sont illustrées aux figures 3 et 4.
  2. De plus, des bouchons de conception pour l’entrée et la sortie du moule permettent d’éviter les fuites lors de l’ensemencement des cellules.
  3. À l’aide d’une imprimante 3D, imprimez les moules et les bouchons à l’aide de filament PLA.
  4. Obtenez les moules à l’acide polylactique (PLA) qui ont été imprimés en 3D (contrôle + pneumonectomie) (Figure 5A).
  5. Pesez 10 parties de base d’élastomère de silicone et 1 partie d’agent de durcissement d’élastomère de silicone pour obtenir un total de 30 ml de mélange (rapport masse/masse de 10:1) pour remplir les moules à une épaisseur de 3 mm (Figure 5B).
    REMARQUE : Ne mélangez pas les solutions mères pendant le processus de pesage. Utilisez des matériaux de pesage distincts pour chaque réactif.
  6. Versez la base en élastomère et l’agent de durcissement ensemble et mélangez soigneusement
    REMARQUE : Cela peut être fait dans un bateau de pesée.
  7. Verser la solution bien mélangée dans les moules (environ 15 mL pour la moitié du moule) (Figure 5C).
  8. Dégazez le PDMS en le plaçant dans une chambre à vide pendant 30 à 60 minutes ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles (figure 5D).
  9. Retirer le PDMS de la chambre à vide et durcir à température ambiante pendant 48 h.
    REMARQUE : Un four n’a pas été utilisé pour le durcissement en raison de la capacité thermique des moules PLA.
  10. Extrayez le PDMS du moule PLA.
  11. Rincez généreusement le moule en PLA avec de l’eau DI pour vous assurer qu’il ne reste aucune impureté à sa surface afin qu’il puisse être réutilisé.

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Figure 3 : Dessin CAO 3D du système vasculaire de contrôle. Dimensions, en mm, du modèle vasculaire témoin en vue de dessus et de côté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Dessin CAO 3D d’une vascularisation de pneumonectomie. Dimensions, en mm, du modèle de vascularisation de la pneumonectomie en vue de dessus et de côté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Création de moules PDMS. Création de moules PDMS. (A) Moules PLA imprimés en 3D pour les expériences de contrôle (orange) et de pneumonectomie (vert). (B) Balance avec matériaux de fabrication PDMS. (C) Verser le mélange PDMS (base 10:1 + agent de durcissement) dans les moules imprimés en 3D. (D) Dégazage PDMS dans une chambre à vide. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Culture cellulaire et ensemencement

  1. Utilisez une technique d’asepsie appropriée selon les protocoles de laboratoire locaux.
  2. Vaporisez de l’éthanol à 70 % et apportez tous les matériaux et composants nécessaires dans l’enceinte de sécurité biologique (BSC) (figure 6A), y compris des morceaux de PDMS et quatre morceaux de ruban adhésif double face.
  3. Placez deux morceaux de ruban adhésif double face dans chaque plaque de culture cellulaire (Figure 6B).
  4. Placez chaque moitié vasculaire PDMS dans sa propre boîte de culture cellulaire sur le ruban adhésif double face (Figure 6C).
  5. Stérilisez davantage tous les composants en les exposant à la lumière UV pendant 20 minutes dans l’ESB.
  6. Décongeler la trypsine, le milieu de culture HLMVEC et 20 μg/mL de fibronectine à 37 °C si nécessaire.
  7. Placez plusieurs gouttes de 30 μL de fibronectine à 20 μg/mL le long du système vasculaire PDMS à l’aide d’une micropipette. Si nécessaire, inclinez le PDMS à l’aide d’une pointe de pipette pour enrober uniformément le PDMS (Figure 7A).
  8. Incuber les morceaux PDMS pendant 30 minutes pendant qu’ils sont dans l’ESB.
  9. Après l’incubation, aspirer la solution de fibronectine et laisser sécher les morceaux de PDMS dans l’ESB (figure 7B).
  10. Introduire dans l’ESB un flacon confluent de cellules HLMVEC (37 °C, 5 % CO2).
  11. Aspirer le milieu de culture HLMVEC de la fiole de culture. Rincer brièvement avec de la trypsine ou du PBS stérile.
  12. Aspirez le produit de lavage et ajoutez 3 mL de trypsine dans la fiole. Incuber à 37 °C, 5 % CO2 pendant 5 min. Observez les cellules au microscope pour confirmer que toutes les cellules sont détachées du flacon.
  13. Ajouter 9 mL de milieu de culture complet HLMVEC pour arrêter l’action de la trypsine.
  14. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml, puis rincez le ballon avec 10 ml de milieu de culture HLMVEC pour recueillir les cellules restantes.
  15. Transférer dans le tube de 50 ml. Cellules de centrifugation à 220 x g pendant 5 min.
  16. Une fois l’opération terminée, confirmez visuellement la pastille de cellule au bas du tube. Vaporisez le tube avec de l’éthanol à 70 % et apportez-le dans l’enceinte de biosécurité. Aspirez le surnageant en laissant la pastille.
  17. Remettez doucement les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture HLMVEC frais et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Calculez le nombre total de cellules à l’aide des équations ci-dessous, où A-H est le nombre de cellules comptées par carré de l’hémocytomètre. Gardez les cellules sur la glace.
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  18. Amener la concentration de cellules à 2 x 106 cellules/mL avec le milieu de culture HLMVEC.
  19. Placez les bouchons imprimés en 3D aux extrémités de chaque moitié de système vasculaire pour éliminer les fuites de suspension cellulaire du moule PDMS, comme le montre la figure 5 (4 bouchons au total, 2 par pièce PDMS) (Figure 7C).
  20. Injecter 300 μL de suspension de cellules HLMVEC (600 k cellules) à l’aide d’une micropipette dans chaque morceau de PDMS (figure 7D).
  21. Transférez doucement les morceaux de PDMS contenant des cellules HLMVEC dans l’incubateur (37 °C, 5 % de CO2) pendant 1 à 2 h pour qu’ils soient fixés (figure 7E).
  22. Inspectez avec un microscope pour confirmer visuellement la bonne fixation du HLMVEC aux substrats PDMS.
  23. Retournez les moitiés vasculaires du PDMS dans l’ESB.
  24. Retirez les quatre bouchons, ajoutez suffisamment de milieu de culture HLMVEC pour immerger les moitiés vasculaires PDMS et remettez les plaques de culture contenant les vascularisations PDMS dans l’incubateur (figure 7F).
  25. 6 à 10 h après l’ensemencement, pipeter manuellement le milieu de culture HLMVEC entourant le PDMS jusqu’au système vasculaire pour rafraîchir le milieu le plus proche des cellules.

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Figure 6 : Fixation des moules PDMS aux plaques. Étapes de base pour fixer le système vasculaire PDMS aux plaques de culture cellulaire. (A) Matériaux nécessaires pour placer les moitiés vasculaires PDMS dans les plaques de culture. (B) Deux morceaux de ruban adhésif double face sont placés en diagonale dans chaque plaque de culture stérile. (C) Moitiés vasculaires PDMS montées sur l’adhésif double face. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Ensemencement des HLMVECs dans des moules PDMS. Étapes d’ensemencement des HLMVECs dans le système vasculaire PDMS. (A) Remplissez le système vasculaire de 150 à 300 μL avec 20 μg/mL de fibronectine. (B) Aspirer l’excès de fibronectine à l’aide de la technique du tilt tap. (C) Bouchez les extrémités de la moitié vasculaire PDMS avec des bouchons imprimés en 3D. (D) Ensemencer 500-600K cellules dans un milieu de 300 μL dans chaque moitié vasculaire. (E) Placez les moitiés de PDMS dans l’incubateur pendant 1 à 2 h pour faciliter la fixation des cellules. (F) Couvrir les moitiés du PDMS avec du support et retirer les bouchons. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Assemblage et fonctionnement du système d’écoulement

  1. Effectuez la procédure d’écoulement une fois que les cellules des moitiés vasculaires du PDMS sont complètement confluentes, comme déterminé par une inspection visuelle au microscope.
  2. Étalonnez la pompe péristaltique selon le protocole du fabricant avant d’effectuer une expérience.
  3. Autoclave tous les composants autoclavables, y compris le tube d’écoulement, les connecteurs de tube, le réservoir de la seringue et le bouchon en caoutchouc.
  4. Immergez les blocs acryliques, les vis, les bouchons, les pièces de tube Masterflex L/S 16 de 1 pouce de long et le couvercle de la plaque de boîte de Pétri de 15 mm dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 min et traitez-le par UV pendant 20 min dans un BSC, en le retournant à mi-chemin.
  5. Une fois que tout l’autre équipement et le matériel sont stérilisés, apportez les moitiés vasculaires du PDMS dans l’ESB.
  6. Aspirer le milieu HLMVEC de la boîte de Pétri contenant les moitiés vasculaires (Figure 8A,B).
  7. Placez les moitiés du PDMS dans les deux blocs de polycarbonate, en vous assurant qu’elles sont alignées (Figure 8C).
  8. Appliquez un scellant à base de silicone aux extrémités du système vasculaire, où le tube sera fixé aux moitiés du système PDMS, et placez le tube d’un pouce de long dans les deux extrémités du système vasculaire inférieur (figure 8D).
  9. Retournez le bloc acrylique supérieur (contenant la moitié supérieure du système vasculaire PDMS) sur le bloc acrylique inférieur (contenant la moitié inférieure du système vasculaire PDMS) (Figure 8E).
  10. Boulonnez les blocs d’acrylique avec le bloc fileté sur le fond et bouchez les extrémités libres des tubes d’un pouce de long avec les bouchons imprimés en 3D (Figure 8F).
  11. Retirer un bouchon et injecter doucement 500 μL de milieu de culture HLMVEC dans le système vasculaire, en l’inclinant pour éviter la formation de bulles d’air, puis replacer le bouchon.
  12. Placez l’ensemble de la puce assemblée dans l’incubateur pour permettre au silicone de durcir pendant 1 à 2 h.
  13. Apportez la puce assemblée et tous les autres matériaux stériles dans l’ESB et connectez le tout pour configurer le système d’écoulement conformément à la figure 9. Assurez-vous que le tube passant par la pompe péristaltique jusqu’à l’entrée du système vasculaire est fixé au fond du réservoir de la seringue. Cela permettra à la gravité d’alimenter le tube et de réduire les bulles d’air dans le système.
  14. Amorcez doucement le système d’écoulement avec le média HLMVEC. À l’aide d’une pipette sérologique de 50 ml, injecter 30 ml de milieu dans le haut du réservoir de la seringue (figure 10B). Faites fonctionner la pompe péristaltique à un faible débit pour remplir le tube. Continuez à ajouter du média dans le réservoir jusqu’à ce que le système soit complètement amorcé et que toutes les bulles soient éliminées.
    REMARQUE : Les bulles d’air peuvent cisailler les cellules pendant l’expérience d’écoulement.
  15. Fixez le tube à l’entrée du réservoir (à partir de la sortie du moule vasculaire) à l’aide d’un raccord fixé à un bouchon en caoutchouc placé en haut du réservoir (Figure 10C).
  16. Détachez le système d’écoulement de la pompe péristaltique et placez-le sur la casserole métallique. Transportez en douceur l’ensemble de l’installation de l’ESB à l’incubateur (37 °C, 5 % CO2). Alimentez la tubulure de la pompe péristaltique par l’arrière de l’incubateur.
  17. Remettez la pompe péristaltique en place et réglez-la sur le débit souhaité pour émuler le débit sanguin à travers le modèle vasculaire.
  18. Démarrez la pompe et assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites. Laissez le système fonctionner pendant 24 h ou la durée souhaitée. Vérifiez périodiquement les fuites.

figure-protocol-7
Figure 8 : Construction de la puce d’écoulement. Construction de la puce d’écoulement. (A) Aspirer le milieu de la plaque de culture cellulaire. (B) Le PDMS se divise en deux après l’aspiration du support. (C) Retirez les moitiés PDMS de la plaque avec d’autres matériaux nécessaires à la construction de la puce (bouchon, filtre de seringue, morceaux de tube 1/2", mastic silicone, 10x vis et blocs acryliques). (D) Placez les moitiés PDMS dans les blocs d’acrylique et appliquez du mastic silicone aux endroits marqués en rouge. (E) Placez le tube dans les découpes respectives. (F) Connectez les moitiés de la chambre d’écoulement et fixez le bouchon et le filtre de la seringue. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-8
Figure 9 : configuration du système d’écoulement Mise en place du système d’écoulement. Le système d’écoulement complet est construit à l’aide de tubes, de connecteurs de tubes, d’une pompe péristaltique, d’un réservoir de seringue, d’un support et de la puce d’écoulement. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 10 : Amorçage du système d’écoulement. Amorçage du système d’écoulement avec des fluides. (A) Configuration simple du système d’écoulement sans fluide. (B) Le bouchon en caoutchouc est retiré du réservoir de la seringue et le média est ajouté en continu jusqu’à ce que le tube soit rempli et qu’il y ait 20 à 30 ml d’excès de média dans le réservoir. (C) Système d’écoulement amorcé avec un média HLMVEC. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Fixation et coloration

  1. Lavez chaque moitié vasculaire PDMS dans du PBS pendant 5 minutes. Ajoutez-en suffisamment pour immerger toute la section vasculaire.
  2. Aspirez le PBS du système vasculaire en inclinant la plaque et en laissant le PBS s’écouler, puis aspirez le liquide de ruissellement.
  3. Ajouter 600 μL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans du PBS dans chaque moitié vasculaire et incuber à température ambiante (RT) pendant 20 minutes.
  4. Aspirez la solution de PFA dans un conteneur à déchets approprié en utilisant la méthode décrite à l’étape 2.
  5. Lavez les cellules fixes 3 fois dans du PBS pendant 5 minutes chacune en suivant la procédure décrite à l’étape 2.
    REMARQUE : Jetez chacun de ces lavages dans un récipient à déchets approprié pour le formaldéhyde.
  6. Bouchez les extrémités des moitiés vasculaires PDMS avec les bouchons propres imprimés en 3D.
  7. Préparez de l’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % dans du PBS pour le blocage.
  8. Remplissez les moitiés vasculaires avec 600 μL de solution bloquante et incubez pendant 30 minutes à RT.
  9. Retirez les bouchons et aspirez la solution de blocage.
  10. Préparez une dilution 1:200 de lectine d’agglutinine de germe de blé (WGA) avec une biotine conjuguée (anticorps primaire) dans une solution de BSA à 3 % pour colorer GCX9.
  11. Remettez les bouchons pour boucher les extrémités du système vasculaire et ajoutez 500 μL de solution d’anticorps primaires à chaque moitié vasculaire.
  12. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 1 h.
  13. Aspirez doucement l’anticorps primaire en suivant la technique précédemment utilisée.
  14. Lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
  15. Préparer une dilution de 1:500 du conjugué de streptavidine WGA (anticorps secondaire) dans une solution de BSA à 3 %.
  16. Remettez les bouchons pour boucher les extrémités du système vasculaire et ajoutez 500 μL de solution d’anticorps secondaires à chaque moitié vasculaire.
  17. Répétez les étapes 6.12 à 6.14.
  18. Ajoutez le milieu de montage DAPI à la surface vasculaire en distribuant des gouttes de 30 μL à intervalles réguliers pour remplir complètement le système vasculaire.
  19. Placez des lamelles en verre sur le PDMS pour couvrir les canaux vasculaires.
  20. Scellez les bords de la lamelle à l’aide d’un vernis à ongles transparent.
  21. Couvrir les plaques de papier d’aluminium et les conserver à 4 °C jusqu’à l’imagerie.

7. Imagerie

  1. Mettez le microscope sous tension et ouvrez l’application de visualisation sur l’ordinateur connecté.
  2. Ouvrez le microscope et augmentez la lumière. Fixez la plate-forme appropriée pour s’adapter aux échantillons (support de boîte de Pétri polyvalent).
  3. Placez un échantillon sur le porte-plat à l’intérieur du microscope avec la zone d’intérêt centrée au-dessus de l’objectif.
  4. Baissez la lumière et fermez le couvercle du microscope.
  5. Sur le logiciel du microscope, sélectionnez l’option Capturer une image fixe .
  6. Choisissez le type d’échantillon, utilisez-le polyvalent.
  7. Sélectionnez l’objectif approprié dans la section de l’objectif pour une meilleure visualisation.
  8. Dans le logiciel du microscope, ajustez la position de l’objectif pour l’aligner sur une région d’intérêt (ROI).
  9. Sélectionnez l’autofocus et les cellules doivent être à peu près nettes.
  10. Ajustez manuellement la mise au point pour clarifier complètement l’image.
  11. Ajustez la luminosité et l’exposition pour visualiser les cellules plus clairement.
  12. Activez le multicolore et la couleur dans le logiciel.
  13. Dans les paramètres CH, activez CH1 Floor DAPI et CH2 Floor GFP.
  14. Ajustez la luminosité de chaque canal séparément pour visualiser clairement les images.
  15. Sélectionnez Z-Stack dans le logiciel du microscope.
  16. Ajustez la mise au point sur le plan le plus élevé de l’image et sélectionnez définir pour définir la limite supérieure
  17. Réglez la mise au point sur le plan le plus bas de l’image et sélectionnez définir pour définir la limite inférieure
  18. Sélectionnez l’épaisseur de la tranche souhaitée et appuyez sur Démarrer la capture pour prendre l’image.
    REMARQUE : Ces images seront également transmises à un logiciel d’analyse au microscope pour être modifiées.

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Résultats

Les résultats de l’étude de simulation de fluide à écoulement laminaire à l’état stationnaire ont montré une augmentation de la contrainte de cisaillement dans certaines bifurcations dans les modèles de pneumonectomie par rapport au modèle témoin, illustré à la figure 11. Visualisées à l’étape 2.8 du protocole, les zones rouges indiquent les zones de forte contrainte de cisaillement, tandis que les zones bleues montrent les zones de faible contrainte de cisaillement.

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Discussion

La modélisation vasculaire est un nouveau domaine d’exploration important. La création réussie d’un modèle vasculaire précis est très prometteuse pour faire progresser le domaine de l’ingénierie tissulaire et du développement de médicaments. Cet article décrit une nouvelle méthode de génération d’un système vasculaire OOC qui peut être utilisée pour émuler une pneumonectomie ou tout autre système vasculaire ou géométrie afin d’étudier un lien potentiel entre l’altération de GCX et les co...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs tiennent à exprimer leur plus profonde gratitude au département de génie biomédical de l’Institut polytechnique de Worcester pour leur soutien et leurs conseils. Nous tenons à remercier tout particulièrement Megan Ouellette, John Martel et Sudish Vengat pour leurs efforts de collaboration et leurs idées novatrices qui ont grandement amélioré la qualité et la viabilité de cette recherche. De plus, nous tenons à remercier Samantha Cocchiaro et Udaya Rattan pour leurs contributions en laboratoire et leur soutien et leur aide essentiels.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
#8-32 x 3/4 po Vis à métaux zinguée à tête ronde combo (paquet de 8)Everbilt204274613-
0,25 % EDTA-trypsineThermoFisher Scientific25200056-
Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 15 mlThermo Scientific12-565-269-
Antenne parabolique 35x10mm, Nunclon DeltaThermo Scientific153066-
Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 50 mlThermo Scientific12-565-271-
Bouchons en caoutchouc assortisFisherbrand14-132
Fioles traitées pour la culture cellulaire BioLite (25cm^2)Thermo Scientific12-556-009-
Fioles traitées à la culture cellulaire BioLite (75cm^2)Thermo Scientific12-556-010-
COMSOL MultiphysiqueCOMSOLN/A-
Adhésif double face  ;3M16758005-
Epredia Richard-Allan Scientific Cover Glass  ;Thermo Scientific22-050-218-
Sérum fœtal bovinThermoFisher Scientific  ;A5256701-
FibronectineThermoFisher Scientific  ;3301601520 &mu ; Dilution en g/mL
Fisherbrand Bains-marie à commande numérique Isotemp : modèle 210Fisherbrand15-462-10Q-
Fisherbrand Seringue stérile (60 ml)Fisherbrand14-955-461-
Cellules endothéliales microvasculaires du poumon humainSigma Aldrich540-05A  ;-
Keyence BZX810 Fluorescent MicroscopeCléenceN/A-
Krayden Dow Sylgard 184 Kit d’élastomètre en silicone. Transparent, (1,1 LB)Dow4019862-
Marga Cipta feuille d’acrylique coulée 1/2' d’épaisseur, 48x96'Marga CiptaN/A-
Tête de pompe Masterflex L/S Easy-Load IIMasterFlex77200-50
Tube de pompe de précision Masterflex L/S, silicone durci au platine, L/S 16 ; 25 piedsMasterFlex96410-16-
Pompe péristaltique standard Masterflex L/SMasterflex07522-20
Micropipette 0,2 à 2 &mu ; LFisherbrandFBE00002-
Micropipette 10 à 100 &mu ; LFisherbrandFBE00100-
Micropipette 100 à 1000 &mu ; LFisherbrandFBE01000-
Micropipette 5 à 50 &mu ; LFisherbrandFBE00050-
Milieu de croissance des cellules endothéliales microvasculaires (500ml)Sigma - Aldrich111-500-
Nalgene Filtres à seringue stérilesThermo Scientific725-2520-
Nikon Eclipse TS-100 Fluorescent MicroscopeNikonNI-TS100
Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS, 10X), formule de DulbeccoThermo ScientificJ61917. K3-
Prusament PLA Prusa Galaxy Noir 1kgPrusaPRM-PLA-GLX-1000-
Microscope hybride rebelle, droit et inversé, découvrez EchoÉCHO76376-746-
Mastic silicone  ;Loctite908570-
SolidWorks (en anglais)Dassault SystèmesN/A
Pipettes sérologiques jetables en polystyrène stérile avec bande de loupe (10 ml)Fisherbrand13-678-11F-
Pipettes sérologiques jetables stériles en polystyrène avec bande de loupe (25 ml)Fisherbrand13-678-11-
Pipettes sérologiques jetables stériles en polystyrène avec bande de loupe (50 ml)Fisherbrand13-678-11F-
Pipettes sérologiques jetables stériles en polystyrène avec bande de loupe (5 ml)Fisherbrand13-678-11D-
Streptavidine, conjugué Alexa Fluor 488Invitrogen  ;Réf. S32354
Streptavidine, conjugué Alexa Fluor 488InvitrogenRéf. S32354-
Seringue resevoir  ;BD300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT Albumine, bovin, fraction V, 35 % soln., qualité réactif, sans acide gras, avec azoture comme conservatiThermo ScientificN12H004-
Connecteurs de tubesFisherbrand01-000-161-
Milieu de montage anti-effacement VECTASHIELD avec DAPI  ;Bouclier de VectaN° H-1200-10-
Incubateur CO2 à chemise d’eau VWRAvantar  ;10810-744 ;-
Anticorps biotinylé WGAVecteurRéf. B-1025-

Références

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Mots-clés

Contrainte de cisaillementMod lisation vasculaireVasculature pulmonaireSimulation de fluideCellules HLMVECVasculature en PDMSImmunomarquagePompe p ristaltique

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